PL247235B1 - Acyloglicerol zawierający resztę stigmasterolu oraz sposób otrzymywania acyloglicerolu - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy acyloglicerolu zawierającego identyczne reszty kwasu tłuszczowego w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz przyłączoną poprzez linker węglanowy resztę stigmasterolu w pozycji sn-3, o wzorze 1. Zgłoszenie obejmuje również sposób otrzymywania acyloglicerolu zawierającego identyczne reszty kwasu tłuszczowego w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz przyłączoną poprzez linker węglanowy resztę stigmasterolu w pozycji sn-3, który to sposób polega na tym, że z komercyjnie dostępnego lub otrzymanego znanymi metodami (S)-solketalu w sekwencjach trzech następujących kolejno reakcji: estryfikacji chloromrówczanem stigmasterylu, hydrolizie pierścienia acetalowego i estryfikacji uwolnionych grup hydroksylowych kwasem tłuszczowym otrzymuje się acyloglicerol o wzorze 1, który oczyszcza się metodami chromatograficznymi.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest acyloglicerol zawierający resztę stigmasterolu w pozycji sn-3.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania acyloglicerolu zawierającego resztę stigmasterolu w pozycji sn-3.

Acyloglicerole zawierające resztę stigmasterolu w pozycji sn-3 mogą stanowić składnik nowych formulacji liposomowych o potencjalnym prozdrowotnym zastosowaniu jako funkcjonalne dodatki do żywności lub nutraceutyki. Acyloglicerole ze względu na naturalną obecność w organizmie ludzkim stanowią również doskonałą bazę do wykorzystania ich jako efektywny lipidowy system dostarczania leków, w tym przypadku dodatkowo wzbogacony o stigmasterol.

Należący do fitosteroli stigmasterol znany jest ze swej aktywności antyhipercholesterolemicznej, przeciwzapalnej, przeciwmiażdżycowej, antyoksydacyjnej (Salehi B., Quispe C., Sharifi-Rad J., Cruz-Martins N., Nigam M., Mishra A.P., Alexeevich Konovalov D., Orobinskaya V., Abu-Reidah I.M., Zam W., Sharopov F., Venneri T., Capasso R., Kukula-Koch W., Wawruszak A., Koch W. Phytosterols: from clinical previdence to potential clinical applications, Frontiers in Pharmacology, 2021, 11, nr 599959). Znane są także pochodne stigmasterolu w postaci estrów z kwasami tłuszczowymi o aktywności antyhipercholesterolomicznej (Moreau R.A., Nystromb L., Whitaker B.D., Winkler-Moser J.K., Baer D.J., Gebauer S.K., Hicks K.B. Phytosterols and their derivatives: Structural diversity, distribution, metabolism, analysis, and health-promoting uses, Progress in Lipid Research, 2018, 70, 35-61). Uzyskano również pochodną glicerofosfocholiny, w której reszty stigmasterolu są przyłączone poprzez linker bursztynowy jednocześnie w pozycjach sn-1 i sn-2. Utworzone z udziałem tego koniugatu liposomy wykorzystano jako nośniki biologicznie aktywnych związków: doksorubicyny i amfoterycyny B. (Huang Z., Jaafari M.R., Szoka Jr F.C. Disterolphospholipids: nonexchangeable lipids and their application to liposomal drug delivery, Angewandte Chemie International Edition, 2009, 48, 4146-4149; Iman M., Huang Z., Szoka Jr F.C., Jaafari M.R. Characterization of the colloidal properties, in vitro antifungal activity, antileishmanial activity and toxicity in mice of a distigmasterylhemisuccinoyl-glycero-phosphocholine liposome-intercalated amphotericin B, International Journal of Pharmaceutics, 2011, 408, 163-172).

Znane są także asymetryczne acyloglicerole z przyłączonymi resztami stigmasterolu poprzez linker bursztynowy lub węglanowy jednocześnie w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz w pozycjach sn-2 i sn-3 (Rudzińska M., Grudniewska A., Chojnacka A., Gładkowski W., Maciejewska G., Olejnik A., Kowalska K. Distigmasterol-modified acylglycerols as new structured lipids-synthesis, identification and cytotoxicity, Molecules, 2021, 26, 6837).

