PL247544B1 - Implant cylindryczny modyfikowany poli(katecholaminą) - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest implant cylindryczny zawierający warstwy polimeru o różnej budowie charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej cztery warstwy polimeru o budowie włóknistej, w którym: pierwsza warstwa (1) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów, nie większym niż 10 µm, druga warstwa (2) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm i porowatości nie większej niż 1%, trzecia warstwa (3) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 µm, czwarta warstwa (4) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 µm, a jednocześnie pierwsza warstwa (1) polimeru i czwarta warstwa (4) polimeru pokryte są poli(katecholaminą).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest implant cylindryczny zawierający warstwy polimeru o różnej budowie, modyfikowany powierzchniowo poli(katecholaminą) do zastosowania jako implant zastępujący niedrożne naczynia krwionośne.

W patencie PL238765B1 ujawniono sposób wytwarzania protez naczyniowych małych średnic, charakteryzujących się dwuwarstwową budową o zróżnicowanej porowatości i właściwościach mechanicznych.

Zwężenie światła naczynia krwionośnego w wyniku odkładania blaszki miażdżycowej prowadzi do choroby niedokrwiennej serca, będącej główną przyczyną zgonów na całym świecie. Tętnice wieńcowe doprowadzające krew do serca mają średnice wewnętrzne w zakresie 2-6 mm i charakteryzują się zróżnicowaną, warstwową budową. Poszczególne warstwy tętnic tworzą komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, włókna kolagenu i elastyny¹.

Na rynku obecne są syntetyczne protezy naczyń krwionośnych wytworzone z poli(tereftalanu etylenu) (PET, Dacron®) oraz politetrafluoroetylenu (PTFE), jednakże jedynie 39% wszczepionych protez wykazuje drożność w ciągu 5 lat po implantacji². Odsetek ten maleje w przypadku protez o małych średnicach < 6 mm, gdzie głównymi problemami poimplantacyjnymi są silny odczyn zapalny oraz powstawanie skrzepów, a także brak integralności z otaczającymi tkankami.

Wieloletnie badania nad protezami naczyń krwionośnych o małych średnicach wykazały, że proteza naczynia krwionośnego, powinna być swoistym rusztowaniem dla komórek zasiedlających jej ściany, a jej właściwości, struktura i morfologia powinny być zbliżone do tych charakteryzujących naczynie natywne³.

Większość wytwarzanych protez naczyń krwionośnych małych średnic jest jedno- lub dwuwarstwowa. Znane są jednowarstwowe nanowłókniste protezy wytwarzane z polikaprolaktonu o dużej wytrzymałości mechanicznej i wysokiej porowatości⁴, a także hemozgodne poliuretanowe protezy o włóknach ukierunkowanych⁵. Wytwarzane są też protezy dwuwarstwowe z kwasu poli-L-mlekowego metodą rozdziału faz⁶, charakteryzujące się zróżnicowanymi właściwościami poszczególnych warstw.

Oprócz morfologii istotny wpływ na biozgodność protez naczyń krwionośnych ma struktura chemiczna protezy. Większość polimerowych materiałów, z których wytwarzane są protezy wykazuje właściwości biopasywne, ograniczające adhezję komórek do powierzchni protezy³.

W stanie techniki znane są sposoby modyfikacji powierzchni protez polegające na przyłączeniu krótkich sekwencji peptydowych, takich jak RGD, CAG, REDV^7,8, czynników wzrostu⁹, czy polidopaminy¹⁰ w celu poprawy ich właściwości biologicznych. Jednakże związki te często nie są selektywne dla komórek zasiedlających naczynie krwionośne¹¹, a przyłączanie ich następuje w wyniku wieloetapowych reakcji lub nie są efektywne w przypadku zapewnienia długoterminowej drożności protez¹².

Najczęściej stosowaną metodą wytwarzania protez naczyń krwionośnych o małych średnicach i strukturze włóknistej mającej naśladować strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej jest elektroprzędzenie¹³. Elektroprzędzenie jest dobrze poznaną metodą umożliwiającą wytwarzanie materiałów włóknistych¹⁴. W metodzie tej przędzenie włókien odbywa się w wyniku przyłożenia napięcia elektrycznego do dyszy którą podawany jest roztwór polimeru. Naładowany elektrycznie strumień polimeru poddawany jest procesowi rozciągania w polu elektrycznym, w wyniku czego powstają włókna polimerowe. Rodzaj siły napędowej w procesie elektroprzędzenia wyklucza tworzenie włókien z roztworów polimerów o niskiej przewodności elektrycznej¹⁵.

Inną metodą umożliwiającą produkcję włókien znaną ze stanu techniki jest również rozdmuch roztworu polimeru^16,17. Metoda ta charakteryzuje się większą wydajnością i bezpieczeństwem w porównaniu do elektroprzędzenia¹⁷. Siłą napędową tego procesu jest strumień gazu pod wysokim ciśnieniem, który wyciąga włókna polimerowe z dyszy i kieruje je na kolektor. Łatwość manipulacji parametrami procesu rozdmuchu roztworu polimeru umożliwia wytwarzanie włókien o zróżnicowanych właściwościach z szerokiej gamy polimerów¹⁸.

