PL244325B1 - Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria - Google Patents

Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria Download PDF

Info

Publication number
PL244325B1
PL244325B1 PL439945A PL43994521A PL244325B1 PL 244325 B1 PL244325 B1 PL 244325B1 PL 439945 A PL439945 A PL 439945A PL 43994521 A PL43994521 A PL 43994521A PL 244325 B1 PL244325 B1 PL 244325B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
accession number
deposited under
under accession
volume
alternaria
Prior art date
Application number
PL439945A
Other languages
Polish (pl)
Other versions
PL439945A1 (en
Inventor
Maciej Walczak
Aleksandra Burkowska-But
Original Assignee
Bacto Tech Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bacto Tech Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Bacto Tech Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL439945A priority Critical patent/PL244325B1/en
Publication of PL439945A1 publication Critical patent/PL439945A1/en
Publication of PL244325B1 publication Critical patent/PL244325B1/en

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest szczep bakterii zidentyfikowanej jako Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 oraz szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Eksperymentalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu. Zgłoszenie obejmuje także biopreparat zawierający szczep bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 zawierający od 35% do 69% objętościowych wody wodociągowej korzystniej od 45% do 55% objętościowych wody wodociągowej, od 35% do 69% objętościowych alkoholu trójwodorotlenowego, korzystniej od 45% do 55% objętościowych oraz 2 molowy wodny roztwór wodorotlenku potasu w ilości od 1% do 5% objętości, najkorzystniej gdy alkoholem trójwodorotlenowym jest glicerol, przy czym biopreparat zawiera nie mniej niż 2 x 10<sup>9</sup> w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek bakterii będących przedmiotem wynalazku. Przedmiotem niniejszego zgłoszenia jest również zastosowanie szczepu bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczepu bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00334 do zwalczania i zapobiegania rozwojowi fitopatogenów Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, a zwłaszcza Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.The subject of the application is a strain of bacteria identified as Brevibacillus brevis (DW1A) deposited under accession number B/00329 and a strain of Bacillus valezensis (DW2S) deposited under accession number B/00334 in the Polish Collection of Microorganisms (PCM) at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wroclaw. The application also covers a biopreparation containing the bacterial strain Brevibacillus brevis (DW1A) deposited under accession number B/00329 and/or the bacterial strain Bacillus valezensis (DW2S) deposited under accession number B/00334 containing from 35% to 69% by volume of tap water, preferably from 45%. up to 55% by volume of tap water, from 35% to 69% by volume of trihydric alcohol, more preferably from 45% to 55% by volume, and a 2 molar aqueous solution of potassium hydroxide in an amount from 1% to 5% by volume, most preferably when the trihydric alcohol is glycerol, with wherein the biopreparation contains not less than 2 x 10<sup>9</sup> in 1 ml of freeze-dried spores of bacterial cells being the subject of the invention. The subject of this application is also the use of the Brevibacillus brevis (DW1A) bacterial strain deposited under accession number B/00329 and/or the Bacillus valezensis (DW2S) bacterial strain deposited under accession number B/00334 to combat and prevent the development of phytopathogens Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, and especially Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.

Description

Przedmiotem wynalazku są dwa szczepy bakterii zidentyfikowane jako Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 oraz Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Eksperymentalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu przy ulicy Weigla 12 w dniu 20 kwietnia 2021 roku. Oba szczepy zostały wyizolowane z gleb uprawnych obszarów rolniczych województwa kujawsko-pomorskiego. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie wyżej wymienionych szczepów do zapobiegania rozwoju niektórych grzybów fitopatogennych oraz biopreparat zawierający szczepy tych bakterii do oprysku roślin i gleby lub bezpośrednio doglebowo.The subject of the invention are two strains of bacteria identified as Brevibacillus brevis (DW1A) deposited under accession number B/00329 and Bacillus valezensis (DW2S) deposited under accession number B/00334 in the Polish Collection of Microorganisms (PCM) at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wrocław at 12 Weigla Street on April 20, 2021. Both strains were isolated from cultivated soils in agricultural areas of the Kuyavian-Pomeranian Voivodeship. The subject of the invention is also the use of the above-mentioned strains to prevent the development of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria for spraying plants and soil or directly into the soil.

Syntetyczne fungicydy mają zazwyczaj szerokie spektrum oddziaływania, wpływając zarówno na mikroorganizmy patogenne jak organizmy pożyteczne, w przypadku nieprawidłowego użycia mogą być także toksyczne dla owadów i ptaków i ulegają powolnej biodegradacji. Naciski organizacji ochrony środowiska, ochrony zdrowia, producentów żywności i konsumentów na całym świecie doprowadziły do zmniejszenia stosowania ilości chemicznych (tj. syntetycznych) pestycydów i ujednolicenia norm ich użycia. Od 1 września 2008 na obszarze UE obowiązują ujednolicone normy w zakresie dopuszczalnego poziomu pozostałości pestycydów w żywności, a w każdym kraju UE musi być prowadzony oficjalny rejestr dopuszczonych do stosowania środków ochrony roślin.Synthetic fungicides usually have a broad spectrum of effects, affecting both pathogenic and beneficial microorganisms; if used incorrectly, they can also be toxic to insects and birds and biodegrade slowly. Pressure from environmental protection organizations, health care organizations, food producers and consumers around the world has led to a reduction in the use of chemical (i.e. synthetic) pesticides and harmonization of standards for their use. Since September 1, 2008, uniform standards regarding the permissible level of pesticide residues in food have been in force in the EU, and each EU country must maintain an official register of approved plant protection products.

