PL245026B1 - Sposób wytwarzania nanonośników poli(D,L laktydowych) stabilizowanych surfaktyną oraz nanonośniki wytworzone tym sposobem - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania polimerowych nośników (D,L laktydowych) stabilizowanych surfaktyną, charakteryzujący się tym, że ma następujące etapy: a) rozpuszczenie poli(D,L laktydu) w rozpuszczalniku organicznym; b) prowadzenie precypitacji międzyfazowej poprzez wkraplanie fazy organicznej wytworzonej w etapie a) do wodnego roztworu surfaktyny przez 1-5 minut przy ciągłym mieszaniu fazy wodnej, przy czym surfaktyna w roztworze wodnym stanowi surfaktynę w formie kwasu karboksylowego lub soli sodowej; c) mieszanie aż do wytrącenia się polimeru; d) odparowanie rozpuszczalnika organicznego. Kolejnym przedmiotem wynalazku są polimerowe nośniki poli(D,L laktydowe) stabilizowane surfaktyną wytworzone sposobem według wynalazku, charakteryzujące się tym, że stanowią sferyczne cząstki o średnicy hydrodynamicznej wynoszącej od 125 do 200 i współczynniku polidyspersyjności PDI˂0.15.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nanonośników poli(D,L laktydowych) stabilizowanych surfaktyną oraz nanonośniki wytworzone tym sposobem, które stanowią polimerowe nanocząstki z poli(D,L laktydu) stabilizowane surfaktyną, czyli anionowym związkiem powierzchniowo czynnym należącym do grupy biosurfaktantów, przeznaczonych do stosowania w formulacjach kosmetycznych i farmaceutycznych, jako nośniki hydrofobowych substancji aktywnych.

Ze stanu techniki znane jest zastosowanie surfaktyny jako związku powierzchniowo czynnego (surfaktantu) w kompozycjach farmaceutycznych. Na przykład z dokumentu WO2009050726 A2 znana jest kompozycja farmaceutyczna mikronizowanego bupropionu o kontrolowanej wielkości cząstek w zakresie 1-60 μm, gdzie mediana wielkości cząstek jest mniejsza niż 40 μm. W korzystnym wariancie kompozycja może zawierać nośnik (np. polimer) oraz surfaktant (np. surfaktyną). Surfaktanty korzystnie poprawiają właściwości powierzchniowe, na przykład zmniejszając interakcje cząstka-cząstka, i mogą sprawić, że ich powierzchnia będzie mniej adhezyjna. Surfaktanty mogą również sprzyjać wchłanianiu (solubilizacji) substancji terapeutycznej lub diagnostycznej i zwiększać jej biodostępność. Dokument wskazuje, że surfaktant może stabilizować daną cząsteczkę, zarówno wewnątrz, jak i na jej powierzchni. Surfaktant można na przykład wprowadzić do nośników o kontrolowanym lub spowolnionym uwalnianiu, takich jak powyższe polimerowe mikrosfery.

Niestety doniesienia literaturowe sugerują, iż układy w rozmiarze mikro, powyżej 5 μm mogą blokować naczynia włosowate, dlatego wskazane jest tworzenie układów dostarczania znacznie poniżej tego rozmiaru [R.H. MUller, C. Jacobs, O. Kayser, Adv Drug Deliv Rev 47 (2001) 3-19]. Co więcej, wiadomo, że nerki są zdolne do odfiltrowywania z krwi (tzw. renal clearance) cząsteczek mniejszych niż 30 nm, zaś komórki endohelialne w naczyniach krwionośnych śledziony czy te występujące w szpiku kostnym, mogą mieć nieciągłości nawet do 100 nm. Z kolei, rozmiar nanonośników powyżej 200 nm sprzyja ich wychwytowi przez komórki makrofagowe wątroby (tzw. komórki Browicza-Kupffera stanowiące ok. 15-20% wszystkich komórek wątroby). Wykazano jednak, że struktury o rozmiarach poniżej 150 nm są najbardziej efektywnie internalizowane przez nowotworowe komórki docelowej. Biorąc pod uwagę powyższe ograniczenia, można wywnioskować, że najbardziej optymalny rozmiar nanonośnika, który pozwalałby na wnikanie do patologicznych tkanek nowotworowych, omijając te prawidłowe, jak również ograniczał zjawisko niekorzystnego wyłapywania przez system makrofagów, mieści się w granicach 125-200 nm [C. He, Y. Hu, L. Yin, C. Tang, C. Yin, Biomaterials 31 (2010) 3657-3666; M. Gaumet, A. Vargas, R. Gurny, F. Delie, Eur J Pharm Biopharm 69 (2008) 1-9; S. Acharya, K. Sahoo, Adv Drug Deliv Rev 68 (2011) 70-183].

