PL241834B1

PL241834B1 - Zastosowanie sulfonowanych pochodnych polistyrenu w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirus Zika

Info

Publication number: PL241834B1
Application number: PL433443A
Authority: PL
Inventors: Krzysztof PYRĆ; Krzysztof Pyrć; Magdalena Obłoza; Maria Nowakowska; Paweł BOTWINA; Paweł Botwina; Krzysztof SZCZUBIAŁKA; Krzysztof Szczubiałka
Original assignee: Univ Jagiellonski
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2022-12-12
Also published as: WO2021201705A1; EP4125938A1; PL433443A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sól sodowa poli(4-sulfonianu styrenu) do stosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirusa Zika.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sulfonowana pochodna polistyrenu (PSS), w szczególności sól sodowa poli(4-sulfonianu styrenu) (PSSNa), do zastosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirusa Zika (ZIKV), jak również zastosowanie takiej sulfonowanej pochodnej jako leku lub substancji aktywnej w leczeniu/profilaktyce zakażeń ZIKV.

ZIKV, należący do rodziny Flaviviridae, został wyizolowany po raz pierwszy w 1947 roku z próbki pochodzącej od makaka¹. Przez wiele lat nie przyciągał on jednak szczególnej uwagi naukowców ze względu na bardzo rzadkie i często bezobjawowe zakażenia u ludzi. Jednakże obraz ten zaczął zmieniać się od 2007 roku, kiedy wybuchła epidemia ZIKV w Mikronezji (wyspa Yap)². Kolejna epidemia wybuchła 6 lat później w rejonie Polinezji, gdzie choroba dotknęła blisko 20 000 osób³. Następna fala zachorowań miała miejsce w Brazylii i objęła nawet 1 300 000 osób. ZIKV w stosunkowo krótkim czasie rozprzestrzenił się na całym świecie, a Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zakwalifikowała go jako patogen stanowiący międzynarodowe zagrożenie zdrowia publicznego. Dane WHO z 2019 r. wskazują, że transmisja wirusa Zika odnotowana została w 87 państwach i terytoriach. Przy zwiększającej się liczbie przypadków zaobserwowano, że chociaż sama choroba ma charakter stosunkowo łagodny, jej konsekwencje mogą być bardzo poważne. Dotyczy to w szczególności zakażenia kobiet w okresie ciąży, ponieważ może ono prowadzić do mikrocefalii u płodu⁴. ZIKV jest arbowirusem, który do rozprzestrzeniania się wymaga wektora - komara z rodzaju Aedes⁴, jednakże do zakażenia może dojść również przez bezpośredni kontakt z zakażoną osobą, m.in. w czasie kontaktów seksualnych⁵. U dzieci kobiet zakażonych podczas ciąży wykrywa się wiele wad wrodzonych i niepełnosprawności, zwanych wrodzonym zespołem Zika^6,7. Do najczęstszych wad należą mikrocefalia, uszkodzenie tkanki mózgowej, uszkodzenie tylnej części oka, bliznowacenie plamki żółtej, wrodzone przykurcze, takie jak stopa końskoszpotawa lub artrogrypoza, a także hipertonia ograniczająca ruch ciała wkrótce po urodzeniu⁸. U osób dorosłych zakażenie ZIKV wiąże się również z powikłaniami ze strony układu nerwowego, takimi jak zespół Guillaina-Barrego.

Chociaż ZIKV stanowi poważne zagrożenie zdrowia, brak jest skutecznej szczepionki i nie jest dostępne specyficzne względem ZIKV leczenie przeciwwirusowe. Przy zakażeniu zalecane jest jedynie leczenie wspomagające. Istnieje zatem potrzeba stworzenia nowego leku hamującego, który jako substancję czynną zawierałby związek skutecznie hamujący replikację wirusa ZIKV, wykazywałby niską toksyczność, a jego stosowanie zmniejszałoby ryzyko powikłań i łagodziło objawy zakażenia.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sól sodowa poli(4-sulfonianu styrenu) do stosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirusa Zika.

