PL246693B1 - Sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek nośnika oraz urządzenie mikroprzepływowe do generacji monodyspersyjnych cząstek nośnika - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek nośnika obejmujący etapy: wytworzenia cząstek nośnika w zawiesinie, nanoszenia cząstek nośnika na substrat, obrazowania, przy czym etap obrazowania obejmuje: identyfikowanie wybranej pojedynczej cząstki nośnika i/lub identyfikowanie kolejno wszystkich cząstek nośnika; gdzie na etapie wytworzenia cząstek nośnika wytwarza się zawiesinę cząstek nośnika zawierających każdą mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, przy czym komórki i/lub substancje chemiczne są podawane do cząstek nośnika sekwencyjnie wg określonego protokołu w taki sposób, że kolejna wytworzona cząstka nośnika zawiera znaną mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, i na etapie nanoszenia cząstek nośnika na substrat nanosi się cząstki nośnika na substrat w postaci łańcucha, znamienny tym, że cząstki nośnika (8 albo 8') zawierające komórki i/lub substancje chemiczne w zawiesinie nanosi się z igły nanoszącej (10 albo 10') jedna po drugiej na powierzchnię substratu (5 albo 5'a), przy czym gdy tempo podawania ffeed cząstek nośnika (8 albo 8') z igły nanoszącej (10 albo 10') na powierzchnię substratu (5 albo 5'a) jest równe tempu unoszenia fadv=U/D cząstek nośnika (8 albo 8') przez podłoże, gdzie U to prędkość przemieszczania się głowicy drukującej (3) a D to średnica cząstki nośnika (8 albo 8'), określone wyrażeniem fadv = ffeed, to cząstki nośnika (8 albo 8') są nanoszone w postaci liniowego łańcucha (13), przy czym gdy ffeed>fadv to cząstki nośnika (8 albo 8') są nanoszone w postaci łańcucha zawierającego sekwencje zaburzeń (13a), i na etapie obrazowania dokonuje się identyfikowania pojedynczej cząstki nośnika i/lub cząstek nośnika (8 albo 8') na podstawie wygenerowanej sekwencji zaburzeń. Wynalazek obejmuje również urządzenie do wytwarzania cząstek nośnika.

Description

Opis wynalazku

DZIEDZINA WYNALAZKU

Przedmiotem wynalazku jest sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek nośnika, takich jak na przykład mikrokropelki, przy czym sposób umożliwia ich łatwą identyfikację. Przedmiotem wynalazku jest także urządzenie do generacji monodyspersyjnych cząstek nośnika. Wynalazek znajduje zastosowanie w wysokoprzepustowych testach diagnostycznych lub badaniach bioanalitycznych, w których pojedyncze cząstki służyć mogą jako mikro-kontenery dla żywych komórek biomolekuł, i/lub substancji czynnych.

STAN WIEDZY

Badania przesiewowe o wysokiej przepustowości (HT). Możliwość znacznego zwiększenia tempa badań przesiewowych (tj. o rzędy wielkości) w testach diagnostycznych lub bioanalitycznych jest niezwykle istotna w kilku dyscyplinach, takich jak biologia rozwoju [1], transkryptomika i genomika na poziomie pojedynczych komórek [2], badania przesiewowe przeciwciał monoklonalnych [3], opracowanie kombinacji leków do spersonalizowanego leczenia raka [4, 5] lub badań przesiewowych antybiotyków [6]. Kapsułkowanie i wysokowydajna hodowla komórek i mikro-tkanek jest szczególnie interesująca w badaniach nad wpływem mikro-środowiska raka na wydajność leków, w tym na przykład nad rolą komórek okalających [7] lub unaczynienia guza [8].

Mikroprzepływy kropelkowe w skriningu HT. Mikroprzepływy kropelkowe pozwalają na kapsułkowanie komórek i/lub chemikaliów (takich jak leki) w bardzo małych próbkach płynu - mikro-kropelkach - co zwiększa wydajność badań przesiewowych o rzędy wielkości w porównaniu z tradycyjnymi metodami opartymi na zautomatyzowanym pipetowaniu i nanoszeniu próbek do mikro-dołków (ang. micro - well). Na przykład, typowa liczba mikro-dołków na pojedynczej płytce wielodołkowej jest rzędu 102, podczas gdy objętość pojedynczego dołka jest rzędu 105-104 L, co łącznie odpowiada zużyciu 1-10 ml odczynników na płytkę. Dla porównania, urządzenie mikroprzepływowe może z łatwością wygenerować 105 kropelek w jednym eksperymencie (czas rzędu minut), każda o objętości 10^-10 L, co daje zużycie 10 μL odczynników. Podsumowując, zastosowanie mikro-kropelek pozwala na zwiększenie przepustowości co najmniej o dwa do trzech rzędów wielkości (liczba przesianych próbek) z proporcjonalnym zmniejszeniem objętości a więc i kosztów odczynników również o dwa do trzech rzędów wielkości.

Obecnie, technologie mikroprzepływowe bazujące na mikrokroplach są bliskie osiągnięcia poziomu pełnej technologicznej gotowości do wdrożenia w przemyśle, w szczególności w skriningu HT pojedynczych komórek (ang. single-cell analysis) [2]. Taki rosnący potencjał komercyjny testów opartych na kropelkach powoduje dalsze zapotrzebowanie na rozwój i optymalizację technologii kropelkowych. W szczególności, w celu wydajnej analizy rzędu 105-106 kropel zawierających różne mieszanki odczynników, potrzeba jest platformy o dużej przepustowości, która umożliwiałaby wydajną identyfikację poszczególnych kropel.

Metody oznaczania kropel: „kody kreskowe” a porządkowanie. Jednym z największych wyzwań technologicznych związanych z zastosowaniem kropelek emulsji w biologicznym skriningu HT jest identyfikacja poszczególnych kropel, z których każda może zawierać inną mieszankę odczynników. Obecnie dostępne metody takiej identyfikacji obejmują (i) wstrzykiwanie tak zwanych „kodów kreskowych” do kropelek, to znaczy związków chemicznych o unikalnych właściwościach, których odczyt następuje przy użyciu metod fizycznych (np. optycznych) [9, 10] lub biochemicznych (np. sekwencjonowanie DNA) [2, 11, 12], (ii) uporządkowanie przestrzenne kropel w matrycy 2D [13] lub w sekwencji ID [14-16], (iii) kombinację znakowania „kodem kreskowym” i uporządkowania przestrzennego za pomocą dodatkowych „pasywnych” kropelek [5, 17].

Użycie „kodów kreskowych”. Wcześniej zademonstrowane metody dołączania kodów kreskowych do pojedynczych kropel polegały na zastosowaniu (a) optycznych kodów kreskowych - czyli barwników fluorescencyjnych / kombinacji barwników zawartych w kroplach i emitujących konkretne długości fali o zadanej intensywności (lub ich kombinacje), lub (b) biochemicznych kodów kreskowych bazujących na dodaniu do kropel DNA o unikalnej sekwencji nukleotydów. Obydwie metody mają zarówno zalety, jak i ograniczenia. Zastosowanie optycznych kodów kreskowych jest technologicznie proste ze względu na względnie nieskomplikowaną procedurę znakowania/odczytu kropelek, jednak liczba możliwych do oznakowania kropel jest mocno ograniczona. Dotychczas zademonstrowano odczyt od kilkudo kilkunastu poziomów intensywności dla jednego barwnika (jednej długości fali). Przy kombinacji dwóch-trzech barwników daje to teoretycznie możliwość oznakowania i identyfikacji kilkudziesięciu- do około tysiąca unikalnych optycznych kodów kreskowych [9, 10, 18-20], co jednak przy niektórych zastosowaniach jest liczbą wciąż za małą o 2-3 rzędy wielkości. Ponadto, metoda jest inwazyjna, ponieważ barwniki mogą potencjalnie wchodzić w interakcje z aktywnymi odczynnikami (takimi jak leki) zawartymi w kropelkach. W niedawnych pracach, w celu zwiększenia liczby kodów kreskowych zastosowano sekwencje DNA. Zamiast barwników użyto kulek hydrożelowych zawierających unikalne sekwencje nukleotydów, które zostały następnie wstrzyknięte bezpośrednio do kropelek [2, 11, 12]. W ten sposób uzyskano możliwość unikalnego znakowania milionów kropelek. Jednak precyzyjne i powtarzalne wstrzykiwanie pojedynczej kulki do każdej kropli jest technicznie nietrywialne: wymaga bardzo precyzyjnej synchronizacji procesu generowania kropelek i dozowania kulek hydrożelowych. Być może jednak największym ograniczeniem metody jest to, że procedura dekodowania opiera się na połączeniu DNA komórkowego ze wstrzykniętą sekwencją nukleotydów w celu sekwencjonowania DNA i jako taka zakłada konieczność uśmiercenia komórek na etapie odczytu „kodów kreskowych”. W szczególności metoda ta nie jest odpowiednia do badań przesiewowych nad skutecznością/toksycznością leków.

Porządkowanie przestrzenne kropelek. Inna, w pełni nieinwazyjna metoda znakowania kropelek polega na ich uporządkowaniu w postaci matrycy (uporządkowanie 2D) lub prostej sekwencji liniowej (uporządkowanie 1D). Na przykład, porządkowanie kropel w 2D zostało zademonstrowane przez Cole i in. [13] poprzez nanoszenie kropelek jedna po drugiej na podłoże w postaci kwadratowej matrycy. Każda kropla została uwięziona w „nano-dołku” prefabrykowanym na podłożu (gdzie „nano” odnosi się do nanolitrowej objętości dołka). Takie podejście jest całkowicie analogiczne do zastosowania tradycyjnej płytki wielodołkowej, jednak w znacznie mniejszej skali przestrzennej. Metoda umożliwia szereg różnych zastosowań ze względu na łatwy dostęp do nadrukowanych kropelek, w tym wstrzykiwanie odczynników, inkubację, zasysanie pojedynczych kropel do dalszej analizy itp. Metoda jest jednak technicznie skomplikowana i kosztowna, w szczególności wymaga wytworzenia nano-dołków z wbudowanymi mikroelektrodami do pozycjonowania kropelek na podłożu przy użyciu pola elektrycznego. Kilka innych prac koncentrowało się na prostszym podejściu wykorzystującym kolejność generowania kropel: tak długo jak kropelki są przechowywane w oryginalnej sekwencji 1D, w której zostały wygenerowane, tak długo mogą być jednoznacznie zidentyfikowane. Na przykład Boedicker i in. [15] wygenerowali krople zawierające bakterie wraz z antybiotykami w różnych stężeniach i przechowywali ustaloną sekwencję kropel w kanale lub wężyku teflonowym. Odczyt intensywności fluorescencji z kropel jedna po drugiej następował poprzez przemieszczanie ich wzdłuż kanału (lub wężyka) przez pole widzenia mikroskopu epifluorescencyjnego co pozwoliło ustalić minimalne stężenie hamujące antybiotyku (MIC). Później Churski i in. [14] wykorzystali podobną strategię do przeprowadzenia badań przesiewowych nad efektami oddziaływania (synergii) dwóch różnych antybiotyków. Również w tym przypadku zadana kombinacja stężeń antybiotyków kodowana była poprzez pozycję kropli w sekwencji liniowej. W obu przypadkach [14, 15] przepustowość badań była raczej niska: zbadano zazwyczaj do kilkudziesięciu kombinacji stężeń. Cao i in. [16] zademonstrowali, że przepustowość metody może być zwiększona i potencjalnie służyć do skanowania nawet do 218 różnych kombinacji, na przykład 3 różnych antybiotyków („trójwymiarowy skan”) każdy w 6 różnych stężeniach (6³ = 218). W tym przypadku metodę przetestowano wyłącznie na barwnikach (tj. bez udziału substancji czynnych).