Literatura ujawnia również zastosowanie surfaktyny jako stabilizatora emulsji. W publikacji autorstwa Lewińskiej i współpracowników ujawniono system dostarczania leków w postaci nanoemulsji stabilizowanej przez surfaktynę produkowaną przez z Bacillus subtilis. Ujawniona nanoemulsja zawiera 50% surfaktyny z Bacillus subtilis, 30% Transcutolu i 20% fazy olejowej. Kompozycja została przeznaczona do kapsułkowania zawartych w fazie olejowej substancji aktywnych (takich jak witamina C, witamina E, kurkumina). Wytworzone nośniki charakteryzowały się średnimi rozmiarami cząstek 69-183 nm (Lewińska A, Domżał-Kędzia M, Jaromin A, Łukaszewicz M. Nanoemulsion Stabilized by Safe Surfactinfrom Bacillus subtilis as a Multifunctional, Custom-Designed Smart Delivery System. Pharmaceutics. 2020 Oct; 12(10): 953. DOI: 10.3390/pharmaceutics12100953).

Literatura wskazuje, że polimerowe micelle stanowią atrakcyjną alternatywę w zakresie nośników dostarczania leków. W tym kontekście najważniejszą cechą micelarnych systemów dostarczania, która odróżnia je od innych nośników leków w postaci cząstek, jest ich mały rozmiar i wąski rozkład wielkości. Zastosowanie miceli na bazie polimerów zyskało wiele uwagi ze względu na dużą różnorodność polimerów, ich biokompatybilność, biodegradowalność i wiele grup funkcyjnych, które prezentują podczas koniugacji. W pracy autorstwa Ouahab i współpracowników zaproponowano nowy system dostarczania indometacyny (IND) z wykorzystaniem polimerycznych miceli PDLLA stabilizowanych PEG. Autorzy wskazali, że ujawnione micele mPEGPDLLA można stosować jako wydajne nośniki związków, które same wykazują słabą rozpuszczalność, niepożądaną farmakokinetykę i niską stabilność w środowisku fizjologicznym. Hydrofilowa powłoka w znacznym stopniu przyczynia się do zachowania farmaceutycznego preparatu polimerycznego poprzez utrzymywanie miceli w stanie zdyspergowanym, jak również poprzez zmniejszenie niepożądanych interakcji leków z komórkami i białkami (Ouahab A, Shen Y, Tu J. Novel oral delivery system of indomethacin by solidified mPEG-PDLLA micelles: in vivo study. Drug

Delivery 2012; 19(4): 232-237). Jednakże zbyt mały rozmiar otrzymanych nośników (Dh <20 nm) sugeruje, że mogą być one zbyt szybko usuwane z krążenia przez nerki w wyniku wspomnianego powyżej „renal clearance”. Co więcej ostatnie doniesienia dowodzą o szkodliwych właściwościach glikolu polietylenowego (PEG-u), który stabilizuje powyższe układy. Do poważnych skutków ubocznych stosowania PEG-u zaliczamy m.in. wywoływanie niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w wyniku działania przeciwciał anty-PEG, co może skutkować przyspieszeniem klirensu krwi, niską skutecznością załadowanej substancji aktywnej, nadwrażliwością, alergią a niektórych przypadkach innych zagrażających życiu skutków uboczne [The Importance of Poly(ethylene glycol) Alternatives for Overcoming PEG Immunogenicity in Drug Delivery and Bioconjugation, Polymers 2020, 12, 298]. Dlatego poszukiwanie innych nośników o odpowiednich rozmiarach i bardziej biozgodnych komponentach jest bardzo pożądane.

