PL240748B1

PL240748B1 - Magnetic-hydrodynamic microfluidic platform, method of its production and method of artificial tissue culture in a magnetic micropole

Info

Publication number: PL240748B1
Application number: PL429859A
Authority: PL
Inventors: Roman SZAFRAN; Urszula LEWANDOWSKA; Jakub FICHNA
Original assignee: Politechnika Wroclawska; Univ Medyczny W Lodzi
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-05-30
Also published as: PL429859A1

Description

PL 240 748 B1PL 240 748 B1

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna stanowiąca zespół wymiennego czipa mikrofluidalnego jednorazowego użytku do prowadzenia trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych i badań z ich wykorzystaniem, w zadanych warunkach hydrodynamicznych oraz urządzenia wytwarzającego mikropole magnetyczne (tzw. generatora mikropola magnetycznego) o zadanych właściwościach, a w szczególności zadanym rozkładzie natężenia pola magnetycznego. Przedmiotem wynalazku jest również szybki i bezpośredni sposób wytwarzania magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej opartej na prefabrykowanych elementach i ich laserowej modyfikacji, jak również sposób prowadzenia hodowli sztucznych tkanek w stałym polu magnetycznym z wykorzystaniem magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej.The subject of the invention is a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform, which is a set of replaceable, disposable microfluidic chip for conducting three-dimensional (3D) cell cultures and research with their use, under given hydrodynamic conditions, and a device generating magnetic micropfields (the so-called magnetic micropfield generator) with given properties, and in in particular, the given distribution of the magnetic field strength. The subject of the invention is also a quick and direct method of producing a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform based on prefabricated elements and their laser modification, as well as a method of culturing artificial tissues in a constant magnetic field with the use of a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform.

Magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna znajduje zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii i inżynierii biomedycznej do hodowli organów i guzów nowotworowych na czipach mikrofluidalnych tzw. bioczipach mikroprzepływowych (ang. tumor-on-a-chip, organ-on-a-chip) znajdujących potencjalne zastosowanie w badaniach podstawowych mechanizmów różnicowania komórek oraz sposobów sygnalizacji międzykomórkowej, badaniach odpowiedzi tkanek na stymulacje i uszkodzenia o podłożu fizycznym, chemicznym i biologicznym, diagnostyce, rokowaniu i leczeniu chorób, w szczególności chorób nowotworowych - w tzw. medycynie spersonalizowanej (metody celowane) oraz na różnych etapach badań nowych substancji terapeutycznych, jak również w badaniach toksycznego wpływu związków chemicznych na tkanki i organy człowieka. Platforma umożliwia hodowlę przestrzenną spersonalizowanych zmian nowotworowych z wykorzystaniem komórek pobranych od pacjenta i tworzenie modeli zmian nowotworowych umożliwiających dobór optymalnych metod leczenia, w tym metod skojarzonych dla nowotworów odpornych na radiację i chemioterapię np. celowanego leku przeciwnowotworowego, napromieniowania i immunoterapii.The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform is used in biology, medicine, pharmacy, biotechnology and biomedical engineering for the cultivation of organs and tumors on microfluidic chips, the so-called microfluidic biochips (tumor-on-a-chip, organ-on-a-chip) with potential application in the study of basic mechanisms of cell differentiation and methods of intercellular signaling, studies of tissue response to stimulation and damage on a physical, chemical and biological basis, diagnosis, prognosis and treatment of diseases, in particular neoplastic diseases - in the so-called personalized medicine (targeted methods) and at various stages of research into new therapeutic substances, as well as in studies of the toxic effects of chemical compounds on human tissues and organs. The platform enables spatial cultivation of personalized neoplastic lesions with the use of cells collected from the patient and the creation of models of neoplastic lesions enabling the selection of optimal treatment methods, including combined methods for cancers resistant to radiation and chemotherapy, e.g. targeted anti-cancer drug, radiation and immunotherapy.

