PL243663B1 - Zastosowanie wanikozydów - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy aktywności przeciwnowotworowych disacharydowych estrów fenylopropanoidów izolowanych z kłączy rdestowca sachalińskiego. Związki te znane są jako wanikozyd A i wanikozyd B i zgodnie z wynalazkiem nadają się do stosowania w leczeniu lub profilaktyce nowotworów, zwłaszcza czerniaka.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest aktywność przeciwnowotworowa disacharydowych estrów fenylopropanoidów izolowanych z kłączy rdestowca sachalińskiego. Związki te znane są jako wanikozyd A i wanikozyd B i zgodnie z wynalazkiem nadają się do stosowania w leczeniu lub profilaktyce czerniaka.

Czerniak jest złośliwym nowotworem wywodzącym się z melanocytów. Częstość występowania czerniaka stale rośnie, a śmiertelność w grupie pacjentów z zaawansowaną chorobą jest nadal bardzo wysoka. Chociaż czerniak stanowi tylko 4% wszystkich nowotworów skóry, jest odpowiedzialny za ponad 80% zgonów związanych z rakiem skóry [1]. Zlokalizowany czerniak we wczesnym stadium jest leczony chirurgicznie, a następnie chemioterapią lub radioterapią. Niestety większość pacjentów diagnozuje się w momencie, gdy nowotwór już daje przerzuty, a istniejące standardowe metody leczenia wykazują ograniczoną skuteczność [2].

Rzadziej występujący czerniak amelanotyczny, który nie wykazuje pigmentu - melaniny lub posiada go bardzo mało, jest jeszcze trudniejszy do diagnozy i wiąże się z wyższym ryzykiem śmierci [3]. W ostatnich latach wzmożone prace badawcze doprowadziły do zatwierdzenia przez Food and Drug Administration (FDA) nowych metod leczenia ukierunkowanych na szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK), który jest powszechnie aktywowany w czerniaku skóry. Zatwierdzono leki będące inhibitorami BRAF, m.in. wemurafenib i dabrafenib, stosowane same lub w połączeniu z inhibitorami kinazy białkowej (MEK), takimi jak trametynib, dedykowane pacjentom z mutacją BRAFV600, która występuję w około 60-80% czerniaków [4], [5]. Leczenie inhibitorami BRAF wraz z inhibitorami MEK zahamowuje rozwój choroby nowotworowej u prawie wszystkich pacjentów z mutacją BRAFV600, ale ostatecznie u większości pacjentów rozwija się oporność na te leki [6]. Pomimo postępów w leczeniu, nadal istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe skuteczne strategie terapeutyczne dla tej wysoce agresywnej choroby. Poszukiwanie nowych leków odbywa się na wielu poziomach. Nasz zespół skoncentrował badania na poszukiwaniu aktywnych przeciwnowotworowo roślinnych substancji należących do polifenoli. Wybór tej grupy związków uzasadniony jest wcześniejszymi badaniami ukazującymi, że polifenole mogą wpływać hamująco na proliferację komórek nowotworowych oraz doprowadzać do ich śmierci działając na różne mechanizmy komórki nowotworowej, co jest niezwykle istotne bo zmniejsza ryzyko rozwinięcia oporności nowotworu na te substancje. Polifenole doprowadzają do śmierci komórki nowotworowej poprzez promowanie apoptozy, regulację autofagii, hamowanie proliferacji, a także poprzez wpływ na ich metabolizm i inne mechanizmy [7], [8].

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych związków, które będą nadawały się do stosowania w terapii przeciwnowotworowej czerniaka.

Nieoczekiwanie niniejszy wynalazek dostarcza wiedzę o przydatności terapeutycznej disacharydowych estrów fenylopropanoidów izolowanych z kłączy rdestowca sachalińskiego. Przedmiotem wynalazku jest wanikozyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu chorobie nowotworowej, przy czym stosowanym związkiem jest wanikozyd A o wzorze

Com<i_7- struktura

Quat CH 169.3 147.9 168.9 147.19 168.49147.17

168.48 146.8 161.5 131.6 161.4 131.3 161.3 131.2

149.3 124.6 127.8 116.82 127.12116.81 127.09116.80 103.4 116.3

115.4

CH₂ 114.9 66.3 114.7 65.8 114.4 65.5 111.5

92.9 81.0 79.1 75.0

74.0 72.9 72.4 72.3

CH₃

56.5

PL 243663 Β1 lub wanikozyd B o wzorze

Comp_&- struktura

Quat CH 172.S 148.0 169.2 147.2 168.9 146.9 168.4 131.6 168.3 131.3 161.6 131.2 161.4 124.5 161.3 116.9 150.6 116.9 149.3 116.8 127.7 116.3 127.2 115.3 127.0 114.8 103.6 114.6 114.2

CH_a 111.6 66.4 90.6 65.5 81.1 65.4 79.4

74.3 72.4 72.3 72,1

CH₃ 56.5 21.0 lub ich mieszaniny, natomiast nowotworem jest czerniak.

