PL241129B1

PL241129B1 - Strains of bacteriophages specific for bacteria belonging to the Salmonella genus and their use in the production of preparations against pathogenic bacteria

Info

Publication number: PL241129B1
Application number: PL430168A
Authority: PL
Inventors: Marta Kuźmińska-Bajor; Alina Wieliczko
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-06-07
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2022-08-08
Also published as: PL430168A1

Abstract

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do gatunku Salmonella, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00114, F/00115, F/00116, F00117, F/00118. Wynalazek dotyczy także zastosowanie szczepu bakteriofaga, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod wskazanymi numerami, do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych, służących do zwalczania bakterii Salmonella.The invention relates to a new bacteriophage strain specific for bacteria belonging to the Salmonella species, selected from the strains deposited in the Polish Microbiological Collection under the deposit numbers: F / 00114, F / 00115, F / 00116, F00117, F / 00118. The invention also relates to the use of a bacteriophage strain selected from the strains deposited in the Polish Collection of Microorganisms under the numbers indicated, for the production of antibacterial preparations for the control of Salmonella bacteria.

Description

PL 241 129 B1PL 241 129 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku są szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Salmonella, o potencjale technologicznym do wytwarzania preparatów zwalczających bakterie patogenne, zwłaszcza Salmonella enterica ssp. enterica.The subject of the invention is bacteriophage strains specific for bacteria belonging to the genus Salmonella, with technological potential for the production of preparations against pathogenic bacteria, especially Salmonella enterica ssp. Enterica.

Za jedną z głównych przyczyn chorób odzwierzęcych, których źródłem jest żywność, uznawane są bakterie z rodzaju Salmonella (Scientific report of EFSA and ECDC, 2017). Należące do rodziny Enterobacteriaceae pałeczki Salmonella enterica są przyczyną zachorowań ludzi i zwierząt na całym świecie, do których dochodzi najczęściej po spożyciu skażonych produktów żywnościowych, spośród których najważniejszymi obok jaj, są mięso drobiowe i przetwory drobiarskie surowe, bądź poddane niewystarczającej obróbce termicznej [1; 2; 3].Salmonella bacteria are considered to be one of the main causes of food-related zoonoses (Scientific report of EFSA and ECDC, 2017). Salmonella enterica, belonging to the family of Enterobacteriaceae, cause disease in humans and animals all over the world, which most often occurs after the consumption of contaminated food products, the most important of which, apart from eggs, are poultry meat and raw poultry products or products subjected to insufficient thermal treatment [1; 2; 3].

