PL242134B1 - Sposób otrzymania antybakteryjnych nanokompozytów tlenku cynku - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania antybakteryjnych nanokompozytów tlenku cynku poprzez zewnątrzkomórkową biosyntezę z użyciem supernatantu uzyskanego z hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego oraz prekursora w postaci azotanu cynku charakteryzuje się tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego to szczep Lactobacillus paracasei LPC20 zdeponowanego pod numerem B/00287 a do supernatantu pohodowlanego dodaje się przy jednoczesnym mieszaniu azotan cynku w stężeniu 0,1 g/mL, a proces biosyntezy prowadzi się w temperaturze 60°C przez 1 h, po czym supernatant ogrzewa się w temperaturze 100°C aż do całkowitego odparowania płynu i uzyskania nanokompozytu w formie proszku, następnie nanokompozyt oczyszcza się poprzez trzykrotne płukanie wodą dejonizowaną z odwirowaniem.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania antybakteryjnych nanokompozytów tlenku cynku, z użyciem hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego, które mają zastosowanie w farmacji wobec szczepów patogennych, w szczególności S. aureus, E. coli oraz K. pneumonia.

Cynk jest jednym z najważniejszych i niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania mikroelementów - stanowi składnik centrów aktywnych wielu enzymów zaangażowanych w metabolizm, bierze udział w mineralizacji kości, gojeniu się ran, odpowiada za prawidło we funkcjonowanie układu immunologicznego, wydzielanie insuliny czy też utrzymanie prawidłowego stężenia witaminy A oraz cholesterolu Chociaż cynk jest uznawany za stosunkowo nietoksyczny, to istnieje coraz więcej dowodów na to, że wolne jony cynku mogą powodować np. degradację neuronów, co ujawniono w publikacji Frederickson, Christopher J., Jae-Young Koh, and Ashley I. Bush. 2005. “The Neurobiology of Zinc in Health and Disease.” Nature Reviews Neuroscience 6(6): 449-62. Wyeliminowanie cytotoksycznego działania jonów Zn²⁺ wykazano przez otrzymanie tlenku cynku w formie biokoloidów połączonych bioaktywnym ligandem - białkami bądź w formie nanokompozytów ZnO (ZnO NCs, ang. Zinc Oxide Nanocomposites) ujawnione w publikacji naukowej Pomastowski, Paweł et al. 2016. “Silver-Lactoferrin Nanocomplexes as a Potent Antimicrobial Agent.” Journal of the American Chemical Society 138(25): 7899-7909. Podstawowymi metodami otrzymywania nanoZnO są metody chemiczne oraz fizyczne, jednak otrzymane w ten sposób nanomateriały charakteryzują się wysoką cytotoksycznością w stosunku do komórek zwierzęcych i ludzkich, co dyskwalifikuje ich zastosowanie jako np. preparaty medyczne.

Mikrobiologiczny wewnątrzkomórkowy sposób otrzymania nanocząstek ZnO ujawniono w publikacji naukowej Kundu, Debasree et al. 2014. “Extracellular Biosynthesis of Zinc Oxide Nanoparticles Using Rhodococcus Pyridinivorans NT2: Multifunctional Textile Finishing, Biosafety Evaluation and in Vitro Drug Delivery in Colon Carcinoma.” Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 140: 194-204 stosując mikroorganizmy gram -dodatnie (Rhodococcus pyridinivorans). Natomiast w publikacji Jayaseelan, C. et al. 2012. “Novel Microbial Route to Synthesize ZnO Nanoparticles Using Aeromonas Hydrophila and Their Activity against Pathogenic Bacteria and Fungi.” Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 90: 78-84, przedstawiono użycie bakterii gram-ujemnych (np. Aeromonas hydrophila) do otrzymania nanokompozytów ZnO. Zastosowanie bakterii probiotycznych kwasu mlekowego (np. Lactobacillus plantarum VITES07 lub Lactobacillus paracasei LB3) ujawniono w publkacji Selvarajan, E., and V. Mohanasrinivasan. 2013. “Biosynthesis and Characterizati on of ZnO Nanoparticles Using Lactobacillus Plantarum VITES07.” Materials Letters 112: 180-82.

