PL241477B1 - Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu - Google Patents
Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu Download PDFInfo
- Publication number
- PL241477B1 PL241477B1 PL433249A PL43324920A PL241477B1 PL 241477 B1 PL241477 B1 PL 241477B1 PL 433249 A PL433249 A PL 433249A PL 43324920 A PL43324920 A PL 43324920A PL 241477 B1 PL241477 B1 PL 241477B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- enzyme
- diosgenone
- kstd
- reaction
- concentration
- Prior art date
Links
- AZXZUBZBLNFUPF-UHFFFAOYSA-N Tamogenone Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(=O)C=C4CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 AZXZUBZBLNFUPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- AZXZUBZBLNFUPF-CLGLNXEMSA-N chembl1915879 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 AZXZUBZBLNFUPF-CLGLNXEMSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- QEGQIJLALWETNE-CLGLNXEMSA-N (25r)-spirosta-1,4-dien-3-one Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C=CC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 QEGQIJLALWETNE-CLGLNXEMSA-N 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 51
- 101710116689 3-oxosteroid 1-dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 241000029117 Sterolibacterium denitrificans Species 0.000 claims abstract description 30
- XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 2-METHOXYETHANOL Chemical compound COCCO XNWFRZJHXBZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 5-methylphenazinium methyl sulfate Chemical compound COS([O-])(=O)=O.C1=CC=C2[N+](C)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 RXGJTUSBYWCRBK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 3
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims abstract 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 20
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 16
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 14
- 241000187561 Rhodococcus erythropolis Species 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 6
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical class [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000001172 liquid--solid extraction Methods 0.000 claims 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 abstract description 2
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 abstract 1
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 5
- HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(C#N)=C(C#N)C1=O HZNVUJQVZSTENZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JPJALAQPGMAKDF-UHFFFAOYSA-N selenium dioxide Chemical compound O=[Se]=O JPJALAQPGMAKDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIBAPVLFORANSS-UHFFFAOYSA-N Smilagenone Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CCC(=O)CC4CCC3C2C2)C)C2OC11CCC(C)CO1 CIBAPVLFORANSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SMZOGRDCAXLAAR-UHFFFAOYSA-N aluminium isopropoxide Chemical compound [Al+3].CC(C)[O-].CC(C)[O-].CC(C)[O-] SMZOGRDCAXLAAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- NYOXRYYXRWJDKP-GYKMGIIDSA-N cholest-4-en-3-one Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 NYOXRYYXRWJDKP-GYKMGIIDSA-N 0.000 description 3
- NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N cholestenone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 NYOXRYYXRWJDKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 3
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 3
- CIBAPVLFORANSS-AIEOQHCFSA-N tigogenone Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 CIBAPVLFORANSS-AIEOQHCFSA-N 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014548 Rubus moluccanus Nutrition 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N androst-4-ene-3,17-dione Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-QAGGRKNESA-N 0.000 description 2
- AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N androstenedione Natural products O=C1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 AEMFNILZOJDQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N cholest-5-en-3-one Chemical compound C1C=C2CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 GGCLNOIGPMGLDB-GYKMGIIDSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTTWKVFKBPAFDK-UHFFFAOYSA-N (9beta,10alpha)-Androst-4-ene-3,17-dione Natural products OC1CCC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 BTTWKVFKBPAFDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLAJNZSPVITUCQ-UHFFFAOYSA-N 1,3,2-dioxathietane 2,2-dioxide Chemical compound O=S1(=O)OCO1 QLAJNZSPVITUCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 17alpha-methyltestosterone Natural products C1CC2=CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C)(O)C1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- -1 23-bromo-(25R)-spirosta-1,4-dien-3-one Chemical compound 0.000 description 1
- KVBWBCRPWVKFQT-UHFFFAOYSA-N 3-iodobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(I)=C1 KVBWBCRPWVKFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930183217 Genin Natural products 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N Methyltestosterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@](C)(O)[C@@]1(C)CC2 GCKMFJBGXUYNAG-HLXURNFRSA-N 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006036 Oppenauer oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000224017 Plasmodium berghei Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GMBQZIIUCVWOCD-WWASVFFGSA-N Sarsapogenine Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC[C@H]3[C@@H]2C1)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@H](C)CO1 GMBQZIIUCVWOCD-WWASVFFGSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RTMWIZOXNKJHRE-UHFFFAOYSA-N Tigogenin Natural products CC1COC2CC(C)(OC12)C3CCC4C5CCC6CC(O)CCC6(C)C5CCC34C RTMWIZOXNKJHRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAJOUDAEBSDOST-QCMZPDNYSA-N [(1S,2S,4S,5'R,6R,7S,8R,9S,12S,13R,14R,16R)-14-acetyloxy-5',7,9,13-tetramethylspiro[5-oxapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icos-18-ene-6,2'-oxane]-16-yl] acetate Chemical compound C[C@H]1[C@H]2[C@H](C[C@H]3[C@@H]4CC=C5C[C@H](C[C@@H](OC(C)=O)[C@]5(C)[C@H]4CC[C@]23C)OC(C)=O)O[C@]11CC[C@@H](C)CO1 NAJOUDAEBSDOST-QCMZPDNYSA-N 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WPUJEWVVTKLMQI-UHFFFAOYSA-N benzene;ethoxyethane Chemical compound CCOCC.C1=CC=CC=C1 WPUJEWVVTKLMQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- YWWZCHLUQSHMCL-UHFFFAOYSA-N diphenyl diselenide Chemical compound C=1C=CC=CC=1[Se][Se]C1=CC=CC=C1 YWWZCHLUQSHMCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hydrogen chloride Substances Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960001566 methyltestosterone Drugs 0.000 description 1
- NPAGDVCDWIYMMC-IZPLOLCNSA-N nandrolone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 NPAGDVCDWIYMMC-IZPLOLCNSA-N 0.000 description 1
- 229960004719 nandrolone Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 125000003003 spiro group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/02—Dehydrogenating; Dehydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu o wzorze 2, który polega na tym, że prowadzi się regioselektywną enzymatyczną dehydrogenację diosgenonu o wzorze 1 biokatalizatorem w postaci genetycznie zmodyfikowanych komórek E. coli lub preparatem enzymatycznym o aktywności KSTD pochodzącym z bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S DSM: 13999 o sekwencji identycznej do Sekwencji 1 lub podobnej do Sekwencji 1 (identyczność nie mniejsza niż 70%) lub z Rodococcus erythropolis SQ1 o sekwencji identycznej do Sekwencji 2 lub podobnej do Sekwencji 2 (identyczność nie mniejsza niż 70%) środowisku wodno-organicznym, w obecności reutleniacza, którym jest 2,6-dichloroindofenol, metosiarczan fenazyny lub mieszanina 2,6-dichloroindofenolu i metosiarczanu fenazyny, w temperaturze 20 - 45°C, w mieszanie reakcyjnej, która zawiera: - bufor zapewniający pH w zakresie 6,5 — 9,0 wybrany spośród potasowego buforu ortofosforanowego, buforu glicyna - wodorotlenek sodu lub buforu chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanowego, - wodny roztwór solubilizatora o stężeniu 0 — 10% (w/v), którym jest 2-hydroksypropyl-β-cylkodekstryna, rozpuszczalnik organiczny 2-metoksyetanol, dioksan lub izopropanol w ilości 1 — 4% (v/v), utrzymując biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności KSTD przez okres do 24 godzin, który to proces regioselektywnej dehydrogenacji diosgenonu ma następujący przebieg: do reaktora mieszalnikowego wprowadza się bufor, solubilizator rozpuszczony w wodzie, reutleniacz i diosgenon rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym, po czym inicjuje się reakcję dodając preparat enzymatyczny o aktywności KSTD i monitoruje się przebieg reakcji. Uzyskany w ten sposób produkt oczyszcza się metodą ekstrakcji do fazy stałej.
Description
PL 241 477 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu (o wzorze 2) na drodze enzymatycznej selektywnej dehydrogenacji (25 R )-spirosta-4-en-3-onu (o wzorze 1), mającego nazwę zwyczajową diosgenon.
Sposób, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania związków o potencjalnej aktywności biologicznej przeciwko zarodźcowi malarii Plasmodium berghei (Pabón A. i inni, Molecules, 2013, 18, 3356-3378), posiadających właściwości przeciwzapalne (inhibicja produkcji INF-γ przez limfocyty T CD4+ - Quan H.-J. i inni, Eur. J. Med. Chem., 2002, 37 (8), 659-669), czy właściwości cytotoksyczne względem linii raka jelita grubego HCT 116 (human colorectal (HCT 116) carcinoma cell) (Quan H.-J. i inni, Eur. J. Med. Chem., 2002, 37 (8), 659-669).
Konwersje enzymatyczne są ekologiczną alternatywą względem klasycznej syntezy chemicznej w uzyskiwaniu aktywnych biologicznie związków i są coraz częściej stosowane w przemyśle farmaceutycznym, zwłaszcza do produkcji leków steroidowych (Chen M.-M. i inni, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, 96, 133-142). Stwierdzono, że wprowadzenie wiązania podwójnego między pierwszym i drugim atomem węgla w pierścieniu A diosgenonu (wzór 1) prowadzi do powstania (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu (wzór 2), który jest związkiem o podwyższonej aktywności przeciw interferonowi γ.
Chemiczne metody otrzymywania (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu są przeprowadzane jednoetapowo z diosgenonu, albo z tigogenonu albo z tigogenolu z wykorzystaniem silnych utleniaczy takich jak 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinon czy ditlenek selenu, oraz toksycznych rozpuszczalników takich jak benzen, toluen czy dichlorometan.
Znana jest chemiczna metoda otrzymywania (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu w której w wyniku reakcji diosgenonu z 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinonem, w obecności kwasu benzoesowego, otrzymywany jest (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-on z konwersją ok. 60% w przypadku procesu prowadzonego w gorącym toluenie przez 12 godzin (Pabón A. i inni, Molecules, 2013, 18, 3356-3378) lub z wydajnością ok. 49% w procesie prowadzonym w absolutnym gorącym dioksanie przez 36 godzin (Quan H.-J. i inni, Eur. J. Med. Chem., 2002, 37 (8), 659-669). Produkt reakcji oczyszczany jest za pomocą chromatografii kolumnowej na złożu krzemionkowym z wykorzystaniem mieszaniny heksanu/dichlorometanu/octanu etylu (4:1:1) jako eluentu (Pabón A. i inni, Molecules, 2013, 18, 3356-3378) lub po przepłukaniu dichlorometanem i wodorotlenkiem sodu za pomocą preparatywnej chromatografii cieczowej (Quan H.-J. i inni, Eur. J. Med. Chem., 2002, 37 (8), 659-669).