W aspekcie zdrowia publicznego, dodatkowym zagrożeniem jest narastająca oporność szczepów bakteryjnych na różne grupy chemioterapeutyków. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznała lekooporność drobnoustrojów za jedno z największych zagrożeń dla dotychczasowych osiągnięć medycyny oraz dla życia publicznego [4]. Nadużywanie antybiotyków lub ich niewłaściwe stosowanie, zarówno w medycynie ludzkiej jak i weterynarii, jest jedną z głównych przyczyn pojawienia się opornych szczepów. Sytuacja ta stwarza problem w doborze efektywnej terapii antybakteryjnej zarówno u zwierząt, jak i u ludzi. Dodatkowo, szczepy oporne mogą być transmitowane, poprzez żywność pochodzenia zwierzęcego, na ludzi. Warto podkreślić, że w produkcji drobiarskiej oraz medycynie ludzkiej wykorz ystywane są te same grupy chemioterapeutyków (fluorochinolony, tetracykliny, aminoglikozydy), co dodatkowo stwarza zagrożenie dla zdrowia publicznego. Wśród szczepów Salmonella ssp. izolowanych od ludzi i zwierząt odnotowano wysoki odsetek szczepów wieloopornych [5]. Najwyższy odsetek opornych na ciprofloksacynę i kwas nalidyksowy szczepów Salmonella spp., stwierdzono wśród izolatów pochodzących z mięsa kurcząt rzeźnych, odpowiednio 42,6% i 39,7%. Dodatkowo, od kurcząt rzeźnych, niosek towarowych oraz indyków rzeźnych, izolowano szczepy Salmonella enterica i E. coli oporne na kolistynę, lek „ostatniej szansy” stosowany w medycynie ludzkiej w przypadku trudno leczących się infekcji. Zwiększająca się liczba bakteryjnych szczepów opornych stanowi zagrożenie rozprzestrzeniania się tych zarazków i wzrostu infekcji bakteryjnych trudnych do wyleczenia. Powszechność występowania na całym świecie chorób odzwierzęcych powodowanych przez bakterie patogenne, w tym szczepy wielooporne, pochodzących z żywności, wskazuje na istotę poszukiwania alternatywnych metod jej zabezpieczenia, a działania prewencyjne należy wprowadzić już na etapie hodowli zwierząt. Z kolei, niepowodzenia antybiotykoterapii i chemioterapii jako następstwo pojawienia się szczepów bakteryjnych o wysokiej oporności, a nawet szczepów niewrażliwych na stosowane dotąd leki, zmusza do poszukiwań innych metod zapobiegania i leczenia infekcji bakteryjnych. Wśród alternatywnych wobec antybiotyków i chemioterapeutyków sposobów zwalczania tego typu infekcji, w tym zakażeń szczepami wieloopornymi, w medycynie ludzkiej i weterynarii, coraz częściej wymienia się terapię z użyciem bakteriofagów [6; 7].In terms of public health, an additional threat is the growing resistance of bacterial strains to various groups of chemotherapeutic agents. The World Health Organization (WHO) recognized the drug resistance of microorganisms as one of the greatest threats to the achievements of medicine to date and to public life [4]. The overuse of antibiotics or their misuse, both in human and veterinary medicine, is one of the main reasons for the emergence of resistant strains. This situation creates a problem in the selection of effective antibacterial therapy in both animals and humans. Additionally, resistant strains can be transmitted through food of animal origin to humans. It is worth emphasizing that the same groups of chemotherapeutic agents (fluoroquinolones, tetracyclines, aminoglycosides) are used in poultry production and human medicine, which additionally poses a threat to public health. Among the strains of Salmonella ssp. Isolated from humans and animals, a high percentage of multi-resistant strains was noted [5]. The highest percentage of Salmonella spp. Strains resistant to ciprofloxacin and nalidixic acid was found among isolates derived from meat from fattening chickens, 42.6% and 39.7%, respectively. In addition, strains of Salmonella enterica and E. coli resistant to colistin, a "last resort" drug used in human medicine for difficult-to-heal infections, were isolated from chickens for fattening, laying hens and turkeys for fattening. The increasing number of resistant bacterial strains poses a threat of the spread of these germs and the increase in bacterial infections that are difficult to treat. The worldwide prevalence of zoonoses caused by pathogenic bacteria, including multiresistant strains, derived from food indicates the importance of seeking alternative methods of its protection, and preventive measures should be introduced at the stage of animal husbandry. In turn, the failure of antibiotic therapy and chemotherapy as a consequence of the emergence of highly resistant bacterial strains, and even strains insensitive to the drugs used so far, forces us to seek other methods of preventing and treating bacterial infections. Among the methods of combating this type of infection, including infections with multi-resistant strains, alternative to antibiotics and chemotherapeutic agents, in human and veterinary medicine, therapy with the use of bacteriophages is more and more often mentioned [6; 7].

