PL247605B1 - Sposób przygotowania platformy do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii i/lub komórek nowotworowych, z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania platformy do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, przedstawionej na rysunku, zwłaszcza bakterii i/lub komórek nowotworowych, z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana (SERS), obejmującej podłoże stanowiące folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem i poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego, i pokrytą warstwą metalu aktywnego SERS-owsko, charakteryzujący się tym, że obejmuje etapy, w których folię z tworzywa sztucznego pokrywa się przewodzącym tlenkiem albo stosuje się gotową folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem, następnie otrzymaną folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem poddaje się działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego, po czym nanosi się warstwę metalu aktywnego SERS-owsko.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku sposób przygotowania elastycznej platformy do powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, która służy do bezpośredniej detekcji i/lub identyfikacji substancji i/lub mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, z użyciem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana.

Powierzchniowo wzmocniony efekt Ramana (ang. Surface Enhanced Raman Spectroscopy SERS) został po raz pierwszy odkryty w 1974 roku przez Martina Fleischmanna, Patricka J. Hendra i A. Jamesa McQuillana, którzy zaobserwowali bardzo duży wzrost intensywności pasm ramanowskich dla pirydyny zaadsorbowanej na powierzchni srebra [1]. Kilka lat później zaproponowano dwa mechanizmy wzmocnienia sygnału: efekt elektromagnetyczny oraz mechanizm przeniesienia ładunku. Do dzisiaj dokładny mechanizm powstania wzmocnienia sygnału ramanowskiego nie został całkowicie wyjaśniony i jest kwestią dyskusyjną. Przyjmuje się, iż mechanizm wzmocnienia elektromagnetycznego odpowiada głównie za zwiększenie sygnału SERS [2].

Pierwsze eksperymenty były przeprowadzone z wykorzystaniem szorstkiej elektrody srebrnej jako podłoże SERS. Aby zaobserwować efekt SERS muszą być spełnione dwa warunki. Pierwszym z nich jest obecność badanej cząsteczki w strefie schropowaconej powierzchni metalu, którego nierówności wynoszą od kilku do stu nanometrów. Geometria powierzchni ma również znaczący wpływ na wzmocnienie sygnału ramanowskiego. Powierzchnia platformy SERS powinna charakteryzować się obecnością nano- lub mikro-nierówności, będących różnego rodzaju uskokami i pofałdowaniami czy igłami. Źródłem tych nierówności mogą być też agregaty lub skupiska atomów metalu znajdujące się na powierzchni, i obecnie przyjmuje się że optymalna średnica takich agregatów to kilkadziesiąt nanometrów. Obecność nierówności/skupisk atomów o takich średnicach powoduje powstawanie tzw. „hotspot”. Są to miejsca o lokalnym, bardzo wysokim natężeniu promieniowania elektromagnetycznego, które powodują wzmacnianie słabych pasma ramanowskich. Platforma SERS posiada tym większe i powtarzalne wzmocnienie im takich miejsc jest więcej.

Drugim warunkiem jest pokrycie powierzchni metalem szlachetnym. Na wzmocnienie sygnału SERS wpływ mają również właściwości elektryczne metalu. Zazwyczaj stosuje się ze srebro, złoto i ich stopy, rzadziej miedź [2]. W ostatnich latach jest również duże zainteresowanie zastosowaniem aluminium do UV SERS [3]. Nanostrukturalna powierzchnia wymienionych metali wykazuje powierzchniowy rezonans plazmonowy - LSPR (ang. Localized Surface Plasmon Resonance). To właśnie z powodu rezonansu plazmonów występujących w nanocząstkach metali szlachetnych możemy zaobserwować wzrost intensywności sygnału ramanowskiego.

Aby przygotować platformę SERS stosuje się szereg metod, zarówno bottom-top, jak i topbottom. Do szeroko stosowanych metod należy fotolitografia, metody elektrochemiczne (wytrawiania, elektrodepozycja, elektroredukcja), metody chemiczne (wytrawianie, synteza nanocząstek, redukcja metali), a także różne modyfikacje metod CVD (ang. Chemical Vapour Deposition) i PVD (ang. Physical Vapour Deposition) [4]. Optymalna odległość adsorbatu od powierzchni nie przekracza kilku nanometrów [5,6].

Zainteresowanie tą techniką w ostatnich dwudziestu latach rośnie głównie z powodu jej czułości i selektywności. Technikę SERS wykorzystuje się w wielu dziedzinach, na przykład w przemyśle, ochronie środowiska, żywności, oraz medycynie. Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana umożliwia identyfikację nawet pojedynczych cząsteczek, substancji o bardzo małym stężeniu, nawet 10^-12 mol/l, dając unikalne widmo [7]. Jest ona potężnym narzędziem do wykrywania biologicznych analitów w niewielkim stężeniu, jakie może występować naturalnie. Jednym z największych wyzwań techniki SERS jest znalezienie najlepszego podłoża, które daje wysokie wzmocnienie sygnału ramanowskiego, powtarzalne wyniki, a zarazem jest tanie i wytrzymałe.