W pracy Carlon Nussbaum i innych (J. Am. Chem. Soc., 1959, 81 (19), 5230-5233) opisano metodę utleniania diosgenonu w mieszaninie alkoholu amylowego i lodowatego kwasu octowego za pomocą ditlenku selenu. Produkty reakcji są ekstrahowane za pomocą dichlorometanu z dodatkiem wodorotlenku sodu i poddawane oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej (eluent benzen-eter etylowy), a końcowa wydajność do produktu wynosi ok. 3%.
W artykule Potjamarn Bunyathaworn i innych (Steroids, 2010, 74 (6) 432-444) opisano metodę syntezy (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z tigogeniny ((25R)-5a-spirostan-3e-olu) z wykorzystaniem kwasu meta-jodobenzoesowego oraz diselenku difenylu, ogrzewanych we wrzącym toluenie przez 7 godzin. Produkt wydzielano z toluenu dodając dichlorometan z wodą oraz oczyszczając oddzieloną warstwę organiczną za pomocą chromatografii flash co pozwoliło na 70% wydajność syntezy.
Z pracy Carlon Nussbaum i innych (J. Am. Chem. Soc., 1959, 81 (19), 5230-5233) znana jest dwuetapowa metoda otrzymywania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z dioctanu ruskogeniny, polegająca na hydrolizie substratu, prowadzonej w mieszaninie chloroformu i metanolu z dodatkiem stężonego chlorowodoru przez 24 godziny, której produkty po zobojętnieniu i oczyszczeniu poddawane są utlenianiu Oppenauera (działaniu izopropanolanu glinu w mieszaninie wrzącego cykloheksanonu i toluenu). Wydajność całego procesu nie przekracza 20%.
Inna znana metoda syntezy (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu obejmuje utlenianie mieszaniny genin w toluenie za pomocą cykloheksanonu i izopropanolanu glinu (Al(0-i-Pr)3). Metoda ta wymaga oczyszczania produktu reakcji z wykorzystaniem toksycznych rozpuszczalników (benzenu, toluenu) oraz charakteryzuje się niską wydajnością (Burn D. i inni, J. Chem. Soc., 1958, 795-799). W artykule tym opisano również trójetapową reakcję syntezy (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu z tigogenonu. Według ujawnionej procedury, do roztworu tigogenonu w kwasie octowym wprowadza się roztwór bromu w kwasie octowym. Po 12 godzinach produkt wytrąca się, mieszając roztwór kwasu octowego z wodą i po rekrystalizacji w mieszaninie dichlorometanu i metanolu otrzymuje się nieoczyszczony 2,4,23-tribromo-5a-25-spirostan-3-on. Następnie ogrzewa się go przez 2 godziny we wrzącej
PL 241 477 B1
2,4,6,-trimetylopirydynie uzyskując 23-bromo-(25 R )-spirosta-1,4-dien-3-on. Związek ten poddaje się następnie działaniu jodku sodu w kwasie octowym w atmosferze azotu na łaźni wodnej przez 30 h, po czym otrzymany (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-on izoluje się mieszaniną eteru i benzenu.
Z dostępnej literatury znane są sposoby izolacji preparatu enzymatycznego o aktywności A1-dehydrogenazy 3-ketosteroidowej (KTSD) ze Sterolibacterium denitrificans (Chiang Y.-R. i inni, Appl. Environ.I Microb., 2008, 74 (1), 107-113) o skrócie AcmB (Anaerobic cholesterol metabolism enzyme B). Opisana jest również metoda transformacji genetycznej Escherichia coli w celu otrzymania rekombinowanego enzymu AcmB (K. Sofińska i inni, BBA - Gen. Subjects, 2019, 1863 (6), 1027-1039).
W literaturze przedstawione są liczne inne przykłady metod pozyskiwania enzymów typu KTSD, charakteryzujących się jednak spektrum substratowym ograniczonym tylko do 3-ketosteroidów (np. Knol J. i inni, Biochem J., 2008, 410 (2), 339-346; Itagaki E. i inni, J. Biochem., 1990, 108, 122-127; Cho K.-P. i inni, J. Biochem., 1995, 117 (5), 1043-1049; Penasse, L. i inni,. Steroids, 1968, 12 (4), 525-544; Plesiat P. I inni, J. Bacteriol., 1991, 173 (22), 7219-7227).
Znane są również z literatury przykłady zastosowania enzymu AcmB ze Sterolibacterium denitrificans do przeprowadzenia reakcji odwodornienia w pozycji C1-C2 dla szeregu standardowych, czteropierścieniowych 3-ketosteroidów (analogów progesteronu) oraz substratów nietypowych dla enzymów z tej klasy dehydrogenaz 3-ketosteroidowych (KTSD), takich jak cholest-4-en-3-on czy cholest-5-en-3-on. W szczególności w artykule Chiang Y.-R. i innych (Appl. Environ./Microb., 2008, 74 (1), 107-113) ujawniono zdolność preparatu enzymatycznego AcmB do biokatalitycznej transformacji progesteronu, testosteronu, 19-nortestosterou, androst-4-en-3,17-dion, jak również cholest-4-en-3-onu i cholest-5-en-3-onu z wykorzystaniem 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 6,5.
Z kolei w opisach patentowych PL 228070, PL 228071 i PL 228517 (A. Rugor i inni) ujawniono sposób wytwarzania propionianu androsta-1,4-dien-17e-ol-3-onu, androsta-1,4,6-trien-17e-ol-3-onu i 17a-metyloandrosta-1,4-dien-17e-ol-3-onu z wykorzystaniem Ks[Fe(CN)6] jako reutleniacza.