W korzystnej realizacji wynalazku masa cząsteczkowa soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi od 1,1 kDa do 3160 kDa.

W innej korzystnej realizacji wynalazku masa cząsteczkowa soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi 3160 kDa.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku stężenie soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi od 0,5 mg/ml do 2 mg/ml.

W jeszcze następnej korzystnej realizacji wynalazku stężenie soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi 1 mg/ml.

Celem przeprowadzonych badań było opracowanie nowego inhibitora, który będzie łagodził objawy zakażenia ZIKV i zmniejszał ryzyko powikłań. Najbardziej efektywne były polimery PSSNa (sól sodowa poli(4-sulfonianu styrenu) ), które praktycznie całkowicie hamowały replikację wirusa in vitro. Jednocześnie zastosowane polimery charakteryzowały się niską toksycznością względem komórek ludzkiej glioblastomy (U251) oraz komórek małpiej nerki (Vero PZH), podatnych na zakażenie wirusem Zika. Przeprowadzone badania wykazały, że najefektywniej działają polimery o wysokiej masie cząsteczkowej. Testy mechanistyczne wykazały, że PSSNa wiąże ZIKV i blokuje w ten sposób ich zdolność do zakażania komórek gospodarza.

Przykłady realizacji wynalazku zobrazowano na figurach 1-6. Na fig. 1 przedstawiono cytotoksyczność PSSNa o różnych masach cząsteczkowych w stężeniach 2000, 1000 i 500 μg/ml, wyznaczoną za pomocą testu XTT na komórkach U251 i Vero PZH. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Na fig. 2 przedstawione są średnie wartości z odchyleniami standardowymi (słupki błędów), przedstawiające hamowanie cyklu replikacji ZIKV przez polimery PSSNa o różnych masach cząsteczkowych w komórkach U251. Hamowanie infekcji oceniano przy użyciu ilościowej reakcji Real Time PCR (RT-qPCR). Polimery były obecne w pożywce podczas całego cyklu replikacyjnego

PL 241 834 B1

ZIKV. Dane przedstawiono jako wartości logarytmiczne liczby kopii RNA ZIKV na mililitr. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ze standardowymi odchyleniami (słupki błędów). Gwiazdka wskazuje wartości statystycznie różniące się od kontroli (P < 0,05). Fig. 3 przedstawia hamowanie cyklu replikacji ZIKV przez PSSNa w różnych typach komórek. Hamowanie infekcji oceniano przy użyciu RT-qPCR. Komórki U251 i Vero PZH zakażano w obecności odpowiedniego stężenia PSSNa odpowiednio przez 4 i 3 dni. Dane są pokazane jako wartości logarytmiczne liczby kopii RNA ZIKV na mililitr. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie z co najmniej trzech powtórzeń. Fig. 4 przedstawia aktywność przeciwwirusową PSSNa o różnych masach cząsteczkowych na różnych etapach cyklu infekcji ZIKV. Nazwy odpowiednich testów są zaznaczone nad wykresami. Hamowanie infekcji oceniano przy użyciu RT-qPCR. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ze standardowymi odchyleniami (słupki błędów). Gwiazdki wskazują wartości statystycznie różniące się od kontroli (P < 0,05). Fig. 5 przedstawia blokowanie przez PSSNa przyłączania się ZIKV do komórek gospodarza. Komórki Vero PZH zakażono ZIKV (TCID50 = 10000/ml) w obecności 250 μg/ml PSSNa. Komórki utrwalono 2 godziny po inkubacji w 4°C i zebrano obrazy konfokalne. Pasek skali = 100 μm. Fig. 6 przedstawia oddziaływanie PSSNa z cząsteczkami ZIKV. PSSNa-FITC lub PBS nałożono na szkiełka nakrywkowe pokryte kolagenem. Następnie dodano ZIKV i inkubowano przez 1 godzinę. Preparaty na szkiełkach utrwalono, wybarwiono immunologicznie stosując przeciwciała specyficznie wykrywające białko E ZIKV i poddano obrazowaniu. Pasek skali = 100 μm.