We wszystkich trzech przykładach opisanych powyżej [14-16] objętości kropel były rzędu 1 μL przy liczbie skanowanych próbek, tj. różnych stężeń lub kombinacji stężeń, rzędu 101-102; przy rozdzieleniu każdej próbki na 10 identycznych kropel (w celu uzyskania statystycznie wiarygodnych pomiarów dla każdego stężenia) dawało to 102-10³ kropel. Należy zauważyć, że takie objętości i przepustowości są w istocie łatwo osiągalne również przy użyciu tradycyjnych płytek wielodołkowych. W związku z tym postęp w przepustowości i minimalizacji kosztów wymaga dalszej miniaturyzacji kropelek i zwiększenia liczby możliwych do jednoznacznego oznakowania próbek.

„Kody kreskowe” w sekwencjach liniowych. W przypadku sekwencji liniowych skanowanie coraz większej liczby kropelek zwiększa ryzyko niepowodzenia odczytu całej sekwencji w przypadku pojedynczego błędu w odczycie którejś z kropel spowodowanych np. niekontrolowaną koalescencją kropel. Bardziej niezawodne podejście do znakowania kropel zostało niedawno zaproponowane przez Eduati i in. [5] oraz Song i in. [17]. Polega ono na wprowadzeniu do sekwencji kropel dodatkowych kropel „pasywnych” (zawierających wyłącznie barwniki lub inne znaczniki), tak, aby każda „aktywna” kropla zawierająca właściwe odczynniki mogła zostać jednoznacznie zidentyfikowana na podstawie informacji zakodowanych w sąsiadującej sekwencji kropel „pasywnych”. Do kodowania Eduati i in. zastosowali system binarny (wysokie lub niskie stężenie barwnika w każdej z pasywnych kropli odpowiadało odpowiednio „1” lub „0”) tak, że sekwencja n pasywnych kropel wystarczała do jednoznacznego oznakowania 2ⁿ kropel aktywnych. W szczególności, zademonstrowano oznakowanie 62 różnych kropel aktywnych przy użyciu 340 kropel pasywnych. W istocie, dla uzyskania bardziej wiarygodnych danych, generowano serie kilku/kilkunastu aktywnych kropel-replik o tym samym składzie. Przy generowaniu 10 kropel-replik, łącznie wygenerowanych było około 1000 kropli. Metoda zastosowana została do badań przesiewowych nad działaniem kombinacji leków przeciwnowotworowych na komórki raka trzustki pobranych bezpośrednio od pacjentów. Równolegle Song i in. [17] zademonstrowali podobną metodę kodowania, tj. również opartą na sekwencjach pasywnych kropel, jednak ze zwiększoną liczbą „stanów” każdej pasywnej kropli, co poprawiło wydajność kodowania. Autorzy zastosowali kombinację sygnałów magnetycznych (poprzez dodanie cieczy ferromagnetycznej do pasywnych kropel) i optycznych, co pozwoliło na odróżnienie 14 sygnałów magnetyczno-optycznych dla pojedynczej pasywnej kropli. Zastosowanie sekwencji zawierającej tylko 4 krople pasywne pozwoliło na wygenerowanie 144 = 38416 unikalnych „kodów kreskowych”. Podejście Song'a opierało się jednak na dość złożonym sposobie formułowania sekwencji kropel pasywnych w mikro-kanale poprzez selektywne eliminowanie wybranych kropel z początkowej niekodującej sekwencji (tj. przekierowywanie części kropel do bocznego mikro-kanału), co skutkowało dużą ilością niewykorzystanych kropel i zmarnowanej ferromagnetycznej cieczy. W obu demonstracjach [5, 17] kropelki miały objętości około 1 μl, co znowu nie dawało znaczącej przewagi nad tradycyjnymi technikami bazującymi na mikro-dołkach.

Problemem technicznym stawianym przed wynalazkiem jest dostarczenie sposobu znakowania nośników do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości, który zapewniałby łatwe znakowanie nośników, łatwą identyfikację ich po zakończonym eksperymencie, przy czym do znakowania nie byłoby konieczne wykorzystywanie dodatkowych substancji typu barwników lub ich kombinacji, znakowanie nie wymagałoby zliczania każdego nośnika w sekwencji, minimalizowało ryzyko błędu odczytu położenia nośnika w sekwencji oraz nie wykorzystywałoby szkodliwych rozpuszczalników. Innym problemem jest dostarczenie urządzenia do realizacji sposobu. Powinno ono mieć prostą konstrukcję oraz umożliwiać stosowanie różnych substancji do wytwarzania cząstek nośników.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek nośnika obejmujący etapy:

I. Wytworzenia cząstek nośnika w zawiesinie,

II. Nanoszenia cząstek nośnika na substrat,

III. Obrazowanie, przy czym etap obrazowania obejmuje:

a) Identyfikowanie wybranej pojedynczej cząstki nośnika i/lub

b) Identyfikowanie kolejno wszystkich cząstek nośnika, gdzie na etapie wytworzenia cząstek nośnika wytwarza się zawiesinę cząstek nośnika zawierających każda mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, przy czym komórki i/lub substancje chemiczne są podawane do cząstek nośnika sekwencyjnie wg określonego protokołu w taki sposób, że kolejna wytworzona cząstka nośnika zawiera znaną mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, i na etapie nanoszenia cząstek nośnika na substrat nanosi się cząstki nośnika na substrat w postaci łańcucha, charakteryzujący się tym, że cząstki nośnika zawierające komórki i/lub substancje chemiczne w zawiesinie nanosi się z igły jedna po drugiej na powierzchnię substratu, przy czym gdy tempo podawania feed cząstek nośnika z igły na powierzchnię substratu jest równe tempu unoszenia fadv = U/D cząstek nośnika przez podłoże, gdzie U to prędkość przemieszczania się głowicy drukującej a D to średnica cząstki nośnika, określone wyrażeniem fadv = f/eed, to cząstki nośnika są nanoszone w postaci liniowego łańcucha, przy czym gdy ffeed > fadv to cząstki nośnika są nanoszone w postaci łańcucha zawierającego sekwencje zaburzeń, i na etapie obrazowania identyfikuje się pojedynczą cząstkę nośnika i/lub cząstki nośnika (8 albo 8') na podstawie wytworzonej sekwencji zaburzeń w naniesionym łańcuchu cząstek nośnika, przy czym zaburzenie obejmuje przegrupowanie się cząstek nośnika (8 albo 8') na powierzchni substratu (5 albo 5'a) w postać lokalnego nieliniowego ugrupowania cząstek nośnika (8 albo 8'), przy czym cząstki nośnika (8) wytwarzane są w układzie trójfazowym pierwszym trzech niemieszających się cieczy A1, B1 i C1, gdzie faza A1 jest fazą dyspergowaną (kroplową), B1 fazą dyspergującą (pośrednią) zaś C1 fazą zewnętrzną, przy czym stosunek objętościowy faz A1 i B1 wynosi od 76:24 v/v do 90:10 v/v, przy czym zawartość cząstek nośnika (8 albo 8') w zawiesinie wynosi nie mniej niż 70% v/v dla cząstek sztywnych albo nie mniejszej niż 76% v/v dla cząstek nośnika z cieczy lub gazu, przy czym substrat (5 albo 5'a) stanowi substrat o właściwościach hydrofilowych albo fluorofilowych wybrany

PL 246693 Β1 z grupy obejmującej modyfikowany poliwęglan, szkło aktywowane plazmą O2 albo niemodyfikowany poliwęglan.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku zaburzenie obejmuje przegrupowanie się cząstek nośnika na powierzchni substratu w postać lokalnego nieliniowego ugrupowania cząstek nośnika.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku sekwencja zaburzeń zapisywana jest w postaci układu łańcuchów pomiędzy zaburzeniami i opisana jest wzorem

S = £i...L_M (III) gdzie:

S- sekwencja zaburzeń, tj. uporządkowany ciąg liczb całkowitych Li,

M- jest całkowitą liczbą wygenerowanych łańcuchów (M+1 jest liczbą wygenerowanych zaburzeń), Li - oznacza odległość między zaburzeniami i oraz /+1 mierzoną w średnicach cząstek nośnika, oraz gdzie pozycja lj, pojedynczej cząstki J nośnika w łańcuchu Li jest zdefiniowana wzorem

[1/+1] (IV) gdzie:

czynnik „+1” wynika stąd, że cząstek nośnika w łańcuchu pomiędzy zaburzeniami jest więcej o jedną niż wynosi odległość U między nimi, j- numeruje kolejne cząstki, gdzie j= i - numeruje kolejne łańcuchy L, gdzie i = 1,... ,M, i’ - numeruje kolejne łańcuchy L, gdzie i' = 1,...,/, przy czym każdej pojedynczej cząstce nośnika J w łańcuchu L, przypisuje się współrzędne [i,lj] na podstawie wzoru (IV) co zapisać można w postaci przyporządkowania ;->[ i,lj], Jako że każdej cząstce J przypisana jest inna para współrzędnych [i,lj], to również każdej parze [i,lj] przypisana jest jedna cząstka J, tj. istnieje jednoznaczne przyporządkowanie odwrotne [i,lj] -> J, określone również na podstawie wzoru (iv).

W innej korzystnej realizacji wynalazku wyodrębnia się z sekwencji S ciągi W = Li-n1...Li...Li+n-n1 zawierające każdy n łańcuchów, gdzie n, ni są ustalonymi liczbami całkowitymi, oraz n > ni > 0. W celu identyfikacji pojedynczej cząstki o współrzędnej lj w łańcuchu L, określa się odpowiadający temu łańcuchowi ciąg W, a następnie identyfikuje się go jako jeden z wyodrębnionych wcześniej ciągów Wi, w sekwencji S, co pozwala na określenie indeksu i. Następnie na podstawie wzoru (IV) określa się indeks cząstki J.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku każdy z n kolejnych łańcuchów U grupuje się w rozłączne ciągi W_r gdzie r = [/7n] = Ι,.,.^ΜΙη] jest indeksem numerującym kolejne ciągi, oraz gdzie nawias [...] oznacza część całkowitą, przy czym każdemu łańcuchowi U w ciągu W_r przypisuje się współrzędne [r,m] gdzie współrzędna m dana jest wzorem m = i-rn. (V)

W celu zidentyfikowania pojedynczej cząstki o współrzędnej lj, w m-tym łańcuchu w ciągu W_r, identyfikuje się na podstawie wzoru (V) indeks łańcucha i, a następnie na podstawie wzoru (IV) określa się indeks cząstki J.