Bakteriofagi (fagi) są wirusami specyficznymi w stosunku do bakterii i używane są do ich zwalczania od momentu odkrycia na początku XX wieku. Niedługo po odkryciu tych bytów biologicznych, bakteriofagi stały się kluczowym środkiem w walce z patogenami. Wynalezienie penicyliny i gwałtowny rozwój antybiotykoterapii sprawiły, że leczenie bakteriofagami zostało prawie całkowicie zastąpione leczeniem z użyciem antybiotyków, szczególnie w zachodniej Europie i Stanach Zjednoczonych. Wobec narastającego problemu lekooporności bakterii i kryzysu antybiotykoterapii, poszukiwanie skutecznych środków przeciwbakteryjnych stało się jednym z głównych obszarów badań współczesnej biotechnologii i medycyny, a jako jedną z najbardziej atrakcyjnych alternatyw do leczenia antybiotykami wskazywana jest terapia bakteriofagami. Bakteriofagi infekują komórkę bakteryjną, namnażają się w niej, a następnie powodują jej rozpad i uwalnianie wirusów potomnych. Co ciekawe, charakteryzują się zdolnością do namnażania tylko w miejscu infekcji, gdzie zlokalizowane są bakterie wrażliwe na konkretnego wirusa. W momencie gdy wszystkie komórki bakteryjne zostaną zainfekowane, cała populacja zostaje wyeliminowana, a wraz z nią wirus, który traci swego gospodarza. Innymi cechami przyczyniającymi się do faktu, że bakteriofagi są doskonałym środkiem do walki z zakażeniami bakteryjnymi, jest niska toksyczność, brak interakcji z komórkami ludzkimi i zwierzęcymi, brak powiązania z opornością na antybiotyki oraz istnienie różnych form aplikacji jako terapeutyków [8]. Bakteriofagi charakteryzują się wysoką specyficznością w stosunku do gospodarza, co w praktyce oznacza, że są zdolne zakażać pojedynczy gatunek bakterii lub nawet serotyp występujący w ramach gatunku [9] i pozostają obojętne dla pozostałej mikroflory.Bacteriophages (phages) are bacteria-specific viruses and have been used to combat them since their discovery in the early 20th century. Shortly after the discovery of these biological entities, bacteriophages became a key agent in the fight against pathogens. The invention of penicillin and the rapid advancement of antibiotic therapy meant that bacteriophage treatment was almost completely replaced by antibiotic treatment, especially in Western Europe and the United States. In view of the growing problem of bacterial drug resistance and the crisis of antibiotic therapy, the search for effective antibacterial agents has become one of the main areas of research in modern biotechnology and medicine, and bacteriophage therapy is indicated as one of the most attractive alternatives to antibiotic treatment. Bacteriophages infect a bacterial cell, multiply in it, and then break it down and release daughter viruses. Interestingly, they are characterized by the ability to multiply only at the site of infection, where bacteria sensitive to a specific virus are located. Once all bacterial cells are infected, the entire population is eliminated, and with it the virus loses its host. Other features contributing to the fact that bacteriophages are an excellent means of fighting bacterial infections are low toxicity, no interaction with human and animal cells, no association with antibiotic resistance, and the existence of various forms of application as therapeutics [8]. Bacteriophages are highly specific for the host, which in practice means that they are capable of infecting a single bacterial species or even a serotype within the species [9] and remain indifferent to the remaining microflora.

PL 241 129 B1PL 241 129 B1

Dostępne dane literaturowe na temat bakteriofagów specyficznych względem pałeczek Salmonella enterica ssp. enterica wskazują na efektywne działanie bakteriofagów w terapii i prewencji zakażeń tymi bakteriami u drobiu [10; 11; 12; z3], gryzoni [14; 15; 16], trzody chlewnej [17], a nawet ludzi [18].The available literature data on bacteriophages specific for Salmonella enterica ssp. Enterica indicate the effective action of bacteriophages in the therapy and prevention of infections with these bacteria in poultry [10; 11; 12; z3], rodents [14; 15; 16], pigs [17] and even humans [18].

Celem wynalazku było uzyskanie preparatów fagowych, które mogłyby być skutecznie wykorzystane do zapobiegania zakażeniom bakteryjnym jak i w leczeniu infekcji powodowanych przez pałeczki Salmonella, zarówno u ludzi jak i u zwierząt.The aim of the invention was to obtain phage preparations that could be effectively used for the prevention of bacterial infections as well as the treatment of infections caused by Salmonella, both in humans and in animals.

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofagowego specyficznego wobec bakterii należących do rodzaju Salmonella, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00114, F/00115, F/00116, F/00117.The invention relates to a new bacteriophage strain specific for bacteria belonging to the genus Salmonella, selected from the strains deposited in the Polish Microbiological Collection under the deposit numbers: F / 00114, F / 00115, F / 00116, F / 00117.