PSSNa jest łatwym w syntezie i tanim polimerem. Może być otrzymywany na drodze polimeryzacji rodnikowej w bardzo szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Jest on też polimerem stosowanym już klinicznie. Jako lek w formie doustnej lub doodbytyniczej zawiesiny jest stosowany w leczeniu hiperkalemii, tj. zbyt wysokiego poziomu potasu w osoczu (np. preparaty Kayexelate, Kionex, Kalexelate). Nie ulega on absorpcji z układu pokarmowego.

Przykład 1

Wpływ soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) (PSSNa) o różnych masach cząsteczkowych na przeżywalność komórek.

W badaniach zastosowano komercyjnie dostępne (Pressure Chemicals i Sigma-Aldrich) sole sodowe poli(4-sulfonianu styrenu) o różnych masach cząsteczkowych i o małym współczynniku dyspersji (stosowane jako wzorce analityczne w chromatografii żelowej (GPC)).

Metody

Cytotoksyczność polimerów została oznaczona z wykorzystaniem zestawu do testu żywotności XTT (XTT Viability Assay Kit, Biological Industries, Izrael). Test pozwala na ilościowe oznaczenie aktywności metabolizmu komórek. Jedynie żywe, aktywne metabolicznie komórki zdolne są do przekształcenia tetrazoliowego substratu (karboksyanilidu 2,3-bis-(2-metoksy-4-nitro-5-sulfenylo)-(2H)-tetrazoliny, XTT) w jego barwną pochodną, której stężenie, mierzone absorbancją przy 480 nm, koreluje z liczbą żywych komórek oraz ich żywotnością. Do przeprowadzenia doświadczenia wykorzystano permisywne linie komórkowe, tj. komórki ludzkiej glioblastomy (U251) oraz komórki małpiej nerki (Vero PZH). Komórki hodowano przez 48 h w pożywce DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) z dodatkiem 3% FBS (inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca), penicyliny, streptomycyny i gentamycyny. Do pożywki dodano wodne roztwory PSSNa o różnych masach cząsteczkowych lub, w przypadku próbek kontrolnych, wodę. Po inkubacji komórek na płytce 96-dołkowej przez 4 doby, usunięto pożywkę i do każdego dołka płytki dodano 100 μl świeżej pożywki oraz 20 μl aktywowanego XTT. Po 2 h inkubacji nadsącz przeniesiono do przezroczystej płytki 96-dołkowej i za pomocą spektrofotometru w standardowy sposób mierzono absorbancję przy długości fali wynoszącej 480 nm. Uzyskane wartości zostały znormalizowane względem absorbancji zmierzonej dla komórek kontrolnych (bez PSSNa), którym przypisano 100% żywotności. Przetestowano roztwory wodne 19 polimerów PSSNa o różnych masach cząsteczkowych (1,1; 2,1; 3,6; 4,2; 6,5; 9,7; 14,9; 20,7; 29,1; 63,9; 104,5; 145; 261; 466; 666; 976; 1000; 2070 i 3160 kDa) w 3 różnych stężeniach (0,5 mg/ml, 1 mg/ml i 2 mg/ml). Wyniki eksperymentu przedstawia fig. 1.

Wyniki

Uzyskane wyniki wskazują na niską cytotoksyczność polimerów w stężeniu 0,5 mg/ml i 1 mg/ml (fig. 1) w przypadku obu testowanych linii komórkowych.

Przykład 2

Wpływ soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) (PSSNa) na infekcję ZIKV.