Oprócz rozmiaru i biokompatybilności, bardzo ważnym aspektem jest również niska polidyspersyjność wytworzonych nośników. Termin „polidyspersyjność” (lub „dyspersja” jako zalecane przez IUPAC) służy do opisania stopnia nierównomierności rozkładu wielkości cząstek. PDI, znany również jako wskaźnik heterogeniczności, jest liczbą obliczaną jako dwuparametrowe dopasowanie do danych korelacyjnych (analiza kumulantów). Ten indeks jest bezwymiarowy i przeskalowany w taki sposób, że wartości mniejsze niż 0,05 są głównie obserwowane w wysoce monodyspersyjnych standardach. Jednak tak monodyspersyjne układy nie występują w naturze. Dlatego tradycyjnie nośniki substancji aktywnych o zakresach PDI <0,2 są określane jako te o dobrej jakości, zaś te o PDI <0,15 należą do tych najbardziej pożądanych w badaniach aplikacyjnych, bo świadczą o ich długiej stabilności (Pharmaceutics 2018,10(2), 57].

Natomiast dokument IN01641MU2008 A dotyczący zastosowania nanocząstek metali (złota i srebra) w medycynie wskazuje, że aby przetrwać w środowisku in vivo, konieczne jest zaprojektowanie systemu, który jest rozpuszczalny w wodzie, odporny na agregację, biokompatybilny i nie zawiera toksycznych substancji chemicznych. W dokumencie zaproponowano nowy sposób przygotowania i formulacji nanocząstek metali koloidalnych (w szczególności złota i srebra) z naturalnie występującymi gumami (np. guma Gellan), które działają jako środek redukujący oraz stabilizujący. Wytworzone nanocząstki są następnie zamykane biosurfaktantem (soforolipidami), który pomaga w stabilizacji, modyfikacji powierzchni, umożliwia wiązanie się z aktywnymi cząsteczkami biologicznymi i pomaga we wchłanianiu cząsteczek przez błony biologiczne, zwłaszcza przez barierę krew-mózg.

W literaturze naukowej i patentowej opisane są sposoby wytwarzania i zastosowania różnych typów nośników polimerowych, zbudowanych m.in. biodegradowalnych polimerów, polielektrolitów i kopolimerów. Jedną z najbardziej korzystnych metod ich wytwarzania jest precypitacja międzyfazowa, podczas której polimer jest rozpuszczany w rozpuszczalniku organicznym mieszalnym z wodą i po dodaniu do wodnego roztworu surfaktantu, wytrąca się na granicy międzyfazowej rozpuszczalnik organiczny/woda. Nanoprecypitacja wyróżnia się z pośród innych metod otrzymywania nanonośników tym, że nie wymaga dużego nakładu energii, wysokich sił ścinających i temperatur, gwałtownego mieszania, sonifikacji, a ponadto stosowania toksycznych rozpuszczalników. Struktury otrzymane w wyniku tego podejścia charakteryzują dostrajanymi (100-1000 nm) rozmiarami, unimodalnym rozkładem wielkości nośników (współczynnik polidyspersyjności PDI nawet poniżej 0,2), wysokim stopniem enkapsulacji hydrofobowych związków bioaktywnych (>80%) oraz pożądaną długoterminową stabilnością koloidalną. Dlatego precypitowane układy znajdują szerokie zastosowanie przemysłowe m.in. w katalizie, diagnostyce, chemii gospodarstwa domowego, agrochemii ale także jako nośniki substancji aktywnych m.in. w przemyśle kosmetycznym, farmaceutycznym i rolnictwie (Mora-Huertas CE, Fessi H, Elaissari A. Polymer-based nanocapsules for drug delivery. Int J Pharmaceut. 385 (2010) 113-142). Niestety większość prowadzonych badań dotyczy polimerowych nanonośników stabilizowanych surfaktantami niejonowymi (głównie z grupy polioksyetylatów), których biokompatybilność i biodegradacja nie jest zbyt wysoka. Praca Bazylińskiej i współpracowników (Colloid Surf. A: Physicochem. Eng. Aspects 442 (2014) 42-49), opisuje syntezę nośników precypitowanych zbudowanych z poli(D,L laktydu), PDLLA lub polikaprolaktonu, PCL, stabilizowane polietoksylowanym olejem rącznikowym (Cremophor EL) przeznaczonych do enkapsulacji barwników hydrofobowych z grupy indocyjanin. Z pracy Zili i współpracowników (Int. J. Pharm. 294 (2005) 261-267) znany jest sposób wytwarzania nanocząstek z poli(s-kaprolaktonu) przy zastosowaniu metody precypitacji międzyfazowej stabilizowanych polioksetylatami (Tween 80 i Span 80), które zawierają gryzeofulvinę. Z kolei praca Ricci-Jiinior i współpracowników (Int. J. Pharm. 310 (2006) 187-195) opisuje wykorzystanie nanocząstek z kopolimeru laktydu i glikolidu do enkapsułowania ftalocyjaniny zawierającej w swojej strukturze cynk, które były dodatkowo stabilizowane alkoholem poliwinylowym (PVA).