Istotą wynalazku jest również szczep bakteriofaga, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00114, F/00115, F/00116, F/00117, do zastosowania jako preparat przeciwbakteryjny, służących do zwalczania bakterii Salmonella, korzystnie należących do gatunku Salmonella enterica, zwłaszcza podgatunku Salmonella enterica ssp. enterica.The essence of the invention is also a bacteriophage strain selected from the strains deposited in the Polish Collection of Microorganisms under deposit numbers: F / 00114, F / 00115, F / 00116, F / 00117, for use as an antibacterial preparation used to combat Salmonella bacteria, preferably belonging to Salmonella enterica species, especially the subspecies Salmonella enterica ssp. enterica.

Korzystnie jest, gdy do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych wykorzystuje się całe wiriony bakteriofaga wirulentnego w preparatach zawierających jednego faga, jak i w postaci mieszaniny, w skład której może wchodzić kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów.Preferably, for the production of antibacterial preparations, whole virions of a virulent bacteriophage are used in preparations containing one phage, as well as in the form of a mixture which may include several or a dozen active bacteriophages.

Dodatkowo wynalazek dotyczy wykorzystania oczyszczonych fagowych białek, strukturalnych, jak i enzymatycznych, zwłaszcza enzymów litycznych w postaci lizozymu albo endolizyny, albo egzopolisacharydazy.Additionally, the invention relates to the use of purified phage proteins, both structural and enzymatic, especially lytic enzymes in the form of lysozyme or endolysin or exopolysaccharidase.

Korzystnie jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do leczenia zakażeń wywołanych przez pałeczki Salmonella.Preferably, the antibacterial preparations are preparations for the treatment of infections caused by Salmonella.

Korzystnie także jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do zapobiegania zakażeniom wywołanym przez pałeczki Salmonella.It is also preferred that the antibacterial preparations are preparations for the prevention of Salmonella infections.

Korzystnie również jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do eliminowania pałeczek Salmonella z powierzchni biotycznych albo abiotycznych.It is also preferred that the antimicrobial preparations are preparations for the elimination of Salmonella from biotic or abiotic surfaces.

Istota wynalazku została zilustrowana poniższymi przykładami wykonania:The essence of the invention is illustrated by the following embodiments:

P r z y k ł a d 1: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr/S1Example 1: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr / S1

Bakteriofag wirulentny był izolowany ze ścieków z oczyszczalni w Bolesławcu. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Salmonella enterica ssp. enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A41 prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygoto wano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą Salmonella Enteritidis A41 i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli Salmonella Enteritidis A41 i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie. W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Salmonella enterica ssp. enterica, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 66 przebadanych szczepów Salmonella enterica ssp. enterica, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 40 szczepów, w tym 28 szczepów należących do serowaru Salmonella Enteritidis, 11 Salmonella Gallinarum i 1 Salmonella Senftenberg.The virulent bacteriophage was isolated from the sewage from the treatment plant in Bolesławiec. Bacteriophages were isolated directly from the liquid environmental test, which was filtered using a filter with a pore diameter of 0.22 µm, and then analyzed in the spot on test. For this purpose, an 18-hour bacterial culture of the Salmonella enterica ssp. Enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A41 strain, carried out in 5 ml of LB medium, was spread over the surface of a Petri dish with solidified LB medium and allowed to dry the surface. Simultaneously, a series of decimal dilutions of the environmental sample filtrate were prepared and spotted onto the surface of a Petri dish with a Salmonella Enteritidis A41 culture and incubated for a further 18 hours at 37 ° C. After obtaining a positive result, i.e. complete lysis of the bacteria at the site of the filtrate spotting and its dilutions, or the presence of single bacteriophage plaques on the bacterial grass, a pure bacteriophage strain was derived from a single plaque, which was collected with a sterile needle. The needle was placed in 1 ml of LB medium and incubated for 10 minutes with gentle shaking. The sample was then added to 5 ml of a 5-hour culture of Salmonella Enteritidis A41 and incubated for 18 hours at 37 ° C with 180 rpm shaking, centrifuged and filtered through a 0.22 µm filter. The filtrate obtained in this way was used for the subsequent phage isolation from a single plaque. Reinsulation was repeated 4 times. In order to characterize the phage, its lytic spectrum was determined against selected isolates of Salmonella enterica ssp. Enterica from the strain collection of the Department of Epizootiology with the Department of Birds and Exotic Animals, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Wrocław. The susceptibility of bacteria to phage was analyzed in the drop test. Of the 66 tested strains of Salmonella enterica ssp. Enterica, positive lytic reactions were observed for 40 strains, including 28 strains belonging to the Salmonella Enteritidis serovar, 11 Salmonella Gallinarum and 1 Salmonella Senftenberg.