W ostatnich latach odnotowano znaczne wzrost zainteresowania alternatywnymi, elastycznymi podłożami do platform SERS. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się podłoża z papieru [8,9], polimerów [10,11], tworzyw sztucznych [12-14], czy elastomerów takich jak PDMS [15]. W przypadku warstwy plazmonicznej aktywnej SERS-owsko, będącej nanocząstkami złota i srebra, najpopularniejszymi metodami nakładania są drukowanie oraz nakładanie przez zanurzanie (ang. dip-coating). Stosuje się także metody stosowanie w wytwarzaniu klasycznych podłoży SERS jak np. nakładanie warstwy metalu przy pomocy techniki PVD. Wykorzystywane są różne materiały polimerowe oraz techniki modyfikacji powierzchni polimerów, przy czym dużym zainteresowaniem cieszy się politereftalan etylenu (PET) [16-18]. Kalachyova i inni [19] zastosowali folię PEEK jako podłoże, które następnie poddali działaniu lasera o długości fali 248 nm, co zmieniło strukturę powierzchni polimeru. W celu uzyskania platform SERS próbki pokryto cienką warstwą złota przy pomocy metody PVD. Wu i inni [20] zastosowali podłoże z folii PET, na którą nanosili przy pomocy metody sitodruku nanocząstki srebra, uzyskując czułą i uniwersalną platformę SERS. Li i inni [21] wykorzystali trójwymiarowe piramidy krzemowe jako matrycy, która posłużyła do odbicia struktury na folii z PMMA. Na tak przygotowanej strukturze osadzono nanocząstki srebra. Wang i inni [22] uzyskali nanostruktury o wysoko rozwiniętej powierzchni na folii PET pokrytej następnie nanocząstkami złota, uzyskując platformę SERS. Lu i inni [23] uzyskali platformę SERS, osadzając w procesie elektrodepozycji nanostruktury złota na folii PET. Liu i inni [24] zastosowali folie PET, na której wytwarzano w procesie fotolitografii periodyczne, piramidalne struktury. Ich powierzchnia następnie była pokrywana nanocząstkami srebra, stając się platformą SERS.

Elastyczne podłoża SERS opisane są również w zgłoszeniach patentowych i opisach patentowych. Szymborski i inni w zgłoszeniu patentowym P.424152 „Platform a i jej zastosowanie do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, techniką powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana oraz sposób osadzania tych mikroorganizmów na wytworzonych platformach” zaproponowali platformę SERS z włókien polimerowych (PLA, PLLA, nylon, PVDF) wytworzonych metodą elektrospinningu.

Z kolei Witkowska i inni w zgłoszeniu patentowym P.406900 „Platforma do badań substancji chemicznych oraz mikroorganizmów techniką wzmocnionej powierzchniowo spektroskopii Ramana i sposób jej otrzymywania” zademonstrowała matę polimerową wytworzoną metodą Forcespinning'u, czyli wyciągania włókna polimerowego przy pomocy siły odśrodkowej. Maty te po pokryciu warstwą złota przy pomocy metody PVD umożliwiały osadzenie bakterii na ich powierzchni bezpośrednio z cieczy i równocześnie wykazywały duże wzmocnienie sygnału Ramana.

Platformy elastyczne posiadają szereg zalet:

i) Są łatwe w obróbce mechanicznej: łatwo się je tnie, wygina oraz przycina do dowolnego kształtu (w odróżnieniu od podłoży bazujących na krzemie, szkle czy kwarcu).

ii) Nie kruszą się i/lub pękają przy obciążeniach momentami zginających i skręcających.

iii) Oferują wysokie wzmocnienie EF, dzięki czemu można je zastosować w większości aplikacji analitycznych.

iv) Proces technologiczny ich wytwarzania jest prosty, a gotowe półfabrykaty (np. folie pokryte przewodzącym tlenkiem) można kupić komercyjnie w dużych ilościach.

v) Elastyczne platformy SERS można przymocować do szorstkich, nieregularnych powierzchni i bezpośrednio z nich pobierać próbki np. pot z powierzchni ciała czy pestycydy z powierzchni owoców.

vi) Ze względu na swoją elastyczność oferują zwiększoną wszechstronność pobierania próbek np. wymazy czy mikroekstrakcje [25,26].

Warstwy wierzchnie polimerów i tworzyw sztucznych są modyfikowane metodami fizycznymi (np. plazma tlenowa [27], plazma argonowa [28] oraz wytrawianie plazmowe [29]) i chemicznymi, by poprawić ich zdolności do wzmacniania sygnału ramanowskiego. Jedną z takich metod jest wyładowanie koronowe, a w szczególności barierowe wyładowanie dielektryczne, zaliczane do technik plazmowych.

Mimo, że plazma stanowi 99,9% masy wszechświata to w warunkach ziemskich jest ona stosunkowo rzadkim zjawiskiem (jonosfera otaczająca Ziemię oraz wyładowania atmosferyczne). Wykorzystanie technologiczne plazmy zostało zapoczątkowane w XIX wieku (ozonator i piec łukowy), ale rozkwit technologii wykorzystujących plazmę to wiek XX, gdzie znalazła szerokie zastosowanie w technologiach materiałowych, chemicznych, biomedycznych, ochronie środowiska i innych. Typowa klasyfikacja plazmy dzieli ją na trzy typy:

1. Plazmę wysokotemperaturową (np. synteza termojądrowa),

2. Plazmę niskotemperaturową (np. wyładowanie elektryczne zupełne, łuk elektryczny, plazma wysokoczęstotliwościowa ciśnienia atmosferycznego),

3. Plazmę nietermiczną (np. wyładowanie elektryczne niezupełne, wyładowanie koronowe, wyładowanie w gazach rozrzedzonych, dielektryczne wyładowanie barierowe).

Szczególnie duże zastosowanie w technice ma plazma niskotemperaturowa i nietermiczna. Plazmy te wytwarza się za pomocą wyładowań elektrycznych, które przyjmują różne formy w zależności od geometrii elektrod i rodzaju zasilania. W technologiach plazmowych wykorzystuje się zarówno wyładowania niezupełne (nie zwierające elektrod reaktora plazmowego), jak i wyładowania zupełne, do których zaliczamy wyładowanie łukowe.