Z opisu międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO2006052285 znane są inne polimerowe nanocząstki syntezowane z kwasu akrylowego lub akrylamidów, które mogą służyć do enkapsułowania, ekstrahowania i uwalniania różnego typu składników bioaktywnych (np. leków, przeciwutleniaczy). Nanocząstki otrzymywane są techniką odwróconej mikroemulsyfikacji, która pozwala na otrzymanie sferycznych cząstek kwasu poliakrylowego lub poliakrylamidu o rozmiarach od 50 do 80 nm. Inny przykład nanocząstek, które mogą być stosowane jako nośniki leków, ujawniony jest w opisie patentowym nr US7867984, który dotyczy bioaktywnych nanocząstek zbudowanych z chitozanu lub poli(kwasu glutaminowego) i zawierających kationowe związki tłumiące głód. Cząstki mogą być wykorzystane w doustnym podawaniu leków. Inne cząstki przydatne do otrzymywania nośników szczepionek ujawnione są w dokumencie WO2008115641, który dotyczy kompozycji zawierających m.in. polimerowe nanocząstki, antygeny, substancje wpływające na odpowiedź immunologiczną organizmu.

W dokumencie WO2009137112 opisana jest metoda wytwarzania nieimmunogennych nanocząstek syntezowanych ze związków pochodzenia białkowego przydatnych w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych. Nośniki otrzymywane są metodą nanoprecypitacji, podczas której materiał białkowy wytrącany jest poprzez zmianę pH, co prowadzi do wytworzenia nanocząstek o preferowanych rozmiarach od 100 do 300 nm. W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego numer US 2009/0099282 A1 ujawnione są nieorganiczne nanocząstki zbudowane z SiO2, AI2O3 lub mieszaniny SiO2 i AI2O3 o rozmiarach poniżej 400 nm, które mają kowalencyjnie przyłączone różnego typu barwniki, w tym barwniki typu cyjanin. Opisane nanocząstki mają zastosowanie do barwienia polimerów. Z kolei zgłoszenie patentowe (WO/2010/035118) dotyczy układów zawierających polimerowe nanocząstki (zbudowanych z polimeru lub polielektrolitu) i służących do enkapsułowania związków wykorzystywanych w rolnictwie. W zgłoszeniu tym zostały zaprezentowane zdjęcia wykonane techniką mikroskopii sił atomowych (AFM) oraz z zastosowaniem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Celem wynalazku było zapewnienie nowych polimerowych nośników dostarczania leków oraz nowego sposobu ich wytwarzania.

Dotychczas nie są znane sposoby dotyczące otrzymywania polimerowych nanonośników poli(D,L laktydu), inaczej poli(kwasu D,L-mlekowego), PDLLA stabilizowanych surfaktyną, w formie soli sodowej lub kwasu karboksylowego.

Nieoczekiwanie twórcy wynalazku stwierdzili, że surfaktyna zdolna jest do tworzenia w procesie precypitacji międzyfazowej sferycznych nośników PDLLA o rozmiarach 125-200 nm, przydatnych do enkapsułowania związków biologicznie czynnych o dużej hydrofobowości.

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania nośników polimerowych przeznaczonych do enkapsulacji hydrofobowych substancji aktywnych i zawierających w swojej matrycy poli(D,L laktyd), należących do grupy biokompatybilnych poliestrów oraz biosurfaktant, czyli surfaktynę, w formie soli sodowej lub kwasu karboksylowego, charakteryzujący się tym, że nanocząstki otrzymywane są w wyniku precypitacji międzyfazowej poprzez wkraplanie 1 mL fazy organicznej z rozpuszczonym 5 mg poli(D, L laktydu) oraz 0,5 mg/mL potencjalnej substancji aktywnej w ciągu 3-5 minut do 5 mL wodnego roztworu surfaktyny, a następnie po 3 do 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.