Istotnym problemem technicznym jest trudność w odwzorowaniu właściwości strukturalnych natywnych naczyń krwionośnych, tak by struktura powierzchni wewnętrznej protezy sprzyjała adhezji komórek śródbłonka, a jednocześnie proteza zachowywała pożądane właściwości mechaniczne. Materiał implantacyjny, który ma bezpośredni kontakt z krwią musi spełniać wiele wymogów, a ich jednoczesne spełnienie jest często trudne do osiągnięcia. Wymogi te to m.in.: porowatość umożliwiająca przepływ cząstek sygnałowych (m.in. cytokin) i wspierająca rozwój komórek, porowatość gradientowa, tzn. inne wielkości porów dla powierzchni wewnętrznej i zewnętrznej, właściwości mechaniczne (elastyczność, wytrzymałość na rozciąganie) zbliżone do właściwości zastępowanych tkanek (np. naczyń krwionośnych), powierzchnia selektywna względem wybranych typów komórek, tzn. sprzyjająca adhezji jednego typu przy jednoczesnym ograniczaniu adhezji drugiego typu komórek, brak aktywacji procesów zapalnych i wykrzepiania krwi.

Celem według wynalazku było opracowanie cylindrycznej struktury, która będzie spełniała wymogi dotyczące właściwości strukturalnych, mechanicznych oraz biologicznych stawiane protezom naczyń krwionośnych małych średnic w szczególności: odpowiednia średnica włókien warstwy wewnętrznej, elastyczność zbliżona do elastyczności naczyń ludzkich, pokrycie sprzyjające adhezji komórkowej.

Nieoczekiwanie, niniejszy wynalazek rozwiązuje wszystkie wyżej wymienione problemy techniczne.

Istotę wynalazku stanowi materiał implantacyjny, zawierający warstwy o różnej budowie charakteryzujący się tym, że zawiera co najmniej cztery warstwy włókniste. Pierwsza warstwa jest warstwą nanowłóknistą o średniej średnicy włókien nie większej niż 500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie większym niż 10 pm. Druga warstwa jest warstwą mikrowłóknistą niskoporowatą o średniej średnicy włókien nie większej niż 1500 nm i porowatości nie większej niż 1%. Trzecia warstwa jest warstwą mikrowłóknistą o włóknach nieukierunkowanych o średniej średnicy włókien nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 μm. Czwarta warstwa jest warstwą mikrowłóknistą o włóknach ukierunkowanych o średniej średnicy włókien nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 μm, a jednocześnie pierwsza warstwa i czwarta warstwa są powierzchniowo zmodyfikowane poli(katecholoaminą).

W przedmiocie wynalazku można wytwarzać materiały implantacyjne o grubości ścian od 100 do 1000 μm, a materiał implantacyjny zawsze zbudowany jest z 4 warstw. Warstwa wewnętrzna ma zawsze grubość 2-20 μm. Grubość pozostałych warstw zależy od całkowitej grubości ścianki jaką chcemy uzyskać. Jednakże grubości muszą spełniać odpowiednie założenia. Grubość warstwy drugiej - niskoporowatej mikrowłóknistej musi być taka, aby zapewnić szczelność materiału implantacyjnego. Zbyt mała grubość drugiej warstwy stwarza ryzyko przeciekania, natomiast grubości warstw mikroporowatych o włóknach nieukierunkowanych i ukierunkowanych (dwóch ostatnich) powinny być w stosunku od 2:1 do 2,5:1.

Korzystnie, polimerem z którego zbudowana jest proteza jest poliuretan o twardości 75A w skali Shore’a.

Korzystnie, proteza ma kształt cylindryczny o całkowitej grubości ściany od 100 do 1000 μm.

Korzystnie, średnica wewnętrzna protezy mieści się w przedziale od 1 mm do 7 mm.

Korzystnie, pierwsza warstwa i czwarta warstwa są powierzchniowo zmodyfikowane poli(katecholaminą), np. poli(noradrenaliną) lub poli(dopaminą).

Korzystnie, grubość warstwy poli(katecholaminy) jest nie większa niż 1 μm.

Istotę wynalazku stanowi również materiał implantacyjny jak określono powyżej do zastosowania jako proteza naczyniowa do bezpośredniego kontaktu z krwią.

Korzystnie, materiał implantacyjny jak określono powyżej jest przeznaczony do zastosowania jako implant zastępujący niedrożne naczynia krwionośne.

Nanowłóknista struktura powierzchni wewnętrznej materiału implantacyjnego sprzyja adhezji komórek śródbłonka i tworzeniu przez nie monowarstwy po wszczepieniu do organizmu. Bioaktywna powłoka z poli(katecholaminy) zwiększa efektywność tego procesu pozwalając na uniknięcie ryzyka niepowodzenia implantacji. Zewnętrzna, mikrowłóknista, wysokoporowata warstwa materiału umożliwia adhezję i wnikanie komórek mięśni gładkich do wnętrza struktury, co w konsekwencji prowadzi do odbudowy naczynia krwionośnego. Opracowany materiał pozwala na wytwarzanie rurowych struktur o szerokim zakresie średnic wewnętrznych i grubości ścian, dzięki czemu mogą one mieć zastosowanie przy leczeniu niedrożności naczyń krwionośnych o różnej średnicy.

Materiały implantacyjne, w szczególności materiały do bezpośredniego kontaktu z krwią, np.: protezy naczyniowe będące przedmiotem wynalazku, wytwarzane są metodą rozdmuchu roztworu polimeru i charakteryzują się włóknistą strukturą oraz budową warstwową. Każda z czterech warstw wytwarzana jest przy odpowiednio dobranych wartościach parametrów procesu rozdmuchu roztworu polimeru (tj.: stężenie roztworu polimeru, odległość dysza-kolektor, szybkość obrotowa kolektora, natężenie przepływu roztworu polimeru, ciśnienie gazu) oraz objętościach roztworów polimerów, co gwarantuje uzyskanie ich pożądanych właściwości strukturalnych tj. porowatość, rozmiar porów, średnica włókien, grubość poszczególnych warstw, grubość ściany, szczelność oraz mechanicznych.

