PL245261B1 - Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium - Google Patents
Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium Download PDFInfo
- Publication number
- PL245261B1 PL245261B1 PL442101A PL44210122A PL245261B1 PL 245261 B1 PL245261 B1 PL 245261B1 PL 442101 A PL442101 A PL 442101A PL 44210122 A PL44210122 A PL 44210122A PL 245261 B1 PL245261 B1 PL 245261B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- horvu
- morex
- cadmium
- gene
- barley
- Prior art date
Links
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 71
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 66
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 241000173698 Hordeum pubiflorum Species 0.000 claims description 2
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 abstract description 15
- ZRWPUFFVAOMMNM-UHFFFAOYSA-N Patulin Chemical compound OC1OCC=C2OC(=O)C=C12 ZRWPUFFVAOMMNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 abstract description 3
- 108050000194 Expansin Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108010048607 glycerophosphodiester phosphodiesterase Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 39
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108090000069 P-type ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000003697 P-type ATPases Human genes 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006550 Lantana camara Species 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 231100000693 bioaccumulation Toxicity 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N tellanylidenegermanium Chemical compound [Te]=[Ge] JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, kodujących odpowiednio białko z rodziny leguminozin fosfodiesterazę glicerofosfodiestrową, ekspansynę, kolagen typu II oraz transporter metali ciężkich. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w liściach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów. Prezentowane zgłoszenie pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.The subject of the application are primer sequences enabling the analysis of gene expression levels in barley leaves and a method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium. More specifically, the application concerns primers for identifying genes with the identifiers HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135 700, encoding a protein from the leguminozin family, glycerophosphodiester phosphodiesterase, expansin, type II collagen and a heavy metal transporter, respectively. Primers were designed for each gene to determine their expression level in barley leaves using the proposed gene expression level testing system. The presented application will allow the selection of plant varieties in terms of tolerance to cadmium stress, which will make it possible to use forms in breeding that will not accumulate heavy metals in their tissues.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, kodujących odpowiednio białko z rodziny leguminozin, fosfodiesterazę glicerofosfodiestrową, ekspansynę, kolagen typu II oraz transporter metali ciężkich. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w liściach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.The subject of the invention are primer sequences enabling the analysis of the level of gene expression in barley leaves and a method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium. More specifically, the application concerns primers for identifying genes with the identifiers HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135 700, encoding a protein from the leguminozin family, glycerophosphodiester phosphodiesterase, expansin, type II collagen and a heavy metal transporter, respectively. Primers were designed for each gene to determine their expression level in barley leaves using the proposed gene expression level testing system.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe) wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1, 2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali ciężkich może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Prezentowany wynalazek pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.Heavy metals, including lead (Pb), cadmium (Cd), zinc (Zn), mercury (Hg), arsenic (As), silver (Ag), chromium (Cr), copper (Cu) and iron (Fe) have toxic effects even in small doses [1, 2]. These compounds do not biodegrade, which is why they bioaccumulate and biomagnify. While some heavy metals, in precisely defined doses, are necessary for the proper functioning of plant and animal organisms, their excessive concentration has a toxic effect. The presence of the above-mentioned heavy metals in the soil or water available to plants leads to their accumulation in the plant body, and then in the organisms of herbivores, where the concentration of heavy metals can reach even higher concentrations [3]. The presented invention will allow the selection of plant varieties in terms of tolerance to cadmium stress, which will make it possible to use in breeding forms that will not accumulate heavy metals in their tissues.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem kadmu. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, Sebastian oraz mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę kadmu niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego w odmianie Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w liściach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie kadmem, i wskazanie tych, które mogą różnicować genotypy jęczmienia tolerancyjne i wrażliwe na kadm.Among heavy metals, Cd, Zn and Pb have some of the highest accumulation rates in plant organisms [4], and in Poland the greatest risk of contamination occurs in the case of Cd and Pb. The impact of these heavy metals on the growth of, among others, barley (Hordeum vulgare) has already been studied by teams of researchers [5]. As part of the research leading to the development of this invention, hydroponic cultivation of barley plants with the addition of cadmium was carried out. Two barley genotypes were used for the study, Sebastian and the hvd14.d mutant [6], which showed a varied response to heavy metal treatment. The Sebastian variety was more tolerant to the tested dose of cadmium than the hvd14.d mutant, which was confirmed by weaker growth inhibition and less damage to the photosynthetic apparatus in the Sebastian variety compared to the mutant. Analyzes of the level of gene expression in the leaves of both forms allowed the selection of genes involved in barley's response to cadmium treatment and the identification of those that can differentiate cadmium-tolerant and cadmium-sensitive barley genotypes.