Istotą wynalazku jest acyloglicerol zawierający identyczne reszty kwasów tłuszczowych w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz resztę stigmasterolu przyłączoną w pozycji sn-3 poprzez linker węglanowy.

Wynalazek dotyczy także sposobu otrzymywania acyloglicerolu zawierającego identyczne reszty kwasów tłuszczowych w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz resztę stigmasterolu przyłączoną w pozycji sn-3 poprzez linker węglanowy. Istota wynalazku polega na tym, że z komercyjnie dostępnego lub otrzymanego znanymi metodami literaturowymi (S)-solketalu w sekwencjach trzech następujących kolejno reakcji prowadzonych w bezwodnych rozpuszczalnikach: estryfikacji grupy hydroksylowej (S)-solketalu chlorom rówczanem stigmasterylu w obecności pirydyny albo pochodnej pirydyny, w następnej kolejności hydrolizie połączenia acetalowego, w obecności katalizatora i następnie estryfikacji uwolnionych grup hydroksylowych kwasem tłuszczowym, w obecności czynnika sprzęgającego charakterystycznego dla reakcji estryfikacji oraz pirydyny albo pochodnej pirydyny. W wyniku tych przejść chemicznych otrzymuje się acyloglicerol, który oczyszcza się metodami chromatograficznymi.

Korzystnie jest, gdy reakcje estryfikacji prowadzi się w bezwodnym chloroformie, w obecności dimetyloaminopirydyny.

Korzystnie jest, gdy jako katalizator w procesie hydrolizy stosuje się kwas trifluorometanosulfonowy, a reakcję prowadzi się w obniżonej temperaturze, stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę trifluoroetanolu i bezwodnego dichlorometanu.

Korzystnie jest, gdy w ostatnim etapie syntezy w drugiej reakcji estryfikacji, jako kwas tłuszczowy stosuje się kwas palmitynowy albo kwas oleinowy.

Korzystnie jest gdy jako czynnik sprzęgający w drugiej reakcji estryfikacji stosuje się N,N’-dicykloheksylokarbodiimid.

Korzystnie jest także, gdy do oczyszczania produktów poszczególnych reakcji stosuje się zautomatyzowany system do chromatografii flash.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie asymetrycznego acyloglicerolu zawierającego identyczne reszty kwasów tłuszczowych w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz resztę stigmasterolu przyłączoną poprzez linker węglanowy w pozycji sn-3 z dobrymi wydajnościami. Zaletą wynalazku jest również otrzymanie produktu w łagodnych warunkach, przy ciśnieniu atmosferycznym. Zaletą wynalazku jest też skrócenie procedury izolowania i oczyszczania produktów reakcji z mieszaniny poreakcyjnej dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego systemu do chromatografii flash.

Wynalazek jest bliżej objaśniony w przykładach wykonania oraz na figurach rysunku, gdzie fig. 1 przedstawia wykres zmiany płynności błony w różnych temperaturach [T°] określonych na podstawie anizotropii A fluorescencji sondy DPH dla kontroli (liposomy uformowane z DPPC) oraz dla trzech mieszanin DPPC i acyloglicerolu otrzymanego zgodnie z przykładem 1, gdzie R stanowi resztę kwasu palmitynowego, w różnych stosunkach molowych DPPC do acyloglicerolu, zaś fig. 2 to wykres zmiany płynności błony w różnych temperaturach T[°], określonych na podstawie anizotropii A fluorescencji sondy DPH dla kontroli (liposomy uformowane z DPPC) oraz dla trzech mieszanin DPPC i acyloglicerolu otrzymanego zgodnie z przykładem 2, gdzie R stanowi resztę kwasu oleinowego, w różnych stosunkach molowych DPPC do acyloglicerolu.