PL 241 834 B1

Metody

W celu określenia aktywności przeciwwirusowej soli sodowej sulfonianu polistyrenu (PSSNa) przeciwko ZIKV (szczep H/PF/2013) przeprowadzono test hamowania zakażenia ZIKV przez PSSNa. W tym doświadczeniu polimer był obecny w pożywce na każdym etapie infekcji wirusowej. W doświadczeniu wykorzystano całkowicie konfluentne komórki U251 po 48 h od wysiania na płytce 96-dołkowej. Pożywkę usunięto i dodano 100 μl świeżej pożywki z dodatkiem 3% FBS (inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca), penicyliny, streptomycyny, gentamycyny oraz polimerów PSSNa o różnych masach cząsteczkowych (1 mg/ml dla PSSNa o 19 różnych masach cząsteczkowych i 0,5 mg/ml dla PSSNa wybranych do testów mechanizmu działania opisanego w przykładzie 3). Próbki kontrolne nie zawierały PSSNa.

Do komórek dodano ZIKV w ilości pozwalającej osiągnąć miano końcowe TCID50 (ang. 50% tissue culture infective dose) = 400/ml. Płytki inkubowano przez 2 h w 37°C, następnie komórki przepłukano dwukrotnie roztworem PBS w celu usunięcia niezwiązanych cząstek wirusowych. Na koniec do każdej studzienki dodano 100 μl roztworu polimeru w pożywce hodowlanej i komórki inkubowano przez 4 dni. Po tym czasie nadsącz zebrano w celu oceny liczby kopii wirusowego RNA z zastosowaniem ilościowej reakcji Real Time PCR (RT-qPCR).

Izolację wirusowego RNA przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu do izolacji RNA (Viral DNA/RNA Isolation Kit, A&A Biotechnology, Polska) zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Tak wyizolowane RNA zostało poddane odwrotnej transkrypcji (RT) oraz ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR).

W skrócie, reakcję RT-qPCR przeprowadzono w następujący sposób. 3 μl wyizolowanego wirusowego RNA przepisano na matrycę cDNA i powielono w reakcji o objętości 10 μl zawierającej 1 χ GoScript™ RT Mix for 1-Step RT-qPCR, 1 χ GoTaq Probe qPCR Master Mix with dUTP, 100 nM swoistej sondy znakowanej 6-karboksyfluoresceiną (FAM) i 6-karboksytetrametylorodaminą (TAMRA) (5’-FAM-CGGCATACAGCATCAGGTGCATAGGAG-TAMRA-3’), oraz 450 nM każdego startera (5’TTGGTCATGATACTGCTGATTGC-3’ i 5’-CCTTCCACAAAGTCCCTATTGC-3’). Reakcję przeprowadzono w termocyklerze (CFX96 Touch™ Real-197 Time PCR Detection System, Bio-Rad) w następujących warunkach: 45°C 15 min (odwrotna transkrypcja), 95°C 2 min, następnie 40 cykli po 15 sekund w 95°C i 30 sekund w 60°C.

W celu oceny początkowej liczby cząsteczek wirusowego RNA w próbce przygotowano odpowiednie wzorce. Przepisany na cDNA fragment sekwencji powielono z zastosowaniem starterów opisanych powyżej. Tak otrzymany DNA klonowano do plazmidu pTZ57R/T (Thermo Scientific, Polska) z zastosowaniem zestawu InsTAclone PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Polska). Przeprowadzono transformację szczepu E. coli TOP10 (Life Technologies, Polska) i namnażanie wektora plazmidowego w standardowy sposób. Następnie plazmid oczyszczono z zastosowaniem zestawu do izolacji GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, Polska) i poddawano linearyzacji poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Kpnl. Stężenie linearyzowanego DNA oceniano poprzez pomiar spektrofotometryczny i obliczano liczbę kopii na mililitr. Jako matrycę w reakcji PCR w czasie rzeczywistym stosowano sześć 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych. Zdolność polimerów do zahamowania namnażania się ZIKV wyznaczono jako spadek logarytmu liczby kopii RNA wirusowego na mililitr pożywki.