Z dotychczasowego stanu techniki znane są rozwiązania, które pozwalają na zwiększenie tolerancji roślin na toksyczne działanie kadmu, bądź wykorzystanie roślin do usunięcia kadmu z podłoża. Na przykład w opisie patentowym CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są w stanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu.The current state of the art provides solutions that allow increasing the tolerance of plants to the toxic effects of cadmium or using plants to remove cadmium from the substrate. For example, in patent description CN102085527A, the authors describe the possibility of using plants of the species Lantana camara to remove cadmium from the substrate. These plants are cadmium hyperaccumulators and are able to develop normally even in soil contaminated with a dose of 50 mg/kg. During growth, they take up cadmium through the root system and transport it to the above-ground part. Hence, the concentration of cadmium in the soil decreases.
Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny.Application EP12191891 describes the possibility of reducing the expression of genes encoding transporters from the P-type ATPase family, which are involved, among others, in cadmium transport. Thanks to this, it is possible to limit the transport of this metal to the above-ground part of the plant, which limits its accumulation in the plant tissues.
Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2, kodującego transporter nukleozasady - kwasu askorbinowego.The authors of application CN109880829A indicate that the introduction of an additional copy of the HvPAA1 gene (encoding P-type ATPase) under the control of a constitutive promoter increases the tolerance of barley plants to cadmium treatment. A similar effect, according to application number CN113584047A, can be achieved by using genetic engineering to introduce an additional copy of the HvNAT2 gene, encoding the nucleobase transporter - ascorbic acid.
Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.In turn, application number CN107326032A presents the MNB1 gene encoding mannose-binding lectin 1, the overexpression of which may increase the tolerance of Arabidopsis thaliana plants to the presence of cadmium in the substrate.
Pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny oraz selekcji form odpornych na metale ciężkie nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.Among the patent applications regarding the impact of heavy metals on plants and the selection of forms resistant to heavy metals, no applications were found that would be based on information regarding the level of barley gene expression.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji, w liściach jęczmienia, pięciu genów kodujących białka: z rodziny leguminozin, fosfodiesterazę glicerofosfodiestrową, ekspansynę, kolagen typu II oraz transporter metali ciężkich. Dzięki wykorzystaniu tych starterów możliwa jest analiza odpowiedzi roślin na stres przez pryzmat różnych mechanizmów związanych z odpowiedzią w liściach rośliny jęczmienia na traktowanie kadmem. Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, w którym kluczowym etapem jest analiza poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia bazująca na ww. sekwencjach starterów.The aim of the creators of this invention was to develop primer sequences enabling the analysis of the expression level in barley leaves of five genes encoding proteins: from the leguminozin family, glycerophosphodiester phosphodiesterase, expansin, type II collagen and a heavy metal transporter. Thanks to the use of these primers, it is possible to analyze the response of plants to stress through the prism of various mechanisms related to the response of barley plant leaves to cadmium treatment. Another goal of the creators was to develop a method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium, in which the key stage is the analysis of the level of gene expression in barley leaves based on the above-mentioned. primer sequences.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów dla genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG-0326410,The essence of the invention are the primer sequences for the genes HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG-0326410,
HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, których ekspresja w liściach wskazuje na obniżoną tolerancję na kadm, przedstawione w wykazie sekwencji:HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, the expression of which in leaves indicates reduced tolerance to cadmium, shown in the sequence listing:
a. dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0428280a. for the HORVU.MOREX.r2.5HG0428280 gene
b. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0144480b. for the HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 gene
c. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326410c. for the HORVU.MOREX.r2.4HG0326410 gene
d. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 sekwencje nukleotydowe 1 i 2, sekwencje nukleotydowe 5 i 6, sekwencje nukleotydowe 7 i 8, sekwencje nukleotydowe 9 i 10.d. for the HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 gene, nucleotide sequences 1 and 2, nucleotide sequences 5 and 6, nucleotide sequences 7 and 8, nucleotide sequences 9 and 10.