Kilkukrotne stosowanie tych samych syntetycznych fungicydów na tym samym obszarze prowadzi często do mutacji i powstania i selekcji mikroorganizmów odpornych na dany fungicyd. Zwalczanie patogenów takimi związkami chemicznymi staje się już nieskuteczne. Opracowywanie nowych skutecznych związków o zbliżonych mechanizmach działania staje się coraz trudniejsze i droższe, w związku z tym coraz częściej poszukuje się naturalnych możliwości skutecznego zwalczania i kontroli rozwoju patogenów wywołujących choroby roślin uprawnych obniżających ich plonowanie.Repeated use of the same synthetic fungicides in the same area often leads to mutations and the emergence and selection of microorganisms resistant to a given fungicide. Fighting pathogens with such chemical compounds is no longer effective. Developing new effective compounds with similar mechanisms of action is becoming more and more difficult and expensive, therefore natural options for effective combating and controlling the development of pathogens causing diseases of crop plants that reduce their yield are increasingly being sought.

Bakterie z rodzaju Bacillus występują powszechnie w glebie, wodach słodkich i słonych, na roślinach zarówno żywych, jak i obumarłych. Stwierdzono, że szczepy Bacillus subtilis i Brevibacillus chronią rośliny zapobiegając lub hamując rozwój chorób grzybicznych, co zostało potwierdzone zarówno w badaniach biochemicznych, jak i podczas sekwencjonowania genomów (Wang i wsp. Genome announcements, 2015,3; Caulieri i wsp. Front. Microbiol 2018, 9; Shafi i wsp. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2017,31 (3). Intensywne ich namnażanie w glebie następuje po wprowadzeniu do gleby materii organicznej np. obornika, jednak po jej rozłożeniu bakterie te przechodzą w formę przetrwalnikową lub giną.Bacteria of the Bacillus genus are common in soil, fresh and salt water, and on both living and dead plants. It was found that Bacillus subtilis and Brevibacillus strains protect plants by preventing or inhibiting the development of fungal diseases, which was confirmed both in biochemical studies and during genome sequencing (Wang et al. Genome announcements, 2015,3; Caulieri et al. Front. Microbiol 2018 , 9; Shafi et al. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 2017, 31 (3). Their intensive multiplication in the soil occurs after the introduction of organic matter into the soil, e.g. manure, but after its decomposition, these bacteria transform into spores or die.

Ponadto Bacillus i Brevibacillus wytwarzają endospory odporne na czynniki fizyczne i chemiczne, takie jak ciepło, suszenie, rozpuszczalniki organiczne i promieniowanie UV, dlatego produkowanie preparatów w formie komercyjnej i przechowywanie gotowych produktów na ich bazie jest łatwiejsze w porównaniu do bakterii nie przetrwalnikowych, w związku z tym użycie szczepów Bacillus oraz Brevibacillus jako środków biokontroli może zmniejszyć ilość chemicznych fungicydów stosowanych do zwalczania grzybów fitopatogennych (Li i wsp. Biological Control 2021, 153).In addition, Bacillus and Brevibacillus produce endospores that are resistant to physical and chemical factors, such as heat, drying, organic solvents and UV radiation, therefore producing preparations in a commercial form and storing finished products based on them is easier compared to non-spore bacteria, due to including the use of Bacillus and Brevibacillus strains as biocontrol agents may reduce the amount of chemical fungicides used to combat phytopathogenic fungi (Li et al. Biological Control 2021, 153).

W opisie do patentu polskiego nr 198772 ujawniono nowy szczep bakterii Bacillus subtilis, w postaci biologicznie czystej kultury o szerokiej aktywności przeciwgrzybiczej i przeciwbakteryjnej. Szczep ma oznaczenie AQ713 i został zdeponowany w NRRL 7 marca 1997 r. w ramach Traktatu Budapeszteńskiego o Uznaniu Depozytu Mikroorganizmów dla Celów Procedury Patentowej pod nr dostępu B21661. Wykazano, że metabolit wytworzony przez szczep Bacillus subtilis lub jego mutanty ekstrahowany rozpuszczalnikiem, który ma ciężar cząsteczkowy poniżej 10000 daltonów, wykazuje aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną oraz przeciwko kukurydzianej stonce korzeniowej. Również supernatant otrzymany z hodowli szczepu AQ713 Bacillus subtilis lub jego mutantów otrzymany znanym w technice sposobem obejmującym wirowanie, sączenie, sedymentację i itp. ma aktywność przeciw kukurydzianej stonce korzeniowej.The description of Polish patent No. 198772 discloses a new strain of Bacillus subtilis bacteria in the form of a biologically pure culture with broad antifungal and antibacterial activity. The strain has the designation AQ713 and was deposited with the NRRL on March 7, 1997 under the Budapest Treaty on the Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of the Patent Procedure under accession number B21661. A solvent-extracted metabolite produced by a strain of Bacillus subtilis or its mutants, which has a molecular weight below 10,000 daltons, has been shown to have antifungal and antibacterial activity and against the corn rootworm. Also, the supernatant obtained from the culture of Bacillus subtilis strain AQ713 or its mutants obtained by a method known in the art including centrifugation, filtration, sedimentation, etc. has activity against the corn rootworm.