Z fazy dyspergowanej w złączu T głowicy drukującej powstają cząstki nośnika w postaci kropli, które są zawieszone w fazie dyspergującej (pośredniej). Zawiesina cząstek nośnika po wytworzeniu faz z dyspergowanej i dyspergującej jest nanoszona na substrat w otoczeniu fazy trzeciej - zewnętrznej. Stąd też stosunek fazy trzeciej (zewnętrznej) do dwóch pierwszych faz (dyspergowanej i dyspergującej) może być dowolny.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku stosunek objętościowy faz A1 i B1 wynosi 86:14 v/v.

Korzystnie substrat o własnościach fluorofiłowych stanowi poliwęglan lub szkło pokryte warstwą o modyfikowane za pomocą mieszaniny zawierającej metylononafluoroizobutylowy, eter metylo-nonafluorobutylowy) i fluorowany silan (Novec 1720) lub etanol, 2-propanol, metanol, 2-(difluorometoksymetylo) 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan, 4-metoksy-1,1,1,2,2,3,3,4,4-nonafluorobutan (Aculon).

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku fazę A1 stanowi olej z grupy węglowodorów z dodatkiem surfaktantu, który stanowi monooleinian sorbitanu (SPAN80), albo woda albo mieszanina heksa dekanu oraz monooleinian sorbitanu w stosunku wagowym 100: x w/w gdzie 0.01 < x < 0.1 albo mieszanina wody z solą disodową bis(4-{etytlo[(3-sulfonatofenylo)metylo]amino}fenylo)(2-sulfonatofenylo)metylidu (Erioglaucyna), przy czym zawartość soli disodowej bis(4-{etytlo[(3-sulfonatofenylo)metylo]amino}fenylo)(2-sulfonatofenylo)metylidu w mieszaninie wynosi 0.1% w/w mieszaniny.

Korzystnie fazę B1 stanowi mieszanina wody z surfaktantem, który stanowi laurylosiarczan sodu (SDS) w stosunku wagowym 100:x w/w gdzie x > 1 albo mieszanina 3-etoksy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodekafluoro-2-trifluorometylo-heksanu (Novec 7500) z fluorosurfaktantem, który stanowi trójblokowy perfluoropolieter-poli(tlenek etylenu)-perfluoropolieter (PFPE-PEG-PFPE) w stosunku wagowym 100: x w/w mieszaniny, gdzie x > 1, albo mieszanina wody z surfaktantem wybranym z grupy obejmującej: monooleinian polioksymetylenosorbitanu (Tween 20) albo laurylosiarczan sodu albo mieszanina heksadekanu, oleju silikonowego o lepkości 5cSt oraz monooleinianu sorbitanu w stosunku wagowym odpowiednio od 70:30:1 w/w do 0:100: x w/w, gdzie korzystnie x jest w przedziale od 1 do 3.

Korzystnie fazę C1 stanowi mieszanina Novec 7500 z fluorosurfaktantem PFPE-PEG-PFPE w stosunku wagowym 100: x w/w, gdzie x > 1 albo olej węglowodorowy albo płyn fluorowany, korzystnie 3-etoksy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodekafluoro-2-trifluorometylo-heksan.

Korzystnie olej węglowodorowy jest wybrany z grupy obejmującej: heksadekan, olej mineralny, skwalen albo olej silikonowy.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji wynalazku cząstki nośnika wytwarza się w układzie trójfazowym drugim, przy czym fazę pierwszą A2 i fazę trzecią C2 stanowi powietrze, fazę drugą B2 stanowi wodny roztwór żelatyny z surfaktantem.

W innej korzystnej realizacji wynalazku fazę B2 stanowi mieszania wodnego roztworu żelatyny, korzystnie Type B bloom 225, przy czym zawartość żelatyny wynosi 5% w/v, z surfaktantem, korzystnie heksadecylotrimetyloamoniowy (CTAB), przy czym zawartość surfaktantu wynosi 0,5% w/v.

W kolejnej innej korzystnej realizacji wynalazku substrat jest schładzany do temperatury 5°C.

Drugim przedmiotem wynalazku jest urządzenie mikroprzepływowe do generacji monodyspersyjnych cząstek nośnika zawierające ruchomy układ drukujący połączony z układem nanoszącym, który jest połączony płynowo ze źródłem fazy dyspergowanej i fazy dyspergującej, charakteryzujące się tym, że ruchomy układ drukujący zawiera aktuator w kierunku Z połączony przesuwnie z aktuatorem w kierunku X, który zawiera ruchomą prowadnicę, przy czym do ruchomej prowadnicy zamocowany jest uchwyt, do którego jest zamocowany układ nanoszący zawierający głowicę drukującą, powstałą poprzez połączenie nierozłączne płytki dolnej i płytki górnej, przy czym płytka górna zwiera kanał wlotowy fazy dyspergowanej i kanał wlotowy fazy dyspergującej, płytka dolna zwiera kanał doprowadzający fazy dyspergowanej połączony z portem wlotowym fazy dyspergowanej, kanał doprowadzający fazy dyspergującej połączony z portem wlotowym fazy dyspergującej, przy czym kanał doprowadzający fazy dyspergowanej jest połączony z portem wlotowym fazy dyspergowanej, i płytka dolna zawiera kanał wylotowy połączony z komorą do mocowania igły nanoszącej, przy czym kanał wylotowy ma szerokość H i wysokość W, komora do mocowania igły nanoszącej ma wysokość i szerokość H1, przy czym komora do mocowania igły nanoszącej jest otrzymaną przez frezowanie na głębokości Hi - H' i płytki górnej i na głębokości H' płytki dolnej, przy czym całkowita wysokość Hi komory do mocowania igły nanoszącej wynosi Hi = 2H'-H, co zapewnia, że kanał doprowadzający jest współosiowy z komorą do mocowania igły nanoszącej, przy czym do układu nanoszącego przyłączony jest poprzez port wlotowy fazy dyspergującej za pomocą elastycznego połączenia płynowego zbiornik z fazą dyspergującą, i poprzez port wlotowy fazy dyspergowanej za pomocą elastycznego połączenia płynowego zbiornik z fazą dyspergowaną, i do komory do mocowania igły nanoszącej przyłączona jest igła nanosząca o średnicy zewnętrznej równej wysokości komory Hi.

W korzystnej realizacji wynalazku igła nanosząca zawiera dwa zgięcia pod kątem prostym, przy czym wlot igły jest równoległy do wylotu igły i są skierowane w tą samą stronę.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku igła nanosząca jest igłą prostą.

W innej korzystnej realizacji wynalazku szerokość kanału doprowadzającego wynosi W.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku wysokość H kanału doprowadzającego jest równa wysokości kanału szerokości kanału doprowadzającego W.

W jeszcze innej korzystnej realizacji wynalazku wysokość H kanału doprowadzającego jest większa lub równa szerokości W kanału doprowadzającego.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku komora do mocowania igły nanoszącej ma kwadratowy przekrój poprzeczny, przy czym wysokość i szerokość komory wynosi Hi.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku wewnętrzna średnica igły wynosi Di, przy czym Di > H. Dzięki spełnieniu tego warunku cząstki nośnika pozostają stabilne w momencie opuszczania igły i jednoczesnego nanoszenia na podłoże.

W jeszcze kolejnej korzystnej realizacji wynalazku wysokość komory Hi do mocowania igły nanoszącej jest większa od wysokości kanały doprowadzającego Hi > H. Warunek ten wynika bezpośrednio z warunku Di > H.

W jeszcze następnej kolejnej korzystnej realizacji wynalazku średnica wewnętrzna igły nanoszącej Di jest mniejsza od dwukrotności wysokości H kanału doprowadzającego Di<2H. Dzięki spełnieniu tego warunku cząstki nośnika układają się na wyjściu z igły nanoszącej jedna po drugiej, tak, że sekwencja nanoszenia ich na podłoże jest taka sama jak sekwencja wytwarzania.

Wynalazek ujawnia skalowalną i niezawodną metodę znakowania mikro-bioreaktorów, takich jak kropelki lub mikro-cząstki hydrożelu, które w dalszej części określamy po prostu „cząstkami nośnika”, poprzez ich sekwencyjne nanoszenie na podłoże w postaci liniowego łańcucha z zaburzeniami, tak, że poszczególne cząstki można zidentyfikować wyłącznie na podstawie charakterystycznej lokalnej sekwencji zaburzeń. Metoda nie wymaga dodatkowych cząstek „pasywnych”. Wszystkie cząstki mogą zawierać substancję czynną zaś ich pozycja w sekwencji zakodowana jest wyłącznie w uporządkowaniu przestrzennym. Uporządkowanie to dokonuje się w sposób spontaniczny wyłącznie poprzez oddziaływania między cząstkami i wewnętrzną dynamikę układu, tj. nie wymaga precyzyjnego pozycjonowania cząstek tak jak w przypadku macierzy 2D bazujących na użyciu „nanodołków” [13] lub innych metod precyzyjnego drukowania.

Zalety urządzenia wg wynalazku: (i) wytwarzanie monodyspersyjnych cząstek nośnika, np. kropel, o współczynniku polidyspersyjności CV < 3% (dla średnicy cząstek), (ii) wytwarzanie cząstek sekwencyjnie jedna po drugiej i ich nanoszenie na substrat w tej samej kolejności, (iii) wysoka zawartość cząstek w generowanej emulsji tj. powyżej 76% v/v, (iv) zastosowanie konfiguracji dysza-substrat umożliwiającej adsorpcję cząstek na substracie tj. odpowiednio mała odległość od substratu (rzędu średnicy kropel, ok. 200 mikrometrów), dopasowanie ukierunkowania wylotu dyszy do wyporności wytłaczanej zawiesiny (zgodnie z grawitacją w przypadku zawiesiny cięższej od fazy zewnętrznej, w kierunku przeciwnym w przypadku zawiesiny lżejszej od fazy zewnętrznej).