Ponadto, istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tole rancji na kadm, pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zmniejszonej tolerancji na kadm, obejmu jący następujące etapy:Moreover, the essence of the invention is a method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium, allowing the selection of barley varieties with reduced tolerance to cadmium, including the following steps:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w warunkach hydroponiki przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, przy czym jedną grupę stanowią siewki kontrolne, których wzrost prowadzi się w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, natomiast drugą grupę stanowią siewki badane pod kątem ich tolerancji na kadm, których wzrost przez co najmniej 10 dni, korzystnie 14 dni, prowadzi się w takich samych warunkach jak siewki kontrolne, po czym na czas co najmniej 5 dni, korzystnie 10 dni, poddaje się je stresowi przez dodanie od 3 μM do 10 μM kadmu, korzystnie 5 μM kadmu,a. barley seedlings are grown in hydroponic conditions for at least 15 days, preferably 24 days, with one group of control seedlings, the growth of which is carried out in conditions ensuring no contact of plants with cadmium, while the second group consists of seedlings tested for their cadmium tolerance, the growth of which is carried out for at least 10 days, preferably 14 days, in the same conditions as control seedlings, and then they are stressed for at least 5 days, preferably 10 days, by adding from 3 μM to 10 μM cadmium, preferably 5 μM cadmium,
b. izoluje się RNA z liści jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,b. RNA is isolated from barley leaves of control plants and test plants,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,c. cDNA synthesis is carried out,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG-d. the level of gene expression HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG- is analyzed
0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 metodą qPCR u roślin kontrolnych i badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 by qPCR in control and test plants, characterized by the fact that the primer sequences presented in the sequence list are used to analyze the level of gene expression:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.i. for the HORVU.MOREX.r2 gene.
ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 iii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0086120 iv. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326410ii. for the HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 gene iii. for the HORVU.MOREX.r2.2HG0086120 gene iv. for the HORVU.MOREX.r2.4HG0326410 gene
v. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0135700v. for the HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 gene
- sekwencje nukleotydowe 1 i 2, - sekwencje nukleotydowe 3 i 4, - sekwencje nukleotydowe 5 i 6, - sekwencje nukleotydowe 7 i 8, - sekwencje nukleotydowe 9 i 10,- nucleotide sequences 1 and 2, - nucleotide sequences 3 and 4, - nucleotide sequences 5 and 6, - nucleotide sequences 7 and 8, - nucleotide sequences 9 and 10,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MO-e. the relative expression level of the HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MO- genes is calculated
REX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz roślinami badanymi traktowanymi kadmem,REX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700, based on reference gene expression levels, with gene expression levels being compared between control plants and cadmium-treated test plants,
f. identyfikuje się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 wskazujący na obniżoną tolerancję na kadm.f. barley genotypes are identified showing a higher level of gene expression HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2 compared to analogous genotypes bred in control conditions .4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 indicating reduced tolerance to cadmium.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem tolerancji na kadm.Preferably, the same barley variety as the plants tested for cadmium tolerance are used as control plants.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1 -a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7].Preferably, the following genes are used as reference genes: EF1 (Elongation factor 1 -a) and/or GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.Preferably, the growth of barley control plants in hydroponic culture takes place in Hoagland's medium.
Korzystnie, wzrost roślin jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 750 do 1000 μποΙ m-2 s-1, najkorzystniej 900 μποΙ m-2 s-1.Preferably, the growth of barley plants is carried out in the following conditions: air temperature from 18 to 22°C, most preferably 20°C, photoperiod from 14/10 to 20/4, most preferably 16/8, light intensity from 750 to 1000 μποΙ m -2 s -1 , most preferably 900 μποΙ m -2 s -1 .