Poszczególne warstwy nakładane są kolejno na cylindryczny kolektor. Warstwę wewnętrzną o porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie większym niż 10 μm tworzą nieukierunkowane nanowłókna o średnich średnicach nie większych niż 500 nm. Kolejna warstwa niskoporowata o porowatości nie większej niż 1 %, wytworzona jest z mikrowłókien o średnich średnicach nie większych niż 1500 nm. Następna warstwa mikrowłóknista o włóknach nieukierunkowanych wytworzona jest z losowo ułożonych włókien o średnich średnicach nie większych niż 1500 nm i charakteryzuje się średnim rozmiarem porów nie mniejszym niż 10 μm i porowatością co najmniej 50%. Zewnętrzna warstwa mikrowłóknista o porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 pm zbudowana jest z włókien ukierunkowanych (ułożonych równolegle) o średnich średnicach nie większych niż 1500 nm. Możliwe jest wytworzenie materiałów o średnicach wewnętrznych w zakresie 1-7 mm oraz grubościach ściany 100-1000 pm.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wielowarstwowość oraz różnorodność struktury poszczególnych warstw materiału implantacyjnego odwzorowują właściwości strukturalne natywnego naczynia krwionośnego. Nanowłóknista struktura powierzchni wewnętrznej materiału sprzyja adhezji komórek śródbłonka i tworzeniu przez nie monowarstwy. Niskoporowata warstwa włóknista zapewnia pożądane właściwości mechaniczne oraz szczelność. Zewnętrzna ukierunkowana warstwa mikrowłóknista wspomaga adhezję i proliferację komórek mięśni gładkich, które następnie dzięki porom o odpowiednim rozmiarze wnikają do środkowej warstwy o mikrowłóknach nieukierunkowanych. Warstwa ta odwzorowuje swoją strukturą macierz zewnątrzkomórkową, która w organizmie wypełnia przestrzeń między komórkami. Włókna ukierunkowane to włókna, które są ułożone w sposób równoległy względem siebie, włókna nieukierunkowane są ułożone przypadkowo we wszystkich kierunkach.

Poli(katecholaminy) regulują i wspomagają funkcje metaboliczne komórek śródbłonka, a także redukują adhezję i aktywację płytek krwi¹⁹. Obecność poli(katecholaminy) na powierzchni materiału, zwiększa adhezję oraz przyspiesza formowanie monowarstwy komórek śródbłonka na powierzchni wewnętrznej materiału, co istotnie redukuje ryzyko powstawania stanów zapalnych i skrzepów w organizmie po implantacji. Ponadto obecność poli(katecholaminy) na powierzchni zewnętrznej materiału sprzyja także adhezji i proliferacji komórek mięśni gładkich²⁰, które zasiedlają wnętrze naczynia krwionośnego. Ponadto obecność poli(katecholaminy) zwiększa hydrofilowość powierzchni materiału, co znacząco poprawia adhezję komórek.

Warstwowa struktura materiału implantacyjnego oraz bioaktywna powłoka z poli(katecholaminy) sprzyjają adhezji komórek śródbłonka oraz mięśni gładkich do powierzchni materiału oraz poprawie właściwości biologicznych i odbudowie naczynia krwionośnego. Materiał implantacyjny charakteryzuje się dużą elastycznością i wytrzymałością mechaniczną, zaś wykonany jest z polimeru miękkiego o twardości A w skali Shore’a. Polimerem takim jest polimer syntetyczny taki jak poliuretan, polilaktyd, polikaprolakton, najkorzystniej jednak poliuretan.

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania został zilustrowany na rysunku, na którym:

Fig. 1A przedstawia schemat warstwowego materiału implantacyjnego naczynia krwionośnego w przekroju poprzecznym;

Fig. 1B przedstawia morfologię przekroju poprzecznego materiału z widoczną warstwowością struktury, a także morfologie powierzchni wewnętrznej oraz powierzchni zewnętrznej;

Fig. 1C przedstawia szkielet materiału przed modyfikacją;

Fig. 1D przedstawia materiał implantacyjny, w szczególności materiał do bezpośredniego kontaktu z krwią, np.: protezę naczyniową wg wynalazku.

Wynalazek został bliżej przedstawiony w poniższych przykładach wykonania.

Ogólna budowa aparatury wykorzystywana w sposobie otrzymywania materiałów implantacyjnych wg wynalazku

We wszystkich przykładach wykonania wykorzystano aparaturę do rozdmuchu roztworu polimeru zawierającą układ dwóch koncentrycznych dysz - dyszę zewnętrzną oraz dyszę wewnętrzną. Dyszą wewnętrzną podawano roztwór polimeru, natomiast dyszą zewnętrzną - sprężony gaz. W przykładach wykonania jako gaz wykorzystywano powietrze. W alternatywnych przykładach wykonania mogą być stosowane jednakże również inne gazy takie jak azot, dwutlenek węgla lub argon, zapewniając uzyskanie analogicznego efektu. Ciśnienie gazu aparaturze regulowano za pomocą manometru w zakresie 0-0,2 MPa.

Jako kolektor, wykorzystywano cylindryczny kolektor o średnicy w zakresie 2-8 mm. Kolektor był wprawiany w ruch za pomocą silnika umożliwiającego ruch obrotowy kolektora w zakresie szybkości obrotowych 1 000-25 000 rpm, przy czym sam rodzaj silnika pozostaje bez znaczenia na uzyskiwany rezultat przedmiotu wynalazku.

Aparatura zawiera ponadto moduł liniowy umożliwiający ruch posuwisto-zwrotny kolektora względem układu dysz aparatury.

Roztwory polimeru podawano do dyszy wewnętrznej wykorzystując pompę strzykawkową zapewniającą natężenie przepływu w zakresie 0-30 ml/h.