Przykład 1: W kolbie dwuszyjnej o pojemności 250 cm³ umieszcza się 0,5 g (3,8 mmol) (S)-solketalu, 0,61 g (5 mmol) dimetyloaminopirydyny (DMAP) w 25 cm³ bezwodnego chloroformu, a następnie wkrapla 15 cm³ chloroformowego roztworu zawierającego 2,4 g (5 mmol) chloromrówczanu stigmasterylu. Całość umieszcza się na mieszadle magnetycznym i miesza w temperaturze pokojowej aż do całkowitego przereagowania (S)-solketalu. W trakcie reakcji dochodzi do estryfikacji grupy hydroksylowej (S)-solketalu chloromrówczanem stigmasterylu. Po odparowaniu rozpuszczalnika z mieszaniny reakcyjnej na wyparce rotacyjnej otrzymany 1,2-O-izopropylideno-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol oczyszcza się metodą chromatografii flash na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (puriFlash® 30SIHP-F0040) z zastosowaniem elucji gradientowej, z udziałem eluentu o początkowym składzie heksan : octan etylu 100 : 0 i końcowym składzie heksan : octan etylu 5 : 1.

Otrzymuje się 2 g (92% wydajności teoretycznej) 1,2-O-izopropylideno-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glycerolu o następujących stałych fizycznych i spektroskopowych:

Białe kryształy, temperatura topnienia 99-106°C; Rf = 0,29 (heksan : octan etylu 5 : 1).

1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0.69 (s, 3H, CH3-18s), 0.78 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-27s), 0.8 (t, J = 7.4 Hz, 3H, CH3-29s), 0.84 (d, J = 6.4 Hz, 3H, CH3-26s), 0.90-1.10 (m, 3H, H-9s, H-14s i H-15s(p)), 1.01 (s, 3H, CH3-19s), 1.2 (d, J = 6.6 Hz, 3H, CH3-21s), 1.12-1.29 (m, 5H, H-1s(a), H-12s(a), H-16s(p), H-17s i jeden z CH2-28s), 1.36 i 1.43 (2 x s, 6H, CH3-5 i CH3-6), 1.38-1.66 (m, 9H, H-2s(p), H-7s(a), H-8s, CH2-11s, H-15s(a), H-24s, H-25s i jeden z CH2-28s), 1.69 (m, 1 H, H-16s(a)), 1.86-1.95 (m, 2H, H-1s(p) i H-2s(a)), 1.95-2.06 (m, 3H, H-7s(p), H-12s(p) and H-20s), 2.36-2.42 (m, 2H, CH2-4s), 3.78 (dd, J = 8.6 and 5.9 Hz, 1H, jeden z CH2-1), 4.08 (dd, J = 8.6 i 6.4 Hz, 1H, jeden z CH2-1), 4.13 (dd, J = 11.1 i 5.8 Hz, 1H, jeden z CH2-3), 4.15 (dd, J = 11.1 i 5.4 Hz 1H, jeden z CH2-3), 4.33 (m, 1 H, H-2), 4.47 (m, 1H, H-3s), 5.01 (dd, J = 15.1 i 8.8 Hz, 1H, H-23s), 5.15 (dd, J = 15.2 i 8.7 Hz, 1H, H-22s), 5.39 (m, 1H, H-6s); ¹³C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 12.2 (C-18s), 12.23 (C-29s), 18.96 (C-27s), 19.24 (C-19s), 21.00 (C-11s), 21.07 (C-26s), 21.20 (C-21s), 24.33 (C-15s), 25.39 (C-28s), 25.32 i 26.70 (C-5 i C-6), 27.63 (C-2s), 28.88 (C-16s), 31.81 (C-8s), 31.86 (C-7s i C-25s), 36.52 (C-10s), 36.81 (C-1s), 37.96 (C-4s), 39.59 (C-12s), 40.47 (C-20s), 42.18 (C-13s), 49.99 (C-9s), 51.21 (C-24s), 55.91 (C-17s), 56.76 (C-14s), 66.36 (C-1), 67.56 (C-3), 73.31 (C-2), 78.16 (C-3s), 109.86 (C-4), 122.98 (C-6s), 129.27 (C-23s), 138.28 (C-22s), 139.24 (C-5s), 154.33 (-C(O)O-Stig);