Wynalazek obejmuje też kompozycje do ochrony roślin i owoców przed szkodnikami, które zawierają całą brzeczkę z hodowli określonych powyżej bakterii według wynalazku i chemiczny fungicyd albo całą brzeczkę i biologiczny lub chemiczny środek szkodnikobójczy i korzystnie jeszcze dodatkowo chemiczny fungicyd.The invention also includes compositions for protecting plants and fruits against pests, which contain the entire wort from the culture of the above-mentioned bacteria according to the invention and a chemical fungicide, or the entire wort and a biological or chemical pesticide and, preferably, an additional chemical fungicide.

Z publikacji polskiego opisu patentowego nr 234499 znana jest kompozycja zawierająca wyizolowane szczepy saprofitycznych bakterii glebowych reprezentujących następujące rodzaje: Arthrobacter, Bacillus, Citrobacter, Paenibacillus, Pseudomonas, które zdeponowano 19 grudnia 2017 roku pod numerem depozytu B/00148 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM, Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN, Wrocław, Polska. Ujawniono biopreparat zawierający kompozycję powyższychFrom the publication of the Polish patent description No. 234499, a composition is known containing isolated strains of saprophytic soil bacteria representing the following genera: Arthrobacter, Bacillus, Citrobacter, Paenibacillus, Pseudomonas, which were deposited on December 19, 2017 under the deposit number B/00148 in the Polish Collection of Microorganisms PCM, Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences, Wrocław, Poland. A biopreparation containing a composition of the above is disclosed

PL 244325 BI szczepów, który zawiera podłoże płynne mineralne uzupełnione glukozą jako jedynym źródłem węgla lub podłoże stałe mineralne uzupełnione glukozą jako jedynym źródłem węgla. Biopreparat korzystnie zawiera co najmniej 105 komórek bakterii w ml podłoża, korzystniej co najmniej 106 komórek bakterii w 1 ml podłoża, korzystniej cfu każdego szczepu wynosi co najmniej 106 komórek w 1 ml podłoża.PL 244325 BI strains, which contains a liquid mineral medium supplemented with glucose as the only carbon source or a solid mineral medium supplemented with glucose as the only carbon source. The biopreparation preferably contains at least 10 5 bacterial cells per ml of medium, more preferably at least 10 6 bacterial cells in 1 ml of medium, more preferably the cfu of each strain is at least 10 6 cells in 1 ml of medium.

Wykazano skuteczność biopreparatu według patentu nr 234499 wobec bakterii Pseudomonas syringae, które są patogenem pomidora, grochu, ogórka, soi, kalafiora, fasoli i drzew owocowych, ziemniaka, marchwi, papryki, a także wobec bakterii Pectobacterium carotovorum, które są patogenem marchewki, ziemniaka, pomidora, papryki, zielonych warzyw liściastych, dyni, cebuli poprzez zraszanie gleby przed wysiewem.The effectiveness of the biopreparation according to patent No. 234499 has been demonstrated against the bacteria Pseudomonas syringae, which is a pathogen of tomatoes, peas, cucumber, soybeans, cauliflower, beans and fruit trees, potatoes, carrots, peppers, as well as against the bacteria Pectobacterium carotovorum, which is a pathogen of carrots, potatoes, tomatoes, peppers, green leafy vegetables, pumpkins, onions by sprinkling the soil before sowing.

Wykazano także, że kompozycja według wynalazku po dodaniu do gleby silniej stymuluje wzrost roślin, co wykazano na przykładzie ziemniaka, marchwi, pomidora i papryki, niż pojedyncze szczepy wchodzące w skład biopreparatu, przez co nie tylko wykazano działanie bakteriobójcze na fitopatogeny: Pseudomonas syringae i Pectobacterium carotovorum, ale i synergistyczny efekt współdziałania poszczególnych bakterii wchodzących w skład kompozycji według wynalazku.It has also been shown that the composition according to the invention, when added to the soil, stimulates plant growth more strongly, as demonstrated by the example of potatoes, carrots, tomatoes and peppers, than individual strains included in the biopreparation, which not only demonstrated a bactericidal effect on phytopathogens: Pseudomonas syringae and Pectobacterium carotovorum, but also the synergistic effect of the interaction of individual bacteria included in the composition according to the invention.

W świetle przedstawionego stanu techniki wynika, że wytwarzanie poszczególnych substancji o charakterze przeciwgrzybowym, a także skuteczność działania przeciwko określonym fitopatogenom charakteryzuje poszczególne izolaty bakterii, w związku z tym sprawdzono skuteczność antagonistycznego działania przeciwko wybranym fitopatogenom bakterii glebowych zidentyfikowanych jako Brevibacillus brevis i Bacillus valezensis, wyizolowanych z gleb użytkowanych rolniczo na terenie województwa kujawsko-pomorskiego.In the light of the presented state of the art, it appears that the production of individual antifungal substances, as well as the effectiveness of action against specific phytopathogens, characterizes individual bacterial isolates. Therefore, the effectiveness of antagonistic action against selected phytopathogens of soil bacteria identified as Brevibacillus brevis and Bacillus valezensis, isolated from soils used for agriculture in the Kuyavian-Pomeranian Voivodeship.