Do jednej z najpowszechniej stosowanych technik plazmowych należą wyładowania elektryczne wytwarzane w układach o znacznej asymetrii pola elektrycznego. Należą do nich wyładowania koronowe w układach ostrze-płyta i przewód-płyta, w symetrii płaskiej i cylindrycznej. Zalicza się tu także wyładowania w obecności dielektryków o wysokiej stałej dielektrycznej oraz wyładowania zachodzące po powierzchni dielektryków stałych, zwane wyładowaniami powierzchniowymi. W zależności od polaryzacji elektrod rozróżnia się wyładowania koronowe dodatnie i ujemne. W konfiguracji ostrze - płyta i dodatniej polaryzacji ostrza, wyładowanie rozpoczyna się pojedynczym impulsem, który w miarę wzrostu napięcia przekształca się w wyładowanie wstęgowe, jarzeniowe i w końcu iskrowe. Przy przeciwnej polaryzacji ostrza obserwuje się koronę ujemną w postaci impulsów Trichela, które wraz ze wzrostem napięcia, przekształcają się w drgania korony i wyładowanie iskrowe. Wyładowania koronowe stosowane są szeroko do oczyszczania gazów wylotowych, usuwaniu lotnych substancji organicznych, uzdatniania wody pitnej oraz modyfikacji warstwy wierzchniej tworzyw sztucznych.

Drugą, obok wyładowania koronowego, popularną technologią jest wyładowanie powstające przy wykorzystaniu napięcia zmiennego o wysokiej wartości i w obecności bariery dielektrycznej. Z tego powodu nazywane są dielektrycznym wyładowaniem barierowym (ang. dielectric barrier discharge - DBD). Typowe konfiguracje elektrod to układ płaski i cylindryczny, w których dielektryk (szkło, ceramika, lub warstwa polimeru/tworzywa sztucznego), jest umieszczony na elektrodzie wysokonapięciowej, rzadziej na obu elektrodach, bądź między nimi, tworząc jedną lub więcej szczelin (przerw) wyładowczych. Dielektryczne wyładowania barierowe wytwarzane są przy stosunkowo szerokim zakresie ciśnień, zwykle od 0,1 do 1,0 atmosfery, przy napięciu przemiennym sięgającym w niektórych zastosowaniach nawet 100 kV i częstotliwości od kilku herców do nawet kilku MHz. Długość szczeliny wyładowczej, może wynosić od ułamka milimetra do kilku milimetrów, w zależności od zastosowań. Odpowiednia geometria elektrod układu, rodzaj dielektryka, sposób zasilania w energię elektryczną oraz czas oddziaływania wyładowania na próbkę decydują o parametrach wytwarzanej plazmy oraz możliwościach i charakterze pracy układu [30,31].

Wyładowanie koronowe i dielektryczne wyładowanie barierowe są stosowane do modyfikacji powierzchni tworzyw sztucznych [32], włókien i materiałów poddawanych malowaniu, zgrzewaniu i czyszczeniu [33]. W literaturze przedmiotu, zarówno naukowej, branżowej, jak i dokumentach patentowych, brak jest wzmianek o stosowaniu w/w obróbek plazmowych w celu wytwarzania platform SERS.

Głównym celem niniejszego wynalazku było stworzenie nowej klasy podłoży (tzw. platform) wzmacniających sygnał SERS, które:

i) będą umożliwiały uzyskiwanie wysokich (tj. > 105) współczynników wzmocnienia sygnału Ramana, ii) będą uniwersalne, tj. będą umożliwiały pomiar próbek zarówno biologicznych (np. bakterie, grzyby, komórki nowotworowe), jak i niebiologicznych (tj. związki organiczne), iii) będą umożliwiały bezpośrednie osadzanie bakterii/komórek nowotworowych z cieczy, tj. osocza, krwi, moczu oraz wody, tak by nie istniała konieczność ich wyodrębniania z cieczy a następnie przenoszenia na podłoże SERS, iv) będą umożliwiały przykładanie potencjału elektrycznego, tak by można było osadzać bakterie/komórki nowotworowe przy pomocy efektu dielektroforetycznego (DEP) (zgłoszenie patentowe: „Sposób osadzania mikroorganizmów i/lub komórek nowotworowych na platformie SERS przy użyciu efektu dielektroforetycznego (DEP), sposób oznaczania mikroorganizmów i/lub komórek nowotworowych z wykorzystaniem takiej platformy, zastosowanie takiej platformy do bezpośredniej detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii i/lub komórek nowotworowych z użyciem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana”).

Podłoża uzyskane sposobem według niniejszego wynalazku mogą służyć jako podłoża do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, zwłaszcza dla bakterii/komórek nowotworowych.

Celem wynalazku było opracowanie sposobu wytwarzania platformy o wysokim współczynniku wzmocnienia, dużej powtarzalności, stabilności, łatwości obróbki, np. poprzez cięcie i wyginanie, która umożliwiałaby przykładanie potencjałów elektrycznych (osadzanie bakterii/komórek nowotworowych przy pomocy efektu DEP), a przez to zdolnej do pomiarów mikroorganizmów, a szczególnie bakterii, przy pomocy techniki SERS.

Mikroorganizmy po hodowli na pożywkach mikrobiologicznych z agarem zazwyczaj identyfikuje się przy pomocy testów biochemicznych (np. testy API) i metod genetycznych (np. łańcuchowa reakcja polimerazy). W celu skrócenia i ułatwiania identyfikacji mikroorganizmów, zaproponowano szybką i nieinwazyjną technikę SERS. Aby spełnić wszystkie w/w założenia, należało opracować innowacyjną platformę SeRS, która:

i) posiada duży współczynnik wzmocnienia sygnału ramanowskiego (EF > 10⁵), ii) jest stabilna w czasie, a przestrzenne pomiary wykonane przy jej pomocy są powtarzalne, iii) metoda wytworzenia nie wymaga drogiej aparatury, jest szybka i prosta, a przez to tania, iv) jest uniwersalna, łatwa do zastosowania dla różnych próbek, zarówno biologicznych, jak i niebiologicznych (związki organiczne, substancje aktywne w lekach, próbki środowiskowe etc.),

v) umożliwia łatwe osadzenie bakterii bezpośrednio z próbki analitycznej (krew, osocze, mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy) bez konieczności wyodrębniania i przenoszenia bakterii na w platformę osobnych krokach, oraz bez konieczności długotrwałego przygotowywania próbki, vi) umożliwia łatwe zastosowanie platformy jako elektrody, do której można przykładać potencjał elektryczny, vii) umożliwia łatwą obróbkę poprzez cięcie i wyginanie, co umożliwi kontrolę nad kształtem pola elektrycznego.