Korzystnie, że jako rozpuszczalnik w fazie organicznej stosuje się aceton, tetrahydrofuran, acetonitryl, etanol lub dimetylosulfotlenek.

Korzystnie jako fazę wodną stosuje się wodny roztwór surfaktyny w formie kwasu karboksylowego lub soli sodowej o stężeniu od 0,1 do 1%.

Korzystnie, wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła od 800 do 1200 rpm, korzystnie powyżej 1000 rpm.

Korzystnie, jako hydrofobową substancję aktywną stosuje się związek o współczynniku podziału n-oktanol/woda w zakresie 2-5.

Kolejnym przedmiotem wynalazku są nanocząstki otrzymywane według sposobu opisanego powyżej, przy czym mają rozmiary od 125 nm do 200 nm oraz stopień polidyspersyjności, PDI <0,15 oraz sferyczny kształt.

Korzystnie, nanocząstki zawierają hydrofobową substancję aktywną.

Surfaktyna to biokompatybilny i biodegradowalny cykliczny naturalny lipoheptapeptyd o wysokiej aktywności powierzchniowej, wytwarzany przez Bacillus subtilis. Ten biosurfaktant jest fascynującą biocząsteczką zdolną do obniżenia napięcia powierzchniowego wody z 72 do 27 mN/m przy stężeniu tak niskim jak 10 mg/l. Ponadto surfaktyna , w przeciwieństwie do dostępnych na rynku komercyjnych surfaktantów wykazuje działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwwirusowe, a nawet przeciwnowotworowe, jednocześnie wspomagając produkcję kolagenu [N.S. Shaligram and R.S. Singhal, Surfactin - A review on biosynthesis, fermentation, purification and applications. Food Technol. Biotechnol. 48 (2010) 119-134 ;Vollenbrich D, Ozel M, Vater J, Kamp RM, Pauli G. Mechanism of Inactivation of Enveloped Viruses by the Biosurfactant Surfactin from Bacillus subtilis. Biologicals, 1997; 25:289-297; Meena KR, Kanwar SS. Lipopeptides as the Antifungal and Antibacterial Agents: Applications in Food Safety and Therapeutics. BioMed Research International 2015; Doi: 10.1155/2015/473050; Vollenbroich D, Pauli G, Ozel M, Vater J. Antimycoplasma Properties and Application in Cell Culture of Surfactin, a Lipopeptide Antibiotic from Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 1997; 63(1): 44-49; Desmyttere H, Deweer C, Muchembled J, Sahmer K, Jacquin J, Coutte F, Jacquest P. Antifungal activities of Bacillus subtilis lipopeptides to two Venturia inaequalis strains possessing different tebuconazole sensitivity. Front. Microbiol. 10:2327. doi: 10.3389/fmicb.2019.02327]. Ta wyjątkowa cecha, w połączeniu z doskonałymi właściwościami emulgującymi i zdolnością do stabilizacji, czyni surfaktynę biozgodnym i unikatowym stabilizatorem dla nowych nanośników substancji aktywnych.

Zasadnicze korzyści z wynalazku polegają na możliwości otrzymania polimerowych, biodegradowalnych i biokompatybilnych nośników o rozmiarach 125-200 nm i sferycznym kształcie, zawierających do 0,5 mg enkapsułowanej substancji aktywnej. Uzyskane nośniki wykazują współczynnik PDI <0,15 co świadczy o ich długiej stabilności. Natomiast rozmiar uzyskanych nośników mieści się w granicach 125-200 nm, co stanowi rozmiar pozwalający na wnikanie do tkanek docelowych przy jednoczesnym ograniczeniu zjawiska niekorzystnego wyłapywania nośnika przez system makrofagów. Nanokapsuły z PDLLA stabilizowane surfaktyną, według wynalazku, mogą znaleźć zastosowanie np. jako układy stosowane w przemyśle kosmetycznym jako biokompatybilne i biodegradowalne układy przenoszące substancje bioaktywne.