Rajabairavi i jego współpracownicy przeprowadzili zewnątrzkomórkową biosyntezę nanoZnO za pomocą supernatantu uzyskanego po hodowli Sphingobacterium thalpophilum i przy użyciu 1 mM azotanu cynku jako prekursora. Proces biosyntezy prowadzono w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie otrzymane próbki suszono w temperaturze 120°C. W rezultacie otrzymano nanocząstki o wielkości około 40 nm wykazujące działanie antybakteryjne wobec szczepów P. aeruginosa i E. aerogenom .

Celem wynalazku jest opracowanie szybkiego sposobu otrzymywania nanokompozytów tlenku cynku o właściwościach antybakteryjnych mających zastosowanie w farmacji wobec szczepów patogennych, w szczególności Pseudomonas aureginosa ATCC 15441, Staphylococcus aureus ATCC 11632, Klebsiella pneumonia ATCC BAA-1144 oraz Escherichia coli ATCC 25922.

Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania antybakteryjnych nanokompozytów tlenku cynku poprzez zewnątrzkomórkową biosyntezę z użyciem supernatantu uzyskanego z hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego oraz prekursora w postaci azotanu cynku charakteryzujący się tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego to szczep Lactobacillus paracasei LPC20 zdeponowanego pod numerem B/00287 a do supernatantu pohodowlanego dodaje się przy jednoczesnym mieszaniu azotan cynku w stężeniu 0,1 g/mL, przy czym proces biosyntezy prowadzi się w temperaturze 60°C przez 1 h, po czym supernatant ogrzewa się w temperaturze 100°C aż do całkowitego odparowania płynu i uzyskania nanokompozytu w formie proszku. Następnie nanokompozyt oczyszcza się poprzez trzykrotne płukanie wodą dejonizowaną z odwirowaniem.

Korzystnie, gdy nanokompozyt doczyszcza się poprzez dializę za pomocą membrany o granicznej masie molowej 3 kDa przez okres co najmniej 120 h.

PL 242134 Β1

Wynalazek przedstawiono w przykładzie wykonania.

Sposób otrzymania nanokompozytówZnO w pierwszym etapie obejmuje hodowlę szczepu L. Paracasei, który został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PGM, PAN, Warszawa) pod numerem B/00287 zawierającego w przedziale od 10⁷ do 108 CFU/mL żywych komórek w 100 mL pożywki płynnej MH (Mueller Hinton Broth; Sigma-Aldrich). Hodowlę prowadzono przez 48 h w temperaturze 37°C. Po upływie czasu inkubacji hodowla bakteryjna została żwirowana (12000 rpm, 30 min, 20°C), a do uzyskanego supernatantu dodano heksahydrat azotanu cynku (Zn(NOs)2 6 H2O) do stężenia 0,1 g/mL przy ciągłym mieszaniu i proces mieszania prowadzono przez 1 godzinę w temperaturze 60°C. Następnie mieszaninę poreakcyjną odwirowano przy prędkości 7000 rpm przez 15 min przy temperaturze 22°C, a uzyskany supernatant przeniesiony do nowego szklanego naczynia i ogrzewano w 100°C do odparowania płynu i uzyskania nanokompozytów tlenku cynku w formie proszku w ilości ok. 8 g. Otrzymany ZnO NCs oczyszczono poprzez przepłukanie 20 mL wodą dejonizowaną, worteksowane przez 10 min, poddane sonikacji w łaźni ultradźwiękowej przez 20 min oraz wirowane (10000 rpm, 10 min, 20°C). Oczyszczanie takie dokonano trzykrotnie. W celu wypłukania niezwiązanych jonów oraz niskocząsteczkowych metabolitów wstępnie oczyszczony nanokompozyt ZnO poddano 5-dniowej dializie przy użyciu membrany o granicznej masie molowej (cut off) 3 kDa (Spectrumlab, USA). Oczyszczone ZnO NCs poddano badaniom fizykochemicznym oraz testom na aktywności antybakteryjną.

Obecność tlenku cynku potwierdzono przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) sprzężonego z detektorem dyspersji energii promieniowania rentgenowskiego (EDX).

Fig. 1 przedstawia obrazy kolejnych powiększeń struktur ZnO a Fig. 2 widmo EDX co jednoznacznie potwierdza obecność ZnO.

