PL246485B1 - Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus - Google Patents
Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus Download PDFInfo
- Publication number
- PL246485B1 PL246485B1 PL442091A PL44209122A PL246485B1 PL 246485 B1 PL246485 B1 PL 246485B1 PL 442091 A PL442091 A PL 442091A PL 44209122 A PL44209122 A PL 44209122A PL 246485 B1 PL246485 B1 PL 246485B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- amino acid
- seq
- acid sequence
- protein
- uberis
- Prior art date
Links
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 title claims abstract description 62
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 title claims abstract description 54
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 44
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 title claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 31
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 28
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 21
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 108010049977 Peptide Elongation Factor Tu Proteins 0.000 claims description 10
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 claims description 7
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 16
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 claims 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 35
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 66
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 19
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 16
- 108010056458 bacterial fibronectin-binding proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000008153 Peptide Elongation Factor Tu Human genes 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229920003043 Cellulose fiber Polymers 0.000 description 4
- 102100032241 Lactotransferrin Human genes 0.000 description 4
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 4
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 3
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 3
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241000193990 Streptococcus sp. 'group B' Species 0.000 description 2
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000144980 herd Species 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710154868 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100038222 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101710162806 Accumulation-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 241000193792 Aerococcus viridans Species 0.000 description 1
- 101710160787 Aldehyde reductase YahK Proteins 0.000 description 1
- 101100257798 Arabidopsis thaliana GBSS1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031462 Bovine Mastitis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009641 CAMP test Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 208000010711 Cattle disease Diseases 0.000 description 1
- 101710104159 Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- 101710108115 Chaperonin GroEL, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 241001508000 Corynebacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 1
- 241000178336 Enterococcus cecorum Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710128530 Fibrinogen-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710184712 GTPase Obg Proteins 0.000 description 1
- 108050005366 Galactose-6-phosphate isomerase subunit LacA Proteins 0.000 description 1
- 101710116987 Heat shock protein 60, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 101710198870 Molybdenum cofactor biosynthesis protein B Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001138504 Mycoplasma bovis Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000010562 Peptide Elongation Factor G Human genes 0.000 description 1
- 108010077742 Peptide Elongation Factor G Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101000620341 Staphylococcus aureus Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 1
- 241000422857 Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid Chemical compound OC(=O)C(\C#N)=C\C1=CC=C(O)C=C1 AFVLVVWMAFSXCK-VMPITWQZSA-N 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000007623 carbamidomethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 102000025748 fibrinogen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000016089 tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme MnmG Human genes 0.000 description 1
- 108050004529 tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme MnmG Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56938—Staphylococcus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56944—Streptococcus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
- G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/315—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
W zgłoszeniu ujawniono sposób i kompozycję diagnostyczną do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus, posiadające co najmniej 80% czułość i specyficzność oraz nadające się do łatwego i szybkiego wykonywania testu wykrywającego zapalenie wymion u krów wywoływanego przez wskazane patogeny
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus.
Zapalenie wymion u krów (mastitis) stanowi istotny problem weterynaryjny, generując milionowe straty finansowe wśród hodowców bydła [1]. Szacuje się, że w krajach uznawanych za liderów w produkcji mleka, mastitis diagnozowane jest nawet u 20% krów [2]. Z kolei straty ekonomiczne generowane w następstwie występowania klinicznej formy mastitis mogą dla każdej farmy wynosić n awet 76 000 USD miesięcznie [3]. Niniejsze straty powodowane są przede wszystkim zmniejszeniem ilości pozyskiwanego mleka, pogorszeniem jego jakości, ale także mogą wynikać z konieczności odizolowania chorych zwierząt na czas leczenia, w którym to zwierzęta nie tylko nie produkują mleka, ale także wymagają leczenia [1].
Wśród najczęstszych patogenów wywołujących mastitis wymienia się bakterie, takie jak: Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Corynebacterium bovis, Mycoplasma bovis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ale także grzyby i glony [4, 5].
Mastitis może przyjmować formę subklinicznej, klinicznej bądź chronicznej infekcji. Forma ta zależy między innymi od czynnika etiologicznego, wieku, rasy, odporności zwierzęcia oraz statusu laktacyjnego. Najrzadziej opisywana jest forma chroniczna, ale prowadzi ona do trwałego zapalenia gruczołu mlekowego. Najbardziej niebezpieczna jest forma kliniczna, która rozpoznawana jest na podstawie widocznych i namacalnych objawów, takich jak: gorączka, obrzęk, ból i zaczerwienienie gruczołu mlekowego, ponadto zmniejszeniu ulega ilości produkowanego mleka, a także pojawiają się zmiany w jego wyglądzie. Z kolei forma subkliniczna generuje największe straty w przemyśle mleczarskim, a jest to związane z brakiem widocznych objawów [6, 7, 8].
Obecnie diagnostyka mastitis oparta jest głównie na szybkich testach umożliwiających oszacowanie liczby komórek somatycznych (ang. somatic cell count, SCC) w próbce badanego mleka krowiego. Metoda ta pozwala na szybkie uzyskani e diagnozy i, co najważniejsze - testy te możliwe są do wykonania bezpośrednio przy zwierzęciu. Jest to ich jeden z ważniejszych atutów, z uwagi na terenowy charakter pracy lekarzy weterynarii. Nie mniej jednak, kluczowym ograniczeniem tej metody jest brak możliwości identyfikacji czynnika etiologicznego. Brak wiedzy na temat patogenu wywołującego infekcję uniemożliwia z kolei wprowadzenie celowanej terapii antybiotykowej, a to może mieć wpływ na wzrost odsetka wielolekoopornych szczepów bakteryjnych, co stanowi rosnący problem na świecie.
Powszechnie stosowane metody umożliwiające identyfikację czynnika etiologicznego, tj. metody hodowlane, molekularne, serologiczne czy spektrometryczne (m.in. MALDI-ToF), są bardziej czasochłonne, wymagają specjalistycznego sprzętu i wykwalifikowanego personelu, a także niejednokrotnie uzyskane wyniki są trudne w jednoznacznej interpretacji. Jednakże, co najistotniejsze, nie mogą zostać przeprowadzone poza laboratorium, co znacznie ogranicza ich użyteczność w diagnostyce chorób bydła.
Zgłoszenie patentowe US2003073073A1 obejmuje multipleksowy test immunochromatograficzny (lateral flow assay, LFA) do diagnostyki mastitis zarówno u krów, jak i innych mlecznych zwierząt. Dla Staphylococcus aureus zastrzeżono m.in. białko fibronectin binding protein, którego wariant A zgłoszono w niniejszym wniosku. Dla pozostałych gatunków (E. coli, S. agalactiae, S. uberis) nie uwzględniono takich samych białek.
Zgłoszenie patentowe WO2019216775A1 opisuje również test LFA do multipleksowej diagnostyki mastitis, ale obejmuje inne antygeny.
Zgłoszenie patentowe US2005260695A1 obejmuje immunodiagnostykę mastitis w oparciu o m.in. laktoferynę.
Patent US9556281B2 dotyczy białka A (SpA) dla Staphylococcus aureus, jako antygenu wykorzystywanego w leczeniu i prewencji w infekcjach wywołanych przez tę bakterię.
Zgłoszenie patentowe CA2270404A1 obejmuje marker diagnostyczny dla Streptococcus uberis - lactoferrin binding protein, które nie znajduje się w puli białek objętych wnioskiem.
Z kolei zgłoszenie patentowe EP1532253A1 opisuje komponent szczepionki przeciwko Streptococcus uberis w postaci białek o masie ok. 22 kDa.
Celem wynalazku jest dostarczenie łatwego do przeprowadzenia, nawet w warunkach polowych, testu diagnostycznego który będzie jednocześnie spełniał następujące wymogi:
PL 246485 Β1 będzie zapewniał możliwość jednoczesnej identyfikacji czterech gatunków bakterii, tj. Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis i Escherichia coli, będących jednymi z najczęściej izolowanych gatunków wywołujących zapalenie wymion,
- czas wykonania testu i oczekiwania na wynik nie przekroczy 20 minut,
- test będzie zapewniał wysoką czułość i specyficzność, wynoszące co najmniej 80%,
- test będzie możliwy do wykonania terenowo, bezpośrednio przy zwierzęciu i przez osobę niewykwalifikowaną w zakresie diagnostyki/medycyny weterynaryjnej (np. hodowcę).
Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus, znamienny tym, że w próbce materiału biologicznego, zwłaszcza mleka, pobranego z wymienia testowanej krowy bada się obecność następujących antygenów:
pochodzącego z E. coli białka ompA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 1:
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQ LGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPIT DDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWT NN1GDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLK.SDVL FNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRA QSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKG IKDVVTQPQA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 5-13, pochodzącego z S. uberis białka EF-Tu o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 2:
MAKEKYDRSKPHVNIGTIGHVDHGKTTLTAAITTVLARRLPTSVNQPKDYASIDAAP EERERG1T1NTAHVEYETETRHYAHIDAPGHADYVKNMITGAAQMDGA1LVVASTDG PMPQTREHILLSRQVGVKHLIVFMNKIDLVDDEELLELVEMEIRDLLSEYDFPGDDLP V1QGSALKALEGDSKYEDIIMELMKTADEY1PEPERDTDKPLLLPVEDVFS1TGRGTVA SGRIDRGTVRVNDEIEIVGIKEETKKAVVTGVEMFRKQLDEGLAGDNVGILLRGVQR DEIERGQVIAKPGSINPHTKFKGEVYILSKDEGGRHTPFFNNYRPQFYFRTTDVTGSIE LPAGTEMVMPGDNVTISVELIHPIAVEQGTTFSIREGGRTVGSGIVSEIEA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 14-24, pochodzącego z S. agalactiae białka ADA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 3:
MTQAVLKELAKAELHCHLDGSLSLPAIRKLANMADIILPSSDKELRKYVIAPAQTESL VDYLKTFEFIRPLLQTKEALRFAAYDVARQAALENVIYIEIRFAPELSMDKGLTASDT VLAVLEGLADAQKEFNIVARALVCGMRQSSHKTTKDIIKHIVDLAPKGLVGFDFAGD EFSYPTDSLVDL1QEVKRSGYPMTLHAGECGCAKHIADSLNLG1KRMGHVTALTGQR DLIKRF VEED V VAEMCLTSNLQTK AAS SIQ SFP YQELYD AGGK1T1NTDNRT VSDTNL TKEYSLFVTYFGTKIEDFLVFNQNAVKASFTSDSEKDTLLHKLQENYDSYLK lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 25-32, oraz pochodzącego z S. aureus białka FnBPA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 4:
MKNSLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAAASEQNTTVEENGNSATENKS KQTTTNNVNNIDETQTYSATSTEQPSNATQVTAEAAPQAVEAPQTSQAPQKVQSTNV ETVKEEVVKEEVQPQVKETARSQENSGDQRQVDLTPKKVTQNQGTEPQVEVAQPRT VSESKPRVTRSTDVAEAKDASEIKGTDVTSKVTVESGSEAPQGNKVEPHAGQRVVL KYKLKFEKGLHKDDYFDFTLSNNVNTHGVSTARKVPDIKNGTVVMATGQLLGNGKI RYTFTDYIDYKVNVTADLEINLFIDPKTVQSNGQQIITSTLNDKETRTTLPIQYNPGVS NSYANWGSIETFDKGNNKFTHVAYIKPQNGHKSDSVSTTGTLTQGSKANGNAPTVK
VYEVLKDAKELPESVYANISDSTMFKDVTQEMKDKLKVENNGSYKLDIEKLEKSYVI HYDGEYLSGSDQVNFRTHMFGYPEQQYKYYYTHLGYQLTWDNGLVLYSNKAKGD GTNGTITESNNMTFDEEYGNGVITGQYDKNLVTTVEEEYDSSTLDIDYHTAIDGEGG
PL 246485 Β1
YVDGYIETIEETDSSAIDIDYHTAVDSEAGHVGGYTESSEESNPIDFEESTHENSKHHA DVVEYEEDTNPGGGQVTTESNLLEFDEESTKGIVTGAISDHTTVEDTKEYTTESNLIEL VDELPEEHGQAQGPIEEITENNQHISHSGLGTENGHGNYGIVEEIEENSHVDIKSELGY EGGQNIGNQSFEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIQGQNKGDQSFEEDTEEDKP KYEQGGNIVDIDFDSVPQIQGQNKGNQSFEEDTEKDKPKYEHGGNIIDIDFDSVPHIHG FNKHTEIIEEDTNKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPQVSGQNEGQQTIEEDTTPPIVPPT PPTPEVPSEPETPTPPTPEVPSEPETPTPTPPTPEVPSEPETPTPPTPEVPSEPETPTPTPPTP EYPSEPETPTPPTPEYP SEPETPTPPMPEIPAEPGKP YPPANEEPKKP SKP VEQGKVVTP VIE1NEKVKAVKPAKTSQSKKTELPETGGEETTNNGVLFGGLLS11GLVELRRNKKNH KA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 33-51, przy czym:
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z E. coli świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem E. coli wywołującym mastitis,
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. uberis świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. uberis wywołującym mastitis,
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. agalactiae świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. agalactiae wywołującym mastitis, natomiast
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. aureus świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. aureus wywołującym mastitis.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus, znamienny tym, że zawiera odczynniki, zwłaszcza przeciwciała, nadające się do wykrywania obecności następujących antygenów:
pochodzącego z E. coli białka ompA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 1:
MKKTAIATAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFTNNNGPTHENQ LGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPIT DDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWT NNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVL FNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRA QSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKG IKDVVTQPQA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 5-13, pochodzącego z S. uberis białka EF-Tu o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 2:
MAKEKYDRSKPHVNIGTIGHVDHGKTTLTAAITTVLARRLPTSVNQPKDYASIDAAP EERERGITINTAHVEYETETRHYAHIDAPGHADYVKNMITGAAQMDGA1LVVASTDG PMPQTREHILLSRQVGVKHLIVFMNKIDLYDDEELLELYEMEIRDLLSEYDFPGDDLP VIQGSALKALEGDSKYEDIIMELMKTADEYIPEPERDTDKPLLLPVEDVFSITGRGTVA SGRIDRGTVRVNDEIEIYGIKEETKKAVVTGVEMFRKQLDEGLAGDNVGILLRGYQR DEIERGQVIAKPGSINPHTKFKGEVYILSKDEGGRHTPFFNNYRPQFYFRTTDVTGSIE LPAGTEMVMPGDNVTISVELIHPIAYEQGTTFSIREGGRTVGSGIVSEIEA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 14-24, pochodzącego z S. agalactiae białka ADA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 3:
PL 246485 Β1
MTQAVLKELAKAELHCHLDGSLSLPAIRKLANMADIILPSSDKELRKYVIAPAQTESL VDYLKTFEF1RPLLQTKEALRFAAYDVARQAALENV1YLE1RFAPELSMDKGLTASDT VLAVLEGLADAQKEFNIVARALVCGMRQSSHKTTKDIIKHIVDLAPKGLVGFDFAGD EFSYPTDSLVDLIQEVKRSGYPMTLHAGECGCAKHIADSLNLGIKRMGHVTALTGQR DLIKRFVEEDVVAEMCLTSNLQTKAASSIQSFPYQELYDAGGKITINTDNRTVSDTNL TKEYSLFVTYFGTKTEDFLVFNQNAVKASFTSDSEKDTLLHKLQENYDSYLK lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 25-32, oraz pochodzącego z S. aureus białka FnBPA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 4:
MKNSLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIWGMGQDKEAAASEQNTTVEENGNSATENKS KQTTTNNVNNIDETQTYSATSTEQPSNATQVTAEAAPQAVEAPQTSQAPQKVQSTNV ETVKEEVVKEEVQPQVKETARSQENSGDQRQVDLTPKKVTQNQGTEPQVEVAQPRT VSESKPRVTRSTDVAEAKDASETKGTDVTSKVTVESGSTEAPQGNKVEPHAGQRWL KYKLKFEKGLHKDDYFDFTLSNNVNTHGVSTARKVPDIKNGTVVMATGQLLGNGKI RYTFTDYIDYKVNVTADEEINLFinPKTVOSNGOOITTSTLNDKF.TRTTLPIOYNPGVS NSYANVNGSIETFDKGNNKFTHVAYIKPQNGHKSDSVSITGTLTQGSKANGNAPTVK VYEVLKDAKELPESVYAN1SDSTMFKDVTQEMKDKLKVENNGSYKLDIEKLEKSYVI HYDGEYLSGSDQVNFRTHMFGYPEQQYKYYYTHLGYQLTWDNGLVLYSNKAKGD GTNGTITESNNMTFDEEYGNGVTTGQYDKNLVTTVEEEYDSSTLDIDYHTAIDGEGG YVDGYIETIEETDSSAIDIDYHTAVDSEAG11VGGYTESSEESNP1DFEESTIIENSKIUIA DVVEYEEDTNPGGGQVTTESNLLEFDEESTKGIVTGAISDHTTVEDTKEYTTESNLIEL VDELPEEHGQAQGPIEEITENNQHISHSGLGTENGHGNYGIVEEIEENSHVDIKSELGY EGGQNIGNQSFEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIQGQNKGDQSFEEDTEEDKP KYEQGGNIVDIDFDSVPQIQGQNKGNQSFEEDTEKDKPKYEHGGNTIDIDFDSVPHIHG FNKHTEITEEDTNKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPQVSGQNEGQQTIEEDTTPPIVPPT PPTPEVPSEPETPTPPTPEVPSEPETPTPTPPTPEVPSEPETPTPPTPEVPSEPETPTPTPPTP EVPSEPETPTPPTPEVPSEPETPTPPMPEIPAEPGKPVPPANEEPKKPSKPVEQGKVVTP VIETNEKVKAVKPAKTSQSKKTELPETGGEETTNNGVLFGGLLSIIGLVLLRRNKKNH KA lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 33-51.