Proponowane rozwiązanie techniczne bazujące na analizie poziomu ekspresji pięciu genów w liściach jęczmienia (HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HGO 13 5700) jest metodą pozwalającą na selekcję odmian jęczmienia wrażliwych na kontakt z kadmem. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów jęczmienia między sobą i wybranie tych, które będą gorzej adaptowały się do traktowania kadmem.Proposed technical solution based on the analysis of the expression level of five genes in barley leaves (HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX. r2.2HGO 13 5700) is a method that allows the selection of barley varieties sensitive to contact with cadmium. By analyzing expression profiles using the presented primers, it is possible to compare barley genotypes with each other and select those that will be less adaptable to cadmium treatment.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomów ekspresji genów u dwóch genotypów po traktowaniu kadmem. Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na kadm, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na kadm. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych kadmem (10-dniowe traktowanie dawką 5 μΜ kadmu). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów, w liściach badanych roślin, po traktowaniu kadmem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady wykonania, nie mają charakteru ograniczającego.The subject of the invention is presented in examples of embodiment and in the drawing, in which: Fig. 1 shows the result of the analysis of gene expression levels in two genotypes after cadmium treatment. The initial Sebastian variety is tolerant to cadmium, compared to the hvd14.d mutant, which is hypersensitive to cadmium. Gene expression was examined by comparing each genotype that grew under control conditions to plants treated with cadmium (10-day treatment with a dose of 5 μΜ cadmium). The expression level was analyzed using the qPCR method, and Fig. 1 shows the relative expression level of the mentioned genes in the leaves of the tested plants after cadmium treatment in relation to the control conditions, for which the expression level was set to 1. The embodiments are not limiting.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań przedstawionych w zgłoszeniu możliwe jest przeprowadzenie selekcji genotypów jęczmienia pod kątem tolerancji na obecność kadmu, a wykorzystanie ich w programach hodowlanych może pozwolić na otrzymanie odmian, które mogą być uprawiane na skażonych glebach.Thanks to the solutions presented in the application, it is possible to select barley genotypes for cadmium tolerance, and their use in breeding programs may allow obtaining varieties that can be grown on contaminated soils.
Przykład 1Example 1
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genówPrimer sequences according to the invention and analysis of gene expression levels
HORVU.MOREX.r2.5HG0427280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480,HORVU.MOREX.r2.5HG0427280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480,
HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410,HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410,
HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 z wykorzystaniem tych sekwencji starterów.HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 using these primer sequences.
RNA wyizolowano z liści 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) oraz tych traktowanych kadmem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 5 μΜ kadmu), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:RNA was isolated from the leaves of 24-day-old barley plants that grew under control conditions (hydroponic culture in Hoagland's medium, air temperature 20°C; photoperiod 16/8; light intensity 900 μmol m -2 s -1 ) and those treated with cadmium (for the first 14 days of cultivation as for control plants, for the next 10 days 5 μΜ of cadmium was added to the medium), using mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, catalog number AM1560). The RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, catalog number K1622) and 1 μg of RNA were used for cDNA synthesis. The obtained cDNA was diluted 4-fold with water and used in the qPCR reaction, which was performed using the LightCycler 480 SYBR Green I Master kit (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, catalog number 04707516001) for each of the primer pairs:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0428280:a) for the HORVU.MOREX.r2.5HG0428280 gene:
- sekwencja nukleotydowa 1- nucleotide sequence 1
- sekwencja nukleotydowa 2- nucleotide sequence 2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0144480:b) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 gene:
- sekwencja nukleotydowa 3- nucleotide sequence 3
- sekwencja nukleotydowa 4- nucleotide sequence 4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0086120:c) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0086120 gene:
- sekwencja nukleotydowa 5- nucleotide sequence 5
- sekwencja nukleotydowa 6- nucleotide sequence 6
d) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326410:d) for the HORVU.MOREX.r2.4HG0326410 gene:
- sekwencja nukleotydowa 7- nucleotide sequence 7
- sekwencja nukleotydowa 8- nucleotide sequence 8
e) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0135700:e) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 gene:
- sekwencja nukleotydowa 9- nucleotide sequence 9
- sekwencja nukleotydowa 10.- nucleotide sequence 10.