Szczep bakteriofaga UPWr/S1 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00114.The bacteriophage strain UPWr / S1 was deposited on May 31, 2019 at the Polish Microbiological Collection, which has the status of an international deposit center for patent purposes. The deposit was given the number F / 00114.

P r z y k ł a d 2: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr/S3Example 2: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr / S3

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z Wrocławskiej Oczyszczalni ścieków Janówek. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciuA virulent bacteriophage isolated from sewage from the Janówek Sewage Treatment Plant in Wrocław. The bacteriophage was isolated directly from the environmental liquid sample which was filtered using

PL 241 129 B1 filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Salmonella enterica ssp. enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A28 prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą Salmonella Enteritidis A28 i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli Salmonella Enteritidis A28 i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.0.22 Pm filter was then analyzed in the spot on test. For this purpose, an 18-hour bacterial culture of the Salmonella enterica ssp. Enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A28 strain, carried out in 5 ml of LB medium, was spread over the surface of a Petri dish with solidified LB medium and allowed to dry the surface. Simultaneously, a series of decimal dilutions of the environmental sample filtrate were prepared and spotted onto the surface of a Petri dish with a Salmonella Enteritidis A28 culture and incubated for a further 18 hours at 37 ° C. After obtaining a positive result, i.e. complete lysis of the bacteria at the site of the filtrate spotting and its dilutions, or the presence of single bacteriophage plaques on the bacterial grass, a pure bacteriophage strain was derived from a single plaque, which was collected with a sterile needle. The needle was placed in 1 ml of LB medium and incubated for 10 minutes with gentle shaking. The sample was then added to 5 ml of a 5-hour culture of Salmonella Enteritidis A28 and incubated for 18 hours at 37 ° C with 180 rpm shaking, centrifuged and filtered using a 0.22 µm filter. The filtrate obtained in this way was used for the subsequent phage isolation from a single plaque. Reinsulation was repeated 4 times.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Salmonella enterica ssp. enterica, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 66 przebadanych szczepów Salmonella enterica ssp. enterica, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 52 szczepów, w tym 31 szczepów należących do serowaru Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, 8 Salmonella Typhimurium, 1 Salmonella Stanley, 1 Salmonella Chester i 1 Salmonella Senftenberg.In order to characterize the phage, its lytic spectrum was determined against selected isolates of Salmonella enterica ssp. Enterica from the strain collection of the Department of Epizootiology with the Department of Birds and Exotic Animals, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Wrocław. The susceptibility of bacteria to phage was analyzed in the drop test. Of the 66 tested strains of Salmonella enterica ssp. Enterica, positive lytic reactions were observed for 52 strains, including 31 strains belonging to Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, 8 Salmonella Typhimurium, 1 Salmonella Stanley, 1 Salmonella Chester and 1 Salmonella Senftenberg.

Szczep bakteriofaga UPWr/S3 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00115.The bacteriophage strain UPWr / S3 was deposited on May 31, 2019 at the Polish Microbiological Collection, which has the status of an international deposit center for patent purposes. The deposit was given the number F / 00115.

P r z y k ł a d 3: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr/S4Example 3: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr / S4