Przykłady realizacji wynalazku zostały zobrazowane na rysunku, gdzie przedstawiono na fig. 1: Przykłady liniowych wzorów z zaburzeniami, (a) Schematyczne przedstawienie metody znakowania cząstek w oparciu o strukturę łańcucha liniowego z zaburzeniami. Pokazano różne typy zaburzeń (ii.-v.). (b) Różne odstępy L między kolejnymi zaburzeniami stanowią „litery” alfabetu, tak, że sekwencja zaburzeń odpowiada sekwencji „liter”. Krótki sekwencje liter tworzą „słowa”. Pokazane są powtórzenia przykładowego słowa w łańcuchu dla liczb liter w słowie n = 2, 3, 4. Im dłuższe słowo, tym rzadziej występuje, zatem odpowiednio długie słowa mogą służyć jednoznacznemu znakowaniu zawartych w nich liter; fig. 2: Schematyczne przedstawienie urządzenia do generowania i nanoszenia kropelek na podłoże w formie łańcucha z zaburzeniami: (a) - dwie fazy ciekłe, (a1) zbliżenie igły, (b) - jedna faza ciekła; fig. 3: (a) Układ mikroprzepływowy ze wskazanymi przekrojami P-P'i Q-Q' i kierunkami rzutowania wzdłuż osi odpowiednio x i y. (Fig. 3b) Przekroje P-P' i Q-Q'. (Fig. 3c) Widok z boku (tj. wzdłuż osi y) na podłoże z naniesionymi kroplami. Wskazany jest kierunek grawitacji (symbol „g”). Panel i.: zbliżenie łańcucha - widok wzdłuż osi y - z widocznymi mostkami kapilarnymi (12). Panel ii.: zbliżenie łańcucha - widok wzdłuż osi x - z widoczną cienką warstwą fazy B na podłożu, (d) Widok wzdłuż osi z (od dołu tj. w kierunku przeciwnym do grawitacji) łańcucha liniowego bez zaburzeń (panel i.) i łańcucha z zaburzeniami (panel ii.). Również tutaj wskazany jest kierunek grawitacji. Zbliżenie segmentu liniowego łańcucha (panel iii.) i zgrubienia (panel iv.); fig. 4: (a) Widok z boku (tj. wzdłuż osi y) na podłoże z naniesionymi pęcherzykami. Wskazany jest kierunek grawitacji (symbol „g”). Panel i.: zbliżenie łańcucha - widok wzdłuż osi y. Panel ii.: zbliżenie łańcucha - widok wzdłuż osi x. (b) Widok wzdłuż osi z (od góry tj. w kierunku zgodnym z grawitacją) łańcucha liniowego bez zaburzeń (panel i.) i łańcucha z zaburzeniami (panel ii.). Również tutaj wskazany jest kierunek grawitacji. Zbliżenie segmentu liniowego łańcucha (panel iii.) i zgrubienia (panel iv.); fig. 5: (a).: zdjęcia kropel w eksperymencie w odstępach czasu 63 ms pokazujące mechanizm generowania zaburzenia w łańcuchu kropel (tj. zygzakowate przemieszczenie kropel w kierunku prostopadłym do osi łańcucha). W drugim panelu od góry strzałki wskazują kierunek przemieszczania się kropel. (b) Zdjęcia pokazujące kroplę wytworzoną na złączu T oraz łańcuchy bez zaburzeń wygenerowane przy różnych stosunkach objętości wody i oleju. (c) Łańcuch z zaburzeniami naniesiony na substrat. Obraz zrekonstruowano przez połączenie trzech zdjęć wykonanych w odstępach około 2 sekund (tło obrazu przetworzono dla lepszej widoczności). (d) łańcuch

PL 246693 Β1 z zaburzeniami utworzony przez pęcherzyki powietrza pod warstwą żelatyny naniesiony i utrwalony na zimnym szklanym podłożu. Linia kontaktu (substrat-żelatyna-powietrze) powyżej i poniżej łańcucha jest wyraźnie widoczna, (e) Fluorescencyjny obraz długiego łańcucha bąbelków wygenerowany przy użyciu żelatyny znakowanej fluoroforem TRITC. W (b) i (d) odległości między kolejnymi zaburzeniami, mierzone jako liczba rozdzielających je kropelek/pęcherzyków, są wskazane poniżej łańcucha. Zaznaczona skala to 500 pm we wszystkich panelach (a-d)

OPIS KONCEPCYJNY

Sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek według wynalazku polega na ich ułożeniu w liniowy łańcuch z regularnie - lecz losowo - rozmieszczonymi wzdłuż łańcucha zaburzeniami. W przypadku identycznych cząstek ułożonych w idealny liniowy łańcuch (fig. 1a, i.), poszczególne cząstki można zidentyfikować tylko poprzez bezpośrednie ponumerowanie kolejno wszystkich cząstek w łańcuchu. Jednak po wprowadzeniu losowych zaburzeń, uzyskany unikalny liniowy wzór zaburzeń może zostać wykorzystany do identyfikacji cząstek na podstawie lokalnej sekwencji zaburzeń, bez konieczności numerowania wszystkich cząstek. Zaburzenia mogą być uzyskane poprzez przemieszczenie wybranych cząstek wzdłuż łańcucha (fig. 1a, ii.), w poprzek łańcucha (fig. 1a, iii.) lub w sposób skoordynowany w obu kierunkach jednocześnie, w szczególności typu zygzakowatego (fig. 1a, iv.-v.).

Odległość L między kolejnymi zaburzeniami mierzoną w średnicach cząstek (Rys. 1 b), traktować można jako dyskretną zmienną losową. Sekwencja odległości Lr, L2, L3,... tworzy zatem unikalny cyfrowy kod. W dalszym ciągu, do opisu zbioru możliwych odległości L skorzystamy z pojęcia „alfabetu”, gdzie każda dyskretna odległość odpowiada określonej „literze”. Krótkie sekwencje odległości interpretować będziemy jako „słowa”. Każdą literę w bardzo długiej sekwencji można zidentyfikować poprzez jej skojarzenie z kilkoma sąsiednimi literami, razem tworzącymi krótką sekwencję liter czyli „słowo”. Do identyfikacji danej cząstki wdanej literze dodatkowo potrzebna jest jeszcze informacja nt. pozycji cząstki w literze. Rozważmy na przykład trzyliterowy alfabet {a,b,c} reprezentujący odpowiednio odległości L={3,4,5}. W takim przypadku, na przykład, jeśli zakodowana cząstka jest trzecią cząstką w drugiej literze czteroliterowego słowa „bcab”, pełną informację o kodowaniu można zapisać jako [„bcab”, 2, 3]. O ile więc słowo „bcab” występuje tylko raz w całej sekwencji, podana informacja wystarcza do jednoznacznej identyfikacji cząstki.

Aby ocenić zdolność danego alfabetu do jednoznacznego znakowania cząstek przy zadanej długości słowa, oszacujmy prawdopodobieństwo wystąpienia danego słowa w całej sekwencji. Ogólnie, zakładając, że alfabet składa się z k liter, z których każda występuje z takim samym prawdopodobieństwem /c¹, prawdopodobieństwo Pk(n) przypadkowego wystąpienia danego słowa zbudowanego z n liter wynosi k~ⁿ. W realizacjach eksperymentalnych dostępne litery to zwykle k kolejnych liczb całkowitych, tj. ko, ko+1, ..., ko+k-1, gdzie ko reprezentuje długość najkrótszej litery w alfabecie. W takim przypadku średnia (ang. average) długość liter wynosi L_av = ko + (k-1)/2. W przypadku zaburzeń typu pokazanego na Rys. 1a ii.-iv., tj. polegających na przemieszczeniu pojedynczych cząstek bez przemieszczania całego łańcucha, średnia liczba cząstek na literę (ang. letter) to po prostu Niett = L_av. W praktycznych realizacjach cząstki oddziałują poprzez silne przyciąganie na krótkich odległościach, w szczególności przez siły napięcia powierzchniowego. W takim przypadku jedyne stabilne konfiguracje to te, w których cząstki pozostają ściśle upakowane, tzn. takie, że odległość między sąsiednimi cząstkami pozostaje zawsze równa średnicy cząstki. W przypadku zaburzeń typu zygzak (Rys. 1a v.) każdemu zaburzeniu towarzyszy skurczenie się łańcucha o jedną średnicę cząstki; stąd otrzymujemy

Niett = Lav + 1 = ko + (k+l)/2. (I)

W takim przypadku, na przykład biorąc k = 4 oraz ko = 1, i kodując za pomocą słów zawierających n = 5 liter, prawdopodobieństwo Pk(n) jest na poziomie jednego promila, PĄ5) = 4^-5 = 0,097 ...%, podczas gdy średnia liczba cząstek na literę wynosi Niett = 3,5. Wydajność metody zdefiniować możemy jako średnią całkowitą (ang. totai) liczbę możliwych do jednoznacznego oznakowania cząstek, tj.

N_tot(k,n) = Niett/Pdn}. (II)

W powyższym przykładzie wydajność metody wynosi około 3500 cząstek. Innym istotnym parametrem jest średnia liczba cząstek Nword zawartych w pojedynczym słowie (ang. word). Jako że Nword = nNiett, np. dla k = 4 i n = 5 otrzymujemy Nword = 17.5. W związku z tym możemy oszacować, że w sekwencji składającej się z kilku tysięcy cząstek - po jednorazowym zeskanowaniu całej sekwencji

PL 246693 Β1 (np. podczas jej tworzenia) - wystarczy następnie zeskanować mniej niż 20 dowolnych kolejnych cząstek w celu jednoznacznej identyfikacji każdej z tych cząstek. Zauważamy, że w optymalnym przypadku liczba k liter tworzących „alfabet” powinna być możliwie mała. W przeciwnym razie w skład alfabetu musiałyby wejść litery odpowiadające dużym odległościom między zaburzeniami, co skutkowałoby zwiększeniem Niett, a więc i Nword. Warto zauważyć, że wielkość l/Nword interpretować możemy jako „rozdzielczość” metody. W rzeczywistych testach „rozdzielczość” kodowania przekładała się na efektywną rozdzielczość optyczną, tj. liczbę pikseli na cząstkę. W istocie, zakładając obrazowanie całego „słowa”, rozdzielczość optyczna na cząstkę wynosi x/N_Word, gdzie xjest (liniową) rozdzielczością kamery. Przy dostatecznie wysokiej x/N_Word identyfikacja cząstek i ilościowa analiza obrazu ich zawartości mogłaby być wykonana bez konieczności wykonywania dodatkowych zdjęć w różnych powiększeniach, zwiększając w ten sposób przepustowość analizy.

Proces znakowania i identyfikacji cząstek składa się z etapów: i) wytworzenia cząstek, ii) naniesienia cząstek na substrat/kodowania oraz iii) obrazowania/dekodowania.

I. Wytworzenie cząstek. Generowana jest sekwencja cząstek tak, aby każda cząstka zawierała unikalną mieszankę komórek i odczynników. Komórki i odczynniki są podawane do cząstek sekwencyjnie zgodnie z uprzednio zdefiniowanym protokołem, tak, że każda kolejna cząstka o numerze J = 1 ,.,.,Νzawiera znaną mieszaninę odczynników.