Cel ten został zrealizowany przez elastyczną platformę do pomiarów powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana według niniejszego wynalazku.

A zatem przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania platformy do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii i/lub komórek nowotworowych, z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, obejmującej podłoże stanowiące folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem i poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego, i pokrytą warstwą metalu aktywnego w technice powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, charakteryzujący się tym, że przygotowanie podłoża obejmuje etapy, w których:

i) folię z tworzywa sztucznego, które stanowi poli(etylenotereftalan), pokrywa się przewodzącym tlenkiem albo zapewnia się folię z tworzywa sztucznego, które stanowi poli(etylenotereftalan), pokrytą przewodzącym tlenkiem, przy czym przewodzący tlenek stanowi tlenek indowo-cynowy, przy czym folia z poli(etylenotereftalanu) ma grubość 125 μm, przy czym grubość tlenku przewodzącego wynosi 5 μm, ii) następnie otrzymaną folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem poddaje się działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego w zakresie napięć od 10 kV do 48 kV i częstotliwości pracy 4,5 ± 0,5 MHz, po czym nanosi się metodą osadzania z fazy gazowej warstwę metalu aktywnego o grubości od 5 nm do 150 nm, przy czym warstwę metalu aktywnego stanowi warstwa srebra.

iii)

Korzystnie, grubość warstwy metalu aktywnego dla pomiaru próbek niebiologicznych jest w zakresie od 5 nm do 150 nm, korzystniej w zakresie od 10 nm do 90 nm, a najkorzystniej w zakresie od 20 nm do 40 nm.

Korzystnie, grubość warstwy metalu aktywnego dla pomiaru próbek biologicznych jest w zakresie od 10 nm do 150 nm, korzystniej w zakresie od 30 nm do 100 nm, a najkorzystniej w zakresie od 50 nm do 80 nm.

Korzystnie, folię z tworzywa sztucznego pokrytą warstwą przewodzącego tlenku nieorganicznego, poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego pokrywa się jedynie warstwą srebra.

Korzystnie, folię z tworzywa sztucznego pokrytą warstwą przewodzącego tlenku nieorganicznego, poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego pokrywa się warstwą miedzi, którą następnie pokrywa się warstwą redukowanego złota pochodzącego roztworu zawierającego jony złota, który stanowi wodny roztwór HAuCl4.

Korzystnie, w etapie i) folię z tworzywa sztucznego pokrywa się przewodzącym tlenkiem, stosując technikę fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).

Korzystnie, w etapie i) folię z tworzywa sztucznego pokrywa się przewodzącym tlenkiem poprzez redukcję w procesie elektrochemicznym lub poprzez elektrodepozycję.

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonego rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia schemat procedury przygotowania próbek (elastycznych platform SERS), polegającej na ich wstępnym przygotowaniu (tj. wycięcie próbki, czyszczeniu w EtOH i w wodzie destylowanej oraz suszeniu), następnie na poddaniu obróbce przy pomocy dielektrycznego wyładowania barierowego, a w końcowym kroku na pokryciu cienką warstwą metalu przy pomocy techniki PVD,

Fig. 2 przedstawia schemat ideowy dielektrycznego wyładowania barierowego (a) oraz schemat zestawu wykorzystanego do modyfikacji folii PET/ITO (b),

Fig. 3 przedstawia zdjęcie zestawu eksperymentalnego do modyfikacji folii PET/ITO (a) oraz wyładowanie barierowe pomiędzy elektrodą wysokonapięciową oraz modyfikowaną folią PET/ITO (b),

Fig. 4 przedstawia zdjęcia wykonane Skaningowym Mikroskopem Elektronowym (SEM) próbki wyjściowej (folii PET/ITO), nie poddanej żadnej obróbce (a), folii PET/ITO po oddziaływaniu dielektrycznym wyładowaniem barierowym wg schematu z Fig. 2b (b), folii z Fig. 3b po napyleniu przy pomocy techniki PVD warstwy srebra o grubości 30 nm (c), oraz folii z Fig. 3b po napyleniu przy pomocy techniki PVD warstwy srebra o grubości 70 nm (d),

Fig. 5 przedstawia zdjęcie próbki wyjściowej (folii PET/ITO) wykonane przy pomocy Mikroskopii Sił Atomowych (AFM) (a), obraz 3D powierzchni ITO (b), oraz przebieg chropowatości powierzchni ITO (c),

Fig. 6 przedstawia intensywność widm p-MBA o stężeniu 10^-6 M uzyskanych dla platform SERS bazujących na folii PET/ITO z napyloną warstwą srebra w zakresie od 5 nm do 40 nm (a) Intensywność pasma 1075 cm^-1 w funkcji grubości warstwy srebra dla p-MBA o stężeniu 10^-6 M. Optymalna grubość, tj. taka, przy której uzyskane największe użyteczne wzmocnienie, to 30 nm (b),

Fig. 7 przedstawia intensywność widm p-MBA o stężeniu 10^-6 M uzyskana dla platform SERS bazujących na folii PET/ITO z zastosowanym dielektrycznym wyładowaniem barierowym; bez wyładowania barierowego oraz płytki szklanej pokrytej warstwą ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu,