Korzystnie, kompozycja diagnostyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera specyficzne wobec określonych powyżej antygenów przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne.
Korzystnie, kompozycja diagnostyczna według wynalazku zawiera znakowane przeciwciała. Szczegółowy opis wynalazku
Jednym z aspektów wynalazku jest multipleksowy test immunodiagnostyczny do wykrywania antygenów bakteryjnych reprezentatywnych dla 4 gatunków bakterii: E. coli, S. uberis, S. agalactiae i S. aureus będących jednymi z najczęstszych czynników etiologicznych zapalenia wymion (mastitis) u krów.
Zgodnie z wynalazkiem zidentyfikowano łącznie 14 immunogennych białek, które wykazują antygenowy potencjał rozumiany jako specyficzność gatunkowa i immunoreaktywność, a także które związane są z powierzchnią komórki bakteryjnej. Właściwości te udało się potwierdzić zarówno przy pomocy analiz bioinformatycznych, jak i eksperymentalnych badań laboratoryjnych wykorzystujących metodę SDS-PAGE i immunoblottingu z zastosowaniem przeciwciał pochodzących od zwierząt zainfekowanych jedną z czterech wymienionych bakterii, jak również pochodzących od zdrowych krów (kontrola ujemna, zwierzęta bez mastitis). W eksperymentach wykorzystano także szczepy pochodzące od zwierząt z mastitis o etiologii innej niż E. coli, S. uberis, S. agalactiae czy S. aureus, celem wykluczenia reakcji krzyżowych.
W przykładowej realizacji, wybrane zgodnie z wynalazkiem białka (ompA dla E. coli, EF-Tu dla S. uberis, ADA dla S. agalactiae, FnBPA dla S. aureus) oraz przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko nim zostały wykorzystane do opracowania szybkiego multipleksowego testu immunochromatograficznego, przy pomocy którego wykrywane mogą być bakterie obecne w mleku pozyskanym od krów z mastitis.
W korzystnej realizacji wynalazku antygeny zidentyfikowane przez twórców wynalazku wykrywane są poprzez monoklonalne przeciwciała stanowiące kluczowy komponent testu immunochromatograficznego (ang. lateral flow assay, LFA).
W omówionej poniżej przykładowej realizacji wynalazku ma on postać kasetkowego testu immunochromatograficznego (ang. lateral flow assay, LFA).
Nieoczekiwanie test oparty na wskazanych zgodnie z wynalazkiem antygenach zapewnia wysoką czułość i specyficzność, wynoszące co najmniej 80%.
Przykład 1. Identyfikacja antygenów nadających się do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus
Identyfikacja antygenów charakterystycznych dla patogennych gatunków Escherichia coli, Streptococcus uberis oraz Streptococcus agalactiae wywołujących mastitis u krów
Przygotowanie próbek próbki mleka (50 ml) pobrano z zakażonych ćwiartek wymion krów, u których zidentyfikowano kliniczne objawy mastitis, takie jak: obrzęk, podniesiona temperatura, stwardnienie, zaczerwienienie oraz bolesność wymienia, zmiany w konsystencji mleka (wodnistość, obecność ropy czy skrzepów). Próbki pobierano w ramach rutynowej procedury pobierania mleka przez lekarzy weterynarii z Przychodni Weterynaryjnej „Omnivet” w Orzeszu oraz Przychodni Weterynaryjnej „Egida” w Wiznej. Ponadto, pobrano 12 próbek mleka od zdrowych zwierząt, które stanowiły kontrolę ujemną. Dodatkowo próbka mleka pochodząca od krowy z zakażeniem wywołanym przez Streptococcus dysgalactiae stanowiła kontrolę mającą na celu wykluczenie reakcji krzyżowej pomiędzy badanymi izolatami należącymi do rodzaju Streptococcus.
próbek krwi (20 ml), w celu pozyskania surowicy, pobierano poprzez pojedyncze wkłucie do żyły szyjnej podczas rutynowych badań diagnostycznych prowadzących do wykrycia mastitis (próbka dodatnia). Ponadto 12 próbek krwi pochodzących od zdrowych zwierząt (kontrola ujemna), pobranych zostało przez lekarzy weterynarii przy okazji wykonania rutynowych badań biochemicznych.
Mleko i surowice przechowywano w temp. -80°C.
Hodowla bakterii i ich identyfikacja
100 μl każdej próbki mleka hodowano na podłożu Columbia z dodatkiem krwi baraniej (Difco) w warunkach tlenowych przez 24 godziny w 37°C. Następnie próbki zidentyfikowane wstępnie jako E. coli, celem potwierdzenia gatunku, hodowano na podłożu McConkey (oxoid) w warunkach tlenowych przez 24 godziny w 37°C. Ponadto, kolonie o morfologii odpowiadającej jednemu z czterech poszukiwanych gatunków poddawano dalszym analizom celem potwierdzenia gatunku. Identyfikacja obejmowała hodowlę na podłożu Granada Agar (bioMerieux) dedykowanemu detekcji β-hemolizującym szczepom Streptococcus agalactiae, na podłożu chromogennym CHROMagar™ Mastitis GP (CHROMagar™) służącemu rozróżnianiu najczęstszych Gram-dodatnim gatunków wywołujących mastitis u krów. Identyfikację prowadzono także w oparciu o test CAMP, test na katalazę, test API i metodę MALDI-ToF. Izolacja i detekcja białek
Izolację białek bakteryjnych prowadzono w oparciu o zmodyfikowaną procedurę Park i wsp. [9], która opracowana została na podstawie protokołu opisanego przez Fanga i Olivera [10]. Modyfikacje obejmowały m.in. hodowlę na płynnym podłożu tryptonowo-sojowym (ang. Tryptic soy broth, TSB; Becton-Dickinson) przez 24 godziny w 37°C. Po zakończeniu hodowli zawiesinę bakteryjną wirowano (3000 rpm przez 30 min), po czym nadsącz usuwano, a pelet bakteryjny zawieszano w 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (ang. phosphate buffered saline, PBS; Thermo Fisher) i wirowano przez 20 minut (3300 rpm). Po trzykrotnym powtórzeniu procedury dla każdej próbki określano mokrą masę bakterii i do każdych 30 mg mokrej masy komórkowej dodawano po 100 μl 0,2% roztworu dodecylosiarczanu sodu (ang. sodium dodecyl sulfate, SDS; Sigma Aldrich), po czym próbki inkubowano przez 1 godzinę w 43°C. Następnie materiał wirowano (20 min, 3300 rpm), a nadsącz zawierający wyizolowane białka zbierano i przenoszono do jałowej probówki typu eppendorf. Pozostały po wirowaniu osad wysiewano na podłoże Columbia z dodatkiem krwi baraniej (difco) i inkubowano przez 18 godzin w 37°C w celu potwierdzenia izolacji jedynie białek związanych z powierzchnią komórki bakteryjnej. Stężenie białek badano przy zastosowaniu zestawu Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Następnie próbki rozporcjowano i przechowywano w -20°C do dalszych badań.
W celu rozdzielenia mieszaniny białek, po 10 μl każdej próbki mieszano z buforem Laemmli’ego, redukowano przez 5 min w temp. 100°C w bloku grzejnym, wirowano 10 min w 13 000 g i nanoszono na gradientowy żel poliakrylamidowy o stężeniu 4-20% [11]. Rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) prowadzono początkowo przez 20 minut przy napięciu 80 V, po czym kontynuowano przez 40 minut przy 120 V. Po zakończeniu SDS-PAGE żel trzykrotnie przepłukiwano w dejonizowanej wodzie (diH2O), po czym wybarwiano w Coomassie Brilliant Blue (BIO-RAD) lub bezpośrednio poddawano transferowi na membranę z polifluorku winylidenu (ang. polyvinylidene difluoride membrane, PVDF; Millipore) przez 90 minut przy napięciu 135 V.
Następnie membrany blokowano w 1% roztworze surowiczej albuminy wołowej (ang. bovine serum albumin, BSA; Thermo Fisher) w PBS z dodatkiem Tween-20 (PBS-T, Thermo Fisher) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
Następnie membrany 3-krotnie przepłukiwano przez 5 minut w PBS-T, po czym inkubowano przez 2 godziny w 37°C z roztworem badanej surowicy w rozcieńczeniu 1:1000 i ponownie płukano w PBS-T (3 x 5 min).
Inkubację z baranimi anty-bydlęcymi Il-rzędowymi przeciwciałami skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową (Novusbio) w rozcieńczeniu 1:10 000 prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym membrany płukano 3-krotnie przez 5 min w PBST. Białkowe prążki wizualizowano poprzez wywołanie chemiluminescencji przy zastosowaniu Pierce™ ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific) i jej pomiar przy użyciu aparatu C-DiGit® Blot Scanner (LI-COR).
Następnie 13 prążków białkowych (3 dla E. coli, 4 dla S. uberis, 6 dla S. agalactiae), które występowały wśród wszystkich szczepów danego gatunku, ale ich immunoreaktywność dla pozostałych gatunków nie była obecna (lub była bardzo słaba) wycięto z żelu i poddano dalszym analizom prowadzącym do identyfikacji białek.