II. Naniesienie cząstek na substrat/kodowanie. Cząstki są następnie nanoszone na podłoże w postaci zaburzonego łańcucha liniowego. Skoncentrowana zawiesina cząstek przepływa przez dyszę o wewnętrznej średnicy Di, gdzie Di jest zbliżone do średnicy D cząstki. Jeśli cząstki są kroplami cieczy, korzystnym warunkiem jest Di< D (w przypadku kropel generowanych na złączu T z kanałem wylotowym o przekroju Η x H wiadomo [21], że D/H = (6/π/(1-^))^1/3, gdzie ^jest frakcją objętości kropel w zawiesinie; stąd, np. dla φ = 0.8 warunek ten odpowiada DilH <2.1, zaś dla φ= 0.9 mamy DilH < 2.7). Dzięki takiej konfiguracji cząstki układają się na wyjściu z dyszy jedna po drugiej, tak, że sekwencja nanoszenia ich na podłoże jest taka sama jak sekwencja wytwarzania. Dysza porusza się ze stałą prędkością U w kierunku równoległym do podłoża. Cząstki opuszczają dyszę i natychmiast przywierają do podłoża za pośrednictwem sił kapilarnych związanych z utworzeniem się mostku kapilarnego (złożonego z fazy ciekłej, w której zawieszone są cząstki) pomiędzy cząstką a podłożem. Mostki kapilarne tworzą się również między kolejnymi cząsteczkami. Siły kapilarne skutecznie stabilizują nanoszoną strukturę pod warunkiem, że mostki kapilarne mają wystarczająco małą objętość, tak, że pozostają rozłączne, tj., że nie ma przepływu cieczy pomiędzy sąsiednimi mostkami. W przeciwnym razie taki przepływ prowadziłby do reorganizacji łańcucha, a więc do utraty informacji zakodowanej w naniesionej strukturze. Minimalna frakcja objętości cząstek w zawiesinie powinna przekraczać około 70% dla sztywnych cząstek. Wartość ta wzrasta wraz ze spadkiem sztywności cząstek, tj. wzrostem ich deformowalności. Dla kropelek cieczy lub bąbelków gazu wynosi ona około 76%.

W przypadku, gdy tempo podawania (ang. feed) ffeed cząstek jedna po drugiej z dyszy na podłoże równe jest tempu unoszenia (ang. advection) fadv = UID cząstek przez podłoże, tj., gdy ffeed = fadv, cząstki nanoszone są na podłoże w postaci idealnie liniowego łańcucha; strukturę taką (13a) pokazano na fig. 3d i. W przypadku ffeed > fadv, podawanie dodatkowych cząstek prowadzi do ich przegrupowań tj. do powstania zaburzeń w łańcuchu. Ponieważ siły kapilarne skutkują silnym przyciąganiem między cząstkami, po przegrupowaniu cząstki pozostają wciąż ściśle upakowane. Ten warunek skutkuje powstaniem łańcucha z zaburzeniami w postaci regularnie powtarzających się zgrubień (lokalnych nieliniowych ugrupowań naniesionych cząstek). Po każdym przegrupowaniu krótki liniowy łańcuch kropelek jest ponownie osadzany aż do następnego przegrupowania itp.; strukturę taką (13b) pokazano na Rys. 3d ii. Przegrupowania kropel skutkujące zgrubieniami są powtarzalne, ale dokładna liczba cząstek wytworzonych między kolejnymi zgrubieniami zmienia się losowo wokół średniej wartości. Losowość ta jest niezbywalną cechą układu fizycznego elastycznych cząstek nanoszonych na substrat w obecności płynu i przypisać ją można zawsze w praktyce skończonej (większej od zera) polidyspersyjności cząstek, jak również wielociałowym elastycznym i hydrodynamicznym oddziaływaniom między cząstkami prowadzącymi do ich chaotycznej dynamiki. Zmienne odległości między kolejnymi zgrubieniami powodują wygenerowanie unikalnego czasoprzestrzennej sekwencji. Sekwencja zaburzeń jest rejestrowana i zapisywana w postaci sekwencji „liter”

S = Li...L_m (III)

PL 246693 Β1 gdzie M+1 jest całkowitą liczbą wygenerowanych zaburzeń, zaś kolejne „litery” U, odpowiadają odległościom między kolejnymi zaburzeniami. Na podstawie sekwencji każdej cząstce j przypisać można zawierającą ją literę U oraz pozycję /w tej literze. Matematycznie, 4 zdefiniować można jako ij=j-& [Wl (IV) gdzie czynnik „+1” pod sumą wynika z faktu, że cząstek w literze jest więcej ojeden niż wynosi odległość U między zgrubieniami (jest to powiązane z ułożeniem cząstek w poprzek łańcucha w każdym zgrubieniu). Podsumowując, procedura ta prowadzi do unikalnego przyporządkowania j -> [i,lj] umożliwiając również odwrotne przyporządkowanie tj. [i,lj] -> J.

III. Obrazowanie/dekodowanie. Po naniesieniu na podłoże cząstki są inkubowane. W tym czasie zachodzi reakcja biochemiczna lub biologiczna, np. wzrost lub śmierć komórek lub inna ich odpowiedź na zawarte w cząstkach składniki aktywne. Następnie cząstki są obrazowane. Obrazowanie powinno być optymalnie wykonane w taki sposób, aby umożliwić zarówno ilościową ocenę sygnału optycznego z poszczególnych cząstek (np. w celu oceny zmian morfologii komórek/tkanek lub zmian w intensywności fluorescencji, itp.), jak również identyfikację cząstek na podstawie lokalnej sekwencji zaburzeń w łańcuchu cząstek. Kluczowy element identyfikacji czy też dekodowania polega na grupowaniu liter tworzonych przez kolejne zaburzenia w krótkie sekwencje tj. „słowa”. Rozważymy teraz dwie możliwe różne procedury identyfikacji.

a. Identyfikacja pojedynczej cząstki na podstawie powiązanego pojedynczego „słowa”. W tym przypadku każdej cząstce przypisujemy pozycję /, w zawierającej ją literze L, zaś literę L grupujemy z sąsiednimi n-1 literami w słowo W, gdzie n jest ustalonym parametrem (długością słowa). Na przykład, jeśli n jest liczbą nieparzystą, słowo w, można wybrać tak, że dana litera U jest środkową literą w przypisanym jej słowie, tzn. że W = Lin... Li... Li+n’, gdzie n-(n-1)/2. Załóżmy teraz, że na podstawie obserwacji n kolejnych liter zidentyfikowaliśmy słowo W o środkowej literze L. Dekodowanie polega na odszukaniu słowa l/l/w sekwencji liter S. Jeśli słowo W występuje w sekwencji S tylko jeden raz, metoda pozwala na jednoznaczną identyfikację litery L, a więc określenie jej indeksu i. Identyfikacja danej cząstki, tj. określenie jej numeru sekwencyjnego J odbywa się poprzez przyporządkowanie [i,lj] -> J na podstawie wzoru (IV). W celu podania przykładu przyjmijmy alfabet składający się z k = 4 różnych liter, odpowiadających odległościom między zaburzeniami L = {1,2,3,4}, które oznaczać będziemy odpowiednio jako litery {a,b,c,d}. Dla przykładu rozważmy sekwencję:

= abdcdbadcabacccdbcbacbcdabdbcaabbdaacdbcacbcacadbcdbada, zawierającą M = 55 liter. Następnie, zakładając, że łańcuch rozpoczyna i kończy się zaburzeniem, sekwencja S odpowiada 244 cząstkom i M+1 = 56 zaburzeniom. Biorąc n = 5, możemy zatem wyróżnić Μ+1-η = 51 kolejnych „słów”, tj. kolejno W=i,2,3,... = {„abdcd”, „bdcdb”, „dcdba”,...}. W całej sekwencji S, 49 słów jest unikalnych tzn. każde z nich występuje tylko raz w sekwencji. Jednak jedno słowo („cdbad”) występuje dwa razy, mianowicie na pozycjach i = 4 oraz i = 50. Obecność „klonu” prowadzi w tym przypadku do niepewności w znakowaniu cząstek. Ponieważ centralna litera tego słowa to „b” odpowiadająca L = 2, jest to litera znakująca L+1 = 3 cząstki. W związku z tym błąd wynosi 3/244, czyli około 1,2%. Oznacza to, że biorąc n = 5, losowo wybraną cząstkę w sekwencji można zidentyfikować z niepewnością na poziomie około 1%. Zauważmy, że dokładność tą można by poprawić, wybierając dłuższe słowa do kodowania tj. zwiększając n, jednak odbyłoby się to kosztem rozdzielczości tj. wymagałoby obrazowania większej liczby cząstek w celu identyfikacji pojedynczego słowa.

b. Identyfikacja kolejnych cząstek poprzez sekwencyjne obrazowanie kolejnych słów. W przypadku skanowania liter jedna po drugiej, kolejne litery pogrupować możemy w słowa tak, że kolejne słowa Wr, gdzie r = Ι,.,.^ΜΙη] (nawias [...] oznacza część całkowitą), zawierają różne litery, tj. każda litera występuje tylko w jednym słowie. Procedura ta, w porównaniu do procedury opisanej w punkcie a., skutkuje mniejszą całkowitą liczbą słów: zamiast M-n+1 słów otrzymujemy [Min] słów. Mniejsza liczba słów oznacza mniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia „klonów”, a więc statystycznie mniejszy błąd w identyfikacji cząstek. W przypadku sekwencji S rozważanej w punkcie a., kolejne słowa to 1/1//=1,2,3,...= {„abdcd”, „badca”, „baccc”,...}. Łącznie otrzymujemy [55/5] = 11 słów. Wszystkie słowa Wr są unikalne, więc błąd wynosi 0%. W celu identyfikacji poszczególnych cząstek w danym słowie Wr, każdej cząstce przypisywana jest pozycja 1/ w zawierającej ją literze L, jak również pozycja m litery L w słowie Wr, gdzie m = 1,...,n. Następnie na podstawie wzoru

PL 246693 Β1 m = i - rn (V) określa się indeks i, tj. identyfikuje się literę Ljako literę U w sekwencji S. Następnie, indeks j może być jednoznacznie określony na podstawie wzoru (IV).

Procedura b. obejmuje skanowanie sekwencji słów jedno po drugim, jest więc ona zbliżona do prostego sekwencyjnego numerowania cząstek. Posiada jednak istotną zaletę, tj. niską podatność na błędy. W prostym sekwencyjnym numerowaniu cząstek, w przypadku jakiegokolwiek fizycznego zniekształcenia łańcucha (tj. np. w przypadku zniszczenia jednej z cząstek, powstania niekontrolowanego zaburzenia lub koalescencji cząstek), kolejność zliczania zostaje utracona i dalsza identyfikacja cząstek nie jest możliwa. Metoda opierająca się na przypisaniu cząstek „literom” i unikalnym „słowom” pozwala przywrócić porządek pomimo napotkanego zniekształcenia umożliwiając w ten sposób identyfikację pozostałych cząstek.

Opisana wyżej procedura ma kilka zalet w stosunku do istniejących metod znakowania. W szczególności: (i) umożliwia identyfikację pojedynczych cząstek na podstawie wyłącznie konfiguracji niewielkiej liczby sąsiednich cząstek bez konieczności skanowania całej sekwencji (zwłaszcza w wersji z punktu III.a. powyżej), (ii) w odróżnieniu od sekwencyjnego numerowania, w przypadku lokalnych fizycznych zniekształceń pojedynczych cząstek, ich zniszczenia, koalescencji itp. umożliwia identyfikację pozostałych cząstek, (iii) unika stosowania dodatków chemicznych lub dodatkowych „pasywnych” cząstek jako „kodów kreskowych”, (iv) w przeciwieństwie do metod opartych na liniowych sekwencjach kropel w kanale lub wężyku wypełnionym olejem, proponowana metoda nanoszenia cząstek na substrat umożliwia wymianę fazy zewnętrznej, przydatną np. w przypadku hodowli komórek wewnątrz cząstek.