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1 -aa) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7]. W odpowiedzi na traktowanie kadmem zaobserwowano wzrost poziomów ekspresji badanych genów.EF1 (Elongation factor 1 -aa) and GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) were used as reference genes in this reaction [7]. In response to cadmium treatment, an increase in the expression levels of the tested genes was observed.
Przykład 2Example 2
Sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 w liściach jęczmienia obejmujący następujące etapy:Method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium based on the analysis of gene expression levels HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU. MOREX.r2.2HG0135700 in barley leaves comprising the following stages:
1. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) na pożywce Hoaglanda [8], natomiast wzrost roślin mających kontakt z kadmem prowadzi się przez 14 dni w tych samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 5 μM kadmu na 10 kolejnych dni,1. control barley seedlings are grown for 24 days under control conditions (air temperature 20°C; photoperiod 16/8; light intensity 900 μmol m -2 s -1 ) on Hoagland's medium [8], while the growth of plants in contact with cadmium is treated for 14 days under the same control conditions, after which 5 μM cadmium is added to the medium for 10 subsequent days,
2. izoluje się RNA z liści jęczmienia, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830) pozwalający na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,2. RNA is isolated from barley leaves, this step being performed using the mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, catalog number AM1560) or MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA , USA, catalog number AM1830) allowing to obtain a chemically pure RNA extract while maintaining its integrity,
3. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,3. single-stranded cDNA is synthesized using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, catalog number K1622) or equivalent and 1 μg of RNA,
4. analizuje się poziom analizuje się poziom ekspresji genów u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się następujące sekwencje starterów:4. the level of gene expression in control and tested plants is analyzed by conducting qPCR reactions using the obtained cDNA (diluted 4 times with water), primers specific for the genes HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 , HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 and the LightCycler 480 SYBR Green I Master kit (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, catalog number 04707516001) or equivalent allowing on real-time DNA amplification analysis, where the following primer sequences are used to analyze the level of gene expression:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0428280:a) for the HORVU.MOREX.r2.5HG0428280 gene:
- sekwencja nukleotydowa 1- nucleotide sequence 1
- sekwencja nukleotydowa 2- nucleotide sequence 2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0144480:b) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0144480 gene:
- sekwencja nukleotydowa3- nucleotide sequence3
- sekwencja nukleotydowa4- nucleotide sequence4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0086120:c) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0086120 gene:
- sekwencja nukleotydowa5- nucleotide sequence5
- sekwencja nukleotydowa6- nucleotide sequence6
d) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326410:d) for the HORVU.MOREX.r2.4HG0326410 gene:
- sekwencja nukleotydowa7- nucleotide sequence7
- sekwencja nukleotydowa8- nucleotide sequence8
e) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0135700:e) for the HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 gene:
- sekwencja nukleotydowa9- nucleotide sequence9
- sekwencja nukleotydowa10.- nucleotide sequence10.
5. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7] dla każdej próby cDNA,5. a qPCR reaction is carried out using the reference gene primers EF1 (Elongation factor 1-a) and GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7] for each cDNA sample,
6. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MO-6. based on the kinetics of the amplification reaction of each gene HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MO-
REX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów; poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślinami narażonymi na 10dniowy stres traktowania kadmem, dla każdego z genotypów,REX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 and reference genes, the relative expression level of the tested genes is calculated; gene expression levels are compared between plants growing in control conditions and plants exposed to 10 days of cadmium treatment stress, for each genotype,
7. identyfikuje się genotypy jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, na podstawie podwyższonego poziomu ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700; dla każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy kontrolą a roślinami traktowanymi kadmem; im wyższa ekspresja genów u roślin stresowanych tym bardziej zostały one uszkodzone przez kadm, co oznacza niższą tolerancję rośliny na kadm.7. barley genotypes with reduced tolerance to cadmium are identified, based on the increased level of gene expression HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700; for each genotype, the expression level of each of the tested genes is compared between the control and cadmium-treated plants; the higher the gene expression in stressed plants, the more they were damaged by cadmium, which means the lower the plant's tolerance to cadmium.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do porównania ich wrażliwości na kadm jest krotność wzrostu ekspresji u roślin stresowanych. Rośliny o najwyższych wskaźnikach są najbardziej wrażliwe. Otrzymane wyniki porównuje się pomiędzy dwiema bądź większą liczbą odmian. Im wyższy poziom ekspresji tym mniejsza tolerancja na kadm. Wynik porównania dwóch odmian o zróżnicowanej tolerancji na kadm przedstawiono na fig. 1 rysunku.The presented procedure should be performed for all analyzed genotypes, and the value used to compare their sensitivity to cadmium is the fold increase in expression in stressed plants. Plants with the highest rates are the most sensitive. The results obtained are compared between two or more varieties. The higher the expression level, the lower the tolerance to cadmium. The result of comparing two varieties with different tolerance to cadmium is shown in Fig. 1 of the drawing.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, nadwrażliwych na kadm, które zostały potraktowane kadmem (dawka od 3 do 10 μΜ, najkorzystniej 5 μΜ; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 pmol m-2 s-1), wykazano podwyższoną ekspresję wspomnianych genów. Ekspresja genów HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 nie ulegała zmianie w takich samych warunkach traktowania u roślin jęczmienia tolerancyjnych na kadm. Stąd rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionych genów w odpowiedzi na traktowanie kadmem zaliczone mogą być do genotypów wrażliwych na kadm.In 24-day-old barley plants hypersensitive to cadmium, which were treated with cadmium (dose from 3 to 10 μΜ, most preferably 5 μΜ; treatment from 5 to 15 days, most preferably 10), compared to plants growing in control conditions (air temperature from 18 to 22°C, most preferably 20°C; photoperiod from 14/10 to 20/4, most preferably 16/8; light intensity from 100 to 150 μmol m -2 s -1 , most preferably 120 pmol m -2 s -1 ) , increased expression of the mentioned genes was demonstrated. The expression of HORVU.MOREX.r2.5HG0428280, HORVU.MOREX.r2.2HG0144480, HORVU.MOREX.r2.2HG0086120, HORVU.MOREX.r2.4HG0326410, HORVU.MOREX.r2.2HG0135700 genes was not changed in such same conditions of treatment u barley plants tolerant to cadmium. Hence, plants showing increased expression of the mentioned genes in response to cadmium treatment may be classified as cadmium-sensitive genotypes.
Literatura:Literature:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.[1] Hawkes J.S. 1997. What is heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Contamination of soil and crops with trace elements. Ed. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerance of spring barley seedlings to Cd and Pb under acidic conditions. Problem Notebooks of Progress in Agricultural Sciences, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Rapacz, M., Stępień, A., & Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RTPCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.[7] Rapacz, M., Stępień, A., & Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RTPCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[8] Hoagland, D. R., & Amon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edit).[8] Hoagland, D. R., & Amon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edition).
PL 245261 Β1PL 245261 Β1
Wykaz sekwencji starterów <110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm <130> 630 <140> P.442101 <141> 2023-02-27 <160> 10 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 cccgtcgtcc ctacagtcc 19 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 2 cglaccgggt gtgccc 16 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 3 tgactctcct tggaagacgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgarc <400> 4 galgtccggc tcacaaagga 20 <210> 5 <211> 20List of primer sequences <110> University of Silesia in Katowice <120> Primer sequences allowing analysis of the level of gene expression in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium <130> 630 <140> P.442101 <141> 2023-02 -27 <160> 10 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 cccgtcgtcc ctacagtcc 19 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213 > Hordeum vulgare <400> 2 cglaccgggt gtgccc 16 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 3 tgactctcct tggaagacgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgarc <400> 4 galgtccggc tcacaaagga 20 <210> 5 <211> 20