Identyfikacja białek
W celu identyfikacji białek wyciętych z żelu elektroforetycznego prążki odbarwiono metanolem, poddano redukcji i alkilacji przy użyciu roztworów ditiotreitolu i jodoacetamidu. Następnie fragmenty żelu trawiono w roztworze trypsyny w 50 mM buforze węglanowym (Promega, Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Technical Bulletin) w 37°C przez noc. Uzyskane w ten sposób peptydy ekstrahowano z żelu przy pomocy roztworu składającego się z wody, acetonitrylu i kwasu trifluorooctowego poprzez trzykrotną elucję (v:v 45:50:5). Mieszaninę peptydów oczyszczano i zagęszczano przy użyciu końcówek C18 Zip-TIP zgodnie z instrukcją producenta (Merck Chemicals, Billerica, MA, USA, PR 02358, Technical Note).
W celu identyfikacji białek, oczyszczone mieszaniny peptydów badanych wraz z roztworem peptydów wzorcowych nałożono na płytkę Anchor Chip MALDI (Bruker), na które następnie nałożono 1 μl macierzy kwasu a-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA, Bruker).
Widma masowe analizowanych próbek uzyskano w zakresie 700-4000 m/z przy pomocy spektrometru Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker) wraz z oprogramowaniem flexControl 3.3 (Bruker). Uzyskane spektra wygładzono, a linię odcięcia skorygowano. Lista pików wygenerowana w programie flexAnalysis 3.0 (Bruker) dla stosunku sygnału do szumu większego niż 3 została przeniesiona do BioTools 3.2 (Bruker) i porównana z oprogramowaniem Mascot 2.2 (Matrix Science) z wykorzystaniem bazy danych Swiss-Prot (www.uniprot.org) ograniczonej do taksonomii „bakterii” z błędem maksymalnym 0,3 Da oraz karbamidometylacji cysteiny, jako obowiązkowej modyfikacji i trypsyny jako enzymu tnącego.
Widma porównywano ze względu na podobieństwo do tzw. peptydowego odcisku palca, charakterystycznego dla poszczególnych białek. W tym przypadku liczbę nakładających się sygnałów peptydowych utworzonych po trawieniu zastosowano do porównania danych z tymi obecnymi w bazie danych białkowych z adnotacjami. Wyniki uzyskane w Mascot z wartością większą niż 61 uznano za istotne statystycznie (p < 0,05). Pozostałe widma jonów fragmentarycznych wybranych peptydów rejestrowano w trybie LIFT i połączono celem identyfikacji MALDI TOF/TOF. Interpretacji wyników dokonano w następujący sposób: wynik białka wynosił -10*Log(P), gdzie P jest prawdopodobieństwem, że obserwowane dopasowanie jest zdarzeniem losowym. Im wyższa wartość punktowa, tym lepsza identyfikacja. Analiza bioinformatyczna
W celu zbadania struktury, funkcji i immunogenności zidentyfikowanych białek wykonano szereg analiz bioinformatycznych uwzględniających predykcję lokalizacji w obrębie komórki, antygenowość, detekcję peptydów sygnałowych oraz klasycznych i nieklasycznych białek. Dodatkowo, wybrane białka poddawano analizie identyfikacji liniowych epitopów limfocytów B, poszukiwaniu modelu PDB i identyfikacji konformacyjnych epitopów komórek B.
Subkomórkową lokalizację białek przewidywano za pomocą PsortB 3.0 oraz serwera Bologna Unified Subcellular Component Annotator (BUSCA) - z rozróżnieniem na bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne. Lokalizacje subkomórkowe oznaczono adnotacją GO, przy czym zewnątrzkomórkowe jako GO:0005615, a cytoplazmatyczne jako GO:0005737.
Predykcji funkcji białek dokonano za pomocą serwerów PRED-LIPO (predykcja białek sygnałowych), SignalP (klasyczne białka), Secretome (nieklasyczne białka dla bakterii Gram-dodatnich) oraz PncsHub (nieklasyczne białka dla bakterii Gram-ujemnych). Białka klasyczne i nieklasyczne przewidziano z wartością ustawienia domyślnego odpowiednio 0,45 i 0,5.
W celu zidentyfikowania najbardziej antygenowych białek przeprowadzono predykcję in silico za pomocą oprogramowania VaxiJen. Przewidywanie antygenowe zostało skorygowane do wartości domyślnej 0,4, a białka z wynikiem > 0,4 uznano za białka antygenowe.
Epitopy komórek B dla białek antygenowych identyfikowano za pomocą Antibody Epitope Prediction w bazie danych IEDB. Konformacyjne epitopy komórek B identyfikowano w następujący sposób: dla każdej sekwencji białka zidentyfikowano matrycę PDB za pomocą SWISS-MODEL Workspace z uwzględnieniem identyfikatorów PDB. Następnie wybrano najlepszą matrycę (o wyższej identyczności), na podstawie której zbudowano odpowiedni model. Wybrane identyfikatory PDB zostały następnie wykorzystane do przewidywania liniowych i nieciągłych konformacyjnych epitopów komórek B za pomocą oprogramowania ellipro.
Wyniki
Identyfikacja gatunkowa bakterii
W puli badanych próbek mleka pozyskanych od krów ze zdiagnozowanym mastitis gatunek lub rodzaj czynnika etiologicznego potwierdzono dla wszystkich badanych izolatów. Najczęściej izolowano bakterie z rodzaju Streptococcus (n=15; 68,2%), następnie bakterie z gatunku Escherichia coli (n=4; 18,2%), Enterococcus cecorum (n=1; 4,5%), Aerococcus viridans (n=1; 4,5%) i Enterobacter cloacae (n=1; 4,5%).
Wśród rodzaju Streptococcus dominował gatunek Streptococcus uberis, który był obecny w 11 badanych próbkach (73%), Streptococcus dysgalactiae wykryto w dwóch próbkach (13%), a Streptococcus agalactiae był obecny tylko w jednej badanej próbce mleka (7%). Jeden szczep paciorkowca (7%) nie został zidentyfikowany na poziomie gatunku.
Na Fig. 1 przedstawiono odsetek szczepów bakteryjnych wyizolowanych z mleka krów z rozpoznaniem zapalenia wymienia z podziałem na gatunki i/lub rodzaje.
Detekcja białek
Detekcję białek prowadzono dla trzech reprezentatywnych szczepów Escherichia coli, dla trzech szczepów Streptococcus uberis i jednego szczepu Streptococcus agalactiae.
Hodowla osadu pozostałego po izolacji białek wykazała wzrost bakterii dla każdego z badanych szczepów (ocena jakościowa), dlatego też założono, że procedura izolacji białek z wykorzystaniem SDS nie uszkodziła ściany komórkowej bakterii, a tym samym pozyskano jedynie białka związane ze ścianą komórkową badanych bakterii.
Na Fig. 2. przedstawiono przykładowe wyniki immunodetekcji białek reprezentatywnych dla Escherichia coli, Streptococcus uberis oraz Streptococcus agalactiae badanych w obecności surowic pochodzących od zakażonych zwierząt (EC-positive - surowice pochodzące od krów z mastitis o etiologii Escherichia coli; SU-positive - surowice pochodzące od krów z mastitis o etiologii Streptococcus uberis, GBS-positive - surowice pochodzące od krów z mastitis o etiologii Streptococcus agalactiae (ang. group B streptococcus; GBS) oraz od zdrowych zwierząt (C-).
Z puli ok. 16 immunoreaktywnych w obecności spulowanych surowic EC-dodatnich (surowice pozyskane od krów z mastitis o etiologii E. coli: nr 1752, nr 0653/1) białek reprezentatywnych dla Escherichia coli trzy, o następujących masach: ok. 5 kDa (EC1), ok. 18 kDa (EC2), i ok. 35 kDa (EC3), poddano dalszym analizom (Fig. 2A).
Z kolei z puli ok. 14 białek Streptococcus uberis specyficznie reagujących z surowicami SU-dodatnimi (surowice pozyskane od krów z mastitis o etiologii S. uberis: nr 0653, nr 5754, nr 7939) pięć prążków o masach: ok. 19 kDa (SU4), ok. 30 kDa (SU3), ok. 41 kDa (SU5), ok. 48 kDa (SU1), ok. 100 kDa (SU2) (Fig. 2B) wycięto i poddano sekwencjonowaniu.
Najmniejszą immunoreaktywność białek odnotowano dla gatunku Streptococcus agalactiae (ang. group B Streptococcus, GBS). Przyczyną tego zjawiska może być mniejsza liczba surowic (n=1, nr 1917) w porównaniu z pozostałymi gatunkami objętymi badaniami. Ostatecznie do dalszych analiz wybrano 6 białek o następujących masach: ok. 29 kDa (GBS1), ok. 48 kDa (GBS2), ok. 60 kDa (GBS3), ok. 80 kDa (GBS8), ok. 85 kDa (GBS4) i ok. 100 kDa (GBS7) (Fig. 2C).