Istotą wynalazku są dwa szczepy bakterii zidentyfikowane jako Brevibacillus brevis (DW1 A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 oraz Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Eksperymentalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu przy ulicy Weigla 12 w dniu 20 kwietnia 2021 roku.The essence of the invention are two strains of bacteria identified as Brevibacillus brevis (DW1 A) deposited under accession number B/00329 and Bacillus valezensis (DW2S) deposited under accession number B/00334 in the Polish Collection of Microorganisms (PCM) at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wrocław at 12 Weigla Street on April 20, 2021.

Istotą wynalazku jest również biopreparat zawierający szczep bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 zawierający od 35% do 69% objętościowych wody wodociągowej korzystniej od 45% do 55% objętościowych wody wodociągowej, od 35% do 69% objętościowych alkoholu trójwodorotlenowego, korzystniej od 45% do 55% objętościowych oraz 2 molowy wodny roztwór wodorotlenku potasu w ilości od 1% do 5% objętości, najkorzystniej, gdy alkoholem trójwodorotlenowym jest glicerol, przy czym biopreparat zawiera nie mniej niż 2 χ 109 w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek bakterii będących przedmiotem wynalazku.The essence of the invention is also a biopreparation containing the Brevibacillus brevis (DW1A) bacterial strain deposited under accession number B/00329 and/or the Bacillus valezensis (DW2S) bacterial strain deposited under accession number B/00334 containing from 35% to 69% by volume of tap water, preferably from 45 % to 55% by volume of tap water, from 35% to 69% by volume of trihydric alcohol, more preferably from 45% to 55% by volume, and a 2 molar aqueous solution of potassium hydroxide in an amount from 1% to 5% by volume, most preferably when the trihydric alcohol is glycerol , with the biopreparation containing not less than 2 χ 10 9 in 1 ml of freeze-dried spores of bacterial cells being the subject of the invention.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie szczepu bakterii Brevibacillus brevis (DW1 A) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczepu bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00334 do zwalczania i zapobiegania rozwojowi fitopatogenów, Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phoma lingamn, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, a zwłaszcza Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.The essence of the invention is also the use of the Brevibacillus brevis (DW1 A) bacterial strain deposited under accession number B/00329 and/or the Bacillus valezensis (DW2S) bacterial strain deposited under accession number B/00334 to combat and prevent the development of phytopathogens, Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phoma lingamn, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, and especially Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.

Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na którym fig. 1 przedstawia przykładową wizualizację hodowli fitopatogenów, a fig. 2 przedstawia przykładową wizualizację stref zahamowania wzrostu fitopatogenów.The invention is presented in example embodiments and in the attached drawings, in which Fig. 1 shows an exemplary visualization of phytopathogen cultures, and Fig. 2 shows an exemplary visualization of phytopathogen growth inhibition zones.

Przykład 1Example 1

Namnażanie szczepów bakteriiMultiplication of bacterial strains

Oba szczepy bakterii namnożono na oddzielnych szalkach Petriego dla każdego ze szczepów bakterii na pożywce o następującym składzie [g/l]:Both bacterial strains were multiplied on separate Petri dishes for each bacterial strain on a medium with the following composition [g/l]:

Składnik Component Stężenie [g/l] Concentration [g/l] Trypton Trypton 5 5 Wyciąg drożdżowy Yeast extract 3 3 Hydrolizat kazeiny Casein hydrolyzate 2 2 NaCI NaCl 5 5 Agar Agar 15 15

Temperatura inkubacji 28 °C, czas inkubacji 3 dni. Po tym czasie biomasę każdego szczepów w ilości jednego oczka ezy bakteriologicznej przeniesiono sterylnie do kolb z pożywką płynną o składzie trypton - 5 g/l, wyciąg drożdżowy - 3 g/]. Po zaszczepieniu pożywkę inkubowano w temperaturze 28°C przez 48 godzin.Incubation temperature 28 °C, incubation time 3 days. After this time, the biomass of each strain in the amount of one mesh of a bacteriological loop was sterilely transferred to flasks with liquid medium containing tryptone - 5 g/l, yeast extract - 3 g/l. After inoculation, the medium was incubated at 28°C for 48 hours.

Przygotowano wstępną hodowlę następujących 27 grzybów fitopatogennych Botrytis cinerea, Botrytis alii, Alternaria alternata, Alternaria solani, Alternaria dauci, Alternaria radicina, Alternaria brasiccae, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium avenaceum, Penicilium verrucosum, Phytophthora cryptogea, Phytophthora megasperma, Phytophthora cactorum, Phytophtora infestans, Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum cocoides, Colletotrichum lindemuthianum, Phomopsis sp., Monilinia sp., Rhizoctonia solani, VerticiIlium sp., Mycospharella fragarie, Cercospora beticola, Cercospora apii, poprzez namnażanie na szalkach Petriego na pożywce PDA o składzie [g/]: wyciąg ziemniaczany - 4,0; glukoza - 20,0; agar - 15,0 inkubując w temperaturze 28°C przez okres od 3 do 10 dni w zależności od rodzaju szczepu.A preliminary culture of the following 27 phytopathogenic fungi was prepared: Botrytis cinerea, Botrytis alii, Alternaria alternata, Alternaria solani, Alternaria dauci, Alternaria radicina, Alternaria brasiccae, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium avenaceum, Penicilium verrucosum, Phytophthora cryptogea, Phytoph thora megasperma, Phytophthora cactorum, Phytophtora infestans, Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum cocoides, Colletotrichum lindemuthianum, Phomopsis sp., Monilinia sp., Rhizoctonia solani, VerticiIlium sp., Mycospharella fragarie, Cercospora beticola, Cercospora apii, through multiplication not in petri dishes on PDA medium with the composition [g/]: potato extract - 4.0; glucose - 20.0; agar - 15.0 by incubating at 28°C for a period of 3 to 10 days depending on the type of strain.