Poniżej opisujemy metodę i urządzenie do nanoszenia mikro-kropel na podłoże, opierającą się na wykorzystaniu sił kapilarnych do spontanicznego przywierania kropel do podłoża jak również spontanicznego tworzeniu liniowego łańcucha kropel z zaburzeniami bez konieczności precyzyjnego pozycjonowania każdej z kropel. Stanowi to zwłaszcza zaletę w porównaniu do zaproponowanej wcześniej metody drukowania kwadratowych macierzy kropelek [13] wymagającej precyzyjnego pozycjonowania kropel w prefabrykowanych „nano-dołkach”.

PRZYKŁAD REALIZACJI 1

Urządzenie wytwarza monodyspersyjne mikrokrople wody, stanowiące cząstki nośnika, przy czym średnica kropel wynosi ok. 300 pm (odchylenie standardowe średnicy kropel rzędu 3%) i nanosi się je jedna po drugiej na podłoże (substrat) w postaci liniowego łańcucha z zaburzeniami lub jako łańcuch niezaburzony. Układ eksperymentalny pokazano na fig. 2a i fig. 3. Urządzenie składa się z mikroprzepływowego złącza T (1), czyli skrzyżowania mikrokanałów doprowadzających (2a), (2b) (patrz fig. 3a-b), wykonanych poprzez frezowanie w płytkach z poliwęglanu, łączonych następnie ze sobą, które razem służą jako głowica drukująca (3) (patrz fig. 2a-b). Mikrokanały mają korzystnie prostokątny przekrój poprzeczny o wysokości H i szerokości W, przy czym preferencyjnie H = W lub H > W (dla H < W reżim prędkości przepływu, przy których wytwarzane są kropelki, jest węższy lub krople nie są wytwarzane). W demonstracji używamy H = W = 150 pm. Głowica drukująca jest przymocowana za pośrednictwem uchwytu (4a) do prowadnicy (4), której ruch w kierunkach x i z kontrolowany jest z pomocą aktuatorów (4b) i (4c). W szczególności, podczas drukowania głowica porusza się równolegle do podłoża (5) ze stałą prędkością U. Dwie niemieszające się fazy ciekłe A1 i B1 są dostarczane do głowicy za pomocą pompy strzykawkowej (6). Wężyki (7) łączące strzykawki z głowicą muszą być elastyczne (np. wężyki PTFE o średnicy wewnętrznej 0.76 mm, zewn. 1.20 mm), aby umożliwić ruch translacyjny głowicy. Krzyżowanie się strumieni niemieszających cieczy na złączu T powoduje spontaniczne tworzenie monodyspersyjnych kropelek (8), które następnie są przepychane przez wąski kanał wylotowy (9) i igłę (10) o średnicy wewnętrznej Di, w sposób jedna po drugiej. W demonstracji używamy Di = 250 pm. Geometria złącza T pozwala na generowanie kropelek przy niskiej liczbie kapilarnej Ca oraz dużej frakcji objętości φ, tj. nawet do około Ca ~ 0.01 (w przeciwieństwie do np. geometrii złącza krzyżowego, ang. cross-flow, która generuje kropelki przy min. Ca ~ 0.1 [22]) oraz przy φ= 90% (fig. 5b). Można również zastosować inne geometrie złącza (takie jak ang. co-flow [23] lub flow-focusing [24]), jednak nie zawsze pozwalają one na generowanie kropelek przy wystarczająco dużej frakcji objętości (>76%, preferencyjnie ok. 86%). Igła (10) wsunięta jest do komory (11) o przekroju kwadratowym (Hi x Hi) w głowicy drukującej (patrz fig. 3b), tak, że kanał wylotowy (9) w głowicy i igła (10) są współosiowe. Taki sposób umiejscowienia igły w głowicy zapobiega niekontrolowanemu rozszczepianiu lub łączeniu kropel, które mogłoby wystąpić na łączu między kanałem wylotowym a igłą np. gdyby igła została umieszczona prostopadle do kanału wylotowego. Głowica drukująca (3) składa się z dolnej płytki (3a) i górnej płytki (3b), patrz fig. 3b. Kanały doprowadzające płyny do złącza T (1) są frezowane w dolnej płytce (3a), podczas gdy komora (11) jest frezowana zarówno w dolnej płytce (3a), jak i górnej płytce (3b) odpowiednio na głębokościach H' i Hi, gdzie Hi = 2H' - H. Takie proporcje gwarantują, że kanał wylotowy (9) i komora (11) są współosiowe. Dysza (10a), czyli wylot igły znajdujący się poza głowicą, umiejscowiony jest tuż nad podłożem, w odległości d około jednej średnicy kropli od podłoża, d®D, patrz fig. 3c. Taka konfiguracja umożliwia bezpośrednie nanoszenie kropelek na podłoże. W przypadku znacznie mniejszych odległości d kropelki rozpadłyby się w niekontrolowany sposób, podczas gdy w przypadku znacznie większych odległości kropelki w ogóle nie docierałyby do podłoża. Cienka warstwa fazy B1 rozprowadzona zostaje na podłożu przed rozpoczęciem nanoszenia kropel (fig. 3c i.) co pozwala na natychmiastowe przywieranie kropel do podłoża. Frakcja objętości kropel jest odpowiednio wysoka, tak, że faza B1 tworzy cienkie mostki kapilarne (12) między kroplami (fig. 3c ii.), ułatwiając tym samym ich samoorganizację w łańcuch (13). Zewnętrzną fazę ciekłą C1, tj. fazę otaczającą fazy A1 i B1, dobiera się tak, aby nie mieszała się z fazą B1, a korzystnie także z fazą A1, przy czym stosunek objętości fazy C1 do pozostałych faz nie ma znaczenia. W celu ustabilizowania kropelek przed koalescencją z innymi kroplami dodaje się surfaktant do fazy B1. Trzy fazy ciekłe są wybrane tak, że faza kroplowa A1 jest preferencyjnie „całkowicie zwilżana” (ang. completely engulfed [25]) przez fazę okalającą B1, to znaczy faza B1 spontanicznie „okala” fazę A1. Odpowiada to następującemu warunkowi dla napięć powierzchniowych (międzyfazowych): yab +ybc < yac [25]. Ponadto, warunkiem równowagi mechanicznej łańcucha jest yab ^ ybc lub yab > ybc. W przypadku yab << ybc kropelki ulegałyby silnemu odkształceniu przez siły kapilarne, co powodowałoby reorganizację kropel i w efekcie pękanie łańcucha. Podłoże dobiera się w taki sposób, aby miało niską energię powierzchniową z fazą B1, dzięki czemu faza B1 ma niższy kąt zwilżania z podłożem niż faza A1, a preferencyjnie również niższy lub podobna jak faza C1. W przypadku fazy zewnętrznej C1 o gęstości większej niż gęstości pozostałych dwóch faz, kropelki po opuszczeniu dyszy są unoszone w górę przez siłę wyporu. W takim przypadku, aby umożliwić przywieranie kropelek do podłoża, wylot igły (10) powinien być skierowany do góry (fig. 2a). W tym celu igła jest zgięta o 180 stopni (2 zgięcia o 90 stopni). W korzystnym przykładzie realizacji wykorzystano wodę z Euroglaucyną (niebieski barwnik) w stężeniu 0,1% w/w jako fazę A1, mieszaninę oleju silikonowego (lepkość 5cSt), heksadekanu, i środka powierzchniowo czynnego SPAN80 w proporcji 70:30:1 w/w jako fazę B1, płyn fluorowany Novec 7500 jako fazę C1. Skład fazy B1, dobrany jest pod kątem uzyskania możliwie niskiego napięcia powierzchniowego z fazą C1 poprzez możliwie duży procentowy udział oleju silikonowego, który ma niższe napięcie powierzchniowe z Novekiem 7500 niż heksadekan. Stosunek oleju silikonowego do heksadekanu 70:30 w/w odpowiada maksymalnemu udziałowi oleju silikonowego w mieszaninie, który wciąż gwarantuje rozpuszczalność w niej surfaktantu SPAN80 (dla wyższych udziałów oleju silikonowego następuje precypitacja SPAN80). Dla takiego składu fazy B1 stosunek objętości fazy A1 do fazy B1 gwarantujący stabilność łańcucha mieści się w przedziale od 76:24 v/v do 90:10 v/v (fig. 5a-b). Dla stosunków mniejszych niż 76:24 v/v łańcuchy stają się niestabilne natomiast dla stosunków większych niż 90:10 v/v generowanie kropel na złączu typu T przestaje być powtarzalne. Innym możliwym wyborem dla fazy B1 jest mieszanina oleju silikonowego, heksadekanu i SPAN80 w innych proporcjach, np. 60:40:1 w/w, 50:50:1 w/w itd., aż do 0:100:1 w/w jednak stabilność łańcuchów w tych przypadkach jest niższa. Jako podłoża używa się płytki z poliwęglanu.

Można również zastosować olej jako fazę A1, wodę jako fazę B1 i płyn fluorowany Novec 7500 jako fazę C1, pod warunkiem, że warunki napięć międzyfazowych są spełnione i że podłoże jest hydrofilowe. Możliwym wyborem jest w takim przypadku heksadekan z dodatkiem SPAN80 w proporcji między 100:0.01 w/w a 100:0.1 w/w jako faza A1, woda z surfaktantem Tween 20 lub SDS (laurylosiarczan sodu) w proporcji 100:1 w/w jako faza B1, oraz Novec 7500 z fluorosurfaktantem PFPE-PEG-PFPE [26] w proporcji 100:1 w/w jako faza C1. Ściany mikrokanałów w głowicy drukującej muszą być zmodyfikowane w celu podniesienia ich hydrofilowości np. metodą opisaną w literaturze [27]. Podłoże musi być hydrofilowe, np. może to być szkło aktywowane plazmą O2.

Kolejnym możliwym zestawem płynów jest woda jako faza A1, Novec 7500 z fluorosurfaktantem PFPE-PEG-PFPE w proporcji 100:1 w/w jako faza B1, oraz heksadekan lub inny olej węglowodorowy (np. olej mineralny lub skwalen) lub silikonowy jako faza C1. W tym przypadku generowana emulsja (złożona z faz A1 i B1) ma ciężar właściwy wyższy niż faza zewnętrzna C1, tak więc wylot igły musi znajdować się nad substratem (a nie pod nim). W tym przypadku stosuje się prostą igłę (10') (fig. 2b) zamiast zagiętej (10). Podłoże musi mieć właściwości fluorofilowe. Takie podłoże uzyskuje się poprzez użycie poliwęglanu lub szkła zmodyfikowanego powierzchniowo odczynnikiem Novec 1720 lub Aculon.