Wyniki

W pierwszym eksperymencie (fig. 2) komórki U251 zakażono ZIKV w obecności każdego z testowanych polimerów PSSNa o 19 różnych masach cząsteczkowych. Analizy RT-qPCR wykazały bardzo silne hamowanie replikacji ZIKV w stężeniu 500 μg/ml. Stwierdzono również, że działanie hamujące jest związane z masą cząsteczkową polimeru. PSSNa o wysokiej masie wykazują silniejsze działanie hamujące (ponad 4 log hamowania), podczas gdy polimery o mniejszej masie cząsteczkowej wykazały słabsze hamowanie (2-4 log spadku). W przypadku niektórych polimerów hamowanie było tak silne, że liczba kopii wirusowego RNA była poniżej dolnej granicy wykrywalności metody RT-qPCR (około 1000 kopii/ml).

Po tych obiecujących wstępnych eksperymentach przeprowadzono kolejne eksperymenty z wykorzystaniem 4 polimerów obejmujących szeroki zakres mas cząsteczkowych (1,1, 20,7, 29,1 i 3160 kDa). Przeprowadzono test hamowania replikacji wirusa w komórkach U251 i Vero PZH , aby sprawdzić, czy efekt jest zależny od rodzaju komórki. Eksperymenty wykazały bardzo podobny wzorzec hamowania w komórkach U251 i Vero PZH, co sugeruje, że PSSNa działa bezpośrednio na składniki ZIKV, a nie na metabolizm komórkowy (fig. 3). Ponownie zaobserwowano korelację między masą cząsteczkową PSSNa a efektywnością hamowania ZIKV, tj. polimery PSSNa o wyższych masach cząsteczkowych

PL 241 834 B1 (29,1 i 3160 kDa) hamowały ZIKV bardziej skutecznie niż polimery charakteryzujące się niższymi masami cząsteczkowymi. W przypadku komórek U251 zaobserwowano silne, zależne od dawki, hamowanie wirusa tylko dla PSSNa o masach cząsteczkowych 29,1 i 3160 kDa, przy dawce IC50 odpowiednio 14,3 i 8,8 μg/ml. Natomiast w komórkach Vero PZH wszystkie badane polimery PSSNa hamowały zakażenie ZIKV w sposób zależny od dawki, a ich skuteczność rosła wraz ze wzrostem ich masy cząsteczkowej. Test hamowania replikacji wirusa wykazał również całkowite zahamowanie replikacji szczepu ZIKV MR-776 w pierwotnych fibroblastach ludzkiej skóry (HSF) w przypadku wszystkich testowanych polimerów PSSNa (1,1,20,7, 29,1 i 3160 kDa) przy 250 μg/ml (danych nie pokazano).

PSSNa w postaci leku do stosowania w leczeniu lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirusa Zika może mieć postać roztworu do podania dożylnego.

Przykład 3

Znakowany fluorescencyjnie fluoresceiną PSSNa otrzymany został wg procedury opisanej uprzednio w literaturze¹⁰.

Określenie mechanizmu przeciwwirusowego działania polimerów PSSNa.

Metody

W celu określenia mechanizmu działania PSSNa i identyfikacji etapu cyklu replikacyjnego, na którym dochodzi do zahamowania infekcji ZIKV, przeprowadzono opisane poniżej testy funkcjonalne przy stężeniu polimeru wynoszącym 0,5 mg/ml. W badaniach wykorzystano cztery różne polimery PSSNa, różniące się masą cząsteczkową (1,1 kDa, 20,7 kDa, 29,1 kDa i 3160 kDa). Wykonano następujące testy komórkowe:

1. Test inaktywacji wińonów przez PSSNa

Stężony ZIKV inkubowano w obecności PSSNa w stężeniu 0,5 mg/ml. Po inkubacji rozcieńczono próbki 1000χ w celu wyeliminowania wpływu PSSNa na same komórki. Przygotowane preparaty poddano analizie z wykorzystaniem miareczkowania wg metody Reed i Muench⁹ poprzez przygotowanie 10 seryjnych pięciokrotnych rozcieńczeń wirusa i zakażenie nimi monowarstwy komórek U251 w 8 powtórzeniach. Po tym czasie za pomocą mikroskopu optycznego oceniano pojawianie się efektu cytopatycznego na skutek zakażenia ZIKV. Liczba dołków, w których pojawił się CPE koreluje liniowo z wartością logarytmiczną TOD50.