Następnie dokonano sprawdzenia działania antagonistycznego na wymienione grzyby fitopatogenne przez bakterie będące przedmiotem wynalazku w ten sposób, że na 81 szalkach Petriego, każda z pożywką PDA o składzie [g/l]: wyciąg ziemniaczany - 4,0; glukoza - 20,0; agar -15,0) zaszczepiono testowe grzyby fitopatogenne poprzez umieszczenie na każdych trzech szalkach Petriego fragmentu agaru z odpowiednim grzybem pobranym z hodowli wstępnej tego samego grzyba. Zaszczepione testowymi grzybami szalki inkubowano przez 24-72 h w temperaturze 26°C. Po tym czasie na przeciwległych biegunach każdej z dwóch 54 szalek doszczepiono badane bakterie (po jednym szczepie bakterii na jedną z 27 szalek Petriego zaszczepionych odpowiednimi grzybami fitopatogennymi). Całość 81 szalek Petriego ponownie inkubowano w temperaturze 26°C przez okres od 3 do 10 dni. Po tym czasie, poprzez zmierzenie średnicy kolonii fitopatogenów sprawdzano wzrost grzybów fitopatogennych na szalkach z doszczepionym szczepem bakterii i porównywano intensywność wzrostu grzyba (Fig. 2) w odniesieniu do próby kontrolnej, którą stanowiły szalki Petriego z pożywką PDA i zaszczepionymi grzybami, ale bez doszczepionego szczepu bakterii (Fig. 1). Fotografie przedstawione na Fig. 1 i Fig. 2 obrazują jedno z 27 porównań oddziaływania badanych bakterii.Then, the antagonistic effect on the mentioned phytopathogenic fungi of the bacteria being the subject of the invention was checked in this way: on 81 Petri dishes, each with PDA medium with the composition [g/l]: potato extract - 4.0; glucose - 20.0; agar -15.0) test phytopathogenic fungi were inoculated by placing a fragment of agar with the appropriate fungus taken from a preliminary culture of the same fungus on each three Petri dishes. Plates inoculated with test fungi were incubated for 24-72 h at 26°C. After this time, the tested bacteria were added to the opposite poles of each of the two 54 dishes (one strain of bacteria per one of the 27 Petri dishes inoculated with appropriate phytopathogenic fungi). The entire 81 Petri dishes were again incubated at 26°C for a period of 3 to 10 days. After this time, by measuring the diameter of the phytopathogen colonies, the growth of phytopathogenic fungi was checked on plates with the inoculated bacterial strain and the intensity of fungal growth was compared (Fig. 2) in relation to the control sample, which consisted of Petri dishes with PDA medium and inoculated fungi, but without the inoculated strain. bacteria (Fig. 1). The photographs presented in Fig. 1 and Fig. 2 show one of 27 comparisons of the impact of the tested bacteria.