Nieoczekiwanie, zgodnie z wynalazkiem zidentyfikowano właściwości przeciwnowotworowe dwóch związków tj. wanikozydu A i wanikozydu B, zaobserwowane zwłaszcza w stosunku do komórek czerniaka złośliwego melanotycznego A375 i amelanotycznego C32.

Wanikozydy A i B poddane badaniu zostały wyizolowane z kłączy rdestowca sachalińskiego Reynoutria sachalinensis [F.Schmidt] Nakai. Kłącza rdestowca sachalińskiego pochodzącego z Azji Wschodniej, jednakże ze względu na wysoką inwazyjność obecnie szeroko rozpowszechnionego w Europie i Ameryce Północnej, są tradycyjnie stosowane w ziołolecznictwie Japonii i Chin, m.in. w leczeniu bólu stawów, różnych stanów zapalnych, żółtaczki, braku miesiączki, kaszlu, oparzeń, urazów, ran i innych. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że kłącza R. sachalinensis są bogatym źródłem disacharydowych estrów fenylopropanoidów z dominującą ilością wanikozydu B [9] [10].

Struktury chemiczne związków: wanikozydu B i wanikozydu A wykorzystane w dalszych badaniach zostały określone za pomocą metod spektroskopowych 1H i 13C NMR oraz analizy HR-MS-qTOF MS i porównane z literaturą. Zarówno metoda izolacji wanikozydóworaz ich identyfikacji została opublikowana w czasopiśmie Planta Medica 2018 Oct;84(15):1118-1126. [10].

W ramach badania, które doprowadziło do uzyskania niniejszego wynalazku przeprowadzono test MTT oceniający wpływ badanych wanikozydów A i B na żywotność komórek czerniaka złośliwego melanotycznego A375 i amelanotycznego C32 oraz na nienowotworowe linie komórkowe: fibroblasty i keratynocyty (HaCaT). Wyniki testu wskazały na cytotoksyczne działanie wanikozydów na komórki czerniaka złośliwego melanotycznego A375 i amelanotycznego C32 już w najniższych badanych stężeniach-2,5 μΜ, 5 μΜ (o około 50% obniżenie żywotności komórek C32 po zastosowaniu wanikozydu A), przy czym szczególnie wrażliwe okazały się być komórki czerniaka złośliwego amelanotycznego C32 na wanikozyd A. Na Fig. 1 przedstawiono wyniki testu MTT przeprowadzonego na liniach czerniaka złośliwego melanotycznego A375, amelanotycznego C32, keratynocytach HaCaT i fibroblastach.

W teście MTT wanikozydy nie wykazały żadnego efektu toksycznego na linie nienowotworowefibroblasty i keratynocyty (HaCaT), w niskich stężeniach do 25 μΜ - keratynocyty i 50 μΜ - fibroblasty. Co więcej jak pokazały wyniki testu oceniającego mechanizm śmierci komórek (indukcję apoptozy i wtórną śmierć komórek) z użyciem RealTime-Glo™ Αηηβχίη V Apoptosis and Necrosis Assay, nawet obserwowane w teście MTT obniżenie żywotności komórek nienowotworowych w stężeniach 25 μΜ, 50 μΜ, nie świadczy o śmierci tych komórek ale o obniżeniu aktywności ich mitochondriów[11]. Test z Anneksyną potwierdził natomiast indukcje apoptozy i wtórną śmierć badanych komórek nowotworowych po inkubacji z wanikozydami, wskazując jednocześnie możliwość występowania dodatkowych mechanizmów śmierci tych komórek, w szczególności śmierci wywołanej reaktywnymi postaciami tlenu. Przypuszczenie to potwierdza struktura chemiczna wanikozydów i obecność aktywnej w reakcjach oksydacyjnych grupy ferulowej w obu wanikozydach i dodatkowej grupy acetylowej w wanikozydzie A, co prawdopodobnie przeważa nad jego silniejszą aktywnością cytotoksyczną.

PL 243663 Β1

Kolejne badania obejmowały wykonanie testu RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay. Poziom fluorescencji odzwierciedla ilość wiązanie białka fuzyjnego aneksyny V z odsłoniętą fosfatydyloseryną, natomiast poziom fluorescencji odzwierciedla utratę integralności błony komórkowej-wtórną śmierć komórki.