IR (ATR, cm^-1): 976, 1057, 1158, 1247, 1370, 1749, 2887, 2941

HRMS dla C3sH58O5[M+Na]+: 593,4182 (masa obliczona), 593,4191 (masa oznaczona)

Uzyskany 1,2-O-izopropylideno-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol (1,5 g, 2,6 mmol) umieszcza się w kolbie, rozpuszcza w 7 cm³ bezwodnego dichlorometanu i 7 cm³ trifluoroetanolu (TFE), schładza do temperatury -12°C stosując łaźnię lodową z NaCI, a następnie dodaje 55 mm³ (0,63 mmol) kwasu trifluorometanosulfonowego. Mieszaninę reakcyjną miesza się na mieszadle magnetycznym przez 30 minut utrzymując temperaturę obniżoną do co najmniej -12°C do -10°C. W trakcie reakcji następuje hydroliza pierścienia acetalowego. Następnie dodaje się 89 mm³ (0,63 mmol) trietyloaminy (TEA) w celu przerwania reakcji. Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymany surowy produkt oczyszcza się metodą chromatografii flash na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (puriFlash® 50SIHP-F0040) z zastosowaniem elucji gradientowej, z udziałem eluentu o początkowym składzie heksan : octan etylu 100 : 0 i końcowym składzie heksan : octan etylu 1 : 1.

Otrzymuje się 0,75 g (54% wydajności teoretycznej) czystego 3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerolu o następujących stałych fizycznych i spektroskopowych:

Białe kryształy, temperatura topnienia 140-147°C; Rf = 0,36 (heksan : octan etylu 1 : 1).

1H NMR (600 MHz, CDCI3) δ: 0.69 (s, 3H, CH3-18s), 0.79 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-27s), 0.80 (t, J = 7.4 Hz, 3H, CH3-29s), 0.85 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-26s), 0.92-1.10 (m, 3H, H-9s, H-14s i H-15s(p)), 1.01 (s, 3H, CH3-19s), 1.2 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-21s), 1.12-1.28 (m, 5H, H-1s(a), H-12s(a), H-16s(p), H-17s i jeden z CH2-28s), 1.39-1.66 (m, 9H, H-2s(p), H-7s(a), H-8s, CH2-11s, H-15s(a), H-24s, H-25s i jeden z CH2-28s), 1.70 (m, 1H, H-16s(a)), 1.86-1.96 (m, 2H, H-1s(p) i H-2s(a)), 1.96-2.00 (m, 3H, H-7s(p), H-12s(p)), 2.03(m, 1H, H-20s), 2.37-2.42 (m, 2H, CH2-4s), 2.45 (s, 2H, 2 x OH), 3.62 (dd, J = 11.5 i 5.7 Hz, 1H, jeden z CH2-1), 3.72 (dd, J = 11.5 i 4.0 Hz, 1H, jeden z CH2-1), 3.97 (m, 1H, H-2), 4.17 (dd, J = 11.4 i 6.4 Hz, 1H, jeden z CH2-3), 4.22 (dd, J = 11.4 i 4.6 Hz 1H, jeden z CH2-3), 4.48 (m, 1H, H-3s), 5.02 (dd, J = 15.2 i 8.7 Hz, 1H, H-23s), 5.14 (dd, J = 15.1 i 8.7 Hz, 1H, H-22s), 5.39 (m, 1H, H-6s); ¹³C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 12.02 (C-18s), 12.23 (C-29s), 18.96 (C-27s), 19.23 (C-19s), 21.00 (C-11s), 21.07 (C-26s), 21.20 (C-21s), 24.32 (C-15s), 25.38 (C-28s), 27.62 (C-2s), 28.88 (C-16s), 31.80 (C-8s), 31.85 (C-7s i C-25s), 36.51 (C-10s), 36.80 (C-1s), 37,94 (C-4s), 39.58 (C-12s), 40.47 (C-20s), 42.18 (C-13s), 49.97 (C-9s), 51.21 (C-24s), 55.90 (C-17s), 56.75 (C-14s), 63,13 (C-1), 68.28 (C-3), 70.01 (C-2), 78.43 (C-3s), 123.11 (C-6s), 129.28 (C-23s), 138.26 (C-22s), 139.12 (C-5s), 154.76 (-C(O)O-Stig);

IR (ATR, cm^-1): 970, 1293, 1458, 1725, 2866, 2937, 3424

HRMS dla C33H54O5 [M+Na]+: 553,3869 (masa obliczona), 553,3866 (masa oznaczona).