PL 244325 BIPL 244325 BI

Lp- Lp- Fito patogen Phyto pathogen Współczynnik hamowania dla szczepu bakterii Inhibition coefficient for the bacterial strain Wywoływana choroba Disease caused Brevibacillus brevis (DW1A) Brevibacillus brevis (DW1A) Bacillus valezensis (DW2S) Bacillus valezensis (DW2S) 1 1 Botrytis cinerea Botrytis cinerea 2.7 2.7 1,0 1.0 Szara pleśń Gray mold 2 2 Botrytis a IIi Botrytis a IIi 1,3 1.3 1,5 1.5 Zgnilizna szyjki cebulu Onion neck rot 3 3 Alternaria alternata Alternaria alternata 1,5 1.5 0,9 0.9 Alternarioza, choroba liści ziemniaka, cebuli, ogórka Alternariosis, a disease of potato, onion and cucumber leaves 4 4 Aiternaria solanii Aiternaria solanii 1,1 1.1 1,5 1.5 Alternarioza, choroba liści ziemniaka Alternariosis, potato leaf disease 5 5 Alternaria dauci Alternaria dauci 1,3 1.3 1,7 1.7 Alternarioza liści marchwi Alternaria blight of carrot leaves 6 6 Alternaria radicina Alternaria radicina 1,3 1.3 1,4 1.4 Czarna zgnilizna marchwi Black rot of carrots z With Alternaria brasiccae Alternaria brasiccae ŁZ ŁZ 44 44 Czerń krzyżowych Black cross 8 8 Fusarium culmorum Fusarium culmorum 1,5 1.5 0,8 0.8 Fuzarioza zbóż, kukurydzy bobu Fusarium blight of cereals, corn and broad beans 9 9 Fusarium oxysporum Fusarium oxysporum 1,5 1.5 1,0 1.0 Fuzarioza zbóż, kukurydzy, bobu, pomidorów, papryki Fusarium blight of cereals, corn, broad beans, tomatoes, peppers 10 10 Fusarium solani Fusarium solani 1,2 1.2 1,5 1.5 Fuzariozy dyniowatych i bobu Fusarium blights of cucurbits and broad beans 11 11 Fusarium avenaceum Fusarium avenaceum 1,2 1.2 1,2 1.2 Fuzariozy dyniowatych, bobowatych i roślin ozdobnych Fusarium diseases of cucurbits, legumes and ornamental plants 12 12 Phytophthora cryptogea Phytophthora cryptogea 1,0 1.0 0,9 0.9 Zgnilizna korzeni pomidora Tomato root rot 13 13 Phytophthora megasperma Phytophthora megasperma 1,0 1.0 1,1 1.1 Zgnilizna korzeni maliny, zgorzel głąba kapusty Raspberry root rot, cabbage root rot 14 14 Phytophthora cactorum Phytophthora cactorum 0,7 0.7 0,7 0.7 Zgnilizna pierścieniowa jabłoni Apple ring rot 15 15 Phytoohtora in fest ans Phytoohtora in fest ans 5J 5J Zaraza ziemniaka Potato blight 16 16 Phoma lingam Phoma lingam 1,9 1.9 1,6 1.6 Sucha zgnilizna kapusty, choroby rzepaku Dry rot of cabbage, rapeseed diseases 17 17 Sclerotinia sclerotiorum Sclerotinia sclerotiorum 1,5 1.5 1,6 1.6 Zgnilizna twardzikowa Scleroderma rot 18 18 Colletotrichum acutatum Colletotrichum acutatum 1,3 1.3 1,9 1.9 Antraknoza truskawki, maliny, borówki Anthracnose in strawberries, raspberries, blueberries ϋ ϋ Colletotrichum cocoides Colletotrichum cocoides Z5 Z5 O ABOUT Antraknoza ziemniaka Potato anthracnose 20 20 Colletotrichum lindemuthianum Colletotrichum lindemuthianum 1,2 1.2 1,2 1.2 Antraknoza fasoli Bean anthracnose 21 21 Phomopsis sp. Phomopsis sp. 1,3 1.3 1,2 1.2 Zgorzel siewek Damping off of seedlings 22 22 Monilinia sp. Monilinia sp. 1,2 1.2 1,2 1.2 Brązowa zgnilizna owoców drzew pestkowych Brown rot of stone fruit 23 23 Rhizoctonia solani Rhizoctonia solani 1,4 1.4 1,3 1.3 Zgorzel siewek, ostra plamistość oczkowa, rizoktonioza ziemniaka Seedling blight, acute eye spot, potato rhizoctoniosis 24 24 Verticillium sp. Verticillium sp. 1,5 1.5 2,1 2.1 Werticilioza drzew owocowych i ziemniaka Verticillium wilt of fruit trees and potatoes 25 25 Mycospharella fragariae Mycospharella fragariae 1,2 1.2 1,2 1.2 Biała plamistość liści truskawki White spot on strawberry leaves 26 26 Cercospora beticola Cercospora beticola 1,5 1.5 1,6 1.6 Chwościk buraka cukrowego i ćwikłowego Sugar beet and beetroot tassel 27 27 Cercospora apii Cercospora apii 2,8 2.8 2,3 2.3 Chwościk selera Celery tassel

Tabela 1 zawiera współczynniki hamowania rozwoju fitopatogenów przez badane szczepy bakterii, które obliczono stosując następujący wzór:Table 1 contains the inhibition factors for the development of phytopathogens by the tested bacterial strains, which were calculated using the following formula:

SBSB

PL 244325 BI gdzie:PL 244325 BI where:

WH SK SB W.H SK SB - współczynnik hamowania, - średnica kolonii grzyba na szalce kontrolnej - średnica kolonii grzyba na szalce badanej (ze szczepami bakterii). - braking coefficient, - diameter of the fungus colony on the control plate - diameter of the fungus colony on the test plate (with bacterial strains).

Dla otrzymanych wyników przyjęto następujące interpretacje:The following interpretations were adopted for the obtained results:

WH < 1 1 < WH < 1,4 1,5 < WH < 2 WH < 1 1 < WH < 1.4 1.5 < WH < 2 - stymulacja rozwoju grzyba pod wpływem bakterii, - brak istotnego wpływu bakterii na rozwój grzyba, - hamowanie rozwoju grzyba, (czcionka pogrubiona) 2 < WH < 2,5 - silne hamowanie rozwoju grzyba (czcionka pogrubiona, podkreślenie pojedyncze) - stimulation of fungus development under the influence of bacteria, - no significant impact of bacteria on the development of the fungus, - inhibition of fungus development, (bold font) 2 < WH < 2.5 - strong inhibition of fungus development (bold font, single underline) WH > 2,6 WH > 2.6 - bardzo silne hamowanie rozwoju grzyba (czcionka pogrubiona, podkreślęnie podwójne) - very strong inhibition of fungus development (bold font, double underline)

Oba wyizolowane szczepy wykazują silne działanie fungistatyczne. Wyniki przeprowadzonych badań laboratoryjnych wykazały hamowanie rozwoju licznych grzybów fitopatogennych, zwłaszcza zaskakująco silne hamowanie stwierdzono w odniesieniu do takich fitopatogenów jak: Botrytis cinerea, (szara pleśń) Alternaria brasiccae (czerń krzyżowych), Phytophtora infestans (zaraza ziemniaka), Colletotrichum cocoides (Antraknoza ziemniaka), Cercospora apii (Chwościk selera).Both isolated strains have a strong fungistatic effect. The results of laboratory tests showed inhibition of the development of numerous phytopathogenic fungi, especially surprisingly strong inhibition was found in relation to such phytopathogens as: Botrytis cinerea (gray mold), Alternaria brasiccae (black cruciferous fungus), Phytophtora infestans (potato blight), Colletotrichum cocoides (Potato anthracnose) , Cercospora apii (Celery weevil).