Jednak jak dotąd w literaturze nie ujawniono faktu zdolności enzymu AcmB do konwertowania związków zbudowanych z więcej niż 4 pierścieni, w tym w szczególności sześciopierścieniowych związków zwierających ugrupowania typu spiro, jak w diosgenonie.
Znane z literatury są doniesienia o aktywności enzymów KSTD, pochodzących z różnych organizmów w reakcji dehydrogenacji przy C1-C2 czteropierścieniowych 3-ketosteroidów (np. Itagaki E. i inni, Biochim. Biophys. Acta, 1990, 1038 (1), 60-67; Mao S. i inni, J. Chem. Technol. Biotechnol., 2019, 94, 309-316), w tym dehydrogenaz ketosteroidowych z bakterii Rhodococcus erythropolis wykazujących aktywność w stosunku do 4-androsten-3,17-dionu, testsosteronu, metylotestosteronu, hydroksykortyzonu, progesteronu, czy octanu kortyzonu, z wykorzystaniem 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 8,0.
Wg doniesień literaturowych enzymy klasy KSTD, z wyjątkiem AcmB, nie wykazują aktywności w stosunku do 3-ketosteroidów, takich jak cholest-4-en-3-on o niezdegradowanym łańcuchu alifatycznym przy C17. Co więcej, w dostępnej literaturze nie znaleziono żadnej metody enzymatycznego uzyskiwania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu, tj. aktywności enzymatycznej dla sześciopierścieniowych 3-ketosaponin.
Istota wynalazku polega na enzymatycznej regioselektywnej A^dehydrogenacji (tj. wprowadzeniu podwójnego wiązania pomiędzy atomy C1 i C2) w substracie, którym jest diosgenon ((25R)-spirost-4-en-3-on) o wzorze 1, co prowadzi do otrzymania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu (o wzorze 2). Reakcję prowadzi się według schematu 1 przedstawionego na załączonym rysunku, przy zastosowaniu enzymu o aktywności KSTD, zwłaszcza pochodzącego ze Sterolibacterium denitrificans albo Rhodococcus erythropolis. Reakcję może katalizować dowolny enzym z klasy KSTD o sekwencji podobnej, tj. nie różniący się o więcej niż 30% aminokwasów, od zaprezentowanych na załączonym rysunku sekwencji 1, tj. KSTD ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999), albo sekwencji 2, tj. KSTD z Rhodococcus erythropolis SQ1.
Wspomniany enzym wprowadza się do środowiska reakcji w postaci preparatu enzymatycznego pochodzącego z natywnej bakterii lub w postaci enzymu rekombinowanego, powstałego w procesie nadekspresji genu zmodyfikowanej bakterii, zwłaszcza Escherichia coli.
Możliwe jest również przeprowadzenie procesu z zastosowaniem komórek Escherichia coli zawierających enzym bez potrzeby wcześniejszej izolacji preparatu enzymatycznego.
PL 241 477 B1
Produkt reakcji korzystnie oczyszcza się metodą ekstrakcji do fazy stałej i otrzymuje (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-on (wzór 2) z wydajnością 52,6%, przy konwersji substratu, ustalonego według chromatografii cieczowej, powyżej 87%.
Korzystne jest, gdy proces prowadzi się w środowisku wodno-organicznym w temperaturze od 20 do 45°C, w pH 6,5-9,0 z zastosowaniem jako utleniacza 2,6-dichlorofenoloindofenolu, metylosiarczanu fenazyny lub mieszaniny 2,6-dichlorofenoloindofenolu i metosiarczanu fenazyny w obecności 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny jako solubilizatora substratu. Dodanie rozpuszczalnika organicznego (np. 2-metoksyetanolu, izopropanolu lub dioksanu) umożliwia łatwiejsze rozpuszczenie substratu i ma korzystny wpływ na konwersję.
Zasadniczymi zaletami wynalazku jest otrzymanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-on, jako jedynego produktu reakcji z konwersją nawet do 100%, z wydajnością izolowaną co najmniej 52,6%, w temperaturze pokojowej, bez zastosowania toksycznych rozpuszczalników oraz silnych utleniaczy.
Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady realizacji.
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie preparatu enzymatycznego o aktywności KSTD z natywnej bakterii Sterolibacterium denitrificans
Procedura przygotowania preparatu enzymatycznego poprzedzona jest dwoma etapami, prowadzącymi do pozyskania natywnego preparatu enzymatycznego z aktywnością AcmB: hodowlą bakteryjną oraz izolowaniem z masy bakteryjnej preparatu enzymatycznego o aktywności AcmB. Hodowlę bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999) prowadzi się w środowisku beztlenowym według procedury opisanej w literaturze (Chiang Y.-R. i inni, J. Biol. Chem., 2007, 282 (18), 13240-13249). Preparat enzymatyczny o aktywności AcmB pozyskuje się w warunkach tlenowych w formie homogenatu bakteryjnego (preparat enzymatyczny „homogenat” stanowiący białka rozpuszczalne i solubilizowane), pozyskiwanego w wyniku rozbicia komórek, solubilizacji białek z błony i ultrawirowania celem odseparowania frakcji błonowej lub jako preparat podczyszczony w formie przebicia kolumny na złożu DEAE-Sepharose (preparat enzymatyczny „po oczyszczeniu”), jak opisano w artykule Dermer J. i inni (J. Biol. Chem., 2012, 287 (44), 36905-36916).