Uzyskany 3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol (0,7 g, 1,3 mmol), N,N’-dicykloheksylokarbodiimid DCC (0,56 g, 2,7 mmol) i dimetyloaminopirydynę DMAP (0,34 g, 2,7 mmol) umieszcza się w kolbie okrągłodennej i rozpuszcza w 30 cm³ bezwodnego chloroformu, po czym wkrapla kwas palmitynowy (0,7 g, 2,7 mmol) rozpuszczony w 20 cm³ chloroformu. Całość miesza się na mieszadle magnetycznym przez 24 godziny. Reakcja polega na estryfikacji dwóch grup hydroksylowych w 3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol kwasem palmitynowym. Biały osad z mieszaniny poreakcyjnej odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem z użyciem lejka ze spiekiem o porowatości G4. Uzyskany przesącz przemywa się kolejno 0,5 molowym roztworem kwasu solnego oraz nasyconym roztworem chlorku sodu do odczynu obojętnego. Warstwę organiczną osusza się bezwodnym MgSO4, przesącza do kolby okrągłodennej i odparowuje rozpuszczalnik na wyparce rotacyjnej. Produkt oczyszcza się przy użyciu chromatografii flash z zastosowaniem elucji gradientowej, na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym (puriFlash® 30SIHP-F0040) z udziałem eluentu o początkowym składzie heksan : octan etylu 100 : 0 i końcowym składzie heksan : octan etylu 30 : 1. Otrzymuje się 0,6 g (45% wydajności teoretycznej) 1,2-dipalmitoilo-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerolu, o wzorze 1 gdzie R stanowi resztę kwasu palmitynowego.

Dane fizyczne i spektroskopowe otrzymanego 1,2-dipalmitoilo-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerolu (wzór 1, gdzie R stanowi resztę kwasu palmitynowego) są następujące:

Bezbarwne kryształy, temperatura topnienia 39-43°C; Rf = 0,17 (heksan : octan etylu 30 : 1).

1H NMR (600 MHz, CDCI3) ) δ: 0.69 (s, 3H, CH3-18s), 0,79 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-27s), 0.80 (t, J = 7.4 Hz, 3H, CH3-29s), 0.84 (d, J = 6.4 Hz, 3H, CH3-26s), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H, CH3-I6’ i CH3-I6”) 0.92-1.10 (m, 3H, H-9s, H-14s i H-15s(p)), 1.01 (s, 3H, CH3-19s), 1.02 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH3-21s), 1.12-1.32 (m, 53H, H-1s(a), H-12s(a), H-16s(p), H-17s, one of CH2-28s, CH2-4’-CH2-15’ i CH2-4”-CH2-15”), 1.37-1.66 (m, 13H, H-2s(p), H-7s(a), H-8s, CH2-11s, H-15s(a), H-24s, H-25s, jeden z CH2-28s, CH2-3’ i CH2-3”), 1.70 (m, 1H, H-16s(a)), 1.86-1.95 (m, 2H, H-1s(p) i H-2s(a)), 1.95-2.08 (m, 3H, H-7s(p), H-12s(p) i H-20s), 2.29-2.33 (m, 4H, CH2-2’ i CH2-2”), 2.37-2.41 (m, 2H, CH2-4s), 4.16 (dd, J = 11.9 i 5.8 Hz, 1H, jeden z CH2-1), 4.22 (dd, J = 11.8 i 5.8 Hz, 1H, jeden z CH2-3), 4.30-4.33 (dd, J = 11.9 i 4.3 Hz, 2H, jeden z CH2-1 i jeden z CH2-3), 4.47 (m, 1H, H-3s), 5.01 (dd, J = 15.1 i 8.8 Hz, 1H, H-23s), 5.15 (dd, J = 15.1 i 8.7 Hz, 1H, H-22s), 5.26 (m, 1H, H-2), 5.39 (m, 1H, H-6s); ¹³C NMR (150 MHz, CDCI3) δ: 12.02 (C-18s), 12.23 (C-29s), 14.11 (C-16’ i C-16”), 18.96 (C-27s), 19.24 (C-19s), 21.01 (C11s), 21.07 (C-26s), 21.20 (C-21s), 22.68 (C-15’ i C-15”), 24.33 (C-15s), 24.85 (C-3’ i C-3”), 25.39 (C-28s), 27.61 (C-2s), 28.89 (C-16s), 29.06, 29.11,29.27, 29.30, 29.36, 29.48, 29.50, 29.63, 29.66, 29.69, 29.71 (C-4’-C13’ i C-4”-C-13”), 31.82 (C-8s), 31.87 (C-25s), 31.92 (C-14’, C-14” i C-7s), 34.03 i 34.19 (C-2’ i C-2”), 36.52 (C-10s), 36.81 (C-1s), 37.94 (C-4s), 39.59 (C-12s), 40.48 (C-20s), 42.19 (C-13s), 50.00 (C-9s), 51.23 (C-24s), 55.92 (C-17s), 56.77 (C-14s), 61.89 (C-1), 65.323 (C-3), 68.74 (C-2), 78.36 (C-3s), 123.04 (C-6s), 129.28 (C-23s), 138.28 (C-22s), 139.20 (C-5s), 154.18 (-OC(O)O-), 172,86 i 173,24 (C-1’ i C-1”);