Fig. 3 przedstawia obraz dyfrakcyjny (SAED), który potwierdza krystaliczną postać ZnO, a przedstawione na Fig. 4 widmo dyfrakcyjne XRD wskazuje na tlenek cynku w formie wurcytu o stałych sieci a = 0,3249 nm i c = 0,5208 nm (zgodnie z kartą JCPDS nr 36-1451, P63mc). W przypadku syntezy kontrolnej (pożywka MH z dodatkiem prekursora) nie wykazano obecności ZnO NCs. Na podstawie otrzymanych wyników oraz równania Scherrera obliczony został krystaliczny rozmiar nanokompozytów, który wynosił 13,70 ± 1,53 nm.

Fig. 5 przedstawia wykres potencjału zeta ZnO NCs w przedziale pH 2-10, wskazując na stabilność struktury ZnO NCs przy największej stabilności nanocząstek w przedziale pH 7-9; średnia wartość potencjału wynosi -29,15 ± 1,05 mV.

Fig. 6 przedstawia wynik badania za pomocą analizy termograwimetrycznej stabilności termicznej otrzymanych nanokompozytów ZnO NCs, które były stabilne termicznie do temperatury 130°C.

Fig. 7 przedstawia wynik badania spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR). Otrzymane dane wskazują na obecność depozytu organicznego na powierzchni nanokompozytów w postaci grup amidowych oraz karboksylowych. Dolny pik (5) w obszarze między 500-600 cm'¹ oznacza wiązanie Zn-0 i potwierdza obecność tlenku cynku w badanej próbce.

Tabela 1 przedstawia skuteczność działania antybakteryjnego wytworzonych nanocząstek tlenku cynku wykazane poprzez oznaczenie minimalnego stężenia hamującego (MIC, ang. Minimal Inhibitory Concentration), czyli najmniejszego stężenia środka o właściwościach antybakteryjnych hamujące wzrost bakterii w warunkach in vitro. Wartość MIC jest wyrażona w pg/mL.

Mikroorganizm	Staphylococcus aureus ATCC 11632	Escherichia coli ATCC 25922	Psendomonas aeruginosa ATCC 15441	Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1144
ZnO NCs	86,25 pg/mL	172,5 pg/mL	-	172,5 pg/mL

Opracowany sposób jest proekologiczny. W sposobie według wynalazku nie został użyty żaden dodatkowy związek chemiczny, a wykorzystanie supernatantu po hodowli mikroorganizmów jest bezpieczne, gdyż posiadają one status GRAS (ang. generally recognized as safe). Ponadto, wykorzystanie serwatki z mleka krowiego, będącej drugim głównym odpadem ciekłym przemysłu mleczarskiego, doskonale wpisuje się w założenia zielonej chemii oraz zrównoważonego rozwoju. Aktualne wykorzystanie przemysłowe serwatki stanowi jedynie niewielki procent jej możliwości, dlatego też wykorzystanie jej w celu syntezy ZnO NCs, znacznie zwiększa wachlarz możliwości wykorzystania tego surowca. Zaproponowane interdyscyplinarne podejście oparte na wykorzystaniu technik stosowanych w naukach che micznych oraz mikrobiologicznych umożliwiło opracowanie metody syntezy nowatorskich nanokompozytów tlenku cynku przy wykorzystaniu supernatantu po hodowli szczepu Lactobacillus paracasei wyizolowanego z serwatki. Otrzymane nanokompozyty ZnO z depozytem organicznym na powierzchni, pozwalają na zastosowanie ich jako preparatów do leczenia np. trudno gojących się ran, i może stać się krokiem milowym w walce z lekoopornością bakterii czy grzybów.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania antybakteryjnych nanokompozytów tlenku cynku poprzez zewnątrzkomórkową biosyntezę z użyciem supernatantu uzyskanego z hodowli szczepu bakterii kwasu mlekowego oraz prekursora w postaci azotanu cynku znamienny tym, że szczep bakterii kwasu mlekowego to szczep Lactobacillus paracasei LPC20 zdeponowanego pod numerem B/00287 a do supernatantu pohodowlanego dodaje się przy jednoczesnym mieszaniu azotan cynku w stężeniu 0,1 g/mL, a proces biosyntezy prowadzi się w temperaturze 60°C przez 1 h, po czym supernatant ogrzewa się w temperaturze 100°C aż do całkowitego odparowania płynu i uzyskania nanokompozytu w formie proszku, następnie nanokompozyt oczyszcza się poprzez trzykrotne płukanie wodą dejonizowaną z odwirowaniem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nanokompozyt doczyszcza się poprzez dializę za pomocą membrany o granicznej masie molowej 3 kDa przez okres co najmniej 120 h.