P r z y k ł a d 2
Przygotowanie preparatu enzymatycznego o aktywności KSTD ze Sterolibacterium denitrificans w nadekspresji w Escherichia coli
Gen kodujący KSTD z S. denitrificans (AcmB) został wklonowany do wektora pMCSG7 zgodnie z procedurą opisaną w pracy Sofińskiej K. i innych (BBA - Gen. Subjects, 2019, 1863 (6), 1027-1039). Uzyskany konstrukt genetyczny został transformowany do komórek E. coli, potraktowanych chlorkiem wapnia w celu nabycia kompetencji. Następnie założono pre-kulturę tak zmodyfikowanych komórek bakteryjnych na pożywce płynnej 2% Lennox Broth (LB) z dodatkiem ampicyliny i kanamycyny tak by końcowe stężenie antybiotyków wynosiło odpowiednio 100 i 50 μg/ml, którą prowadzono w inkubatorze z wytrząsaniem (180 rpm, 37°C, 12 h). Uzyskana kultura została rozcieńczona 100-krotnie w medium LB zawierającym ampicylinę i kanamycynę w takich samych stężeniach jak wyżej, a hodowla była kontynuowana aż do osiągnięcia gęstości optycznej ODsoo o wartości 0,6. Po osiągnięciu opisanej wartości ODsoo obniżono temperaturę w inkubatorze do 16°C i zaindukowano nadekspresję enzymu przez dodatek 0,25 mM e-D-1-tiogalaktopiranozydu izopropylowego (IPTG). Po kolejnych 24 h hodowli komórki zostały oddzielone od pożywki hodowlanej poprzez wirowanie przy 4500 g (1 h, 4°C). Zawiesina komórek została poddana lizie metodą sonikacji (Sonies Vibra-Cell VCX500, cykl przerywany, 5 min, amplituda 40%, energia 150 000 J), a pozostałości komórkowe oddzielono metodą ultrawirowania przy przyspieszeniu kątowym 40 000 g przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakt komórkowy zaaplikowano na kolumnę HisTrap HP (5 ml_ GE Healthcare), by po przepłukaniu buforem podstawowym (50 mM chlorowodorek (tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris-HCI) pH 8,5, 150 mM chlorek sodu, 10% (w/v) glicerol i 0,5% (w/v) Triton-X 100) z dodatkiem 15 mM imidazolu, wymyć enzym w gradiencie imidazolu od 15 mM do 300 mM. Enzym odsolono z wykorzystaniem kolumny Econo-Pac 10DG (BioRad) i zamrożono w -20°C. Stężenie aktywnego enzymu oznaczono spektrofotometrycznie wykorzystując charakterystyczne widmo FAD przy 450 nm (ε450 = 13 100 M-1 cm-1).
P r z y k ł a d 3
Przygotowanie preparatu enzymatycznego o aktywności KSTD z Rhodococcus erythropolis SQ1 w nadekspresji w Escherichia coli
PL 241 477 B1
Gen kodujący KSTD z R. erythropolis SQ1 został wklonowany do wektora pET15b (Rohman A. i inni, Acta. Crystallogr. F, 2012, 68, 551-556) i transformowany do komórek E. coli, potraktowanych chlorkiem wapnia w celu nabycia kompetencji. Następnie założono pre-kulturę bakteryjną w płynnej pożywce 2% LB zawierającej z dodatkiem ampicyliny i kanamycyny tak by końcowe stężenie antybiotyków wynosiło odpowiednio 100 i 50 μg/ml. Hodowla była prowadzona przez 12 h w inkubatorze z wytrząsaniem (37°C, 180 rpm). Właściwą hodowlę komórkową założono poprzez 100-krotne rozcieńczenie pre-kultury w analogicznym medium i kontynuowano, aż do osiągnięcia przez komórki bakteryjne gęstości optycznej OD600 równej 0,6. Następnie temperatura hodowli została obniżona do 16°C, a nadekspresja enzymu zaindukowana przez dodatek 0,1 mM IPTG. Po 48 godzinach prowadzenia hodowli komórki zostały oddzielone od pożywki hodowlanej poprzez wirowanie przy 4500 g (1 h, 4°C) i poddane sonikacji (Sonies Vibra-Cell VCX500, cykl przerywany, 5 min, amplituda 40%, energia 150 000 J). Dalej lizat komórkowy poddano ultrawirowaniu przy 40 000 g, 4°C przez 1 godzinę. Uzyskany ekstrakt komórkowy zaaplikowano na kolumnę HisTrap HP (5 mL GE Healthcare), a enzym eluowano przy użyciu buforu podstawowego (50 mM Tris-HCI pH 8,5, 100 mM chlorek sodu, 10% (w/v) glicerol, 5 mM β-mercaptoethanol (BME)) w gradiencie imidazolu od 10 mM do 300 mM. Enzym odsolono z wykorzystaniem kolumny Econo-Pac 10DG (BioRad) i zamrożono w -20°C. Stężenie enzymu oznaczono spektrofotometrycznie wykorzystując charakterystyczne widmo FAD przy 450 nm (ε450 = 13 100 M-1 cm-1).
P r z y k ł a d 4
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 6,5, w temperaturze 30°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml, zawierającego 100 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 6,5, wprowadzono 2,6-dichloroindofenol (DCPIP) otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w dioksanie, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie dioksanu wynosiło 2% (v/v)) oraz 5 μg rekombinowanego KSTD z S. denitrificans. Reakcje prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 95% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,095 mM.