IR (ATR, cm^-1): 971, 1177, 1257, 1276, 1465, 1741, 2849, 2916

HRMS dla Ge5H114Q/[M+Na]⁺ 1029,8462 (masa obliczona), 1029,8455 (masa oznaczona).

Przykład 2. Postępuje się jak w przykładzie 1, z tym że w ostatnim etapie zamiast kwasu palmitynowego stosuje się kwas oleinowy (0,76 g, 2,7 mmol). Reakcja polega na estryfikacji dwóch grup hydroksylowych w 3-stigmasterylobursztynoilo-sn-glicerolu kwasem oleinowym. Po oczyszczeniu metodą chromatografii flash otrzymuje się 0,81 g (58% wydajności teoretycznej) 1,2-dioleoilo-3-Q-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerolu o wzorze 1, gdzie R stanowi resztę kwasu oleinowego.

Dane fizyczne i spektroskopowe otrzymanego 1,2-dioleoilo-3-Q-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerolu (o wzorze 1, gdzie R stanowi resztę kwasu oleinowego) są następujące:

Gęsta ciecz, Rf = 0,27 (heksan : octan etylu 15 : 1).

¹H NMR (600 MHz, GDGI3) δ: 0.69 (s, 3H, GH3-18s), 0.79 (d, J = 6.5 Hz, 3H, GH3-27s), 0.80 (t, J = 7.4 Hz, 3H, GH3-29s), 0.84 (d, J = 6.4 Hz, 3H, GH3-26s), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H, GH3-18’ i GH3-18”) 0.90-1.10 (m, 3H, H-9s, H-14s i H-15s(p)), 1.01 (s, 3H, GH3-19s), 1.02 (d, J = 6.6 Hz, 3H, GH3-21s), 1.11-1.37 (m, 45H, H-1s(a), H-12s(a), H-16s(p), H-17s, jeden z GH2-28s, GH2-4’-GH2-7’, GH2-4”-GH2-7”, GH2-12’-GH2-17’ i GH2-12”-GH2-17”), 1.37-1.68 (m, 13H, H-2s(p), H-7s(a), H-8s, GH2-11s, H-15s(a), H-24s, H-25s, jeden z GH2-28s, GH2-3’ i GH2-3”), 1.70 (m, 1H, H-16s(a)), 1.86-2.06 (m, 13H, H-1 s(p) i H-2s(a), H-7s(p), H-12s(p) i H-20s, GH2-8’, GH2-8”, GH2-11’ i GH2-11”), 2.29-2.34 (m, 4H, GH2-2’ i GH2-2”), 2.36-2.41 (m, 2H, GH2-4s), 4.17 (dd, J = 11.9 i 5.8 Hz, 1H, jeden z GH2-1), 4.22 (dd, J = 11.8 i 5.8 Hz, 1H, jeden z GH2-3), 4.30-4.33 (dd, J = 11.9 i 4.4 Hz, 2H, jeden z GH2-1 i jeden z GH2-3), 4.47 (m, 1H, H-3s), 5.01 (dd, J = 15.2 i 8.8 Hz, 1H, H-23s), 5.15 (dd, J = 15.2 i 8.7 Hz, 1H, H-22s), 5.26 (m, 1H, H-2), 5.31-5.37 (m, 4H, H-9’, H-9”, H-10’ i H-10”), 5.38 (m, 1H, H-6s); ¹³C NMR (150 MHz, GDGI3) δ: 12.02 (G-18s), 12.23 (G-29s), 14.10 (G-18’ i C-18”), 18.96 (C-27s), 19.24 (G-19s), 21.01 (G-11s), 21.07 (G-26s), 21.20 (G-21s), 22.67 (G-17’ i C-17”), 24.33 (G-15s), 24.82 (G-3’ i C-3”), 25.39 (C-28s), 27.21, 27.16 (G-8’, G-8”, C-11’ i C-11”), 27.61 (C-2s), 28.89 (G-16s), 29.02, 29.07, 29.10, 29.12, 29.17, 29.19, 29.31,29.52, 29.70, 29.72, 29.76 (G-4’-G7’, C-12’-G15’, C-4”-G-7” i C-12”-G-15”), 31.81 (C-8s), 31.87 (G-25s), 31.90 (G-16’, C-16” i C-7s), 34.00 i 34.15 (G-2’ i C-2”), 36.53 (C-10s), 36.81 (G-1s), 37.94 (G-4s), 39.59 (G-12s), 40.48 (G-20s), 42.19 (G-13s), 49.99 (G-9s), 51.22 (G-24s), 55.92 (G-17s), 56.77 (G-14s), 61.89 (G-1), 65.32 (G-3), 68.74 (G-2), 78.36 (G-3s), 123.04 (G-6s), 129.28 (G-23s), 129.70 i 129.99 (G-9’, C-9”, C-10’ i G-10”), 138.28 (C-22s), 139.19 (G-5s), 154.18 (-QC(Q)Q-), 172.82 i 173.20 (G-1’ i C-1”);

IR (ATR, cm^-1): 973, 1161, 1252, 1458, 1744, 2852, 2923

HRMS dla Ge9H118Q/[M+Na]⁺: 1081,8776 (masa obliczona), 1081,8770 (masa oznaczona)

W celu potwierdzenia właściwości fizykochemicznych otrzymanych acylogliceroli opracowano formulacje liposomowe z ich udziałem.

Liposomy, aby wydajnie i bezpiecznie dostarczać związki aktywne, muszą charakteryzować się odpowiednim profilem stabilności. Dlatego stosowane są odpowiednie stabilizatory, np. cholesterol, który zmienia płynność błony, zwiększa jej sztywność i zmniejsza przepuszczalność. Odpowiednia zawartość sterolu zapewnia, np. powtarzalne uwalnianie leków. Obiecujące, ze względu na dodatkowe prozdrowotne działanie, jest wykorzystanie steroli roślinnych (Jovanović A., Balanc B., Ota A., Grabnar P., Djordjević V., Savikin K., Bugarski B., Nedović V. i wsp. 2018. Gomparative Effects of Gholesterol and β-Sitosterol on the Liposome Membrane Gharacteristics, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2018, 120, 1800039; Briuglia M., Rotelia G., McFarlane A., Lamprou D. Influence of cholesterol on liposome stability and on in vitro drug release, Drug Deliv. and Transl. Res. 2015, 5, 231-242; Yu M., Songa W., Tianc F., Dai Z., Zhu Q., Ahmad E., Guo S., Zhu Gh., Zhong H., Yuan Y., Zhang T., Yi X., Shi X., Gan Y., Gao H. Temperature- and rigidity-mediated rapid transport of lipid nanovesicles in hydrogels. PNAS. 2019, 116, 5362-5369).