Informacje ogólne dot. sposobu otrzymywania materiału implantacyjnego wg wynalazku

Odległość kolektora od układu dysz ma znaczący wpływ na porowatość otrzymywanych warstw oraz ilość defektów obecnych w strukturze materiału. Wraz ze wzrostem odległości kolektor-dysza wzrasta porowatość materiału i zmniejsza się ilość defektów.

Stężenie roztworu polimeru wpływa na średnicę otrzymywanych włókien oraz rozmiar porów w poszczególnych warstwach. Średnice włókien i rozmiary porów w warstwach w niniejszym wynalazku dobiera się tak, aby materiał implantacyjny spełniał wymagania komórek zasiedlających naczynie krwionośne.

Wszystkie warstwy materiału implantacyjnego wytwarzane są przy jednakowych wartościach natężenia przepływu roztworu polimeru, korzystnie 30 ml/h oraz ciśnienia sprężonego gazu, korzystnie powierza, 0,1 MPa.

Średnica wewnętrzna materiału implantacyjnego zależy od średnicy kolektora, przy czym średnica kolektora n+1, gdzie n to średnica materiału implantacyjnego. Możliwe jest wytworzenie materiałów o średnicach wewnętrznych w zakresie 1-7 mm.

Sposób ułożenia włókien na kolektorze zależy od szybkości obrotowej kolektora. Włókna wytwarzane przy wyższych szybkościach obrotowych kolektora są bardziej jednorodnie ułożone, ukierunkowane. Przy czym, zakres szybkości obrotowych przy których możliwe jest uzyskanie ukierunkowanych włókien zależy od rodzaju zastosowanego polimeru oraz mieszaniny polimeru i rozpuszczalnika. Ponadto ukierunkowanie włókien wpływa na zmniejszenie się rozmiaru porów w materiale.

W zależności od objętości roztworów, z których wytwarzane są poszczególne warstwy materiału implantacyjnego możliwe jest manipulowanie grubością poszczególnych warstw materiału, a co za tym idzie całkowitą grubością ściany. Możliwe jest wytwarzanie materiałów implantacyjnych o grubościach ściany w zakresie 100-1000 μm.

Grubość pierwszej warstwy 1, tj. warstwy wewnętrznej na którą nakładane są kolejne warstwy materiału implantacyjnego, niezależnie od grubości ścianki materiału mieści się w zakresie 2-10 μm. Grubości pozostałych warstw 2-4 zależą od całkowitej grubości ścianki materiału, przy czym grubość niskoporowatej warstwy mikrowłóknistej 2 musi zapewniać szczelność materiału, natomiast grubości warstw: mikrowłóknistej wysokoporowatej o włóknach nieukierunkowanych 3 i mikrowłóknistej wysokoporowatej o włóknach ukierunkowanych 4 powinny być w stosunku w zakresie od 2:1 do 2,5:1.

Rodzaj polimeru oraz rozpuszczalnika wpływają na właściwości mechaniczne materiału implantacyjnego. Ilość oraz rodzaj grup funkcyjnych polimeru wpływają na właściwości mechaniczne czystego polimeru, a następnie na właściwości mechaniczne materiałów włóknistych wytworzonych z roztworów polimerów. Dodatkowo w zależności od zastosowanego rozpuszczalnika właściwości mechaniczne materiałów wytworzonych z danego polimeru mogą się różnić. Łańcuchy polimerów rozprostowują się podczas rozpuszczania polimerów w rozpuszczalniku. Na możliwość rozpuszczenia polimerów, a także na stopień rozprostowania łańcuchów ma wpływ zastosowany rozpuszczalnik. Sposób ułożenia/stopień rozprostowania łańcuchów polimerów w roztworze może wpływać na właściwości mechaniczne materiałów włóknistych.

Aby zapobiec przyklejeniu się materiału implantacyjnego do kolektora, przed rozpoczęciem procesu wytwarzania, cylindryczny kolektor należy pokryć cienką warstwą roztworu glikolu polietylenowego w wodzie o stężeniu w zakresie 5-50%, korzystnie 10%, korzystnie glikol polietylenowy o masie cząsteczkowej 2000 Da i pozostawić do wyschnięcia.

W celu zdjęcia materiału implantacyjnego z kolektora, kolektor z materiałem należy umieścić w naczyniu z wodą destylowaną do momentu rozpuszczenia się glikolu polietylenowego pokrywającego kolektor, korzystnie jest to 1-3 minuty, co zapewnia swobodne zsunięcie materiału z kolektora. Następnie materiał należy umieścić pod wyciągiem w celu wysuszenia i odparowania resztek rozpuszczalnika, korzystnie 24 h.

Materiały implantacyjne wg wynalazku otrzymuje się w dwóch ogólnych etapach. Pierwszy etap dotyczy wytworzenia czterowarstwowej włóknistej struktury materiału, zaś w drugim etapie prowadzi się modyfikacje powierzchni materiału.

Charakterystykę otrzymanych materiałów oceniano na podstawie zdjęć wykonanych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego.

Ogólny przykład wykonania

W pierwszym etapie wykonania materiału implantacyjnego wg wynalazku wytwarza się czterowarstwową włóknistą strukturę. Aby wytworzyć warstwowy materiał implantacyjny należy przygotować roztwory polimeru w lotnym rozpuszczalniku, korzystnie poliuretanu w 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu, o stężeniach umożliwiających wytworzenie włókien o średnich średnicach 200 oraz 1 000 nm, korzystnie o stężeniach od 2% do 10%. Polimer oraz stężenie roztworu polimeru dobiera się w taki sposób, aby możliwe było uzyskanie włókien o średnich średnicach 200-1 000 nm w zakresie przędzalności roztworów polimerów. Dobór odpowiednich stężeń polimerów gwarantuje wytworzenie włókien o pożądanych średnicach. Polimer powinien być również w pełni rozpuszczalny w wybranym rozpuszczalniku.