Na fig. 2 przedstawiono wyniki testu RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis uzyskane dla wanikozydu A. Wielokrotne pomiary luminescencji i fluorescencji po ekspozycji badanych linii komórkowych C32, A375, HaCaT i fibroblastów na szereg stężeń wanikozyd A mierzone były w czasie 24 godzin inkubacji. Przedstawiono RLU (Lewy panel przedstawia poziom luminescencji odzwierciedlający wiązanie białka fuzyjnego aneksyny V z odsłoniętą fosfatydyloseryną) i RFU (Prawy panel przedstawia poziom fluorescencji odzwierciedlający utratę integralności błony komórkowej). Dane przedstawiają średnią z 3 prób.

Na fig. 3 przedstawiono wyniki testu RealTime-GloTM Annexin V Apoptosis and Necrosis uzyskane dla wanikozydu B. Wielokrotne pomiary luminescencji i fluorescencji po ekspozycji badanych linii komórkowych C32, A375, HaCaT i fibroblastów na szereg stężeń wanikozydu B mierzone w czasie 24 godzin inkubacji. Przedstawiono RLU (Lewy panel przedstawia poziom luminescencji odzwierciedlający wiązanie białka fuzyjnego aneksyny V z odsłoniętą fosfatydyloseryną) i RFU (Prawy panel przedstawia poziom fluorescencji odzwierciedlający utratę integralności błony komórkowej). Dane przedstawiają średnią z 3 prób.

Na fig. 4 przedstawiono wykresy obrazujące zmianę poziomu luminescencji i fluorescencji w czasie w różnych stężeniach wanikozydów w porównaniu do znanego induktora apoptozy - staurosporyny, zastosowanego jako kontrola pozytywna.

Ujawnione powyżej wyniki badań wskazują na wybiórczy mechanizm śmierci wanikozydów w stosunku do nowotworowych komórek czerniaka złośliwego melanotycznego i amelanotycznego, co z pewnością może przekładać się na bezpieczeństwo ich przyszłego zastosowania.

W ramach dalszych badań przeprowadzono również dokowanie molekularne, które pozwoliło prognozować powinowactwo wanikozydów do celów molekularnych jakimi w przypadku czerniaków jest zmutowane białko BRAF(V600E) oraz kinaza MEK1. Wyniki badań wykazały, że zarówno wanikozyd A jak i wanikozyd B wykazują powinowactwo do aktywnych struktur tych białek i mogą być potencjalnymi inhibitorami BRAF(V600E) oraz MEK1. Mechanizm inhibicji tych białek może być jedną z przyczyn uśmiercania komórek czerniaka złośliwego przez wanikozydy, tym bardziej, że zastosowana w badaniu linia czerniaka melanotycznego A375 wykazuje mutację BRAFV600E. Nie są dostępne informacje o potencjalnej mutacji w badanej linii C32 (nie można jednak tego wykluczyć, gdyż w czerniakach amelanotycznych dochodzi do tej mutacji równie często). Co więcej jednoczesne wiązanie się zarówno ze zmutowanym białkiem BRAF(V600E) oraz MEK1 jest dodatkowym ciekawym odkryciem mogącym korzystnie wpłynąć na potencjalną terapię. Poniżej zaprezentowano wyniki z dokowania wanikozydów do zmutowanego białka BRAF(V600E) oraz do białka MEK1. W tabeli porównano również dokowanie badanych przez nas wanikozydów do znanych inhibitorów tych kinaz. Widoczne są te same (pogrubiona czcionka) bardzo ważne z punktu inhibicji miejsca wiązania. Przy czym występujące w wanikozydzie A lub B wiązanie do Lys483 i Cys532 opisano również jako ważne reszty wiązania potencjalnych inhibitorów BRAF[12] [13],

Tabela 1. Oddziaływanie wiazania wodorowego wanikozydu A i wanikozydu B z kinazami BRAF(V600E) i MEK1. W tabeli pokazano również oddziaływanie innych znanych inhibitorów kinaz BRAF(V600E) - ligand: PLX4032 i MEK1 - ligand: UCB1353770.