2. Test protekcji komórek przez PSSNa

Wpływ PSSNa na komórki oceniono poprzez inkubację komórek U251 przez 2 h z PSSNa (0,5 mg/ml) w 37°C. Po tym czasie polimer odpłukano, a komórki zakażono ZIKV (TCID50 = 400/ml). Po 5 dniach inkubacji (37°C; 5% CO2) przeprowadzono analizę replikacji ZIKV z wykorzystaniem RT-qPCR. Na podstawie zmian w replikacji wirusa oceniono wpływ PSSNa na komórki.

3. Test oddziaływania PSSNa z receptorem

Wpływ PSSNa jako inhibitora procesu wiązania wirusa do receptora na powierzchni komórki poddano ocenie poprzez adsorpcję wirusa na komórkach U251 w obecności inhibitora, a następnie usunięcie go z pożywki. Na komórki schłodzone do 4°C dodano mieszaninę wirusa (TCID50 = 400/ml, 4°C), próbkę kontrolną z dodatkiem PSSNa (0,5 mg/ml, 4°C) lub próbkę kontrolną (bez PSSNa). Próbki inkubowano 1 h w 4°C, aby pozwolić na związanie wirusa do receptora, a jednocześnie by zablokować internalizację do wnętrza komórki (transport komórkowy został zablokowany przez niską temperaturę). Próbki przepłukano trzykrotnie PBS, a następnie dodano pożywkę hodowlaną i inkubowano przez 5 dni (37°C; 5% CO2). Po tym czasie przeprowadzono analizę replikacji ZIKV z wykorzystaniem RT-qPCR. Na podstawie zmian w replikacji wirusa oceniono wpływ PSSNa na wiązanie się wirusa do receptora komórkowego.

4. Test wpływu PSSNa na późne etapy zakażenia

Wpływ PSSNa jako inhibitora późnych etapów zakażenia poddano ocenie poprzez zakażenie komórek U251 bez PSSNa, a następnie po odpłukaniu wirusa inkubację w obecności PSSNa. Zatem w momencie samej adsorpcji wirusa do komórek oraz jego internalizacji, PSSNa nie był obecny. Komórki inkubowano w pożywce zawierającej ZIKV (TCID50 = 400/ml) lub próbkę kontrolną przez 2 h w 37°C. Po tym czasie komórki przepłukano trzykrotnie PBS i nałożono pożywkę hodowlaną suplementowaną PSSNa (0,5 mg/ml) lub kontrolą i inkubowano przez 12 godzin, co jest czasem jednego cyklu replikacyjnego ZIKV (37°C; 5% CO2). Po tym czasie przeprowadzono analizę replikacji ZIKV z wykorzystaniem RT-qPCR. Na podstawie zmian w replikacji wirusa oceniono wpływ PSSNa na późne etapy zakażenia.

PL 241 834 B1

Mikroskopia konfokalna

Komórki wysiewano na szkiełkach nakrywkowych w 12-studzienkowych płytkach (TPP, Szwajcaria). Po przeprowadzeniu eksperymentu, komórki utrwalono przy użyciu 4% formaldehydu, permeabilizowano 0,1 Tritonem Χ-100 i zablokowano przez inkubację z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA, Bioshop, Kanada) w PBS przez 2 godziny. Następnie preparaty na szkiełkach inkubowano przez 2 godziny z 1 pg/ ml króliczego przeciwciała anty-ZIKV Envelope (GeneTex, USA). Po przepłukaniu 3 razy PBS komórki inkubowano przez 1 godzinę z 2,5 μg/ml drugorzędowego koziego przeciwciała anty-króliczego skoniugowanego z fluoroforem Atto 488 i/lub falloidyną skoniugowaną z Alexa Fluor 647 (0,2 U/ml, Invitrogen, Polska) barwiącą aktynę komórkową. Następnie preparaty przemyto trzy razy PBS, a jądra komórkowe (DNA) wybarwiono DAPI (0,1 pg/ml, Sigma-Aldrich, Polska) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełka przemywano kilkukrotnie PBS i osadzono na szkiełkach podstawowych używając medium ProLong Diamond Antifade Mountant (Life Technologies, Polska). Obrazy uzyskano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH; wydanie wersja 8.1) przy użyciu oprogramowania ZEN 2012 SP1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH; black edition, wersja 8.1.0.484).