Urządzenie generuje idealnie liniowe łańcuchy (13a) lub łańcuchy z zaburzeniami (13b), patrz fig. 3d i. oraz ii. Każde zaburzenie (14) (fig. 3b iv.) jest generowane przez lokalne przegrupowanie kropelek i połączenie mostków kapilarnych (12) (fig. 3b iii.), w wyniku, czego powstaje pojedynczy „rozgałęziony” mostek kapilarny (15) (fig. 3b iv.). Przegrupowanie zachodzi na podłożu natychmiast po kontakcie kropelek z podłożem (w przypadku zestawu płynów woda/olej/płyn fluorowany zajmuje to ok. 0.2 s, patrz fig. 5a). Proces nanoszenia kropel na podłoże, w tym ich przegrupowanie, pokazano na fig. 5a. Warunkiem skutecznego kodowania informacji jest to, żeby, po wygenerowaniu, łańcuch był stabilny tzn. żeby nie następowały dalsze niekontrolowane przegrupowania kropel. Jak wspomniano, w tym celu konieczne jest zastosowanie odpowiednio dużego stosunku fazy dyspergowanej do fazy dyspergującej (fig. 5b). Odległości L między kolejnymi zaburzeniami w łańcuchu naniesionym na podłoże zmieniają się przypadkowo wzdłuż łańcucha, fluktuując wokół średniej wartości (zbliżonej do 6, fig. 5c), co umożliwia kodowanie informacji. Stabilne łańcuchy.

PRZYKŁAD REALIZACJI 2

To samo złącze T zasilane powietrzem jak fazą A2, wodnym roztworem żelatyny (Type B bloom 225) o stężeniu około 5% w/v z surfaktantem CTAB w ilości około 0,5% w/v jako fazą B2 i powietrzem jako fazą C2 (tj. faza C2 = faza A2) jest wykorzystywane do generowania sekwencji monodyspersyjnych pęcherzyków i nanoszenia ich na podłoże (fig. 2b, fig. 4a-b). Urządzenie demonstruje możliwość generowania struktur z hydrożelem jako fazą B2. Urządzenie jest wyposażone w stalową igłę (10') bez zagięć, skierowaną w dół z wylotem umieszczonym blisko podłoża (5'a). Podłoże (np. szkło) nie powinno być hydrofobowe i musi być schładzane poniżej temperatury topnienia żelatyny, najlepiej do około 5°C i pozostawać w tej temperaturze podczas nanoszenia na nie struktur. Podłoże (5'a) spoczywać może na mosiężnej płycie (5'b) w kontakcie z termostatem (np. kąpielą wodną). W kontakcie z chłodnym podłożem żelatyna szybko zestala się (w ciągu kilku sekund), co zapewnia trwałą stabilność nanoszonej struktury. Zaburzenia pojawiają się spontanicznie przez przegrupowanie pęcherzyków, które podobnie jak w Przykładzie 1 następuje natychmiast po kontakcie pęcherzyków z podłożem (czas poniżej 0.2 s), tj. jeszcze przed zestaleniem się żelatyny. Otrzymane eksperymentalnie struktury pokazano na fig. 5d-e. Podobnie jak w Przykładzie 1 (fig. 5d) odległości L między kolejnymi zaburzeniami w łańcuchu naniesionym na podłoże zmieniają się przypadkowo wzdłuż łańcucha, fluktuując wokół średniej wartości (zbliżonej do 9, fig. 5e).

OZNACZENIA:

(1)	złącze T,
(2a)	kanał doprowadzający dla fazy A,
(2b)	kanał doprowadzający dla fazy B,
(2c)	port wlotowy dla fazy A,
(2d)	port wlotowy dla fazy B,
(3)	głowica drukująca,
(3a)	dolna płytka,
(3b)	górna płytka,
(4)	prowadnica
(4a)	uchwyt,
(4b)	aktuator w kierunku x,
(4c)	aktuator w kierunku z,
(5)	podłoże (substrat),
(5’a)	chłodne podłoże,
(5’b)	płyta chłodząca,
(6)	pompa strzykawkowa,
(6’a)	regulator ciśnienia dla fazy A (źródło fazy dyspergowanej),
(6’b)	pompa strzykawkowa dla fazy B (źródło fazy dyspergującej),
(7)	wężyki doprowadzające,
(8)	kropla,
(8’)	pęcherzyk,

(9) kanał doprowadzający, (10) wygięta igła, (10a) dysza wylotowa, (10’) prosta igła, (11) komora do mocowania igły, (12) mostek kapilarny między kroplami, (13) łańcuch kropel: (13a) - bez zaburzeń, (13b) - z zaburzeniami, (14) zaburzenie/zgrubienie łańcucha (kropelki po przegrupowaniu), (15) połączone mostki kapilarne w zgrubieniu.

LITERATURA

1. Sonnen, K.F. and C.A. Merten, Microfluidics as an Emerging Precision Tool in Developmental Biology. Developmental Cell, 2019. 48(3): p. 293-311.

2. Klein, A.M., et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell, 2015. 161(5): p. 1187-1201.

3. Shembekar, N., et al., Single-Cell Droplet Microfluidic Screening for Antibodies Specifically Binding to Target Cells. Cell Reports, 2018. 22(8): p. 2206-2215.

4. Wong, A.H.H., et al., Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Scientific Reports, 2017. 7.

5. Eduati, F., et al., A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nature Communications, 2018. 9.

6. Kaminski, T.S., O. Scheler, and P. Garstecki, Droplet microfluidics for microbiology: technigues, applications and challenges. Lab on a Chip, 2016.16(12): p. 2168-2187.

7. Straussman, R., et al., Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGFsecretion. Nature, 2012. 487(7408): p. 500-U118.

8. Bray, L.J. and C. Werner, Evaluation of Three-Dimensional in Vitro Models to Study Tumor Angiogenesis. Acs Biomaterials Science & Engineering, 2018. 4(2): p. 337-346.

9. Brouzes, E., et al., Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughpu screening . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(34): p. 14195-14200.

10. Kulesa, A., et al., Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018. 115(26): p. 66856690.

11. Macosko, E.Z., et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell, 2015.161(5): p. 1202-1214.

12. Rotem, A., et al.,. Single-cell ChlP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology, 2015. 33(11): p. 1165-U91.

13. Cole, R.H., et al., Printed droplet microfluidics for on demand dispensing of picoliter droplets and cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017. 114(33): p. 8728-8733.

14. Churski, K., et al., Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab on a Chip, 2012. 12(9): p. 1629-1637.

15. Boedicker, J.Q., et al., Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a Chip, 2008. 8(8): p. 1265-1272.

16. Cao, J.L., et al., Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab on a Chip, 2012. 12(3): p. 474-484.

17. Song, W.Y., et al., Encoding Microreactors with Droplet Chains in Microfluidics. Acs Sensors, 2017. 2(12): p. 1839-1846.

18. Gerver, R.E., et al., Programmable microfluidic synthesis of spectrally encoded microspheres. Lab on a Chip, 2012. 12(22): p. 4716-4723.

19. Ding, Y., et al. A high-throughput droplet-basedmicrofluidic barcode generator, in MicroTAS 17th International Conference on Miniturized Systems for Chemistry and Life Sciences . 2013. Freiburg, Germany.

20. Tomasi, R.F.X., et al., Studying 3D cell cultures in a microfluidic droplet array under multiple time-resolved conditions. biorXiv, 2018: p. DOI: 10.1101/407759.

21. Garstecki, P., et al., Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction scaling and mechanism of break-up. Lab on a Chip, 2006. 6(3): p. 437-446.

22. Abate, A.R., et al., Impact of inlet channel geometry on microfluidic drop formation. Physical Review E, 2009. 80: p. 026310.

23. Kim, S.H., et al., Packing of Emulsion Droplets: Structural andFunctionalMotifs for MultiCored Microcapsules. Advanced Functional Materials, 2011.21(9): p. 1608-1615.

24. Costantini, M., et al., Highly ordered and tunable polyHIPEs by using microfluidics. Journal of Physical Chemistry B, 2014. 2: p. 2290-2300.

25. Torza, S. and S.G. Mason, Coalescence of 2 immiscible liguid drops. Science, 1969. 163(3869): p. 813-814.

26. Holtze, C., et al., Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip, 2008. 8(10): p. 1632-1639.

27. Jankowski, P., et al., Hydrophilicpolycarbonate chips forgeneration of oil-in-water (O/W) and water-in-oil-in-water (W/O/W) emulsions. Microfluidics and Nanofluidics, 2013. 14(3-4): p. 597-604.

Claims (23)

1. Sposób znakowania monodyspersyjnych cząstek nośnika obejmujący etapy:

a) zapewnienie urządzenia mikroprzepływowego do generacji monodyspersyjnych cząstek nośnika i nanoszenia cząstek nośnika na substrat,

b) wytworzenia cząstek nośnika w zawiesinie,

c) nanoszenia cząstek nośnika na substrat,

d) obrazowania, przy czym etap obrazowania obejmuje:

e) identyfikowanie wybranej pojedynczej cząstki nośnika i/lub

f) identyfikowanie kolejno wszystkich cząstek nośnika, gdzie na etapie wytworzenia cząstek nośnika wytwarza się zawiesinę cząstek nośnika, stanowiących fazę dyspergowaną w fazie dyspergującej, przy czym każda z cząstek nośnika zawiera mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, przy czym komórki i/lub substancje chemiczne podaje się do cząstek nośnika sekwencyjnie w taki sposób, że kolejna wytworzona cząstka nośnika zawiera znaną mieszaninę komórek i/lub substancji chemicznych, i na etapie nanoszenia cząstek nośnika na substrat, stanowiący podłoże do nanoszenia, nanosi się cząstki nośnika na substrat w postaci łańcucha, znamienny tym, że cząstki nośnika (8 albo 8') zawierające komórki i/lub substancje chemiczne w zawiesinie nanosi się z igły nanoszącej (10 albo 10') jedna po drugiej na powierzchnię substratu (5 albo 5'a), przy czym gdy tempo podawania ffeed cząstek nośnika (8 albo 8') z igły nanoszącej (10 albo 10') na powierzchnię substratu (5 albo 5'a) jest równe tempu unoszenia fadv = U/D cząstek nośnika (8 albo 8') przez substrat (podłoże), gdzie U to prędkość przemieszczania się głowicy drukującej (3) a D to średnica cząstki nośnika (8 albo 8'), określone wyrażeniem fadv = ffeed, to cząstki nośnika (8 albo 8') są nanoszone w postaci liniowego łańcucha (13), przy czym gdy ffeed > fadv to cząstki nośnika (8 albo 8') są nanoszone jako łańcuch zawierający sekwencje zaburzeń (13a), i na etapie obrazowania identyfikuje się pojedynczą cząstkę nośnika i/lub cząstki nośnika (8 albo 8') na podstawie wytworzonej sekwencji zaburzeń w naniesionym łańcuchu cząstek nośnika, przy czym zaburzenie obejmuje przegrupowanie się cząstek nośnika (8 albo 8') na powierzchni substratu (5 albo 5'a) w postać lokalnego nieliniowego ugrupowania cząstek nośnika (8 albo 8'), przy czym cząstki nośnika (8) wytwarzane są w układzie trójfazowym pierwszym trzech niemieszających się cieczy A1, B1 i C1, gdzie faza A1 jest fazą dyspergowaną (kroplową),

PL 246693 Β1

B1 fazą dyspergującą (pośrednią) zaś C1 fazą zewnętrzną, przy czym stosunek objętościowy faz A1 i B1 wynosi od 76:24 v/v do 90:10 v/v, przy czym zawartość cząstek nośnika (8 albo 8') w zawiesinie wynosi nie mniej niż 70% v/v dla cząstek sztywnych albo nie mniejszej niż 76% v/v dla cząstek nośnika z cieczy lub gazu, przy czym substrat (5 albo 5'a) stanowi substrat o właściwościach hydrofilowych albo fluorofilowych wybrany z grupy obejmującej modyfikowany poliwęglan, szkło aktywowane plazmą O2 albo niemodyfikowany poliwęglan.