Przedmiot wynalazku przedstawiono w poniższych przykładach otrzymywania nowych polimerowych nanośników zawierających hydrofobową substancję bioaktywną oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia surfaktynę A) w formie karboksylowej; B) w formie sodowej; fig. 2 przedstawia rozrzut rozmiarów nanokapsuł według wynalazku otrzymany techniką dynamicznego rozpraszania światła (ang. dynamie light scattering, DLS) dla nośników opisanych w przykładzie 3, zaś fig. 3 przedstawia zdjęcie morfologii wykonane techniką transmisyjnej mikroskopii elektronowej, (ang. transmission electron microscopy, TEM), dla nośników opisanych w przykładzie 3; fig. 4 przedstawia zdjęcie nośników według wynalazku z inkorporowaną kumaryną (tj. hydrofobowym barwnikiem fluorescencyjnym) wykonane techniką mikroskopii fluorescencyjnej; fig. 5 przedstawia mikroskopową analizę penetracji skóry przez nośniki według wynalazku wykonaną przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, gdzie A) przedstawia penetrację skóry przez nośniki według wynalazku, natomiast B) przedstawia penetrację skóry przez próbę kontrolną.

Przy czym wszystkie opisane poniżej testy i procedury doświadczalne przeprowadzono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych zestawów testowych, odczynników i aparatury, postępując zgodnie z zaleceniami producentów stosowanych zestawów, odczynników i aparatury, o ile nie wskazano wyraźnie inaczej. Wszelkie parametry testowe mierzono z zastosowaniem standardowych, powszechnie znanych metod stosowanych w dziedzinie, do której należy niniejszy wynalazek.

Pomiary DLS wykonywano przy kącie rozpraszania 173° za pomocą aparatu Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments), wyposażonego w laser helowo-neonowy (He-Ne), który emituje promieniowanie o długości fali 632,8 nm oraz korelator ALV 5000. Przed pomiarem próbki, termostatowano przez 3 minuty w temperaturze 25°C, a następnie wykonywano pomiary, w co najmniej 3 powtórzeniach, z których średnią przyjmowano jako wynik końcowy. Do oceny otrzymanych wyników zastosowano program DTS 6,20 (Nano).

Pomiary TEM prowadzono przy zastosowaniu mikroskopu FEI Tecnai G² 20 X-TWIN z katodą LaB6, kamerą CCD FEI Eagle 2K, detektorem EDS, detektorem STEM. Próbkę przygotowywano na siatkach węglowo-miedzianych. Poprzez 24 godz. inkubację z zawiesiną nośników, po której przeprowadzono obserwację.

Przykład 1

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (1% wag.) w formie soli sodowej (fig. 1). Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik organiczny usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.

Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła, DLS) wynosi 156 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,098. Przykład 2

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,5% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik organiczny usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła, DLS) wynosi 139 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,085.

Przykład 3

W 1 ml tetrahydrofuranu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,25% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm.

Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła, DLS) wynosi 126 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,074. Rozrzut rozmiarów tych nanokapsuł otrzymany techniką DLS przedstawiono na fig. 2. Morfologię otrzymanych cząstek analizowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Jak wskazano na fig. 3 otrzymano sferyczne nośniki.

Cytotoksyczność wytworzonych nośników według wynalazku wyznaczono poprzez przeżywalność komórek keratynocytów ludzkich HACAT metodą MTT. Hodowla komórkowa była przeprowadzana z wykorzystaniem podłoża (DMEM) Dulbecco’s modified Eagle’s medium, suplementowanego 10% surowicą bydlęcą oraz 2 mM glutaminą, w obecności antybiotyków w stężeniu 100 U/mL penicyliny oraz 100 pg/mL streptomycyny. Hodowle prowadzono w atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% CO2 w temperaturze 37°C. Pasażowano komórki 1-2 razy w tygodniu. Do badań wykorzystywano komórki z pasaży od 4-10, gdzie były one osadzane w płytkach 96-dołkowych, do gęstości 4 x 10³ komórek/dołek, a następnie inkubowano przez ok. 24 godz. Do tak przygotowanych hodowli dodawano nośnik według wynalazku w odpowiednim stężeniu i całość inkubowano przez 18-24 godz. Następnie badano przeżywalność komórek, dodając 50 μl roztworu MTT w stężeniu 0,5 mg/ml i inkubowano w ciemności w temperaturze 37°C przez 4 godz. Po tym czasie wytrącone cząsteczki formazanu rozpuszczono poprzez dodanie 50 μl DMSO, a następnie zmierzono absorbancję przy długości fali 570 nm. Grupą odniesienia były komórki nietraktowane nośnikiem i ich przeżywalność określono jako 100%. A naliza statystyczna nie wykazała istotnego spadku przeżywalności badanych komórek, stąd wniosek, że nośnik nie jest cytotoksyczny względem badanych komórek. A zatem nośnik według wynalazku może być bezpiecznie stosowany w preparatach (np. preparatach kosmetycznych) przeznaczonych dla ludzi. Przykład 4