Wyniki

Wyniki testów funkcjonalnych sugerują, że PSSNa działa poprzez bezpośrednią interakcję z wirusem Zika. Świadczy o tym bardzo silne hamowanie zakaźności próbki po inkubacji z roztworem PSSNa, przedstawione na fig. 4 - wyniki testu inaktywacji wirionów. Zaobserwowano tu również wzrost skuteczności działania przeciwwirusowego wraz ze zwiększaniem masy cząsteczkowej polimeru. PSSNa 3160 kDa obniżył wartość TCID50/ml o prawie 3 log, podczas gdy PSSNa 1,1 kDa obniżył tę wartość tylko o 0,5 log. Zaobserwowano jednak znaczące hamowanie dla 2 polimerów PSSNa (o masach cząsteczkowych 20,7 i 3160 kDa) również w teście przyłączania wirusa (test III). Dlatego nie można wykluczyć dodatkowego niezależnego mechanizmu działania, w którym PSSNa blokuje interakcję między cząstką ZIKV a receptorem komórkowym. Jednak efekt ten nie jest spowodowany bezpośrednią interakcją PSSNa z receptorem, ponieważ nie zaobserwowano żadnego spadku replikacji ZIKV w teście ochrony komórek (test II), w którym polimery inkubowano z komórkami przed infekcją. Nie zaobserwowano żadnego hamowania liczby ZIKV w komórkach traktowanych PSSNa po początkowych etapach replikacji wirusa. Dlatego można założyć, że działanie przeciwwirusowe PSSNa wynika głównie z jego bezpośredniej interakcji z cząstkami ZIKV, co zapobiega przyłączaniu się wirusa do komórek gospodarza.

Obrazy konfokalne potwierdziły, że PSSNa uniemożliwia wirusowi przyłączenie się do komórki. Komórki inkubowano z wirusem i PSSNa w 4°C przez 2 h. W niskiej temperaturze ZIKV mógł się przyłączyć do receptora komórkowego, jednak nie mógł ulegać internalizacji do wnętrza komórki. Uzyskane obrazy wykazały, że oba testowane PSSNa (tj. o masach cząsteczkowych 1,1 i 3160 kDa) znacznie zmniejszyły liczbę wirionów (oznaczonych białymi strzałkami) związanych z komórką (fig. 5). Aby bezpośrednio obserwować interakcję między 10 ZIKV i PSSNa, przeprowadzono test wiązania ZIKV, gdy PSSNa wyznakowany fluoresceiną (PSSNa-FITC) unieruchomiono na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem. Zaobserwowano znaczny wzrost sygnału obwiedni ZIKV w porównaniu do kontroli bez PSSNa-FITC. Obrazy konfokalne wykazują zatem silną interakcję między PSSNa-FITC i ZIKV (fig 6).

Literatura (1) Dick, G. W. A. Zika Virus (I). Isolations and Serological Specificity. 1952, 46 (5), 509-520.

(2) Lanciotti, R. S.; Kosoy, O. L.; Laven, J. J.; Velez, J. O.; Lambert, A. J.; Johnson, A. J.; Stanfield, S. M.; Duffy, M. R. Genetic and Serologic Properties of Zika Virus Associated with an Epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. 2008, 14 (8), 1232-1239.