Przykład 2Example 2

Dla praktycznego zastosowania uzyskanych wyników sporządzono preparat zawierające co najmniej 2 χ 109 w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek szczepu bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zawieszone w roztworze ochronnym o składzie:For the practical application of the obtained results, a preparation was prepared containing at least 2 χ 10 9 in 1 ml of freeze-dried cell spores of the Brevibacillus brevis (DW1A) bacterial strain, suspended in a protective solution composed of:

woda wodociągowa tap water 35% objętości, 35% volume, alkohol trójwodorotlenowy glicerol trihydric alcohol glycerol 60% objętości, 60% of the volume, roztwór 2 molowy KOH w wodzie 2 molar solution of KOH in water 5% objętości 5% volume

pozwalającym na długotrwałe przechowywanie. Preparat rozcieńczono stukrotnie i opryskano rośliny porażone przez Botrytis cinerea (szara pleśń). Zaobserwowano wyraźne zahamowanie rozwoju choroby grzybowej.allowing for long-term storage. The preparation was diluted a hundred times and sprayed on plants infected with Botrytis cinerea (gray mold). A clear inhibition of the development of the fungal disease was observed.

Przykład 3Example 3

Sporządzono preparat zawierające co najmniej 2 χ 109 w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek szczepu bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zawieszone w roztworze ochronnym o składzie:A preparation was prepared containing at least 2 χ 10 9 in 1 ml of freeze-dried spores of Brevibacillus brevis (DW1A) bacteria suspended in a protective solution composed of:

woda wodociągowa tap water 69% objętości, 69% volume, alkohol trójwodorotlenowy glicerol trihydric alcohol glycerol 30% objętości, 30% of the volume, roztwór 2 molowy KOH w wodzie 2 molar solution of KOH in water 1 % objętości 1% of volume

pozwalającym na długotrwałe przechowywanie. Preparat rozcieńczono stukrotnie i opryskano rośliny porażone przez Botrytis cinerea (szara pleśń). Zaobserwowano wyraźne zahamowanie rozwoju choroby grzybowej.allowing for long-term storage. The preparation was diluted a hundred times and sprayed on plants infected with Botrytis cinerea (gray mold). A clear inhibition of the development of the fungal disease was observed.

Przykład 4Example 4

Sporządzono preparat zawierające co najmniej 2 x 109w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zawieszone w roztworze ochronnym o składzie:A preparation was prepared containing at least 2 x 10 9 in 1 ml of freeze-dried cell spores of the bacterial strain Bacillus valezensis (DW2S) suspended in a protective solution composed of:

PL 244325 BIPL 244325 BI

woda wodociągowa tap water 35% objętości, 35% of the volume, alkohol trójwodorotlenowy glicerol trihydric alcohol glycerol 60% objętości, 60% of the volume, roztwór 2 molowy KOH w wodzie 2 molar solution of KOH in water 5% objętości 5% volume

pozwalającym na długotrwałe przechowywanie. Preparat rozcieńczono stukrotnie i opryskano rośliny porażone przez Botrytis cinerea (szara pleśń). Zaobserwowano wyraźne zahamowanie rozwoju choroby grzybowej.allowing for long-term storage. The preparation was diluted a hundred times and sprayed on plants infected with Botrytis cinerea (gray mold). A clear inhibition of the development of the fungal disease was observed.

Przykład 5Example 5

Sporządzono preparat zawierające co najmniej 2 x 109w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zawieszone w roztworze ochronnym o składzie:A preparation was prepared containing at least 2 x 10 9 in 1 ml of freeze-dried cell spores of the bacterial strain Bacillus valezensis (DW2S) suspended in a protective solution composed of:

woda wodociągowa tap water 69% objętości, 69% volume, alkohol trójwodorotlenowy glicerol trihydric alcohol glycerol 30% objętości, 30% of the volume, roztwór 2 molowy KOH w wodzie 2 molar solution of KOH in water 1 % objętości 1% of volume

pozwalającym na długotrwałe przechowywanie. Preparat rozcieńczono stukrotnie i opryskano rośliny porażone przez Botrytis cinerea (szara pleśń). Zaobserwowano wyraźne zahamowanie rozwoju choroby grzybowej.allowing for long-term storage. The preparation was diluted a hundred times and sprayed on plants infected with Botrytis cinerea (gray mold). A clear inhibition of the development of the fungal disease was observed.

Claims (3)