W tym nieograniczającym przykładzie wykonania przedstawiono sposób wytwarzania cząstek według wynalazku z inkorporowaną hydrofobową substancją aktywną. Jako hydrofobową substancję aktywną zastosowano astaksantynę, ale cząstki według wynalazku mogą stanowić nośniki dla dowolnej hydrofobowej substancji aktywnej zarówno ciekłej jak i stałej roztworzonej w odpowiednim oleju (np. arbutyna, czarci pazur, alantoina, astaksantyna, kwas ferulowy, glukozyd ketonu malinowego, lipoglicyna witamina A, witamina D, witamina E, witamina K, olej z awokado, olej z nasion buriti, bakuchiol, witamina C (forma hydrofobowa), estry etylowe kwasów tłuszczowych, olej tsubaki, masło muru muru, olej arganowy, olej z rokitnika zwyczajnego, olejek cynamonowy, olejek z drzewa herbacianego, olej z nasion gryki, olej z nasion z zielonej herbaty, olej z nasion jabłek, olej z nasion truskawek, olej z niebieskiego wrotyczu pospolitego, olej konopny, olejek z kwiatu jagodlinu wonnego, olejek z werbeny, olej z lnianki siewnej, olej z nasion granatu, olej z passiflory, olej sezamowy, olej rzepakowy, olej z pestek moreli, olej tamanu, olej z nasion uśpianu różnolistnego, olej z nasion marchwi, olej z opuncji figowej, oliwa z oliwek, olej z nasion białej pianki łąkowej, oleina roślinna, lipoglicyna, lidokaina, kurkumina, winblastyna i jej pochodne, kortykosteroidy, naproksen, arginina, diklofenak, chinina, chlorchina, fendimetrazyna, ibuprofen, karbazmazepina, tiopental, zopiklon).

Takie właściwości nośników według wynalazku wynikają z właściwości surfaktyny, tj. z jej charakterystycznej budowy hydrofilowo-hydrofobowej umożliwiającej enkapsułowanie związków wykazujących słabą lub bardzo słabą rozpuszczalność w wodzie, dzięki czemu zwiększa się ich biodostępność [Wu YS, Ngai S.C., Goh BH, Chan KG, Lee LH, Chuah LH. Anticancer activities of surfactin and potential application of nanotechnology assisted surfactin delivery. Front. Pharmacol. 8:761. doi: 10.3389/fphar.2017.00761].

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu) oraz 0,5 mg/ml astaksantyny (hydrofobowej substancji aktywnej). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,25% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm.

Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 187 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,100. Przykład 5

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu) oraz 0,5 mg/ml substancji „czarci pazur” (hydrofobowej substancji aktywnej). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,25% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 138 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,015.

Przy czym, wspomniany czarci pazur zastosowany w niniejszym to ekstrakt z korzenia hakorośli rozesłanej (Harpagophytum procumbens) określanej jako „Czarci Pazur”, której główne i aktywne składniki to irydoidy: harpagozyd, harpagid, prokumbid, prokumbozyd, fenole (acetozyd, izo-acetozyd, biozyd) oraz bioflawonoidy, głównie luteolina, kemferol i kwercetyna. Kompleks substancji aktywnych wykazuje szereg właściwości takie jak: przeciwzapalne, przeciwbólowe, znieczulające, odtruwające, antyhistaminowe, regenerujące a także obniża poziom cholesterolu.

Przykład 6

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu) oraz 0,5 mg/ml substancji „czarci pazur” (hydrofobowej substancji aktywnej stanowiącej ekstrakt z korzenia hakorośli rozesłanej). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,25% wag.) w formie kwasu karboksylowego. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 136 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,093.

Przykład 7

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu) oraz 0,5 mg/ml astaksantyny (hydrofobowej substancji aktywnej). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,25% wag.) w formie kwasu karboksylowego. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 139 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,115.