(3) Musso, D.; Bossin, H.; Mallet, H. P.; Besnard, M.; Broult, J.; Baudouin, L.; Levi, J. E.; Sabino, E. C.; Ghawche, F.; Lanteri, M. C.; Baud, D. Zika Virus in French Polynesia 2013-14: Anatomy of a Completed Outbreak. The Lancet Infectious Diseases. 2018.

(4) Kraemer, M. U. G.; Sinka, M. E.; Duda, K. A.; Mylne, A.; Shearer, F. M.; Brady, O. J.; Messina, J. P.; Barker, C. M.; Moore, C. G.; Carvalho, R. G.; Coelho, G. E.; Van Bortel, W.; Hendrickx, G.; Schaffner, F.; Wint, G. R. W.; Elyazar, I. R. F.; Teng, H.-J.; Hay, S. I. The Global Compendium of Aedes Aegypti and Ae. Albopictus Occurrence. Sci. data 2015, 2,150035.

(5) Musso, D.; Roche, C.; Robin, E.; Nhan, T.; Teissier, A.; Cao-Lormeau, V. M. Potential Sexual Transmission of Zika Virus. Emerg. Infect. Dis. 2015, 21 (2), 359-361.

PL 241 834 B1 (6) Baud, D.; Gubler, D. J.; Schaub, B.; Lanteri, M. C.; Musso, D. An Update on Zika Virus Infection. The Lancet. 2017.

(7) Wheeler, A. C. Development of Infants with Congenital Zika Syndrome: What Do We Know and What Can We Expect? Pediatrics 2018.

(8) Rice, M. E.; Galang, R. R.; Roth, N. M.; Ellington, S. R.; Moore, C. A.; Valencia-Prado, M.; Ellis, E. M.; Tufa, A. J.; Taulung, L. A.; Alfred, J. M.; Perez-Padilla, J.; Delgado-López, C. A.; Zaki, S. R.; Reagan-Steiner, S.; Bhatnagar, J.; Nahabedian, J. F.; Reynolds, M. R.; Yeargin-Allsopp, M.; Viens, L. J.; Olson, S. M.; Jones, A. M.; Baez-Santiago, M. A.; Oppong-Twene, P.; VanMaldeghem, K.; Simon, E. L.; Moore, J. T.; Polen, K. D.; Hillman, B.; Ropeti, R.; Nieves-Ferrer, L.; Marcano-Huertas, M.; Masao, C. A.; Anzures, E. J.; Hansen, R. L.; Perez-Gonzalez, S. I.; Espinet-Crespo, C. P.; Luciano-Roman, M.; Shapiro-Mendoza, C. K.; Gilboa, S. M.; Honein, M. A. Vital Signs: Zika-Associated Birth Defects and Neurodevelopmental Abnormalities Possibly Associated with Congenital Zika Virus Infection - U.S. Territories and Freely Associated States, 2018. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2018.

(9) Reed, L. J.; Muench, H. A. Simple Method of Estimating Fifty Percent Endpoints. Am. J. Epidemiol. 1938, 27 (3), 493-497.

(10) Sohn, D., Russo, P.S., Davila, A., Poche, D.S., McLaughlin, M. L., J. Colloid Interface Sci. 1996, 17(1), 31-44.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sól sodowa poli(4-sulfonianu styrenu) do stosowania w leczeniu i/lub profilaktyce infekcji wywołanej przez wirusa Zika.
2. Sól sodowa do stosowania według zastrz. 1, znamienna tym, że masa cząsteczkowa soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi od 1,1 kDa do 3160 kDa.
3. Sól sodowa do stosowania według zastrz. 2, znamienna tym, że masa cząsteczkowa soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi 3160 kDa.
4. Sól sodowa do stosowania według zastrz. od 1 do 3, znamienna tym, że stężenie soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi od 0,5 mg/ml do 2 mg/ml.
5. Sól sodowa do stosowania według zastrz. 4, znamienna tym, że stężenie soli sodowej poli(4-sulfonianu styrenu) wynosi 1 mg/ml.