Co warto podkreślić, wymienione powyżej białka nie wykazywały immunoreaktywności (lub reaktywność ta była bardzo niska) wobec surowic pochodzących od krów bez mastitis (surowice ujemne), co wskazuje na ich wysoką specyficzność. Fakt jakiejkolwiek reaktywności może być następstwem wcześniejszego kontaktu z badanymi patogenami. Co więcej, dla większości prążków białkowych nie zaobserwowano również reakcji krzyżowych pomiędzy badanymi paciorkowcowymi surowicami (S. uberis , S. agalactiae, S. dysgalactiae).
Na Fig. 3 przedstawiono przykładowe wyniki badania reakcji krzyżowych pomiędzy Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis oraz Streptococcus dysgalactiae w obecności surowic pozyskanych od krów ze zdiagnozowanym mastitis o etiologii Streptococcus agalactiae (GBS-positive) oraz spulowanych surowic pozyskanych od krów z mastitis o etiologii Streptococcus uberis (SU-positive). Identyfikacja białek
Uzyskane spektra masowe białek porównane zostały z danymi dostępnymi w bazie danych Swiss-Prot. W rezultacie zidentyfikowano 13 białek dla progu istotności p < 0,05, podczas gdy sześć zidentyfikowano dla S. agalactiae: aspartate carbarnoyltransferase (GBS 1), elongation factor Tu (GBS 2), 60 kDa chaperonin (GBS 3), elongation factor G (GBS 4), galactose-6-phosphate isomerase subunit LacA (GBS 7) oraz adenosine deaminase (GBS 8), cztery dla S. uberis: elongation factor Tu (SU 1), tRNA uridine 5-carboxymethylaminomethyl modification enzyme MnmG (SU 3), GTPase Obg (SU 4), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (SU 5), a 3 dla E. coli, molybdenum cofactor biosynthesis protein B (EC 1), aldehyde reductase YahK (EC 2) oraz outer membrane protein A (EC 3). Różnice w masach molekularnych pomiędzy masą zidentyfikowanych białek a masą określoną w SDS-PAGE na podstawie porównania z masą markeru białkowego może wynikać z obecności wielu form białek, ich modyfikacji lub ich częściowego rozkładu.
Analiza bioinformatyczna opisanych powyżej białek poddano analizie bioinformatycznej, której celem było określenie ich immunogenności i funkcjonalności. W pierwszym etapie analizy białka poddano klasyfikacji na podstawie ich lokalizacji w obrębie komórki. W rezultacie 12 białek zaklasyfikowano jako cytoplazmatyczne (GO: 000573), podczas gdy jedno (EC3) zlokalizowane było na błonie zewnętrznej (GO: 0019867) elementów subkomórkowych.
W następnym etapie dokonano podziału na klasyczne i nieklasyczne białka. Wykazano, że 9 białek: EC3, GBS 1, GBS 2, GBS 3, GBS 4, GBS 7, SU 1, SU 3, SU 5 zidentyfikowano jako białka nieklasyczne (secretomic proteins). Ponadto białka klasyfikowano również pod względem ich antygenowego potencjału i wykazano, że 12 spośród 13 białek oznaczonych zostało jako antygeny. Detekcja peptydów sygnałowych wykazała, że tylko jedno białko, EC3, posiadało peptyd sygnałowy (Sec signal).
Struktury każdego z 13 białek analizowano w celu identyfikacji epitopów komórek B. W rezultacie ich obecność wykazano dla wszystkich białek, a ich liczba oscylowała w granicach 1-22. To z kolei umożliwiło wykonanie dalszych analiz obejmujących identyfikację konformacyjnych epitopów dla wszystkich badanych białek. Najpierw zidentyfikowano najbardziej zbliżoną strukturę białka PDB (wzorcowego) i na jego podstawie zbudowano model białka badanego. Identyczność matrycy dla całej puli analizowanych białek mieściła się w zakresie 35-100%. Skonstruowane w ten sposób modele posłużyły do identyfikacji liniowych i nieciągłych epitopów konformacyjnych. W rezultacie wytypowano 2-10 epitopów liniowych i 3-8 epitopów nieciągłych. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.
Identyfikacja antygenów charakterystycznych dla patogennych szczepów Staphylococcus aureus wywołujących mastitis u krów
Badaniem objęto 3 reprezentatywne szczepy Staphylococcus aureus wyizolowane z mleka krów ze zdiagnozowanym mastitis oraz 6 próbek surowicy pochodzących od krów ze zdiagnozowanym mastitis o etiologii S. aureus. Krew do badań pobrano poprzez jednorazowe wkłucie do żyły szyjnej w ramach rutynowej procedury pobierania krwi do badań diagnostycznych w kierunku mastitis. Zarówno szczepy bakteryjne, jak i próbki surowicy pochodziły z kolekcji własnej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie.
Dodatkowo, 12 próbek surowicy stanowiło pulę kontroli ujemnych i pozyskane zostały przez lekarzy weterynarii z Przychodni Weterynaryjnej Omniwet w Orzeszu w ramach rutynowych badań mających na celu określenie podstawowych parametrów biochemicznych.
Wszystkie izolaty przechowywano w Microbank™ Preservation System (BioMaxima S.A., Poland) w -80°C do dalszych badań. Próbki surowicy przechowywano w takich samych warunkach temperaturowych.
Metody
Analiza bioinformatyczna
W celu wytypowania wysoce specyficznych białek powierzchniowych reprezentatywnych dla Staphylococcus aureus potencjalnie występujących w mleku krowim, które mogłyby stanowić specyficzne biomarkery w innowacyjnym teście immunochromatograficznym do diagnozowania mastitis, wykonano następujące analizy.
W pierwszym etapie pobrano sekwencje aminokwasowe z baz danych Esembl Bacteria i UniProt. W związku z bardzo dużą ilością danych sekwencje połączono w pojedyncze, reprezentatywne dla poszczególnych gatunków, pliki. Następnie sekwencje te podzielono na dwie grupy: „dodatnie” (Gram dodatnie) i „ujemne” (Gram-ujemne). W następnym etapie sekwencje aminokwasowe poddano klastrowaniu przy pomocy programu CD-HIT. Analiz dokonano dla progów identyczności równych 70%, 80% i 90%. Z kolei potencjalnie powierzchniowe białka przewidywano przy użyciu programu PSORTb, który umożliwił określenie lokalizacji białek w obrębie komórki bakteryjnej. Badane sekwencje podzielono na: “Cellwall” (związane ze ścianą komórkową), “CytoplasmicMembrane” (obecne w cytoplazmie), “Extracellular” (białka zewnątrzkomórkowe) oraz “Unknown” (nieznane). Do dalszej analizy wybrano tylko sekwencje zidentyfikowane jako “CellWall”. W następnym etapie połączono dane uzyskane w wyniku analiz prowadzonych w programach PSORTb oraz CD-HIT. Sekwencje aminokwasowe, reprezentatywne dla powierzchniowych białek Staphylococcus aureus, które zakwalifikowane zostały do wspólnego klastra z sekwencjami reprezentatywnymi dla innych gatunków Gram-dodatnich wykluczono z dalszych analiz. Pozostałe białka poddano analizom w bazie NCBI BLAST, których celem było porównanie ich z referencyjnymi sekwencjami reprezentatywnymi dla łącznie 18 gatunków bakterii, wirusów i grzybów, mogących potencjalnie występować w mleku krowim. Do dalszej analizy wybrano tylko te sekwencje, które nie identyfikowały się w żaden sposób z sekwencjami referencyjnymi. W ostatnim etapie analizy bioinformatycznej sekwencje aminokwasowe, które nie zostały wykluczone w poprzednich krokach zostały poddane analizie w bazie danych BLASTp pod kątem wykrywania tzw. sekwencji białkowych nonreduntant (NR). Finalnie wybrano tylko te sekwencje, które były unikalne dla badanych gatunków bakterii (przy maksymalnym progu identyczności 75%).
Hodowla bakterii
W celu ożywienia zbankowanych szczepów S. aureus, 100 μl z każdej próbki hodowano na podłożu Columbia z dodatkiem krwi baraniej (Difco) w warunkach tlenowych przez 24 godziny w 37°C. Po zakończeniu hodowli do dalszych badań pobierano pojedynczą kolonię S. aureus i hodowano w 9 ml płynnego podłoża tryptonowo-sojowego w warunkach tlenowych przez 24 godziny w 37°C.
Izolacja DNA
Izolacja bateryjnego DNA prowadzona była przy użyciu komercyjnego zestawu Genomic Mini Kit (A&A Biotechnology) zgodnie z procedurą producenta zmodyfikowaną o dodanie 0,4 U/μl lizostafiny (A&A Biotechnology). Stężenie i czystość wyizolowanego DNA oceniano przy pomocy aparatu NanoDrop (Thermo Scientific). DNA przechowywano w -20°C do dalszych badań.