P r z y k ł a d 5
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 8,0, w temperaturze 30°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml zawierającego 50 mM Tris-HCI o pH 8,0 wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe DCPIP stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w dioksanie, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie dioksanu wynosiło 2% (v/v)) oraz 5,3 μg rekombinowanego KSTD z R. ertyhropolis. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 97% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,097 mM.
P r z y k ł a d 6
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz mieszaniny metosiarczanu fenazyny i 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 9,0, w temperaturze 30°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml zawierającego 100 mM bufor glicyna - wodorotlenek sodu o pH 9,0 wprowadzono DCPIP otrzymując jego końcowe stężenie 0,15 mM, 0,8 mM metosiarczanu
PL 241 477 B1 fenazyny (PMS), 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w dioksanie, tak by finalne stężenie diosgenonu w reaktorze wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie dioksanu wynosiło 2% (v/v)), oraz 5 μg rekombinowanego KSTD z S. denitrificans. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP- Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 97% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,097 mM.
P r z y k ł a d 7
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz metosiarczanu fenazyny jako reutleniacza w pH 8,0, w temperaturze 30°C
Do reaktora o pojemności 80 ml, zawierającego 100 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 8,0 wprowadzono PMS w ilości dającej końcowe stężenie PMS 4 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 3,2% (w/v), 1,6 ml 30 mM diosgenonu roztworu w 2-metoksyetanolu (EGME), tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,6 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)) oraz 4 mg rekombinowanego enzymu KSTD z S. denitrificans. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 15 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 pm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 100% konwersji substratu po 15 minutach reakcji i stężenie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,6 mM.
P r z y k ł a d 8
Otrzymywanie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą komórek Escherichia coli zawierających rekombinowany enzym KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 6,5, w temperaturze 30°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml, zawierającego 100 mM p otasowy bufor ortofosforanowy o pH 6,5 wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v) oraz 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w dioksanie, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie dioksanu wynosiło 2% (v/v)) oraz 27,2 mg komórek E. coli zawieszonych w 34 μl potasowego buforu ortofosforanowego o pH 8,0, zawierających rekombinowaną KSTD z S. denitrificans. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 98% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynosiło 0,098 mM.
P r z y k ł a d 9
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 6,5, w temperaturze 20°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml, zawierającego 100 mM p otasowy bufor ortofosforanowy o pH 6,5, wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 10 μg rekombinowanego KSTD z S. denitrificans. Reakcje prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 20°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A
PL 241 477 B1
RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 87% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,087 mM.
P r z y k ł a d 10
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 6,5, w temperaturze 45°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml, zawierającego 100 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 6,5, wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 5 μg rekombinowanego KSTD z S. denitrificans. Reakcje prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 45°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 98% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,098 mM.
P r z y k ł a d 11
Otrzymywanie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 8,0, w temperaturze 20°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml zawierającego 50 mM Tris-HCI o pH 8,0 wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 5,3 μg rekombinowanego KSTD z R. ertyhropolis. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 20°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 100% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,1 mM.
P r z y k ł a d 12
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis oraz 2,6-dichloroindofenolu jako reutleniacza w pH 8,0, w temperaturze 45°C
Do minireaktora o pojemności 1 ml zawierającego 50 mM Tris-HCI o pH 8,0 wprowadzono DCPIP otrzymując końcowe stężenie DCPIP 0,15 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 2% (w/v), 20 μl 5 mM roztworu diosgenonu w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisku wyniosło 0,1 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 5,3 μg rekombinowanego KSTD z R. ertyhropolis. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 45°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 20 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 93% konwersji substratu po 20 minutach reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 0,093 mM.