Fig. 8 przedstawia intensywność widm bakterii Escherichia coli uzyskana dla platform SERS bazujących na folii PET/ITO z zastosowanym dielektrycznym wyładowaniem barierowym pokrytych przy pomocy techniki PVD warstwami srebra o grubości: 50 nm, 70 nm i 90 nm,

Fig. 9 przedstawia widma bakterii Escherichia coli uzyskane dla platform SERS bazujących na folii PET/ITO z zastosowanym dielektrycznym wyładowaniem barierowym pokrytym przy pomocy techniki PVD warstwą srebra o grubości 70 nm w różnych miejscach tej samej platformy (mapa) (a) oraz uśrednione widmo bakterii na podstawie widm uzyskanych na Fig. 9a (b),

Fig. 10 przedstawia widmo komórki nowotworowej HeLa, uzyskanej przy pomocy platformy SERS bazującej na folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu, a następnie pokrytej warstwą srebra o grubości 70 nm przy pomocy techniki PVD.

Korzystne przykłady realizacji wynalazku

Przykład 1 - Sposób przygotowania platformy SERS według wynalazku

Procedura przygotowania platformy SERS i pomiaru widma mikroorganizmów składała się z trzech etapów zilustrowanych na Fig. 1. Do uzyskania platformy SERS wykorzystano folię z poli(etylenotereftalanu) (PET) pokrytą warstwą tlenku indowo-cynowego (ang. indium-tin oxide, ITO).

Etapem pierwszym było wstępne przygotowanie próbki, na które składało się wycięcie próbki folii z poli(etylenotereftalanu) (PET) pokrytej warstwą tlenku indowo-cynowego o rozmiarach 30 mm x 30 mm z fragmentu o wymiarze 21 cm x 28 cm. Wyciętą próbkę poddawano czyszczeniu w zlewce wypełnionej etanolem (EtOH, czystość >99%) przez 3 minuty, a następnie przeniesiono do drugiej zlewki wypełnionej wodą destylowaną i czyszczono przez 3 minuty. Czyszczenie odbywało się w temperaturze pokojowej i polegało na delikatnym mieszaniu mechanicznym próbki w zlewce. Po wyjęciu ze zlewki przy pomocy pęsety, próbkę osuszano w delikatnym strumieniu azotu przez 1 minutę.

Drugim etapem było poddanie próbki dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu przez czas 90 sekund (proces przeprowadzono przy użyciu zestawu przedstawionego na Fig. 2 i Fig. 3). Proces ten rozwija powierzchnię właściwą kompozytu PET/ITO, co jest ukazane na Fig. 4a i Fig. 5 (obraz SEM oraz AFM wyjściowej próbki) oraz Fig. 4b (obraz SEM próbki po dielektrycznym wyładowaniu barierowym). W procesie modyfikacji użyto urządzenia firmy ETP, model BD-20AV pracującego w zakresie napięć od 10 kV do 48 kV i częstotliwości pracy 4,5 ± 0,5 MHz.

Trzecim etapem jest pokrycie próbki cienką warstwą srebra (typowe grubości to 30 nm i 70 nm, odpowiednio Fig. 4c i Fig. 4d), przy pomocy metody osadzania z fazy gazowej (ang. Physical Vapour Deposition - PVD). W procesie PVD zastosowano urządzenie firmy Quorum, model Q150T ES, które posiada zintegrowany układ pomiaru grubości warstwy pod postacią wagi kwarcowej. Napylarka wykorzystuje zjawisko osadzania jonów w polu magnetycznym (ang. magnetron sputtering). Platformę umieszczono w komorze roboczej, po czym zmniejszono ciśnienie do wartości 1 x 10^-2 mbar. Prąd zastosowany do napylania srebra wyniósł 25 mA. Po napyleniu warstwy srebra komorę wypełniono argonem, wyjęto próbki i umieszczono w szczelnych pojemnikach.

Przykład 2 - Platforma do badań próbek biologicznych i niebiologicznych

Platforma otrzymana sposobem według Przykładu 1 jest folią PET o grubości 125 μm z naniesioną warstwą tlenku indowo-cynowego o grubości 5 μm. Morfologię powierzchni wyjściowej próbki przedstawia obraz SEM (Fig. 4a) oraz AFM (Fig. 5). Morfologia warstwy wierzchniej jest jednorodna, z nierównościami (Ra) na poziomie 7,0±1,0 nm (nierówność próbki z Fig. 5a pokazana jest na Fig. 5c).

Dielektryczne wyładowanie barierowe powoduje rozwinięcie powierzchni właściwej próbki co ujawnia zdjęcie SEM (Fig. 4b). Widok platformy SERS, tj. folii PET/ITO poddanej wyładowaniu barierowemu, a następnie pokrytej srebrem jest pokazany na Fig. 4c i Fig. 4d. Powierzchnia pokryta srebrem (Fig. 4c i Fig. 4d) charakteryzuje się większą jednorodnością w porównaniu do powierzchni po dielektrycznym wyładowaniu barierowym (Fig. 4b).

W celu dobrania optymalnej grubości warstwy srebra (tj. dającej największe wzmocnienie), przeprowadzono pomiary, których wyniki przedstawione są na Fig. 6. Jako pasmo wzorcowe wybrano pasmo 1075 cm^-1 dla roztworu związku chemicznego p-MBA o stężeniu 10^-6 M (Fig. 6a). Intensywność w funkcji grubości warstwy srebra (Fig. 6b) wykazują, że największe wzmocnienie (894 100 zliczeń) występuje dla grubości warstwy srebra wynoszącej 30 nm. Wartość 30 nm została wybrana jako optymalna grubość warstwy srebra dla pomiarów p-MBA oraz innych próbek niebiologicznych.