Cel	Oddziałujące z ligandem	Wanikozyd A	Wanikozyd B
BRAF(V600E) kinase (ligand: PLX4Q32)	Asp594, Phe595,Trp531	Asp594, Cys532, Thr529, Ser465	Asp594, Cys532, Lys483, Asn581
MEK-1 kinase (Ligand: UCB1353770)	Lys97, Asp208, Val211, Ser212,	Lys97, Asp208, Serl94, Asnl95, Cys207	Lys97, Asp208, Serl94, Asnl95, Glul44

Zgodnie z wynalazkiem wanikozyd A i B wykazują efekt przeciwnowotworowy w stosunku do komórek czerniaka złośliwego melanotycznego i amelanotycznego i powinny nadawać się do stosowania jako leki w terapii tego agresywnego nowotworu, którego dotychczasowe metody leczenia nie są zadowalające. Zaletą stosowania wanikozydów A i B w porównaniu ze standardowymi lekami jest ich mała toksyczność w stosunku do nienowotworowych linii komórkowych oraz różnorodny wpływ na komórki czerniaka złośliwego, blokowanie jednocześnie kilku istotnych mechanizmów życiowych tych komórek, co powinno przełożyć się na mniejsze ryzyko wystąpienia oporności lekowej.

Literatura:

1. Fischer, G.M.; Gopal, Y.N.V.; McQuade, J.L.; Peng, W.; DeBerardinis, R.J.; Davies, M.A. Metabolic Strategies of Melanoma Cells: Mechanisms, Interactions with the Tumor Microenvironment, and Therapeutic Implications. Pigment Cell Melanoma Res. 2018, 31, 11.

2. RASTRELLI, M.; TROPEA, S.; ROSSI, C.R.; ALAI B AC, M. Melanoma: Epidemiology, Risk Factors, Pathogenesis, Diagnosis and Classification. In Vivo (Brooklyn). 2014, 28, 1005-1011.

3. Gong, H.Z.; Zheng, H.Y.; Li, J. Amelanotic melanoma. Melanoma Res. 2019, 29, 221-230.

4. Koseła, H.; Świtaj, T.; Rutkowski, P. Zastosowanie inhibitorów BRAF i MEK w terapii zaa- wansowanego czerniaka. Onkol. w Prakt. Klin. 2011, 7, 246-253.

5. Luke, J.J.; Flaherty, K.T.; Ribas, A.; Long, G. V. Targeted agents and immunotherapies: optimizing outcomes in melanoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2017, 14, 463-482.

6. Gopal, Y.N. V.; Rizos, H.; Chen, G.; Deng, W.; Frederick, D.T.; Cooper, Z.A.; Scolyer, R.A.; Pupo, G.; Komurov, K.; Sehgal, V.; et al. Inhibition of mTORC1/2 Overcomes Resistance to MAPK Pathway Inhibitors Mediated by PGC1 and Oxidative Phosphorylation in Melanoma. Cancer Res. 2014, 74, 7037-7047.

7. Bian, Y.; Wei, J.; Zhao, C.; Li, G. Natural polyphenols targeting senescence: a novel prevention and therapy strategy for cancer. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21.

8. Mitra, T.; Bhattacharya, R. Phytochemicals modulate cancer aggressiveness: A review depicting the anticancer efficacy of dietary polyphenols and their combinations. 2020, 1-13.

9. Nawrot-Hadzik, I.; Ślusarczyk, S.; Granica, S.; Hadzik, J.; Matkowski, A. Phytochemical diversity in rhizomes of three Reynoutria species and their antioxidant activity correlations elucidated by LC-ESI-MS/MS analysis. Molecules 2019, 24.

10. Nawrot-Hadzik, I.; Granica, S.; Domaradzki, K.; Pecio, Ł.; Matkowski, A. Isolation and Determination of Phenolic Glycosides and Anthraquinones from Rhizomes of Various Reynoutria Species. Planta Med. 2018, 84.

11. Riss, T.L.; Moravec, R.A.; Niles, A.L.; Duellman, S.; Benink, H.A.; Worzella, T.J.; Minor, L. Cell Viability Assays. Assay Guid. Man. 2004, 1-31.

12. Campos, L.E.; Garibotto, F.M.; Angelina, E.; Kos, J.; Tomasic, T.; Zidar, N.; Kikelj, D.; Gonec, T.; Marvanova, P.; Mokry, P.; et al. Searching new structural scaffolds for BRAF inhibitors. An integrative study using theoretical and experimental techniques. Bioorg. Chem. 2019, 91, 103125.

13. Tsai, J.; Lee, J.T.; Wang, W.; Zhang, J.; Cho, H.; Mamo, S.; Bremer, R.; Gillette, S.; Kong, J.; Haass, N.K.; et al. Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008, 105, 3041-6.

14. Das, J.; Ramani, R.; Suraju, M.O. Polyphenol compounds and PKC signaling. Biochim. Biophys. Acta - Gen. Subj. 2016, 1860, 2107-2121.

Claims (1)

1. Wanikozyd do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu chorobie nowotworowej, przy czym stosowanym związkiem jest wanikozyd A o wzorze:

lub wanikozyd B o wzorze:

lub ich mieszaniny, przy czym nowotworem jest czerniak.