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z Wrocławskiej Oczyszczalni ścieków Janówek. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Salmonella enterica ssp. enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A28 prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą Salmonella Enteritidis A28 i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli Salmonella Enteritidis A28 i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.A virulent bacteriophage isolated from sewage from the Janówek Sewage Treatment Plant in Wrocław. Bacteriophages were isolated directly from the liquid environmental test, which was filtered using a filter with a pore diameter of 0.22 µm, and then analyzed in the spot on test. For this purpose, an 18-hour bacterial culture of the Salmonella enterica ssp. Enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A28 strain, carried out in 5 ml of LB medium, was spread over the surface of a Petri dish with solidified LB medium and allowed to dry the surface. Simultaneously, a series of decimal dilutions of the environmental sample filtrate were prepared and spotted onto the surface of a Petri dish with a Salmonella Enteritidis A28 culture and incubated for a further 18 hours at 37 ° C. After obtaining a positive result, i.e. complete lysis of the bacteria at the site of the filtrate spotting and its dilutions, or the presence of single bacteriophage plaques on the bacterial grass, a pure bacteriophage strain was derived from a single plaque, which was collected with a sterile needle. The needle was placed in 1 ml of LB medium and incubated for 10 minutes with gentle shaking. The sample was then added to 5 ml of a 5-hour culture of Salmonella Enteritidis A28 and incubated for 18 hours at 37 ° C with 180 rpm shaking, centrifuged and filtered using a 0.22 µm filter. The filtrate obtained in this way was used for the subsequent phage isolation from a single plaque. Reinsulation was repeated 4 times.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Salmonella enterica ssp. enterica, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 66 przebadanych szczepów Salmonella enterica ssp. enterica, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 34 szczepów, w tym 23 szczepów należących do serowaru Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, i 1 Salmonella Senftenberg.In order to characterize the phage, its lytic spectrum was determined against selected isolates of Salmonella enterica ssp. Enterica from the strain collection of the Department of Epizootiology with the Department of Birds and Exotic Animals, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Wrocław. The susceptibility of bacteria to phage was analyzed in the drop test. Of the 66 tested strains of Salmonella enterica ssp. Enterica, positive lytic reactions were observed for 34 strains, including 23 strains belonging to the Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, and 1 Salmonella Senftenberg serovars.

Szczep bakteriofaga UPWr/S4 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00116.The bacteriophage strain UPWr / S4 was deposited on May 31, 2019 at the Polish Microbiological Collection, which has the status of an international depository center for patent purposes. The deposit was given the number F / 00116.

P r z y k ł a d 4: Fag Salmonella enterica ssp. enterica UPWr/S5Example 4: Salmonella enterica ssp. Enterica UPWr / S5 phag

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z Wrocławskiej Oczyszczalni ścieków Janówek. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tymA virulent bacteriophage isolated from sewage from the Janówek Sewage Treatment Plant in Wrocław. Bacteriophages were isolated directly from the liquid environmental test, which was filtered using a filter with a pore diameter of 0.22 µm, and then analyzed in the spot on test. Including

PL 241 129 B1 celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Salmonella enterica ssp. enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A36 prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą Salmonella Enteritidis A36 i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli Salmonella Enteritidis A36 i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.For the purpose, an 18-hour bacterial culture of the strain Salmonella enterica ssp. Enterica serowar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) A36, carried out in 5 ml of LB medium, was spread over the surface of a petri dish with solidified LB medium and allowed to dry the surface. Simultaneously, a series of decimal dilutions of the environmental sample filtrate were prepared and spotted onto the surface of a Petri dish with a Salmonella Enteritidis A36 culture and incubated for a further 18 hours at 37 ° C. After obtaining a positive result, i.e. complete lysis of the bacteria at the site of the filtrate spotting and its dilutions, or the presence of single bacteriophage plaques on the bacterial grass, a pure bacteriophage strain was derived from a single plaque, which was collected with a sterile needle. The needle was placed in 1 ml of LB medium and incubated for 10 minutes with gentle shaking. The sample was then added to 5 ml of a 5-hour culture of Salmonella Enteritidis A36 and incubated for 18 hours at 37 ° C with 180 rpm shaking, centrifuged and filtered using a 0.22 µm filter. The filtrate obtained in this way was used for the subsequent phage isolation from a single plaque. Reinsulation was repeated 4 times.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Salmonella enterica ssp. enterica, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 66 przebadanych szczepów Salmonella enterica ssp. enterica, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 36 szczepów, w tym 25 szczepów należących do serowaru Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, i 1 Salmonella Senftenberg.In order to characterize the phage, its lytic spectrum was determined against selected isolates of Salmonella enterica ssp. Enterica from the strain collection of the Department of Epizootiology with the Department of Birds and Exotic Animals, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Wrocław. The susceptibility of bacteria to phage was analyzed in the drop test. Of the 66 tested strains of Salmonella enterica ssp. Enterica, positive lytic reactions were observed for 36 strains, including 25 strains belonging to the Salmonella Enteritidis, 10 Salmonella Gallinarum, and 1 Salmonella Senftenberg serovars.