W celu uzyskania homogenicznego roztworu polimeru, odpowiednie roztwory należy mieszać np. na mieszadle magnetycznym, korzystnie przez 24 h w temp. pokojowej, aż do całkowitego rozpuszczenia polimeru. Następnie, jeszcze przed rozpoczęciem nakładania włókien na kolektor, kolektor należy pokryć cienką warstwą 10% roztworu glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 2000 Da w wodzie, w celu umożliwienia swobodnego zdjęcia materiału z kolektora po zakończeniu procesu wytwarzania. W alternatywnych przykładach wykonania wykorzystywano roztwory glikolu polietylenowego w wodzie, w większych stężeniach, nawet do 50%. W kolejnych etapach prowadzi się nakładanie warstw polimeru.

Pierwsza warstwa (nanowłóknista) 1 wytwarzana jest z roztworu polimeru o niższym stężeniu, korzystnie 2%, przy odległości kolektora od dyszy wynoszącej minimum 40 cm, korzystnie 50 cm, przy niskiej szybkości obrotowej kolektora, gwarantującej otrzymanie włókien nieukierunkowanych, korzystnie przy szybkości obrotowej kolektora nie większej niż 5 000 rpm.

W kolejnym etapie, nakładana jest druga warstwa 2 o włóknach nieukierunkowanych, tj. na pierwszą warstwę 1, która jest już na kolektorze nakładana jest niskoporowata warstwa mikrowłóknistą 2, wytwarzana z roztworu polimeru o wyższym stężeniu, korzystnie 5%, przy odległości kolektora od dyszy wynoszącej 0-15 cm, korzystnie 10 cm, przy niskiej szybkości obrotowej kolektora, nie większej niż 5 000 rpm.

Warstwa trzecia 3, mikrowłóknista, o włóknach nieukierunkowanych, wytwarzana jest z roztworu polimeru o wyższym stężeniu, korzystnie 5%, przy odległości kolektora od dyszy wynoszącej minimum 20 cm, korzystnie 30 cm, przy niskiej szybkości obrotowej kolektora, nie większej niż 5 000 rpm.

Warstwa czwarta 4, zewnętrzna, mikrowłóknista, o włóknach ukierunkowanych, wytwarzana jest z roztworu polimeru o wyższym stężeniu, korzystnie 5%, przy odległości kolektora od dyszy wynoszącej minimum 20 cm, korzystnie 30 cm, przy wysokiej szybkości obrotowej kolektora, korzystnie >5 000 rpm.

Efektem pierwszego etapu jest otrzymanie warstwowego materiału implantacyjnego. Morfologia poszczególnych warstw sprzyja przyłączaniu się komórek zasiedlających naczynie krwionośne (śródbłonka i mięśni gładkich) do powierzchni wewnętrznej i zewnętrznej materiału, a także umożliwia wnikanie komórek mięśni gładkich do wnętrza struktury.

Po wytworzeniu czterowarstwowej struktury przystępuje się następnie do drugiego etapu jej wytwarzania polegającego na modyfikacji jej powierzchni.

Modyfikacja powierzchni materiałów implantacyjnych - informacje ogólne

Aby przeprowadzić modyfikację powierzchni materiałów implantacyjnych niezbędne są: roztwór 0,01 M buforu Tris-HCI o pH 8,5, otwarte naczynie reakcyjne z dostępem do tlenu atmosferycznego, rozpuszczalna w wodzie sól katecholaminy, mieszadło magnetyczne wraz z elementami mieszającymi lub alternatywne typy mieszadeł umożliwiające uzyskanie homogenicznego roztworu.

Rurowe materiały implantacyjne, należy umieścić w naczyniu reakcyjnym i zabezpieczyć przed wypłynięciem, aby zapewnić jednorodną modyfikacje powierzchni materiałów, gdyż powinny być one całkowicie zanurzone w roztworze reakcyjnym i nie powinny dotykać ścian naczynia reakcyjnego. Naczynie reakcyjne należy umieścić na mieszadle magnetycznym. Należy przygotować roztwór soli katecholaminy w 0,01 M buforze Tris-HCI o pH 5-10, korzystnie 8,5 o stężeniu 1-10 mg soli katecholaminy/ml buforu, korzystnie 2 mg/ml. Roztwór ten sporządza się dodając odpowiednią ilość soli katecholaminy do buforu, a następnie, należy dokładnie wymieszać do rozpuszczenia się soli katecholaminy, korzystnie 5-10 sekund, a następnie niezwłocznie przenieść roztwór do naczynia reakcyjnego. Reakcję należy prowadzić w warunkach standardowych z dostępem do tlenu atmosferycznego przez 1-48 h z ciągłym mieszaniem, korzystnie 24 h. Po zakończeniu reakcji, materiały należy dokładnie wypłukać poprzez umieszczenie w naczyniu z 0,01 M buforem Tris-HCI o pH 8,5 lub wodą w warunkach standardowych na 24 h, następnie materiały należy przepłukać trzykrotnie, korzystnie 3x5 min w ultraczystej wodzie, a następnie wysuszyć na powietrzu, np. umieszczając je pod wyciągiem na 24 h.