Detekcja genu fnb A
Reakcja PCR mająca na celu detekcję genu fnb A kodującego białko A wiążące fibronektynę (ang. fibronectin binding protein A, FnBPA) przeprowadzona została w oparciu o procedurę opracowaną przez Tristan i wsp. [12] z uwzględnieniem drobnych modyfikacji. Amplifikację genu fnb A prowadzono przy użyciu pary starterów o następujących sekwencjach: fnb A-F (CATAAATTGGGAGCAGCATCA) i fnb A-R (ATCAGCAGCTGAATTCCCATT) (Genomed) w stężeniu 0,1 μM (1,25 μl każdego ze starterów na próbkę), 12,5 μl komercyjnej mieszaniny PCR Mix Plus Kit (A&A Biotechnology) oraz 7,5 μl wody wolnej od RNaz (A&A Biotechnology) oraz 2,5 μl bakteryjnego DNA. Reakcję PCR prowadzono w aparacie T100 Thermal Cycler (BIO-RAD) według następującego programu: wstępna denaturacja (5 min, 94°C), 30 cykli amplifikacji z uwzględnieniem etapów denaturacji (1 min, 94°C), przyłączania starterów (1 min, 55°C) i syntezy nici DNA (1 min, 72°C). Reakcję kończył etap 10 minutowej inkubacji w 72°C.
Produkt amplifikacji o wielkości 128 bp wizualizowano w następstwie 60-minutowej elektroforezy w 1% żelu agarozowym (Prona).
Izolacja białek
W celu optymalizacji procedury izolacji białek powierzchniowych dla Staphylococcus aureus porównano dwie metody.
Pierwsza metoda szczegółowo opisana została w sekcji „Izolacja i detekcja białek”.
Natomiast, zgodnie z drugą procedurą opisaną przez Banner i wsp. [13], bakterie hodowano na płynnym podłożu TSB w warunkach tlenowych przez 18 godzin w 37°C, po czym stężenie zawiesiny bakteryjnej doprowadzano do stężenia równego 3.3 McFarland w PBS (gibco). Bakterie dwukrotnie płukano i wirowano (4000 x g, 3 min). Następnie supernatant usuwano, a osad zawieszano w 150 μl roztworu PBS z dodatkiem 12 μl lizostafiny (A&A Biotechnology) i 1 mM inhibitora proteaz PMSF (ang. phenylmethylsulfonyl fluoride; BIORAD) i inkubowano przez 30 min w 37°C z wytrząsaniem. Następnie materiał wirowano (4000 x g, 20 min, 4°C), a czym nadsącz zbierano.
Stężenie białek określano przy zastosowaniu zestawu Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific). Następnie próbki porcjowano i przechowywano w -20°C do dalszych badań. SDS-PAGE i immunoblotting μl mieszaniny białek powierzchniowych poddano rozdziałowi zgodnie z procedurą Laemmli’ego [11]. Po 5 minutowej redukcji w 100°C próbki wirowano przez 15 minut. SDS-PAGE prowadzono przy stałym natężeniu 25 mA. Następnie żele płukano trzykrotnie w dejonizowanej wodzie i barwiono w Coomassie Brilliant Blue (BIO-RAD), zgodnie z procedurą producenta, lub bezpośrednio poddawano transferowi na membranę PVDF, który prowadzono przez 90 minut przy napięciu 135 V.
Membrany blokowano w 1% roztworze BSA (Sigma-Aldrich) w PBS-T (Thermo Fisher) w 4°C przez noc. Po trzykrotnym przepłukaniu w PBS-T przez 5 minut, membrany inkubowano z badanymi próbkami surowicy (SA1, SA3, SA5, SA13, SA29, SA31) rozcieńczonymi w PBS-T przez 2 godziny w 37°C w stężeniu 1:1000, po czym zostały przepłukane ponownie (3 x 5 min). Inkubację z baranimi anty-krowimi drugorzędowymi przeciwciałami IgG skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w PBS-T w stężeniu 1:10 000 prowadzono przez 1 godzinę w 22°C. Następnie membrany płukano 3-krotnie przez 5 minut w PBS-T i poddawano chemiluminescencji, którą wywoływano w aparacie ChemiDoc Imagining System (BIO-RAD) przy użyciu Pierce™ ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific).
Wyniki
Analiza bioinformatyczna
Analizie bioinformatycznej poddano łącznie 515 gatunków i 93 800 000 sekwencji aminokwasowych zebranych za pomocą programów Ensembl Bacteria i UniProt, spośród których 292 gatunki i 46 180 426 sekwencji aminokwasowych zakwalifikowano do grupy „Gram-dodatnich”. Przy pomocy programu CD-HIT wygenerowano 545 500 klastrów odpowiadających bakteriom Gram-dodatnim na poziomie identyczności 70%. Z kolei program PSORTb umożliwił detekcję 101 białek reprezentatywnych dla Staphylococcus aureus zlokalizowanych na powierzchni komórki, spośród których 74 potencjalnie występują w mleku, co zostało przewidziane dzięki analizie przeprowadzonej w bazie NCBI BLAST. Finalnie zidentyfikowano 36 reprezentatywnych dla Staphylococcus aureus białek powierzchniowych, a białko wiążące fibrynogen (FnBPA) było jednym z nich.
Detekcja genu fnb A
W wyniku przeprowadzonej reakcji PCR obecność genu fnb A wykazano we wszystkich badanych szczepach klinicznych Staphylococcus aureus.
Na Fig. 4 przedstawiona została detekcja genu fnb A (128 bp). Legenda: M - marker, SA1, SA13, SA31 - badane szczepy S. aureus, C - kontrola negatywna.
SDS-PAGE i Immunoblotting
Analiza ilości, układu i jakości prążków uzyskanych dwoma metodami izolacji wykazała niewielką przewagę metody drugiej (z zastosowaniem lizostafiny), dlatego też ją wybrano do dalszych eksperymentów.
Detekcja białka o wielkości odpowiadającej FnBPA (ok. 120 kDa) oraz badanie immunoreaktywności w obecności surowic SA-dodatnich (surowice pochodzące od krów ze zdiagnozowanym mastitis o etiologii S. aureus) (K+) wraz z potwierdzeniem specyficzności w obecności surowic pochodzących od krów zdrowych (K-) wykazała obecność specyficznego białka o masie odpowiadającej FnBPA wśród wszystkich badanych szczepów Staphylococcus aureus.
Na Fig. 5 przedstawiona została detekcja białka FnBPA dla S. aureus w obecności surowic SA-dodatnich (K+) wraz z potwierdzeniem ich specyficzności w obecności surowic pochodzących od zwierząt zdrowych (kontrola ujemna, K-).
W Tabeli 1 przedstawiono sekwencje aminokwasowe zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem epitopów pochodzących ze zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem antygenów białkowych charakterystycznych dla patogennych szczepów Staphylococcus aureus wywołujących mastitis u krów.
Przykład 2. Test diagnostyczny do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli', S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus
Zestaw diagnostyczny
W przykładowej realizacji kompozycji diagnostycznej według wynalazku bazujący na niej test diagnostyczny do wykrywania zapalenia mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus składa się z następujących elementów:
ZEWNĘTRZNYCH:
A) plastikowej obudowy
B) okienka do nakładania próbki mleka
WEWNĘTRZNYCH:
A) podkładka do nakładania próbek - paski z włókna celulozowego, o grubości 0,83 mm, wadze 291 g/m2, szybkości przepływu 196 mL/min i retencji 18 μm, (np. C083 Cellulose Fiber Sample Pad Strips; nr kat: CFSP173000, Millipore);
B) podkładka zawierająca koniugat z przeciwciałami - podkładka diagnostyczna z włókna szklanego w paskach o grubości 0,41 μm i wadze 0,75 g/m2 (np. Glass Fiber Diagnostic Pad 10 mm x 300 mm strips 100 pk, nr kat: GFDX103000, Millipore);
C) membrana testowa, na której znajdować się będą: pasek kontrolny i 4 paski testowe z immobilizowanymi przeciwciałami monoklonalnymi specyficznie rozpoznającymi antygeny białkowe obecne w komórkach wykrywanych gatunków bakterii - laminowane karty o wymiarach 6 cm x 30,1 cm z membraną o przepływie bocznym HI-Flow™ Plus i podkładem o grubości 2 μm przyklejonym do powierzchni karty np. HI-Flow™ Plus HF075 Membrane Cards (nr kat: HF075MC100, Millipore) o wysokiej prędkości przepływu; HI-Flow™ Plus HF 120 Membrane Cards, (nr kat: HF120MC100, Millipore) o średniej prędkości przepływu; HI-Flow™ Plus HF180 Membrane Cards, (nr kat: HF180MC100, Millipore) o niskiej prędkości przepływu;
D) podkładka absorbująca niezwiązane reagenty - paski z włókna celulozowego, o grubości 0,83 mm, wadze 291 g/m2, szybkości przepływu 196 mL/min i retencji 18 μm, np. C083 Cellulose Fiber Sample Pad Strips, (nr kat: CFSP173000, Millipore).