P r z y k ł a d 13
Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans w reaktorze zasilanym substratem przy 3,2% (w/v) 2-hydro ksypropylo-p-cyklodekstrynie, w temperaturze 30°C
Claims (8)
- PL 241 477 B1Do reaktora o pojemności 80 ml, zawierającego 100 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 8,0 wprowadzono PMS w ilości dającej końcowe stężenie PMS 4 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 3,2% (w/v), 1,6 ml 30 mM diosgenonu rozpuszczonego w 2-metoksyetanolu (EGME), tak by finalne stężenie diosgenonu w środowisk u wyniosło 0,6 mM (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 4 mg rekombinowanego enzymu KSTD z S. denitrificans. Reakcję prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 15 minut. Po tym czasie do mieszaniny dodano 1,6 ml 30 mM diosgenonu rozpuszczonego w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie 2-metoksyetanolu w reaktorze wyniosło 4% (v/v). Reakcję prowadzono przez kolejne 4 godziny i 15 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 μm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 87% konwersji substratu po 4,5 godziny reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu równe 1,044 mM.P r z y k ł a d 14Otrzymywanie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu za pomocą oczyszczonego rekombinowanego enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans w reaktorze zasilanym substratem przy 8% (w/v) 2-hydroksypropylo-p-cyklodekstrynie, w temperaturze 30°CDo reaktora o pojemności 80 ml zawierającego 100 mM potasowy bufor ortofosforanowy o pH 8,0 wprowadzono PMS w ilości dającej końcowe stężenie PMS 3 mM, 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę dającą końcowe stężenie 8% (w/v) oraz 1,6 ml 30 mM diosgenonu rozpuszczonego w 2-metoksyetanolu (EGME), tak by finalne stężenie w reaktorze diosgenonu wyniosło 0,6 mM, (a tym samym stężenie 2-metoksyetanolu wynosiło 2% (v/v)), oraz 4 mg rekombinowanego enzymu KSTD z S. denitrificans. Transformację prowadzono w warunkach tlenowych, w temperaturze 30°C, przy ciągłym wstrząsaniu przez 45 minut. Po tym czasie do mieszaniny dodano 1,6 ml 30 mM diosgenonu rozpuszczonego w 2-metoksyetanolu, tak by finalne stężenie 2-metoksyetanolu w reaktorze wyniosło 4% (v/v). Reakcję prowadzono przez kolejne 4 godziny i 45 minut. Mieszaninę reakcyjną analizowano za pomocą HPLC stosując do rozdziału fazę mobilną acetonitryl/woda (55% ACN przez 1 min, gradient do 98% przez 0,5 min, 98% ACN przez 4 min, przepływ 0,4 ml/min, T rozdziału 40°C) na kolumnie AMT HALO 90 A RP-Amide, 2,7 pm, 2,1 x 75 mm. W takich warunkach następuje separacja reagentów, czas retencji produktu to 4,78 min a diosgenonu 5,15 min. Dla takich warunków uzyskano 69% konwersji substratu po 5,5 godziny reakcji i stężenie (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu równe 0,816 mM. Po tym czasie dodano 3,66 mg enzymu prowadząc dalej reakcję przez kolejne 1,5 godziny i uzyskując 100 % konwersję substratu oraz końcowe stężenie (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu wynoszące 1,2 mM.Na tej drodze otrzymano 20,8 mg czystego produktu, (25 R )-spirosta-1,4-dien-3-onu, (wydajność oczyszczania 52,6%, stopień konwersji 100%). Produkt oczyszczono metodą ekstrakcji ciecz-ciało stałe stosując kolumienki C18 PolarPlus® (J.M. Baker®), oddzielając PMS za pomocą 40% roztworu izopropanolu w wodzie, a produkt reakcji eluując za pomocą 100% izopropanolu.Uzyskany produkt scharakteryzowano danymi spektralnymi, zmierzonymi za pomocą spektrometru NMR Bruker 400 MHz w deuterowanym chloroformie (CDCI3) i pokazanymi na załączonym rysunku, na którym widmo protonowe produktu 1H NMR przedstawiono na fig. 1, a widmo węglowe 13C-NMR przedstawiono na fig. 2.Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu o wzorze 2 na drodze enzymatycznej selektywnej dehydrogenacji diosgenonu o wzorze 1, znamienny tym, że prowadzi się enzymatyczną regioselektywną dehydrogenację diosgenonu genetycznie zmodyfikowanymi komórkami Escherichia coli wykazujące ekspresję enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999), albo preparatem enzymatycznym o aktywności KSTD, uzyskanym ze szczepu bakterii Sterolibacterium denitrificans Chol-1S (DSM: 13999), o sekwencji identycznej do Sekwencji 1 lub podobnej do Sekwencji 1 przy identyczność sekwencji aminokwasowej nie mniejszej niż 70%, albo genetycznie zmodyfikowanymi koPL 241 477 B1 mórkami Escherichia coli wykazującymi ekspresję KSTD ze Rhodococcus erythropolis SQ1, albo preparatem enzymatycznym o aktywności KSTD uzyskanym ze szczepu bakterii Rodococcus erythropolis SQ1, o sekwencji identycznej do Sekwencji 2 lub podobnej do Sekwencji 2 przy identyczności sekwencji nie mniejszej niż 70%, w środowisku wodno-organicznym, w obecności reutleniacza, którym jest 2,6-dichloroindofenol, metosiarczan fenazyny lub mieszanina 2,6-dichloroindofenolu i metosiarczanu fenazyny, w temperaturze od 20 do 45°C, a najlepiej w 30°C, w mieszanie reakcyjnej, która zawiera:- bufor zapewniający pH w zakresie 6,5-9,0, wybrany spośród potasowego buforu ortofosforanowego, buforu glicyna - wodorotlenek sodu lub buforu chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanowego,- wodny roztwór solubilizatora, którym jest 2-hydroksypropyl-e-cylkodekstryna w ilości 0-10% (w/v),- rozpuszczalnik organiczny, którym jest 2-metoksyetanol, dioksan lub izopropanol w ilości 1-4% (v/v),- utrzymując biokatalityczną aktywność preparatu enzymatycznego o aktywności KSTD przez okres do 24 godzin, który to proces regioselektywne j dehydrogenacji diosgenonu ma następujący przebieg: do reaktora mieszalnikowego wprowadza się bufor, solubilizator rozpuszczony w wodzie, reutleniacz i diosgenon rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym, po czym inicjuje się reakcję dodając biokatalizator o aktywności KSTD, a po jej zakończeniu wydziela się uzyskany produkt metodą ekstrakcji albo chromatografii.
- 2. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się 2,6-dichloroindofenol o stężeniu w środowisku reakcji przynajmniej 0,15 mM, przy pH 6,5 z zastosowaniem enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans.
- 3. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się metosiarczan fenazyny w zakresie stężeń w środowisku reakcji od 0,8 do 4 mM, przy pH 8,0 z zastosowaniem enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans.