PL 247544 Β1

Podczas modyfikacji materiały implantacyjne zanurzone są w roztworze reakcyjnym, przez co związek modyfikujący przyłącza się do powierzchni wewnętrznej i zewnętrznej materiałów, czyli pierwszej warstwy (nanowłókna) i czwartej warstwy (mikrowłókna ukierunkowane). Efektem drugiego etapu jest otrzymanie warstwowego materiału implantacyjnego z poli(katecholaminą) pokrywającą jego powierzchnie, tj. pierwszą warstwę 1 oraz czwartą warstwę 4. Grubość warstwy poli(katecholaminy) wynosi < 1 pm. Obecność poli(katecholaminy) sprzyja adhezji i proliferacji komórek zasiedlających naczynie krwionośne (śródbłonka i mięśni gładkich) oraz hamuje adhezję i aktywację płytek krwi.

Sposób wg wynalazku umożliwia łatwą modyfikację średnicy wewnętrznej otrzymywanej struktury oraz grubości materiału implantacyjnego poprzez zmianę średnicy kolektora i objętości roztworów polimerów. Struktury uzyskanych warstw spełniają wymagania poszczególnych typów komórek zasiedlających naczynie krwionośne, a obecność bioaktywnej powłoki selektywnej sprzyja komórkom tworzącym naczynia krwionośne.

Przykład 1 Przykład wykonania warstwowego materiału implantacyjnego, w szczególności materiału do bezpośredniego kontaktu z krwią, np.: protezy naczyniowej, o średnicy 5 mm i grubości ściany ok. 300 pm, modyfikowanej powierzchniowo poli(noradrenaliną).

Do wykonania materiału implantacyjnego wg przykładu postępowano zgodnie z ogólnym przykładem wykonania opisanym powyżej. W przykładzie wykonania wykorzystano poliuretan typu ChronoFlex®C 75A, jako rozpuszczalnik 1,1,1,3,3,3-heksafluoropropan-2-ol (HFIP), zaś stężenia roztworów polimeru wynosiły 2% i 5% w/w. Do sporządzenia materiału implantacyjnego o średnicy 5 mm wykorzystano cylindryczny kolektor o średnicy 6 mm. Kolejne warstwy włókien nakładano na kolektor jedna po drugiej przy zastosowaniu następujących parametrów procesu:

Warstwa	Stężenie PU [%]	Objętość roztworu [ml]	Odległość dyszako lektor [cm]	Szybkość obrotowa kolektora [rpm]	Natężenie przepływu roztworu polimeru [ml/h]	Ciśnienie sprężonego powietrza [MPa]
1, Nanowłóknista	2	2	50	3000	30	01
2, Niskoporowata mikrowłóknista	5	3,5	10	3000
3, Mikrowłóknista nieukierunkowana	5	7	30	3000
4, Mikrowłóknista ukierunkowana	5	3	30	20000

Modyfikacji powierzchni materiału implantacyjnego dokonano wg ogólnej procedury modyfikacji powierzchni materiałów implantacyjnych opisanej powyżej. W przykładzie wykonania, do modyfikacji powierzchni materiału implantacyjnego wykorzystano roztwór o stężeniu 2 mg chlorowodorku noradrenaliny/ml buforu, który stanowił 0,01 M Tris-HCI o pH 8,5.

W przedmiocie wykonania uzyskano materiał implantacyjny o następującej charakterystyce:

Morfologia: włóknista, warstwowa

Całkowita grubość ściany (warstwy 1-4, wraz z zewnętrzną i wewnętrzną powłoką poli(noradrenaliny): 310 pm

Średnica wewnętrzna protezy: 5 mm

Grubość warstwy poli(noradrenaliny): < 1 pm

Właściwości włókien w poszczególnych warstwach:

Warstwa	Średnia średnica włókien [nm]	Ukierunkowanie włókien
1, Nanowłóknista	260	Nie
2, Niskoporowata mikrowłóknista	390	Nie
3 Mikrowłóknista nieukierunkowana	990	Nie
4, Mikrowłóknista ukierunkowana	990	Tak

PL 247544 Β1

Przykład 2 Przykład wykonania warstwowego materiału implantacyjnego, w szczególności materiału do bezpośredniego kontaktu z krwią, np.: protezy naczyniowej, o średnicy 6 mm i grubości ściany ok. 800 pm, modyfikowanej powierzchniowo poli(dopaminą).

Do wykonania materiału implantacyjnego wg przykładu postępowano zgodnie z ogólnym przykładem wykonania opisanym powyżej. W przykładzie wykonania wykorzystano poliuretan typu ChronoFlex®C 75A, jako rozpuszczalnik 1,1,1,3,3,3-heksafluoropropan-2-ol (HFIP), zaś stężenia roztworów polimeru wynosiły 2% i 5% w/w. Do sporządzenia materiału implantacyjnego o średnicy 6 mm wykorzystano cylindryczny kolektor o średnicy 7 mm. Kolejne warstwy włókien nakładano na kolektor jedna po drugiej przy zastosowaniu następujących parametrów procesu:

Warstwa	Stężenie PU [%]	Objętość roztworu [ml]	Odległość dyszakolektor [cm]	Szybkość obrotowa kolektora [rpm]	Natężenie przepływu roztworu polimeru [ml/h]	Ciśnienie sprężonego powietrza [MPa]
1, Nanowłóknista	2	3	50	3000	30	0,1
2, Niskoporowata mikrowłóknista	5	6	10	3000
3, Mikrowłóknista nieu kierunkowana	5	10	30	3000
4, Mikrowłóknista ukierunkowana	5	4	30	20000

Modyfikacji powierzchni materiału implantacyjnego w przykładzie wykonania, dokonano wg ogólnej procedury modyfikacji powierzchni materiałów im plantacyjnych opisanej powyżej. W przykładzie wykonania, do modyfikacji powierzchni materiału implantacyjnego wykorzystano roztwór o stężeniu 2 mg chlorowodorku dopaminy/ml buforu, który stanowił 0,01 M Tris-HCI o pH 8,5.