1. Szczep bakterii zidentyfikowane jako Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 oraz szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Eksperymentalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu.1. A strain of bacteria identified as Brevibacillus brevis (DW1A) deposited under accession number B/00329 and a strain of Bacillus valezensis (DW2S) deposited under accession number B/00334 in the Polish Collection of Microorganisms (PCM) at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wrocław. 2. Biopreparat zawierający szczep bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczep bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowany pod numerem akcesyjnym B/00334 zawierający od 35% do 69% objętościowych wody wodociągowej korzystniej od 45% do 55% objętościowych wody wodociągowej, od 35% do 69% objętościowych alkoholu trójwodorotlenowego, korzystniej od 45% do 55% objętościowych oraz 2 molowy wodny roztwór wodorotlenku potasu w ilości od 1% do 5% objętości, najkorzystniej, gdy alkoholem trójwodorotlenowym jest glicerol, przy czym biopreparat zawiera nie mniej niż2x 109w 1 ml liofilizowanych przetrwalników komórek bakterii będących przedmiotem wynalazku.2. A biopreparation containing the Brevibacillus brevis (DW1A) bacterial strain deposited under accession number B/00329 and/or the Bacillus valezensis (DW2S) bacterial strain deposited under accession number B/00334 containing from 35% to 69% by volume of tap water, more preferably from 45% to 55% by volume of tap water, from 35% to 69% by volume of trihydric alcohol, more preferably from 45% to 55% by volume, and a 2 molar aqueous solution of potassium hydroxide in an amount from 1% to 5% by volume, most preferably when the trihydric alcohol is glycerol, with wherein the biopreparation contains not less than 2x 10 9 in 1 ml of freeze-dried spores of bacterial cells being the subject of the invention. 3. Zastosowanie szczepu bakterii Brevibacillus brevis (DW1A) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00329 i/lub szczepu bakterii Bacillus valezensis (DW2S) zdeponowanego pod numerem akcesyjnym B/00334 do zwalczania i zapobiegania rozwojowi fitopatogenów Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, a zwłaszcza Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.3. Use of the Brevibacillus brevis (DW1A) bacterial strain deposited under accession number B/00329 and/or the Bacillus valezensis (DW2S) bacterial strain deposited under accession number B/00334 to combat and prevent the development of phytopathogens Alternaria alternata, Alternaria dauci, Alternaria solanii, Fusarium culmorum, Fusarium oxysporum, Fusarium solani Phoma lingam, Sclerotinia sclerotiorum, Verticillium sp., Cercospora beticola, especially Botrytis cinerea, Alternaria brasiccae, Phytophtora infestans, Colletotrichum cocoides, Cercospora apii.
PL439945A 2021-12-22 2021-12-22 Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria PL244325B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL439945A PL244325B1 (en) 2021-12-22 2021-12-22 Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL439945A PL244325B1 (en) 2021-12-22 2021-12-22 Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL439945A1 PL439945A1 (en) 2023-06-26
PL244325B1 true PL244325B1 (en) 2024-01-08

Family

ID=86945240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL439945A PL244325B1 (en) 2021-12-22 2021-12-22 Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL244325B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
PL439945A1 (en) 2023-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Henis et al. Microbiological control of plant pathogens
Jabnoun-Khiareddine et al. Variation in chitosan and salicylic acid efficacy towards soil-borne and air-borne fungi and their suppressive effect of tomato wilt severity
Lamsal et al. Biocontrol of late blight and plant growth promotion in tomato using rhizobacterial isolates
Patyka et al. Specifics of pesticides effects on the phytopathogenic bacteria
Elshafie et al. An attempt of biocontrol the tomato-wilt disease caused by Verticillium dahliae using Burkholderia gladioli pv. agaricicola and its bioactive secondary metabolites
Ruano-Rosa et al. Integrated control of avocado white root rot combining low concentrations of fluazinam and Trichoderma spp.
Kim et al. Biological control of anthracnose (Colletotrichum gloeosporioides) in pepper and cherry tomato by Streptomyces sp. A1022
El-Mohamedy et al. Inhibitory effect of antagonistic bio-agents and chitosan on the growth of tomato root rot pathogens in vitro.
Podile et al. Biological control of peanut diseases
Abdulmoohsin et al. Bioefficiency of some indigenous biocontrol agents against Rhizoctonia solani causing cowpea seed rot and preemergence damping-off
Anjum et al. Bio-efficacy of Trichoderma isolates and Bacillus subtilis against root rot of muskmelon Cucumis Melo L. caused by Phytophthora drechsleri under controlled and field conditions
O’Sullivan et al. Developing actinobacterial endophytes as biocontrol products for fusarium pseudograminearum in wheat
Afouda et al. Biological control of Macrophomina phaseolina on cowpea (Vigna unguiculata) under dry conditions by bacterial antagonists
JP5896643B2 (en) New microorganism and plant disease control material using the new microorganism
Adekunle et al. Field evaluation of selected formulations of Trichoderma species as seed treatment to control damping-off of cowpea caused by Macrophomina phaseolina
JP2017501742A (en) Bacillus subtilis strain deposited at deposit number CECT8258, and methods for protecting or treating plants
Kripalini et al. Studies on Survey of Fusarium wilt of Pea (Pisum sativum L.) and its Management by Native Trichoderma Isolates and Commercial Trichoderma under Pot Condition in Manipur
Walid et al. Biological Control of Tomato Damping-off and Potato Black Scurf by Seed Treatment with Trichoderma harzianum.
PL244325B1 (en) Strains of bacteria of the genus Bacillus, their use to prevent the growth of certain phytopathogenic fungi and a biopreparation containing strains of these bacteria
Parveen et al. Pythium aphanidermatum and its control measures
Khalil Influence of electrical conductivity on biological activity of Pythium ultimum and Binab T in a closed soilless system
Ehteshamul-Haque et al. Impact of seaweeds on fluorescent Pseudomonas and their role in suppressing the root diseases of soybean and pepper
EP3782469A1 (en) Method of controlling soil-borne diseases of plants
Ewekeye et al. In-vitro biocontrol of fungi associated with leaf diseases of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) using Trichoderma species
Pothiraj et al. Screening of Pseudomonas fluorescens against dry root rot pathogen Macrophomina phaseolina in black gram