Przykład 3 - walidacja procedury

W celu walidacji procedury opisanej w Przykładzie 1 porównano ze sobą trzy platformy SERS:

- folię PET/ITO poddaną dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i napyloną warstwą srebra o grubości 30 nm,

- folię PET/ITO nie poddaną dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i napyloną warstwą srebra o grubości 30 nm,

- płytkę szklaną o grubości 0,5 mm pokrytą warstwą ITO poddaną dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i napyloną warstwą srebra o grubości 30 nm.

Warunki eksperymentalne to: laser o długości fali 785 nm i mocy 5 mW, pomiar 2 x 2 sekundy. Każde widmo SERS zostało przedstawione po odcięciu tła i przesunięciu wykresu w celu lepszego przestawienia wyników. Wyniki pomiaru demonstruje Fig. 7. Dla folii PET/ITO bez dielektrycznego wyładowania barierowego nie uzyskano wzmocnienia sygnału ramanowskiego, natomiast dla płytki szklanej wzmocnienie sygnału ramanowskiego uzyskano nieznacznie ponad poziom szumów własnych detektora. Oznacza to, że w procedurze opisanej w Przykładzie 1 konieczne jest zastosowanie folii PET pokrytej warstwą ITO (brak wzmocnienia dla podłoża szklanego), oraz poddanie oddziaływaniu dielektrycznego wyładowania barierowego.

Przykład 4 - Pomiary SERS bakterii i komórek nowotworowych z wykorzystaniem platformy

Platformę wytworzoną w Przykładzie 1 i przedstawioną w Przykładzie 2 zastosowano do pomiarów SERS próbek biologicznych: bakterii Escherichia coli oraz komórki nowotworowej HeLa.

Przygotowano próbkę analitu do pomiaru w ramach kroku d): bakterie poddane hodowli na podłożu mikrobiologicznym z agarem (hodowlę prowadzono przez 24 godziny w cieplarce w temperaturze 37°C) zebrano ezą w ilości kilku kolonii, a następnie umieszczono w 100 μ! 0,9% roztworu NaCI, zwanego dalej solą fizjologiczną. Następnie dyspergowano bakterie przy pomocy wibracji mechanicznych - po poddaniu probówki działaniu worteksu, umieszczono ją w wirówce i poddano wirowaniu (4000 rpm, 5 minut). Po procesie wirowania zlano supernatant, a osad ponownie zawieszono w 100 μ! soli fizjologicznej. Proces powtórzono trzykrotnie. Po ostatnim wirowaniu i zlaniu supernatantu bakterie zawieszono w około 10 μ! soli fizjologicznej, w celu uzyskania gęstej zawiesiny bakterii, a następnie naniesiono niewielką ilość zawiesiny bezpośrednio na folię PET/ITO poddaną barierowemu wyładowaniu koronowemu i pokrytej srebrem (podłożu SERS). Opcjonalnie bakterie hodowano na podłożu mikrobiologicznym płynnym (hodowlę prowadzono przez 24 godziny w cieplarko-wytrząsarce, 140 rpm, w temperaturze 37°C), około 100-1000 μ! pożywki płynnej zawierającej bakterie (objętość zależy od stężenia bakterii w pożywce), umieszczono w probówce i poddano wirowaniu (4000 rpm, 5 minut). Następnie zlano pożywkę znad osadu, a osad zawieszono w 100 μ! soli fizjologicznej. Dalej postępowano tak jak w przypadku przygotowania próbek zawierających bakterie wyhodowane na pożywkach mikrobiologicznych z agarem.

Na przygotowaną platformę SERS naniesiono za pomocą pipety przygotowaną próbkę analitu w postaci kropel soli fizjologicznej z uzyskaną zawiesiną kolonii bakteryjnych, i następnie odparowano ciecz nośnika w temperaturze pokojowej.

Komórki nowotworowe HeLa przygotowano jako zawiesinę o stężeniu 11,51+105 komórek w 1 ml roztworu soli fizjologicznej (PBS). Na przygotowaną platformę SERS naniesiono za pomocą pipety przygotowaną próbkę analitu w postaci kropli soli fizjologicznej z zawiesiną komórek HeLa, po czym odparowano PBS w temperaturze pokojowej.

W celu przeprowadzenia pomiarów wykorzystano spektrometr ramanowski Renishaw In Via Raman wyposażony w diodę laserową o mocy 300 mW, o długości fali 785 nm. Analizę energii wiązki rozproszonej przeprowadzono w spektrometrze przy pomocy siatki dyfrakcyjnej, a intensywność dla poszczególnych energii rejestrowana była w czułym detektorze CCD typ RenCam o rozdzielczości 1024x256 px. Powiększenie obiektywu ogniskującego promień lasera na próbce wynosiło x50 (apertura 0,75). Przestrzenna zdolność rozdzielcza była większa niż 1 μm, spektralna zdolność rozdzielcza około 1 cm^-1.

W celu dobrania optymalnej grubości warstwy srebra (tj. dającej największe wzmocnienie dla próbek biologicznych) przeprowadzono pomiary, których wyniki przedstawione są na Fig. 8. Porównano ze sobą widma zarejestrowane dla bakterii Escherichia coli znajdujących na folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i pokrytej warstwą srebra: 50 nm, 70 nm oraz 90 nm. Najlepsze wzmocnienie zarejestrowano dla platformy pokrytej 70 nm warstwą srebra. Taką grubość wybrano do dalszych pomiarów próbek biologicznych: bakterii E. coli oraz komórek nowotworowych HeLa.

Zmierzono powtarzalność wyników w obrębie tej samej platformy, wyniki przedstawiono na Fig. 9a. Widma SERS bakterii Escherichia coli zarejestrowane są w trybie mapowania w 30 różnych miejscach na folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i pokrytej 70 nm warstwą srebra. Widma zostały zarejestrowane na obszarze 10 μm x 20 μm w krokach co 1,6 μm (pokazano 11 przykładowych widm). Każdy pomiar na mapie został zarejestrowany przy użyciu lasera o długości fali 785 nm z mocą 1,5 mW i czasem integracji pomiaru 2 sekundy. Wyniki świadczą o tym, że platforma charakteryzuje się wysoką powtarzalnością, tj. w różnych miejscach tej samej platformy wyniki są zgodne.