Liposomy wykorzystane do potwierdzenia właściwości przedmiotowych acylogliceroli, składały się z mieszaniny dipalmitoilofosfatydylocholiny (DPPC) i acyloglicerolu w trzech stosunkach molowych: 5 : 1; 10 : 1; 20 : 1, oznaczone na fig. 1 i 2 odpowiednio DPPG 2, DPPG 3 oraz DPPG 4. Przygotowane zostały liposomy zawierające 1,2-dipalmitoilo-3-stigmasteryloksybursztynoiloglicerol otrzymany zgodnie z przykładem 1 (acyloglicerol 1) oraz liposomy zawierające 1,2-dioleoilo-3-stigmasterylobursztynoiloglicerol otrzymany zgodnie z przykładem 2 (acyloglicerol 2). Próby badane porównywane były z próbą kontrolną stanowiącą tylko DPPC oznaczony na fig. 1 i 2 jako DPPC 1. Wyniki badań fluorymetrycznych wykazały, że acyloglicerole zawierające resztę stigmasterolu znacząco wpływają na płynność błon nowych liposomów oraz zmieniają parametry termotropowe dwuwarstwy lipidowej. Powyżej temperatury głównego przejścia fazowego DPPC obecność acyloglicerolu 1 i acyloglicerolu 2 powoduje zmniejsze nie płynności błony czyli wzrost jej sztywności, co oznacza że struktura liposomu będzie bardziej stabilna w warunkach panujących w organizmie. Zwiększenie sztywności błony nowych liposomów wpłynie prawdopodobnie na zmniejszenie jej przepuszczalności, a stigmasterol wchodzący w jej skład będzie stanowił dodatkowy czynnik prozdrowotny.

Claims (9)

1. Acyloglicerol zawierający resztę stigmasterolu, znamienny tym, że identyczne reszty kwasów tłuszczowych znajdują się w pozycjach sn-1 i sn-2 oraz reszta stigmasterolu przyłączona jest poprzez linker węglanowy w pozycji sn-3, przedstawiony na wzorze 1.

2. Sposób otrzymywania acyloglicerolu zawierającego resztę stigmasterolu znamienny tym, że substrat jakim jest (S)-solketal poddaje się reakcji estryfikacji chloromrówczanem stigmasterylu w bezwodnym rozpuszczalniku, w obecności pirydyny albo pochodnej pirydyny, w wyniku czego otrzymuje się 1,2-O-izopropylideno-3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol, który następnie poddaje się reakcji hydrolizy w bezwodnym rozpuszczalniku w obecności katalizatora, otrzymując 3-O-stigmasteryloksykarbonylo-sn-glicerol, który następnie poddaje się reakcji estryfikacji kwasem tłuszczowym w bezwodnym rozpuszczalniku, w obecności czynnika sprzęgającego charakterystycznego dla tego typu reakcji oraz pirydyny albo pochodnej pirydyny, a końcowy produkt o wzorze 1, oczyszcza się metodą chromatograficzną.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcje estryfikacji prowadzi się w bezwodnym chloroformie.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pochodną pirydyny jest dimetyloaminopirydyna.

5. Sposób według zastrz. 2, znamiennym tym, że jako katalizator w procesie hydrolizy stosuje się kwas trifluorometanosulfonowy a reakcję prowadzi się w temperaturze co najwyżej -8 °C, od 15 do 120 minut, stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę zawierającą trifluoroetanol TFE i bezwodny dichlorometan.

6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwasem tłuszczowym jest kwas palmitynowy.

7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kwasem tłuszczowym jest kwas oleinowy.

8. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w trzecim etapie syntezy, w reakcji estryfikacji jako czynnik sprzęgający stosuje się N,N’-dicykloheksylokarbodiimid.

9. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do oczyszczania produktów poszczególnych reakcji stosuje się zautomatyzowany system do chromatografii flash.