Na Fig. 6 przedstawiono schemat budowy i działania testu immunochromatograficznego. Sposób wykonania testu wraz z interpretacją:
1. Próbka mleka, przy użyciu sterylnej pipetki umieszczona zostanie na początku odpowiednio oznaczonego paska (ang. sample pad)
2. W wyniku działania sił kapilarnych próbka badana będzie przemieszczała się w kierunku podkładki zawierającej koniugat przeciwciał ze złotem koloidalnym (ang. conjugate pad), gdzie dojdzie do ich połączenia (antygen-koniugat)
3. Kompleksy antygen-koniugat złota koloidalnego przez ok. 10-20 minut będą przemieszczały się przez pasek testowy (ang. migration membrane), na którym immobilizowane będą 4 rodzaje przeciwciał monoklonalnych (anty-ompA, anty-EF-Tu, anty-ADA, antyFnBPA) specyficznie rozpoznające jeden z czterech antygenów (ompA, EF-Tu, ADA i/lub FnBPA) (ang. test line). Odpowiednie przeciwciała monoklonalne mogą być pozyskane dowolną znaną metodą, przykładowo poprzez immunizację myszy białkami, które wyprodukowane zostały w E. coli. Każdemu badanemu antygenowi odpowiada jeden prążek. W przykładowej realizacji przeciwciała otrzymano przy zastosowaniu procedury opartej na następujących etapach: immunizacji, fuzji, produkcji przeciwciał i określeniu miana przeciwciał, zgodnie z procedurą opisaną przez Galfre’a oraz Milsteina [14]. W zależności od białka, na podstawie którego będą różnicowane gatunki, prążek umiejscowiony będzie na różnej wysokości (Fig. 7).
PL 246485 Β1
Interpretacja:
Po połączeniu się kompleksu badanego antygenu z przeciwciałami, na membranie powstanie barwny prążek świadczący o wyniku dodatnim. Pojawienie się co najmniej dwóch prążków (testowego i kontrolnego) wskazywało będzie na wynik dodatni (zapalenie wymion o etiologii S. aureus lub S. agalactiae lub S. uberis, lub E. coli), podczas gdy jeden (kontrolny) będzie wskazywał na wynik ujemny badania przeprowadzonego poprawnie. Brak jakiegokolwiek prążka lub obecność jedynie prążka testowego będzie świadczył o niepoprawnie przeprowadzonym teście i wymagał będzie powtórzenia całej procedury. Interpretacja testu będzie szybka, jednoznaczna i możliwa do dokonania zarówno przez lekarza weterynarii, jak i przez osobę odpowiedzialną za monitorowanie stanu zdrowia zwierząt w danym stadzie.
Na Fig. 7 przedstawiono schemat testu immunochromatograficznego w odmianie multipleks do jednoczesnej identyfikacji Staphylococcus aureus (SA), Escherichia coli (EC), Streptococcus agalactiae (GBS) oraz Streptococcus uberis (SU). Legenda: A - test dodatni pod względem każdego z badanych gatunków, B - test dodatni w kierunku Streptococcus uberis, C - prążek potwierdzający prawidłowe działania testu (źródło: własne).
Tabela 1. Lista epitopów dla wybranych antygenów reprezentatywnych dla E. coli (ompA), S. uberis (EF-Tu), S. agalactiae (ADA) i S. aureus (FnBPA).
| Lp. | Sekwencja | Długość (liczba aminokwasów) |
| Białko ompA | ||
| 5. | 36wsqyhdtgfinnngpthenqlgag59 | 24 |
| 6. | 7r>YDWLGRMPYKGSVENGAY93 | 18 |
| 7. | l(,5GYPITD1H) | 6 |
| 8. | 126DTKSNVYGKNHDTGVSP142 | 17 |
| 9. | 155EIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQG EAAPVVAPAPAPAPEVQTKHF215 | 61 |
| 10. | 222LFNFNKATLKPF?33 | 12 |
| 11. | 2641GSDAYNQGLSER276 | 13 |
| 12. | 3O2ESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLA325 | 24 |
| 13. | 337IKDVVT342 | 6 |
| Białko EF-Tu | ||
| 14. | 4EKYDRSKW | 7 |
| 15. | 37ARRLPTSVNQPKDYASIDAAPEERER62 | 26 |
| 16. | 144VDDEELLE152 | 8 |
| 17. | 165DFPGD169 | 5 |
| 18. | IK1ALEGDSKYEDI191 | 11 |
| 19. | 2U1EYIPEPERDT210 | 10 |
| 20. | 264EMFRKQLDEGL274 | 11 |
| 21. | 2X(’VQRDEIE2J2 | 7 |
| 22. | 3,)(,PGSINPHTKFKG311 | 12 |
| 23. | 3I7SKDEGGRHTPFFNN331’ | 14 |
| 24. | 35,,AGTEMVM356 | 7 |
| Białko ADA | ||
| 25. | 3fiHLPSSDKELRKYVIAPAQTESLVDm | 25 |
| 26. | lu5LSMDKGLTALl3 | 9 |
| 27. | ,45SS1IKTTK151 | 7 |
| 28. | 174EFSYPTDSlsl | 8 |
| 29. | 227TGQRD231 | S |
| 30. | 253TKAASSIQSF262 | 10 |
| 31. | i^TKIE304 | 4 |
| 32. | 319TSDSEKDTLLHKLQENYD336 | 18 |
PL 246485 Β1
| Lp. | Sekwencja | Długość (liczba aminokwasów) |
| Białko FnBPA | ||
| 33. | 195TDVTSKVTVE204 | 10 |
| 34. | ^ikpnngktesyiy’89 | 13 |
| 35. | 232KFENGLHQGDYFDFT264 | 15 |
| 36. | 342GNYYAN347 | 6 |
| 37. | 415ANTTDTSKFKEVTSNMSGNLNLQNNG440 | 26 |
| 38. | 443 SLMENLDKT Y V454 | 12 |
| 39. | 388SNQNGNQPKVRIFEYLGNNEDIA41() | 23 |
| 40. | ^TYLEGGKIRYTFTNDIEDKYDY297 | 22 |
| 41. | 3,2VQTNGNQTITSTLNEEQTSKELD334 | 23 |
| 42. | 195TDVTSKVT202 | 8 |
| 43. | 232KFENGLHOGDYFDFT246 | 15 |
| 44. | 415ANTTDTSKFKEVTSNMNLNLQNNGSYSLNIENLDKTYV454 | 38 |
| 45. | 3^IKPNNGKTTSVTVT381 | 14 |
| 46. | 474MVGHPYT491 | 7 |
| 47. | 387GSNQNGNQPKVRIFEYLGNNEDIA410 | 24 |
| 48. | 267NGSVVMATGEVLEGGKIRYTFTNDIEDKVDV297 | 31 |
| 49. | 342GNYYA346 | 5 |
| 50. | 458DGEYLNGT465 | 8 |
| 51. | 357KANNR361 | 5 |
Piśmiennictwo:
1. Hogeveen, H., Huijps, K., and Lam, T. J. G. M. (2011). Economic aspects of mastitis: New developments. N. Z. Vet. J. 59:16-23. doi: 10.1080/00480169.2011.547165.
2. Philpot, W. N., and Nickerson, S. C. (1991). Mastitis: Counter Attack: A Strategy to Combat Mastitis. Chicago.
3. He, W., Ma, S., Lei, L., He, J., Li, X., Tao, J., et al. (2020). Prevalence, etiology, and economic impact of clinical mastitis on large dairy farms in China. Vet. Microbiol. 242:108570. doi: 10.1016/J.VETMIC.2O19.108570.
4. Dufour, S., Labrie, J., and Jacques, M. (2019). The Mastitis Pathogens Culture Collection. Microbiol. Resour. Announc. 8:133-52. doi: 10.1128/MRA.00133-19.
5. Lassa, H., Kubiak, J., and Małkińska-Horodyska, M. (2013). Antibiotic susceptibility of the bacteria most often isolated from clinical mastitis in cows. Życie Weterynaryjne. 88:651.
6. Wilson, D. J., Gonzalez, R. N., and Das, Η. H. (1997). Bovine Mastitis Pathogens in New York and Pennsylvania: Prevalence and Effects on Somatic Celi Count and Milk Production. J. Dairy. Sci. 80:2592-8. doi: 10.3168/JDS.S0022-0302(97)76215-5.
7. Kulkami, A. G, and Kaliwal, B. B. (2013). Bovine mastitis: a review. International Journal of Recent Scientific Research 4:543-8.
8. Yalęin, C. (2000). Cost of Mastitis in Scottish Dairy Herds with Low and High Subclinical Mastitis Problems. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 24:465-72.
9. Park, Η. M., Almeida, R. A., and Oliver, S. P. (2002). Identification of lactoferrin-binding proteins in Streptococcus dysgalactiae subsp. dysgalactiae and Streptococcus agalactiae isolated from cows with mastitis. FEMS. Microbiol. Lett. 207:87-90. doi: 10.1111/j.15746968.2002.tb 11033.x.
10. Fang, W., and Oliver, S. P. (1999). Identification of lactoferrin-binding proteins in bovine mastitis-causing Streptococcus uberis. FEMS. Microbiol. Lett. 176:91-6. doi: 10.1111/j. 15746968.1999.tb13647.x.
11. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Naturę. 227:680-5. doi: 10.1038/227680a0.
12. Tristan A, Ying L, Bes M, Etienne J, Vandenesch F, Lina G. (2003). Use of multiplex PCR to identify Staphylococcus aureus adhesins involved in human hematogenous infections. J Clin Microbiol. 41:4465-7. doi: 10.1128/JCM.41.9.4465-4467.2003.
13. Banner M. A., Cunniffe J. G., Macintosh R. L., Foster T. J., Rohde H., Mack D., et al. (2007). Localized tufts of fibrils on Staphylococcus epidermidis NCTC 11047 are comprised of the accumulation-associated protein. J Bacteriol. 189:2793-804. doi: 10.1128/JB.00952-06
14. Galfre G., Milstein C. (1981). Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Methods Enzymol. 73:3-46. doi: 10.1016/0076-6879(81)73054-4.
Claims (6)
1. Sposób wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus , znamienny tym, że w próbce materiału biologicznego, zwłaszcza mleka, z wymienia testowanej krowy bada się obecność następujących antygenów:
- pochodzącego z E. coli białka ompA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 1 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 5-13,
- pochodzącego z S. uberis białka EF-Tu o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 2 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 14-24,
- pochodzącego z S. agalactiae białka ADA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 3 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 25-32 oraz
- pochodzącego z S. aureus białka FnBPA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 4 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 33-51, przy czym:
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z E. coli świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem E. coli wywołującym mastitis,
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. uberis świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. uberis wywołującym mastitis,
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. agalactiae świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. agalactiae wywołującym mastitis, natomiast
- stwierdzenie obecności antygenu pochodzącego z S. aureus świadczy o zakażeniu wymienia testowanej krowy gatunkiem S. aureus wywołującym mastitis.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do badania obecności antygenów stosuje się specyficzne wobec nich przeciwciała.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność antygenów wykrywa się metodą immunochromatograficzną.
4. Kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywoływanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus, znamienna tym, że zawiera odczynniki, zwłaszcza przeciwciała, nadające się do wykrywania obecności następujących antygenów:
- pochodzącego z E. coli białka ompA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 1 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 5-13,
- pochodzącego z S. uberis białka EF-Tu o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 2 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 14-24,
- pochodzącego z S. agalactiae białka ADA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 3 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 25-32 oraz
- pochodzącego z S. aureus białka FnBPA o sekwencji aminokwasowej Sekw. Id. Nr 4 lub zawartych w nim epitopów przedstawionych w Tabeli 1 o sekwencji aminokwasowej wybranej spośród Sekw. Id. Nr 33-51.
PL 246485 Β1
5. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera specyficzne wobec antygenów określonych w zastrz. 4 przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne.
6. Kompozycja diagnostyczna według zastrz. 4, znamienna tym, że zawiera znakowane przeciwciała.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442091A PL246485B1 (pl) | 2022-08-25 | 2022-08-25 | Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus |
| EP23461639.9A EP4343328A3 (en) | 2022-08-25 | 2023-08-25 | Diagnostic method and composition for the detection of mastitis caused by e. coli, s. uberis, s. agalactiae or s. aureus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442091A PL246485B1 (pl) | 2022-08-25 | 2022-08-25 | Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442091A1 PL442091A1 (pl) | 2024-02-26 |
| PL246485B1 true PL246485B1 (pl) | 2025-02-03 |
Family
ID=88207674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442091A PL246485B1 (pl) | 2022-08-25 | 2022-08-25 | Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4343328A3 (pl) |
| PL (1) | PL246485B1 (pl) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030073073A1 (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-17 | Wondu Wolde-Mariam | Method for simultaneous detection of multiple microbial antigens in biological specimens from mastitic animals |
| WO2013186885A1 (ja) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR9713355A (pt) | 1996-11-14 | 2000-01-25 | Univ Saskatchewan | Proteìna de ligação à lactoferrina d streptococcus uberis |
| EP1532253B1 (en) | 2002-08-12 | 2014-04-30 | Intervet International BV | Streptococcus uberis protein, nucleic acid sequence encoding the same and its use in a mastitis vaccine |
| US20050260695A1 (en) | 2003-09-23 | 2005-11-24 | Genprime, Inc. | Methods, compositions, devices, and kits for detecting mastitis |
| US8445215B1 (en) * | 2010-07-23 | 2013-05-21 | Nestec S.A. | Assays and methods for the detection of Crohn's disease |
| US9556281B2 (en) | 2011-08-15 | 2017-01-31 | The University Of Chicago | Compositions and methods related to antibodies to staphylococcal protein A |
| WO2019216775A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Koru Diagnostics Limited | Device for detection of antibodies to a pathogen |
-
2022
- 2022-08-25 PL PL442091A patent/PL246485B1/pl unknown
-
2023
- 2023-08-25 EP EP23461639.9A patent/EP4343328A3/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030073073A1 (en) * | 2001-10-11 | 2003-04-17 | Wondu Wolde-Mariam | Method for simultaneous detection of multiple microbial antigens in biological specimens from mastitic animals |
| WO2013186885A1 (ja) * | 2012-06-13 | 2013-12-19 | 旭化成株式会社 | 乳汁中の特定物質を検出する方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| M.N. ALHUSSIEN, A.K. DANG: "Sci Rep. 2020 Jul 7;10(1):11161", "SENSITIVE AND RAPID LATERAL-FLOW ASSAY FOR EARLY DETECTION OF SUBCLINICAL MAMMARY INFECTION IN DAIRY COWS", * |
| Y. NAGASAWA ET AL.:: "Front Vet Sci. 2020 Jan 22; 6: 504", "RAPID STAPHYLOCOCCUS AUREUS DETECTION FROM CLINICAL MASTITIS MILK BY COLLOIDAL GOLD NANOPARTICLE-BASED IMMUNOCHROMATOGRAPHIC STRIPS" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442091A1 (pl) | 2024-02-26 |
| EP4343328A3 (en) | 2024-04-10 |
| EP4343328A2 (en) | 2024-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Freundt et al. | Chapter IX Identification of Mycoplasmas | |
| Gohari et al. | Characterization of Clostridium perfringens in the feces of adult horses and foals with acute enterocolitis | |
| Lin et al. | Isolation and immunological detection of Mycoplasma ovipneumoniae in sheep with atypical pneumonia, and lack of a role for Mycoplasma arginini | |
| Piras et al. | Identification of immunoreactive proteins of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis | |
| EP3180620B1 (en) | Predicting s. aureus disease | |
| Grange et al. | Characterization of a Propionibacterium acnes surface protein as a fibrinogen-binding protein | |
| EP1224319B1 (en) | Serum amyloid a as marker for inflammatory response, milk quality and the presence of colostrum in milk | |
| Shoukat et al. | A study on detection of pathogenic Listeria monocytogenes in ovine’s of Kashmir region having abortion or history of abortion | |
| Bai et al. | YSIRK-G/S-directed translocation is required for Streptococcus suis to deliver diverse cell wall anchoring effectors contributing to bacterial pathogenicity | |
| Moe et al. | Detection of antibodies against Fusobacterium necrophorum and Porphyromonas levii‐like species in dairy cattle with papillomatous digital dermatitis | |
| Kronvall et al. | Protein A in Staphylococcus aureus strains of human and bovine origin | |
| Asadpour et al. | Study on correlation of Maedi-Visna Virus (MVV) with ovine subclinical mastitis in Iran | |
| US11740237B2 (en) | Biomarkers for detecting microbial infection | |
| Ghazvineh et al. | Molecular detection of selective virulence factors of mycoplasma bovis local isolates involved in bovine mastitis | |
| PL246485B1 (pl) | Sposób i kompozycja diagnostyczna do wykrywania mastitis wywołanego przez E. coli, S. uberis, S. agalactiae lub S. aureus | |
| Poulsen et al. | Occurrence of haemolytic Mannheimia spp. in apparently healthy sheep in Norway | |
| Fusco et al. | Development of a sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant antigens for rapid detection of antibodies against Mycoplasma agalactiae in sheep | |
| KR101311886B1 (ko) | 폐렴연쇄상구균의 분비단백질을 포함하는 폐렴 진단용 조성물 | |
| Watanabe et al. | Predicting an increased risk of severe clinical mastitis and economic loss using a threshold value of bovine leukemia virus proviral load | |
| Hamsten et al. | Expression and immunogenicity of six putative variable surface proteins in Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC | |
| Massi et al. | Neglected bacterial infections associated to bovine respiratory disease in lactating cows from high-yielding dairy cattle herds | |
| US20100129839A1 (en) | Method for in vitro diagnosis of pvl-producing staphylococcus aureus | |
| CN119438592A (zh) | 一种区分单核细胞增生李斯特菌和/或伊氏李斯特菌感染的elisa试剂盒、制备方法及其应用 | |
| Amagliani et al. | A combination of diagnostic tools for rapid screening of ovine listeriosis | |
| Bu et al. | Indirect enzyme-linked immunosorbent assay method based on Streptococcus agalactiae rSip-Pgk-FbsA fusion protein for detection of bovine mastitis |