PL 245261 Β1 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 5 catgtctggg tctggccatt <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213 > Hordeutn yulgare <400> 6 aacctgtact cgacggggta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 7 aaccccgtgt tgUcctgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213 > Hordeutn yulgare <400> 8 tcgtgttctc gtggaaaggg 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 9 cagcgccaag alcgagagg 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213 > Hordeutn yulgare <400> 10 agaacattga ggtcgtcaag c 21PL 245261 Β1 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 5 catgtctggg tctggccatt <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 6 aacctgtact cgacggggta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 7 aaccccgtgt tgUcctgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 8 tcgtgttctc gtggaaaggg 20 <210> 9 <211> 19 <2 12 > DNA <213> Hordeutn yulgare <400> 9 cagcgccaag alcgagagg 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213 > Hordeutn yulgare <400> 10 agaacattga ggtcgtcaag c 21
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442101A PL245261B1 (en) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442101A PL245261B1 (en) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442101A1 PL442101A1 (en) | 2024-03-04 |
| PL245261B1 true PL245261B1 (en) | 2024-06-10 |
Family
ID=90106961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442101A PL245261B1 (en) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245261B1 (en) |
-
2022
- 2022-08-27 PL PL442101A patent/PL245261B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442101A1 (en) | 2024-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop | |
| Dai et al. | Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress | |
| Chao et al. | Genome-wide association studies identify heavy metal ATPase3 as the primary determinant of natural variation in leaf cadmium in Arabidopsis thaliana | |
| Hammond et al. | A comparison of the Thlaspi caerulescens and Thlaspi arvense shoot transcriptomes | |
| Xiao et al. | Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress | |
| Satoh-Nagasawa et al. | Functional relationship heavy metal P-type ATPases (OsHMA 2 and OsHMA3) of rice (Oryza sativa) using RNAi | |
| Graham et al. | Genetical and comparative genomics of Brassica under altered Ca supply identifies Arabidopsis Ca-transporter orthologs | |
| Takano et al. | The rice RCN11 gene encodes β1, 2-xylosyltransferase and is required for plant responses to abiotic stresses and phytohormones | |
| Zhu et al. | Integrated physio-biochemical and RNA sequencing analysis revealed mechanisms of long non-coding RNA-mediated response to cadmium toxicity in wheat | |
| Horvath et al. | Microarray analysis of late-season velvetleaf (Abutilon theophrasti) effect on corn | |
| Blomme et al. | The mitochondrial DNA-associated protein SWIB5 influences mtDNA architecture and homologous recombination | |
| PL245379B1 (en) | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley roots and method of identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium | |
| PL245381B1 (en) | Primer sequences enabling the analysis of gene expression levels in barley leaves and roots and a method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to cadmium | |
| PL245382B1 (en) | Primer sequences enabling the analysis of gene expression levels in barley leaves and roots and a method for identifying barley genotypes with increased tolerance to cadmium | |
| PL245380B1 (en) | Primer sequences enabling analysis of the level of gene expression in barley roots and method of identifying barley genotypes with increased tolerance to cadmium | |
| PL245378B1 (en) | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method of identifying barley genotypes with increased tolerance to cadmium | |
| Kim et al. | Validation of the role of Allium cepa allene oxide synthase (AcAOS) in resistance to Botrytis squamosa | |
| PL245415B1 (en) | Primer sequences enabling the analysis of the level of gene expression in barley roots and a method of identifying barley that was in contact with cadmium | |
| PL245414B1 (en) | Primer sequences allowing analysis of the level of gene expression in barley leaves and a method of identifying barley that was in contact with cadmium | |
| PL245525B1 (en) | Primer sequences for analysis of gene expression levels in barley leaves and roots and a method for identifying barley genotypes with reduced zinc tolerance | |
| PL245473B1 (en) | Primer sequences for analysis of gene expression levels in barley roots and a method for identifying barley genotypes with reduced zinc tolerance | |
| Chao et al. | cDNA-AFLP analysis of inducible gene expression in zinc hyperaccumulator Sedum alfredii Hance under zinc induction | |
| PL245552B1 (en) | Primer sequences enabling analysis of gene expression levels in barley leaves and method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to zinc and cadmium | |
| PL245524B1 (en) | Primer sequences for analysis of gene expression levels in barley roots and a method for identifying barley genotypes with increased zinc tolerance | |
| PL245871B1 (en) | Primer sequences for analysis of gene expression levels in barley leaves and roots and a method for identifying barley genotypes with reduced tolerance to zinc and cadmium |