2. Sposób znakowania wg zastrz. od 1, znamienny tym, że sekwencja zaburzeń zapisywana jest w postaci ciągu liczb odpowiadających długości liniowych segmentów łańcucha pomiędzy kolejnymi zaburzeniami i opisana jest wzorem (III)

S = Li...L_m (III) gdzie:

S-sekwencja długości liniowych segmentów łańcucha, tj. uporządkowany ciąg liczb całkowitych Li,

M - całkowita liczba wygenerowanych segmentów łańcucha (M+1 jest liczbą wygenerowanych zaburzeń),

Li - długość segmentu łańcucha i tj. odległość między zaburzeniami i oraz /+1 mierzoną w średnicach cząstek nośnika, oraz gdzie pozycja lj pojedynczej cząstki J nośnika w segmencie L/jest zdefiniowana wzorem (IV)

[ir+1], (IV) gdzie:

czynnik „+1” wynika stąd, że cząstek nośnika (8 albo 8') w łańcuchu pomiędzy zaburzeniami jest więcej o jedną niż wynosi odległość U między nimi, j- numeruje kolejne cząstki, gdzie j = i - numeruje kolejne segmenty łańcucha Li, gdzie i = 1 ,.,.,Μ, i'- numeruje kolejne segmenty łańcucha Li, gdzie i' = 1,...,/, przy czym każdej pojedynczej cząstce nośnika (8 albo 8') j w segmencie łańcucha U przypisuje sie współrzędne [i,lj] na podstawie wzoru (IV) co zapisać można w postaci przyporządkowania j 4 [iJj]·

3. Sposób znakowania wg zastrz. 2, znamienny tym, że wyodrębnia się z sekwencji S ciągi W, ⁼ Li-nl··· Li...Li+n-rT\ zawierające każdy n długości segmentów łańcucha, gdzie n, m są ustalonymi liczbami naturalnymi oraz n > m > 0.

4. Sposób znakowania wg zastrz. od 2 do 3, znamienny tym, że każde n kolejnych długości segmentów łańcucha U grupuje się w rozłączne ciągi 1/14, gdzie r = [/7n] = Ι,.,.^ΜΙη] jest indeksem numerującym kolejne ciągi, oraz gdzie nawias [...] oznacza część całkowitą, przy czym każdemu segmentowi łańcucha Li w ciągu 1/14 przypisuje się współrzędne [r,m] gdzie współrzędna m dana jest wzorem (V) m = i - rn. (V)

5. Sposób znakowania wg zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek objętościowy faz A1 i B1 wynosi 86:14 v/v.

6. Sposób znakowania wg zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że substrat o własnościach fluorofilowych stanowi poliwęglan lub szkło pokryte warstwą o modyfikowane za pomocą mieszaniny zawierającej eter metylononafluoroizobutylowy, eter metylononafluorobutylowy i fluorowany silan lub mieszaniny zawierającej etanol, 2-propanol, metanol, 2-(difluorometoksymetylo) 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan, 4-metoksy-1,1,1,2,2,3,3,4,4-nonafluorobutan.

7. Sposób znakowania wg zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że fazę dyspergowaną A1 stanowi olej węglowodorowy z dodatkiem surfaktantu monooleinian sorbitanu albo woda albo mieszanina heksadekanu oraz surfaktantu monooleinian sorbitanu w stosunku wagowym 100:x w/w gdzie 0.01 < x < 0.1 albo mieszanina wody z solą disodową bis(4-{etytlo[(3-sulfonatofenylo)metylo]amino}fenylo)(2-sulfonatofenylo)metylidu, przy czym zawartość soli disodowej bis(4-{etytlo[(3-sulfonatofenylo)metylo]amino}fenylo)(2-sulfonatofenylo)metylidu w mieszaninie wynosi 0.1% w/w mieszaniny.

8. Sposób znakowania wg zastrz. 1 albo 5, znamienny tym, że fazę dyspergującą B1 stanowi mieszanina wody z surfaktantem laurylosiarczanem sodu w stosunku wagowym 100:x w/w gdzie x > 1 albo mieszanina 3-etoksy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodekafluoro-2-trifluorometyloheksanu z fluorosurfaktantem, który stanowi trójblokowy perfluoropolieter-poli(tlenek etylenu)perfluoropolieter w stosunku wagowym 100:x w/w mieszaniny, gdzie x > 1, albo mieszanina wody z surfaktantem wybranym z grupy obejmującej: monooleinian polioksymetylenosorbitanu albo laurylosiarczan sodu albo mieszanina heksadekanu, oleju silikonowego o lepkości 5cSt oraz surfaktantu monooleinian sorbitanu w stosunku wagowym odpowiednio od 70:30:1 w/w do 0:100: x w/w, gdzie korzystnie x jest w przedziale od 1 do 3.

9. Sposób znakowania wg. zastrz. 1, znamienny tym, że fazę zewnętrzną C1 stanowi mieszanina 3-etoksy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodekafluoro-2-trifluorometylo-heksan z fluorosurfaktantem, który stanowi trójblokowy perfluoropolieter-poli(tleneketylenu)-perfluoropolieter w stosunku wagowym 100:x w/w, gdzie x > 1 albo olej węglowodorowy albo płyn fluorowany, korzystnie 3-etoksy-1,1,1,2,3,4,4,5,5,6,6,6-dodekafluoro-2-trifluorometylo-heksan.

10. Sposób znakowania wg zastrz. 7, albo 9, znamienny tym, że olej węglowodorowy jest wybrany z grupy obejmującej: heksadekan, olej mineralny, skwalen albo olej silikonowy.

11. Sposób znakowania wg zastrz. 1, znamienny tym, że cząstki nośnika (8') wytwarza się w układzie trójfazowym drugim, przy czym fazę dyspergowaną (pierwszą) A2, i fazę zewnętrzną (trzecią) C2 stanowi powietrze, fazę dyspergującą (drugą) B2 stanowi wodny roztwór żelatyny z surfaktantem.

12. Sposób znakowania wg zastrz. 1 albo 11, znamienny tym, że fazę B2 stanowi mieszanina wodnego roztworu żelatyny, korzystnie Type B bloom 225, przy czym zawartość żelatyny wynosi 5% w/v, z surfaktantem, korzystnie bromek heksadecylotrimetyloamoniowy, przy czym zawartość surfaktantu wynosi 0,5% w/v.

13. Sposób znakowania wg zastrz. 1, znamienny tym, że substrat (5'a) jest schładzany do temperatury 5°C.

14. Urządzenie mikroprzepływowe do generacji monodyspersyjnych cząstek nośnika zawierające ruchomy układ drukujący połączony z układem nanoszącym, który jest połączony płynowo ze źródłem fazy dyspergowanej i fazy dyspergującej, znamienne tym, że ruchomy układ drukujący zawiera aktuator w kierunku Z (4c) połączony przesuwnie z aktuatorem w kierunku X (4b), który zawiera ruchomą prowadnicę, przy czym do ruchomej prowadnicy (4) zamocowany jest uchwyt (4a), do którego jest zamocowany układ nanoszący zawierający głowicę drukującą (3), powstałą poprzez połączenie nierozłączne płytki dolnej (3a) i płytki górnej (3b), przy czym płytka górna (3b) zwiera kanał wlotowy fazy dyspergowanej (2c) i kanał wlotowy fazy dyspergującej (2d), płytka dolna (3a) zwiera kanał doprowadzający fazy dyspergowanej (2a) połączony z portem wlotowym fazy dyspergowanej (2c), kanał doprowadzający fazy dyspergującej (2b) połączony z portem wlotowym fazy dyspergującej (2d), przy czym kanał doprowadzający fazy dyspergowanej (2a) jest połączony z portem wlotowym fazy dyspergowanej (2c), i płytka dolna (3a) zawiera kanał doprowadzający (9) połączony z komorą (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10'), przy czym kanał doprowadzający (9) ma szerokość H i wysokość W, i komora (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') ma wysokość i szerokość Hi, przy czym komora (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') jest otrzymana przez frezowanie na głębokości Hi - H' płytki górnej (3b) i płytki dolnej (3a) na głębokości H', przy czym całkowita wysokość Hi komory (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') wynosi Hi = 2H-H, co zapewnia, że kanał doprowadzający (9) jest współosiowy z komorą (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10'), przy czym do układu nanoszącego przyłączony jest poprzez kanał wlotowy fazy dyspergującej (2d) za pomocą elastycznego połączenia płynowego (7) zbiornik z fazą dyspergującą (Faza B), i poprzez kanał wlotowy fazy dyspergowanej (2c) za pomocą elastycznego połączenia płynowego jest przyłączony zbiornik z fazą dyspergowaną (Faza A), i do komory (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') przyłączona jest igła nanosząca (10 albo 10') o średnicy zewnętrznej równej wysokości komory Hi.

15. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 14, znamienne tym, że igła nanosząca (10') zawiera dwa zgięcia pod kątem prostym, przy czym wlot igły (10') jest równoległy do wylotu igły i są skierowane w tą samą stronę.

16. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 15, znamienne tym, że igła nanosząca (10) jest igłą prostą.

17. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 14, znamienne tym, że szerokość kanału doprowadzającego (9) wynosi W.

18. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 14, znamienne tym, że wysokość H kanału doprowadzającego (9) jest równa szerokości W kanału doprowadzającego (9).

19. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 14, znamienne tym, że wysokość H kanału doprowadzającego (9) jest większa lub równa szerokości W kanału doprowadzającego (9).

20. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 14, znamienne tym, że komora (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') ma kwadratowy przekrój poprzeczny, przy czym wysokość i szerokość komory (11) wynosi H1.

21. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 15, znamienne tym, że wewnętrzna średnica igły (10 albo 10') wynosi D1, przy czym D1 > H.

22. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 20, znamienne tym, że wysokość H1 komory (11) do mocowania igły nanoszącej (10 albo 10') jest większa od wysokości kanału doprowadzającego, co wyraża zależność Hi > H.

23. Urządzenie mikroprzepływowe wg zastrz. 15, znamienne tym, że średnica wewnętrzna igły nanoszącej (10 albo 10') D1 jest mniejsza od dwukrotności wysokości H kanału doprowadzającego (9), co wyraża zależność Di < 2H.