- 4. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się mieszaninę 2,6-dichloroindofenolu i metosiarczanu fenazyny o stężeniach w mieszaninie reakcyjnej równych odpowiednio 0,15 i 0,8 mM, przy pH 9,0 z zastosowaniem enzymu KSTD ze Sterolibacterium denitrificans.
- 5. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się 2,6-dichloroindofenol o stężeniu w środowisku reakcji przynajmniej 0,15 mM, przy pH 8,0 z zastosowaniem enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis.
- 6. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się metosiarczan fenazyny o zakresie stężeń w środowisku reakcji 0,8 do 4 mM, przy pH 8,0 z zastosowaniem enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis.
- 7. Sposób, wg zastrz. 1, znamienny tym, że jako akceptor elektronowy enzymu wykorzystuje się mieszaninę 2,6-dichloroindofenolu i metosiarczanu fenazyny o stężeniach w mieszaninie reakcyjnej równych odpowiednio 0,15 i 0,8 mM, przy pH 9,0 z zastosowaniem enzymu KSTD z Rhodococcus erythropolis.
- 8. Sposób, według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny w środowisku reakcji wynosi od 0 do 10% (v/w), a najlepiej 3-8%.(v/w).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433249A PL241477B1 (pl) | 2020-03-13 | 2020-03-13 | Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL433249A PL241477B1 (pl) | 2020-03-13 | 2020-03-13 | Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL433249A1 PL433249A1 (pl) | 2021-09-20 |
| PL241477B1 true PL241477B1 (pl) | 2022-10-10 |
Family
ID=77746087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL433249A PL241477B1 (pl) | 2020-03-13 | 2020-03-13 | Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL241477B1 (pl) |
-
2020
- 2020-03-13 PL PL433249A patent/PL241477B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL433249A1 (pl) | 2021-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eggert et al. | Enzymatic routes for the synthesis of ursodeoxycholic acid | |
| Zheng et al. | Two-step enzymatic synthesis of ursodeoxycholic acid with a new 7β-hydroxysteroid dehydrogenase from Ruminococcus torques | |
| Pervaiz et al. | Microbial biotransformation: a tool for drug designing | |
| EP3472339B1 (en) | Coupled biotransformation of chenodeoxycholic acid to ursodeoxycholic acid and enzyme mutants applicable in said process | |
| Kollerov et al. | Hydroxylation of lithocholic acid by selected actinobacteria and filamentous fungi | |
| EP3231870B1 (en) | Mutant lacking the hydroxyacyl-coenzyme a dehydrogenase gene and use thereof | |
| TW200806798A (en) | Process for the enantioselective reduction and oxidation, respectively, of steroids | |
| AU2021289329C1 (en) | Genetically modified organisms for the production of steroid derivatives | |
| Fukui et al. | Bioconversion of lipophilic compounds in non-aqueous solvent. Effect of gel hydrophobicity on diverse conversions of testosterone by gel-entrapped Nocardia rhodocrous cells | |
| Sambyal et al. | Production aspects of testosterone by microbial biotransformation and future prospects | |
| Pedrini et al. | Xanthomonas maltophilia CBS 897.97 as a source of new 7β-and 7α-hydroxysteroid dehydrogenases and cholylglycine hydrolase: improved biotransformations of bile acids | |
| JP2017537656A5 (pl) | ||
| Kollerov et al. | Deoxycholic acid transformations catalyzed by selected filamentous fungi | |
| Wojtkiewicz et al. | The efficient Δ1-dehydrogenation of a wide spectrum of 3-ketosteroids in a broad pH range by 3-ketosteroid dehydrogenase from Sterolibacterium denitrificans | |
| Zhao et al. | Production of 5α-androstene-3, 17-dione from phytosterols by co-expression of 5α-reductase and glucose-6-phosphate dehydrogenase in engineered Mycobacterium neoaurum | |
| Tekucheva et al. | Cascade biotransformation of phytosterol to testosterone by Mycolicibacterium neoaurum VKM Ас-1815D and Nocardioides simplex VKM Ас-2033D Strains | |
| Giovannini et al. | 7α-and 12α-Hydroxysteroid dehydrogenases from Acinetobacter calcoaceticus lwoffii: a new integrated chemo-enzymatic route to ursodeoxycholic acid | |
| Karpov et al. | Pregnenolone and progesterone production from natural sterols using recombinant strain of Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 expressing mammalian steroidogenesis system | |
| Mao et al. | Enhancing the sustainability of KsdD as a biocatalyst for steroid transformation by immobilization on epoxy support | |
| Faramarzi et al. | Metabolism of androst-4-en-3, 17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa | |
| Lobastova et al. | Microbiological synthesis of stereoisomeric 7 (α/β)-hydroxytestololactones and 7 (α/β)-hydroxytestolactones | |
| PL241477B1 (pl) | Sposób wytwarzania (25R)-spirosta-1,4-dien-3-onu z diosgenonu | |
| Liu et al. | Mutation breeding of high 4-androstene-3, 17-dione-producing Mycobacterium neoaurum ZADF-4 by atmospheric and room temperature plasma treatment | |
| RU2425052C1 (ru) | Способ получения 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона из андрост-4-ен-3,17-диона, способ получения 6-метиленандроста-1,4-диен-3,17-диона (эксеместана) с использованием полученного 6-метиленандрост-4-ен-3,17-диона | |
| Xu et al. | Single-cell enzymatic cascade synthesis of testolactone enabled by engineering of polycyclic ketone monooxygenase and multi-gene expression fine-tuning |