Szczep bakteriofaga UPWr/S5 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00117.The bacteriophage strain UPWr / S5 was deposited on May 31, 2019 in the Polish Microbiological Collection, which has the status of an international deposit center for patent purposes. The deposit was given the number F / 00117.

Literatura:Literature:

1. Corry JEL, Atabay HI. 2001. Poultry as a source of Campylobacter and related organisms. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Ser. 96S-114S. Washington D.C. ASM Press; 2 2000:121-138.1. Corry JEL, Atabay HI. 2001. Poultry as a source of Campylobacter and related organisms. Soc. Appl. Bacteriol. Symp. Cheese. 96S-114S. Washington D.C. ASM Press; 2000: 121-138.

2. Hald T, Vose D, Wegener HC, Koupeev T. 2004. A Bayesian approach to quantify the contribution of animal-food sources to human salmonellosis. Risk Anal. 24, 255-269.2. Hald T, Vose D, Wegener HC, Koupeev T. 2004. A Bayesian approach to quantify the contribution of animal-food sources to human salmonellosis. Risk Anal. 24, 255-269.

3. Schlundt J, Toyofuku H, Jansen J, Herbst SA.. 2004. Emerging food-borne zoonoses. Rev. Sci. Technol. 23, 513-533.3. Schlundt J, Toyofuku H, Jansen J, Herbst SA .. 2004. Emerging food-borne zoonoses. Rev. Sci. Technol. 23, 513-533.

4. Wold Health Organization. 2014. Antimicrobial Resistance: Global Report on surveillance.4. Wold Health Organization. 2014. Antimicrobial Resistance: Global Report on surveillance.

5. EFSA: 2018. Scientific report: The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016.5. EFSA: 2018. Scientific report: The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016.

6. Thiel K. 2004. Old dogma, new tricks--21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. Jan; 22(1): 31-6.6. Thiel K. 2004. Old dogma, new tricks - 21st Century phage therapy. Nat Biotechnol. Jan; 22 (1): 31-6.

7. Dixon B. 2004. New dawn for phage therapy. Lancet Infect Dis. Mar; 4(3): 186.7. Dixon B. 2004. New dawn for phage therapy. Lancet Infect Dis. Mar; 4 (3): 186.

8. Loc-Carrillo C., Abedon ST. 2011. Pros and Cons of Phage Therapy. Bacteriophage 1:8. Loc-Carrillo C., Abedon ST. 2011. Pros and Cons of Phage Therapy. Bacteriophage 1:

111-114.111-114.

9. Ackermann HW, Audurier A, Berthiaume L., Jones LA, Mayo JA, Vidaver AK. 1978. Guidelines for bacteriophage characterization. Adv. Virus Res. 23, 1-24.9. Ackermann HW, Audurier A, Berthiaume L., Jones LA, Mayo JA, Vidaver AK. 1978. Guidelines for bacteriophage characterization. Adv. Virus Res. 23, 1-24.

10. Nabil NM, Tawakol MM, Hassan HM. 2018. Assessing the impact of bacteriophages in the treatment of Salmonella in broiler chickens. Infection Ecology & Epidemiology, vol. 8, 1539056.10. Nabil NM, Tawakol MM, Hassan HM. 2018. Assessing the impact of bacteriophages in the treatment of Salmonella in broiler chickens. Infection Ecology & Epidemiology, vol. 8, 1539056.

11. Atterbury R, Van Bergen M, Ortiz F, Lovell MA, Harris JA, Boer AD, Wagenaar JA, Allen VM, Barrow PA. 2007. Bacteriophage therapy to reduce Salmonella colonization of broiler chickens, Appl Environ Microbiol, vol. 73 (pg. 4543-9).11. Atterbury R, Van Bergen M, Ortiz F, Lovell MA, Harris JA, Boer AD, Wagenaar JA, Allen VM, Barrow PA. 2007. Bacteriophage therapy to reduce Salmonella colonization of broiler chickens, Appl Environ Microbiol, vol. 73 (pg. 4543-9).