Uśrednione widmo bakterii E. coli (dokonane na podstawie widm przedstawionych na Fig. 9a) z przypisanymi pasmami przedstawiono na Fig. 9b.

Widmo komórki nowotworowej HeLa zarejestrowano na folii PET/ITO poddanej dielektrycznemu wyładowaniu barierowemu i pokrytej 70 nm warstwą srebra. Fig. 10 przedstawia widmo komórki HeLa z przypisanymi pasmami.

Literatura:

[1] M. Fleischmann, P. J. Hendra, and A. J. McQuillan, Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chem. Phys. Lett., vol. 26, no. 2, pp. 163-166, May 1974.

[2] M. F. Cardinal et al., Expanding applications of SERS through versatile nanomaterials engineering, Chem. Soc. Rev., vol. 46, no. 13, pp. 3886-3903, Jul. 2017.

[3] T. Dorfer, M. Schmitt, and J. Popp, Deep-UV surface-enhanced Raman scattering, J. Raman Spectrosc., vol. 38, no. 11, pp. 1379-1382, Nov. 2007.

[4] Haohao Lin, Jack Mock, David Smith, and Ting Gao, and Michael J. Sailor, Surface-Enhanced Raman Scattering from Silver-Plated Porous Silicon, 2004.

[5] H. Lu, H. Zhang, X. Yu, S. Zeng, K.-T. Yong, and H.-P. Ho, Seed-mediated Plasmon-driven Regrowth of Silver Nanodecahedrons (NDs), Plasmonics, vol. 7, no. 1, pp. 167-173, Mar. 2012.

[6] B. J. Kennedy, S. Spaeth, M. Dickey, and K. T. Carron, Determination of the Distance Dependence and Experimental Effects for Modified SERS Substrates Based on Self-Assembled Monolayers Formed Using Alkanethiols, J. Phys. Chem. B, vol. 103, no. 18, pp. 3640-3646, 2002.

[7] H. K. Lee et al., Designing surface-enhanced Raman scattering (SERS) platforms beyond hotspot engineering: emerging opportunities in analyte manipulations and hybrid materials, Chem. Soc. Rev., vol. 48, no. 3, pp. 731-756, Feb. 2019.

[8] Y. H. Ngo, D. Li, G. P. Simon, and G. Garnier, Gold nanoparticle-paper as a three-dimensional surface enhanced Raman scattering substrate., Langmuir, vol. 28, no. 23, pp. 8782-90, Jun. 2012.

[9] Y. H. Ngo, W. L. Then, W. Shen, and G. Garnier, Gold nanoparticles paper as a SERS biodiagnostic platform, J. Colloid Interface Sci., vol. 409, pp. 59-65, Nov. 2013.

[10] E. Witkowska, T. Szymborski, A. Kamińska, and J. Waluk, Polymer mat prepared via Forcespinning™ as a SERS platform for immobilization and detection of bacteria from blood plasma, Mater. Sci. Eng. C, vol. 71,2017.

[11] T. Szymborski, E. Witkowska, W. Adamkiewicz, J. Waluk, and A. Kamińska, Electrospun polymer mat as a SERS platform for the immobilization and detection of bacteria from fluids, Analyst, vol. 139, no. 20, pp. 5061-5064, Sep. 2014.

[12] J. P. Singh, H. Chu, J. Abell, R. A. Tripp, and Y. Zhao, Flexible and mechanical strain resistant large area SERS active substrates, Nanoscale, vol. 4, no. 11, p. 3410, 2012.

[13] G. Lu, H. Li, and H. Zhang, Nanoparticle-coated PDMS elastomers for enhancement of Raman scattering, Chem. Commun., vol. 47, no. 30, p. 8560, 2011.

[14] W.-Y. Wu, Z.-P. Bian, W. Wang, W. Wang, and J.-J. Zhu, PDMS gold nanoparticle composite film-based silver enhanced colorimetric detection of cardiac troponin I, Sensors Actuators B Chem., vol. 147, no. 1, pp. 298-303, May 2010.

[15] A. Alyami, A. J. Quinn, and D. lacopino, Flexible and transparent Surface Enhanced Raman Scattering (SERS)-Active Ag NPs/PDMS composites for in-situ detection of food contaminants, Talanta, vol. 201, pp. 58-64, Aug. 2019.

[16] Z. Li et al., Different number of silver nanoparticles layers for surface enhanced raman spectroscopy analysis, Sensors Actuators B Chem., vol. 255, pp. 374-383, Feb. 2018.

[17] M. Sun et al., A flexible conductive film prepared by the oriented stacking of Ag and Au/Ag alloy nanoplates and its chemically roughened surface for explosive SERS detection and cell adhesion, RSC Adv., vol. 7, no. 12, pp. 7073-7078, 2017.

[18] L. Tian, X. Li, W. Wang, Z. Ali, and Q. Zhang, Self-stripping of free-standing microparticle gel membranes driven by asymmetric swelling, J. Mater. Chem. C, vol. 5, no. 31, pp. 7830-7836, 2017.

[19] Y. Kalachyova, M. Erzina, P. Postnikov, V. Svorcik, and O. Lyutakov, Flexible SERS substrate for portable Raman analysis of biosamples, Appl. Surf. Sci., vol. 458, pp. 95-99, Nov. 2018.

[20] W. Wu et al., Low-Cost, Disposable, Flexible and Highly Reproducible Screen Printed SERS Substrates for the Detection of Various Chemicals, Sci. Rep., vol. 5, no. 1, p. 10208, Sep. 2015.