W przedmiocie wykonania uzyskano materiał implantacyjny o następującej charakterystyce:

Morfologia: włóknista, warstwowa

Całkowita grubość ściany: 850 pm

Średnica wewnętrzna materiału implantacyjnego: 6 mm

Grubość warstwy poli(dopaminy): < 1 pm

Właściwości włókien w poszczególnych warstwach:

Warstwa	Średnia średnica włókien [nm]	Ukierunkowanie włókien
1, Nanowłóknista	260	Nie
2, Niskoporowata mikrowłóknista	990	Nie
3, Mikrowłóknista nieukierunkowana	990	Nie
4, Mikrowłóknista ukierunkowana	990	Tak

Cytowana literatura:

(1) Chen, H.; Kassab, G. S. Microstructure-Based Biomechanics of Coronary Arteries in Health and Disease. J. Biomech. 2016, 49 (12), 2548.

https://doi.org/10.1016/JJBIOMECH.2016.03.023.

(2) Klinkert, P.; Post, P. N.; Breslau, P. J.; van Bockel, J. H. Saphenous Vein versus PTFE for Above-Knee Femoropopliteal Bypass. A Review of the Literature. Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 2004, 27 (4), 357-362.

https://doi.org/10.1016/j.ejvs.2003.12.027.

(3) Mallis, P.; Kostakis, A.; Stavropoulos-Giokas, C.; Michalopoulos, E. Future Perspectives in Small-Diameter Vascular Graft Engineering. Bioengineering 2020, 7(4).

https://doi.org/10.3390/bioengineering7040160.

(4) Pimenta, F. A.; Carbonari, R. C.; Malmonge, S. M. Nanofibrous Tubular Scaffolds for Tissue Engineering of Small-Diameter Vascular Grafts - Development Using SBS Fabrication Technique and Mechanical Performance. Res. Biomed. Eng. 2022, 38 (3), 797-811. https://doi.org/10.1007/S42600-022-00219-X/FIGURES/8.

(5) Liu, R.; Qin, Y.; Wang, H.; Zhao, Y.; Hu, Z.; Wang, S. The in Vivo Blood Compatibility of Bio-Inspired Small Diameter Vascular Graft: Effect of Submicron Longitudinally Aligned Topography. BMC Cardiovasc. Disord. 2013, 13 (1), 1-7.

https://doi.org/10.1186/1471-2261-13-79/FIGURES/4.

(6) Wang, W.; Nie, W.; Zhou, X.; Feng, W.; Chen, L.; Zhang, Q.; You, Z.; Shi, Q.; Peng, C.; He, C. Fabrication of Heterogeneous Porous Bilayered Nanofibrous Vascular Grafts by TwoStep Phase Separation Technique. Acta Biomater. 2018, 79, 168-181.

https://doi.org/10.1016/j.actbio.2018.08.014.

(7) Liu, Y.; Mahara, A.; Kambe, Y.; Hsu, Y. I.; Yamaoka, T. Endothelial Cell Adhesion and Blood Response to Hemocompatible Peptide 1 (HCP-1), REDV, and RGD Peptide Sequences with Free N-Terminal Amino Groups Immobilized on a Biomedical Expanded Polytetrafluorethylene Surface. Biomater. Sci. 2021, 9 (3), 1034-1043.

https://doi.org/10.1039/D0BM01396J.

(8) Mahara, A.; Li, M.; Ohya, Y.; Yamaoka, T. Small-Diameter Synthetic Vascular Graft Immobilized with the REDV Peptide Reduces Early-Stage Fibrin Clot Deposition and Results in Graft Patency in Rats. Biomacromolecules 2020, 21 (8), 3092-3101.

https://doi.org/10.1021/ACS.BIOMAC.0C00457/SUPPL_FILE/BM0C00457_SI_001.PDF.

(9) Antonova, L. V.; Mironov, A. V.; Yuzhalin, A. E.; Krivkina, E. O.; Shabaev, A. R.; Rezvova, M. A.; Tkachenko, V. O.; Khanova, M. Y.; Sergeeva, T. Y.; Krutitskiy, S. S.; Barbarash, L. S. A Brief Report on an Implantation of Small-Caliber Biodegradable Vascular Grafts in a Carotid Artery of the Sheep. Pharm. 2020, Vol. 13, Page 101 2020, 13 (5), 101.

https://doi.org/10.3390/PH13050101.

(10) Fu, J.; Zhu, Q.; Chen, Z.; Zhao, J.; Wu, S.; Zhao, M.; Xu, S.; Lai, D.; Fu, G.; Zhang, W. Polydopamine (PDA) Coatings with Endothelial Vascular Growth Factor (VEGF) Immobilization Inhibiting Neointimal Formation Post Zinc (Zn) Wire Implantation in Rat Aortas. Biomater. Res. 2023, 27 (1), 1-17.

https://doi.org/10.1186/S40824-023-00423-5/FIGURES/10.

(11) Madhurakkat Perikamana, S. K.; Lee, J.; Lee, Y. Bin; Shin, Y. M.; Lee, E. J.; Mikos, A. G.; Shin, H. Materials from Mussel-Inspired Chemistry for Cell and Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules 2015, 16 (9), 2541-2555.

https://doi.org/10.1021/ACS.BIOMAC.5B00852/ASSET/IMAGES/MEDIUM/BM-2015-00852B_0006.GIF.

(12) Li, M. X.; Wei, Q. Q.; Mo, H. L.; Ren, Y.; Zhang, W.; Lu, H. J.; Joung, Y. K. Challenges and Advances in Materials and Fabrication Technologies of Small-Diameter Vascular Grafts. Biomater. Res. 2023, 27 (1), 1-22. https://doi.org/10.1186/S40824-023-00399-2/FIGURES/9.