12. Bardina C, Spricigo DA, Liagostera M. 2012. Significance of the bacteriophagy treatment Schedule In reducing Salmonella colonization of poultry. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6600-6607.12. Bardina C, Spricigo DA, Liagostera M. 2012. Significance of the bacteriophagy treatment Schedule In reducing Salmonella colonization of poultry. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6600-6607.

13. Sillankorva SM, Oliverira H, Azeredo J. 2012. Bacteriophages and their role in food safety. Int. J. Microbiol. 2012: 863945.13. Sillankorva SM, Oliverira H, Azeredo J. 2012. Bacteriophages and their role in food safety. Int. J. Microbiol. 2012: 863945.

14. Nikkhahi F, Dallai MMs, Alimohammadi M, Foroushani AR, Rajabi Z, Fardsanei F, Imeni FM, Bonab PT. 2017. Phage therapy: assessment of the efficacy of a bacteriophage14. Nikkhahi F, Dallai MMs, Alimohammadi M, Foroushani AR, Rajabi Z, Fardsanei F, Imeni FM, Bonab PT. 2017. Phage therapy: assessment of the efficacy of a bacteriophage

Claims

Isolated in the treatment of salmonellosis induced by Salmonella enteritidis in mice. Gastroenterol Hepatol Bed Bench 10 (2): 131-136.

15. Tang F, Zhang P, Zhang Q, Xue F, Ren J, Sun J, Qu Z, Zhuge X, Li D, Wang J, Jiang M, Dai J. 2018. Isolation and characterization of a broad-spectrum phage of multiple drug resistant Salmonella and its therapeutic utility in mice. Microb Pathog. 2019 Jan; 126: 193-198.

16. Naughton PJ, Grant G, Spencer RJ, Bardocz S, Pusztai A. 1996. A rat model of infection by Salmonella typhimurium or Salmonella enteritidis. Journal of Applied Bacteriology 81, 651 656.

17. Wall SK, Zhang J, Rostagno MH, Ebner P. 2010. D. Phage therapy to reduce preprocessing Salmonella infections in market-weight swine. Appl. Environ. Microbiol. 76, 48-53.

18. Abedon ST. 2011. Lysis from without. Bacteriophage 1: 1-4.

Patent claims

1. A bacteriophage strain specific for bacteria belonging to the genus Salmonella, selected from the strains deposited in the Polish Microbial Collection under the deposit numbers: F / 00114, F / 00115, F / 00116, F / 00117.

2. A bacteriophage strain selected from the strains deposited in the Polish Microbiological Collection under the deposit numbers: F / 00114, F / 00115, F / 00116, F / 00117, for use as an antibacterial preparation for the control of Salmonella bacteria.

3. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The method of claim 2, characterized in that the bacteria to be controlled belong to the species Salmonella enterica.

4. The bacteriophage strain for use according to claim 1 Enterica as claimed in claim 3, characterized in that the bacteria to be controlled belong to the subspecies Salmonella enterica ssp. Enterica.

5. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The process of claim 2, wherein the whole virions of the virulent bacteriophage in the single-phage preparations are used for the preparation of the antibacterial preparations.

6. The bacteriophage strain for use according to claim 1 A cocktail according to claim 2, characterized in that a cocktail containing several or a dozen active bacteriophages is used for the production of antibacterial preparations.

7. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The method of claim 2, characterized in that purified phage structural and enzymatic proteins are used for the production of antibacterial preparations, especially lytic enzymes in the form of lysozyme or endolysin or exopolysaccharidase.

8. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The method of claim 2, characterized in that the antibacterial preparations are preparations for the treatment of infections caused by Salmonella.

9. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The method of claim 2, characterized in that the antibacterial preparations are preparations for the prevention of infections caused by Salmonella.

10. The bacteriophage strain for use according to claim 1 The method of claim 2, characterized in that the antibacterial preparations are preparations for the elimination of Salmonella from biotic or abiotic surfaces.