[21] C. Li et al., Constructing 3D and Flexible Plasmonic Structure for High-Performance SERS Application, Adv. Mater. Technol., vol. 3, no. 11, p. 1800174, Nov. 2018.

[22] Y. Wang et al., Flexible, transparent and highly sensitive SERS substrates with cross-nanoporous structures for fast on-site detection, Nanoscale, vol. 10, no. 32, pp. 15195-15204, 2018.

[23] S. Lu, T. You, Y. Gao, N. Yang, C. Zhang, and P. Yin, Rapid fabrication of threedimensional flower-like gold microstructures on flexible substrate for SERS applications, Spectrochim. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc., vol. 212, pp. 371-379, Apr. 2019.

[24] X. Liu, M. Huang, J. Chen, L. Kong, and K. Wang, Fabrication of a large-area, flexible micropyramid PET film SERS substrate and its application in the detection of dye in herbal tea, Laser Phys. Lett., vol. 15, no. 5, p. 055701, May 2018.

[25] W. W. Yu and I. M. White, A simple filter-based approach to surface enhanced Raman spectroscopy for trace chemical detection, Analyst, vol. 137, no. 5, p. 1168, Feb. 2012.

[26] A. Martin, J. J. Wang, and D. lacopino, Flexible SERS active substrates from ordered vertical Au nanorod arrays, RSC Adv., vol. 4, no. 38, p. 20038, Apr. 2014.

[27] G. V. Bianco, M. Losurdo, M. M. Giangregorio, P. Capezzuto, and G. Bruno, Direct Fabrication Route to Plastic-Supported Gold Nanoparticles for Flexible NIR-SERS, Plasmonics, vol. 8, no. 1, pp. 159-165, Mar. 2013.

[28] A. Reznickova, P. Slepicka, H. Y. Nguyenova, Z. Kolska, M. Dendisova, and V. Svorcik, Copper-gold sandwich structures on PE and PET and their SERS enhancement effect, RSC Adv., vol. 7, no. 37, pp. 23055-23064, 2017.

[29] Z. Zuo, K. Zhu, C. Gu, Y. Wen, G. Cui, and J. Qu, Transparent, flexible surface enhanced Raman scattering substrates based on Ag-coated structured PET (polyethylene terephthalate) for insitu detection, Appl. Surf. Sci., vol. 379, pp. 66-72, Aug. 2016.

[30] H. Stryczewska, Technologie plazmowe w energetyce i inżynierii środowiska. 2009.

[31] H. D. Stryczewska, Atmospheric Pressure Cold Plasmas. Generation, Modeling and Applications, Elektr. Zesz., vol. 1, no. 217, 2011.

[32] T. CZAPKA, Wpływ niskotemperaturowej plazmy na właściwości cienkich folii stosowanych do zabezpieczania ogniw fotowoltaicznych, Przegląd Elektrotechniczny, vol. 1, no. 10, pp. 218-222, 2018.

[33] M. Stepczyńska and M. Żenkiewicz, Praktyczne aspekty modyfikowania warstwy wierzchniej materiałów polimerowych metodą wyładowań koronowych, Przetwórstwo Tworzyw, vol. 1, pp. 7-11, 2009.

Claims (7)

1. Sposób przygotowania platformy do detekcji i/lub identyfikacji mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii i/lub komórek nowotworowych, z wykorzystaniem techniki powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, obejmującej podłoże stanowiące folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem i poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego, i pokrytą warstwą metalu aktywnego w technice powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana, znamienny tym, że przygotowanie podłoża obejmuje etapy, w których:

i) folię z tworzywa sztucznego, które stanowi poli(etylenotereftalan), pokrywa się przewodzącym tlenkiem albo zapewnia się folię z tworzywa sztucznego, które stanowi poli(etylenotereftalan), pokrytą przewodzącym tlenkiem, przy czym przewodzący tlenek stanowi tlenek indowo-cynowy, przy czym folia z poli(etylenotereftalanu) ma grubość 125 μm, przy czym grubość tlenku przewodzącego wynosi 5 μm, ii) następnie otrzymaną folię z tworzywa sztucznego pokrytą przewodzącym tlenkiem poddaje się działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego i/lub koronowego w zakresie napięć od 10 kV do 48 kV i częstotliwości pracy 4,5 ± 0,5 MHz, po czym iii) nanosi się metodą osadzania z fazy gazowej warstwę metalu aktywnego o grubości od 5 nm do 150 nm, przy czym warstwę metalu aktywnego stanowi warstwa srebra.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że grubość warstwy metalu dla pomiaru próbek niebiologicznych jest w zakresie od 5 nm do 150 nm, korzystniej w zakresie od 10 nm do 90 nm, a najkorzystniej w zakresie od 20 nm do 40 nm.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że grubość warstwy metalu aktywnego dla pomiaru próbek biologicznych jest w zakresie od 10 nm do 150 nm, korzystniej w zakresie od 30 nm do 100 nm, a najkorzystniej w zakresie od 50 nm do 80 nm.

4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że folię z tworzywa sztucznego pokrytą warstwą przewodzącego tlenku nieorganicznego, poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego pokrywa się jedynie warstwą srebra.

5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że folię z tworzywa sztucznego pokrytą warstwą przewodzącego tlenku nieorganicznego, poddaną działaniu dielektrycznego wyładowania barierowego pokrywa się warstwą miedzi, którą następnie pokrywa się warstwą redukowanego złota pochodzącego z roztworu zawierającego jony złota, który stanowi wodny roztwór HAuCk.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie i) folię z tworzywa sztucznego pokrywa się przewodzącym tlenkiem, stosując technikę fizycznego osadzania z fazy gazowej (PVD).

7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie i) folię z tworzywa sztucznego pokrywa się przewodzącym tlenkiem poprzez redukcję w procesie elektrochemicznym lub poprzez elektrodepozycję.