(13) Leal, B. B. J.; Wakabayashi, N.; Oyama, K.; Kamiya, H.; Braghirolli, D. I.; Pranke, P. Vascular Tissue Engineering: Polymers and Methodologies for Small Caliber Vascular Grafts. Front. Cardiovasc. Med. 2021, 0, 376. https://doi.org/10.3389/FCVM.2020.592361.

(14) Ji, D.; Lin, Y.; Guo, X.; Ramasubramanian, B.; Wang, R.; Radacsi, N.; Jose, R.; Qin, X.; Ramakrishna, S. Electrospinning of Nanofibres. Nat. Rev. Methods Prim. 2024 41 2024, 4 (1), 1-21. https://doi.org/10.1038/s43586-023-00278-z.

(15) Al-Abduljabbar, A.; Farooq, I. Electrospun Polymer Nanofibers: Processing, Properties, and Applications. Polym. 2023, Vol. 15, Page 65 2022, 15 (1), 65. https://doi.org/10.3390/POLYM15010065.

(16) Khan, K. R.; Hassan, M. N. Solution Blow Spinning (SBS): A Promising Spinning System for Submicron / Nanofi Bre Production. Text. Leather Rev. 2021, 4 (3), 181-200. https://doi.org/https://doi.org/10.31881/TLR.2021.04.

(17) Gao, Y.; Zhang, J.; Su, Y.; Wang, H.; Wang, X. X.; Huang, L. P.; Yu, M.; Ramakrishna, S.; Long, Y. Z. Recent Progress and Challenges in Solution Blow Spinning. Mater. Horizons 2021, 8 (2), 426-446. https://doi.org/10.1039/d0mh01096k.

(18) Carriles, J.; Nguewa, P.; Gonzalez-Gaitano, G. Advances in Biomedical Applications of Solution Blow Spinning. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24 (19). https://doi.org/10.3390/ijms241914757.

(19) Tan, X.; Gao, P.; Li, Y.; Qi, P.; Liu, J.; Shen, R.; Wang, L.; Huang, N.; Xiong, K.; Tian, W.; Tu, Q. Poly-Dopamine, Poly-Levodopa, and Poly-Norepinephrine Coatings: Comparison of Physico-Chemical and Biological Properties with Focus on the Application for Blood-Contacting Devices. Bioact. Mater. 2021, 6(1), 285-296. https://doi.org/10.1016/J.BIOACTMAT.2020.06.024.

(20) Ye, C.; Zheng, F.; Xu, T.; Wu, N.; Tong, Y.; Xiong, X. Q.; Zhou, Y. B.; Wang, J. J.; Chen, Q.; Li, Y. H.; Zhu, G. Q.; Han, Y. Norepinephrine Acting on Adventitial Fibroblasts Stimulates Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation via Promoting Small Extracellular Vesicle Release. Theranostics 2022, 12 (10), 4718. https://doi.org/10.7150/THNO.70974’

Lista oznaczeń odsyłających:

- pierwsza warstwa, warstwa nanowłóknista

- druga warstwa, niskoporowata warstwa mikrowłóknista

- trzecia warstwa, warstwa mikrowłóknista nieukierunkowana

- czwarta warstwa, warstwa mikrowłóknista ukierunkowana

- pokrycie z poli(katecholaminy)

- przekrój materiału implantacyjnego wg wynalazku

- morfologia powierzchni wewnętrznej materiału implantacyjnego wg wynalazku

- morfologia powierzchni zewnętrznej materiału implantacyjnego wg wynalazku

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Implant cylindryczny zawierający warstwy polimeru o różnej budowie znamienny tym, że zawiera co najmniej cztery warstwy polimeru o budowie włóknistej, w którym:

   pierwsza warstwa (1) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie większym niż 10 μm, druga warstwa (2) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm i porowatości nie większej niż 1%, trzecia warstwa (3) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 μm, czwarta warstwa (4) polimeru zbudowana jest z włókien polimerowych o średniej średnicy włókien polimerowych nie większej niż 1500 nm, porowatości co najmniej 50% i średnim rozmiarze porów nie mniejszym niż 10 μm, a jednocześnie pierwsza warstwa (1) polimeru i czwarta warstwa (4) polimeru pokryte są poli(katecholaminą).
2. 2. Implant według zastrz. 1 znamienny tym, że włókna polimerowe są włóknami poliuretanowymi, polilaktydowymi lub z polikaprolaktonu.
3. 3. Implant według zastrz. 2 znamienny tym, że włókna poliuretanowe są wykonane z poliuretanu o twardości 75A w skali Shore’a.
4. 4. Implant według dowolnego z zastrz. od 1 do 3 znamienny tym, że całkowita grubość ściany wynosi od 100 do 1000 μm.
5. 5. Implant według zastrz. 4 znamienny tym, że jego średnica wewnętrzna mieści się w przedziale od 1 mm do 7 mm.
6. 6. Implant według dowolnego z zastrz. od 1 do 5 znamienny tym, że poli(katecholaminę) stanowi związek wybrany z grupy obejmującej poli(noradrenalinę) lub poli(dopaminę).
7. 7. Implant wg zastrz. 1 albo 6 znamienny tym, że grubość warstwy poli(katecholaminy) jest nie większa niż 1 μm.
8. 8. Implant jak określono w zastrz. od 1 do 7, do zastosowania jako proteza naczyniowa do bezpośredniego kontaktu z krwią.
9. 9. Implant jak określono w zastrz. od 1 do 8, do zastosowania jako implant zastępujący niedrożne naczynia krwionośne.