Przykład 8

W 1 ml acetonu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu) oraz 0,5 mg/ml substancji „czarci pazur” (hydrofobowej substancji aktywnej stanowiącej ekstrakt z korzenia hakorośli rozesłanej). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 5 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,5% wag.) w formie kwasu karboksylowego. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1000 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.

Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 147 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,092. Przykład 9

W 1 ml etanolu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 1 minuty do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,1% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 1200 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.

Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 192 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,123.

Przykład 10

W 1 ml acetonitrylu rozpuszcza się 5 mg poli(D,L laktydu). Tak przygotowaną fazę organiczną wkrapla się w ciągu 3 minut do 5 ml wodnego roztworu surfaktyny (0,1% wag.) w formie soli sodowej. Wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła 800 rpm. Po 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozmiar nanokapsuł (wyrażony jako średnica hydrodynamiczna, wyznaczona techniką dynamicznego rozpraszania światła) wynosi 200 nm przy współczynniku polidyspersyjności 0,148.

Przykład 1 1

Przeprowadzono mikroskopową analizę przedstawiającą skuteczność inkorporacji substancji aktywnych przez nośniki według wynalazku. Przygotowano polimerowe nośniki poli(D,L laktydowe) stabilizowane surfaktyną wytworzone sposobem według wynalazku, w których hydrofobową substancję aktywną zastąpiono kumaryną (Cumarin 6, Sigma Aldrich), która jest znanym hydrofobowym barwnikiem fluorescencyjnym. A następnie obrazowano na mikroskopie konfokalnym. Wyniki przedstawione na fig. 4 potwierdziły skuteczną inkorporację kumaryny w nośnik według wynalazku.

Przykład 12

Przeprowadzono mikroskopową analizę penetracji skóry przez nośniki według wynalazku. Zawiesinę nośników z inkorporowanym barwnikiem fluorescencyjnym (tj. kumaryną) nanoszono na wycinek skóry ucha świńskiego w warunkach kontrolowanych (komora Franza). Po godzinie zawiesina nośników została odmyta. Skóra została utrwalona oraz zamrożona. Skrawki mrożeniowe zostały przecięte poprzecznie, naniesione na szkiełko i obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym (fig. 5A). Próbkę referencyjną stanowiła kumaryna o tym samym stężeniu co w nośniku rozdyspergowana w fazie olejowej (fig. 5B) Wyniki potwierdziły wyższą skuteczność przenikania przez starum corneum inkorporowanej kumaryny wewnątrz nośnika.

Claims (7)

1. Sposób wytwarzania nośników polimerowych przeznaczonych do enkapsulacji hydrofobowych substancji aktywnych i zawierających w swojej matrycy poli(D, L laktyd), należących do grupy biokompatybilnych poliestrów oraz biosurfaktant, czyli surfaktynę, w formie soli sodowej lub kwasu karboksylowego, znamienny tym, że nanocząstki otrzymywane są w wyniku precypitacji międzyfazowej poprzez wkraplanie 1 mL fazy organicznej z rozpuszczonym 5 mg poli(D, L laktydu) oraz 0,5 mg/mL potencjalnej substancji aktywnej w ciągu 3-5 minut do 5 mL wodnego roztworu surfaktyny, a następnie po 3 do 5 godzinach mieszania rozpuszczalnik usuwa się na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik w fazie organicznej stosuje się aceton, tetrahydrofuran, acetonitryl, etanol lub dimetylosulfotlenek.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako fazę wodną stosuje się wodny roztwór surfaktyny w formie kwasu karboksylowego lub soli sodowej o stężeniu od 0,1 do 1%.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wkraplanie prowadzi się przy prędkości mieszadła od 800 do 1200 rpm, korzystnie powyżej 1000 rpm.

5. Sposób według zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że jako hydrofobową substancję aktywną stosuje się związek o współczynniku podziału n-oktanol/woda w zakresie 2-5.

6. Nanocząstki otrzymywane według sposobu określonego w zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że mają rozmiary od 125 nm do 200 nm oraz stopień polidyspersyjności, PDI <0,15 oraz sferyczny kształt.

7. Nanocząstki według zastrz. 6, znamienne tym, że zawierają hydrofobową substancję aktywną.