Inżynieria sztucznych tkanek jest ugruntowaną dziedziną nauki, dającą nadzieję na rozwiązanie problemów pacjentów cierpiących z powodu nieodwracalnych uszkodzeń narządów będących następstwem chorób, urazów oraz ich degeneracji (Robert Langer, Joseph P Vacanti, (1993) Tissue Engineering, Science, New Series, Vol. 260, No. 5110: 920-926). Istnieje wiele metod hodowli trójwymiarowych struktur komórkowych, wykorzystujących naturalne lub syntetyczne hydrożele, syntetyczne porowate rusztowania oraz zawiesinowe hodowle sferoid i klastrów komórkowych. Rusztowania pełnią rolę syntetycznej macierzy zewnątrzkomórkowej i umożliwiają przestrzenną organizację komórek oraz odpowiadają za dostarczanie bodźców fizykochemicznych stymulujących podziały i wzrost komórek w ich obrębie. Metody te są jednak kosztowne, pracochłonne i złożone, przez co ich rutynowe wykorzystanie w diagnostyce medycznej jest niemożliwe. Kolejnym problemem w hodowli tkanek naśladujących struktury in-vivo jest prowadzenie zwartej kohodowli komórek różnych rodzajów w zadany, uporządkowany sposób. Wytwarzanie sztucznych, unaczynionych tkanek i organów o złożonej strukturze np. serca czy wątroby jest wciąż wyzwaniem pomimo rozwoju technik druku 3D, z uwagi na brak efektywnej technologii umożliwiającej kontrolę położenia komórek w przestrzeni, a przez to formowania funkcjonalnych struktur komórkowych wyższego poziomu w ich obrębie, w szczególności naczyń krwionośnych. (Miranda D. Grounds, Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances, Clin Exp Pharmacol Physiol 2018 Apr, 45(4):390-400). G.R. Suza wykorzystał hydrożel zawierający nanocząstki o właściwościach magnetycznych, nanocząstki złota do hodowli lewitujących w polu magnetycznym sferoid komórkowych zawieszonych pod górną powierzchnią medium hodowlanego na szalce Periego. (Souza, GR. et al, Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation, Nature Nanotechnology, 5, 4, (Apr 2010), 297-301). Z kolei W. L. Haisler rozwiną powyższą metodę opracowując protokół hodowli lewitujących klastrów komórkowych na płytce wielodołkowej, wykorzystujący nanocząstki żelaza połączone bezpośrednio z komórkami oraz pole magnetyczne. Nie zaobserwowano negatywnego wpływu pola magnetycznego o niskim natężeniu (30-500 G) na proliferację i metabolizm komórkowy, natomiast obecność zespalających komórki sił magnetycznych przyczyniła się do formowania zwartych, stabilnych struktur komórkowych. (WL. Haisler et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation, Nature Protocols, 8, 10, (Oct 2013), 1940-9). Powyższe metody umożliwiają kohodowlę klastrów lub sferoid komórkowych o niezróżnicowanej budowie i nieunaczynionych w warunkach stacjonarnych z wykorzystaniem linii komórkowych lub komórek pierwotnych, jednak bez wpływu na morfologiczną budowę tkanki. Wykorzystanie komórek macierzystych w hodowli lewitujących sferoid pozwoliło na uzyskanie zróżnicowanych struktur komórkowych, tzw. organoidów komórArtificial tissue engineering is a well-established field of science with hope for solutions to the problems of patients suffering from irreversible organ damage resulting from disease, trauma and degeneration (Robert Langer, Joseph P Vacanti, (1993) Tissue Engineering, Science, New Series, Vol. 260 , No. 5110: 920-926). There are many methods of culturing three-dimensional cell structures using natural or synthetic hydrogels, synthetic porous scaffolds, and suspension cultures of spheroids and cell clusters. The scaffolds play the role of a synthetic extracellular matrix and enable the spatial organization of cells and are responsible for the delivery of physicochemical stimuli stimulating the division and growth of cells within them. However, these methods are costly, labor-intensive and complex, making their routine use in medical diagnostics impossible. Another problem in the in-vivo mimicking tissue culture is the dense co-culture of cells of various types in a given, orderly manner. The production of artificial, vascularized tissues and organs with a complex structure, e.g. the heart or the liver, is still a challenge despite the development of 3D printing techniques, due to the lack of an effective technology enabling the control of the location of cells in space, and thus the formation of functional cellular structures of a higher level within them, especially blood vessels. (Miranda D. Grounds, Obstacles and challenges for tissue engineering and regenerative medicine: Australian nuances, Clin Exp Pharmacol Physiol 2018 Apr, 45 (4): 390-400). G.R. Suza used a hydrogel containing nanoparticles with magnetic properties, gold nanoparticles to cultivate magnetic levitating cell spheroids suspended under the upper surface of the culture medium in a Peri dish. (Souza, GR. Et al, Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation, Nature Nanotechnology, 5, 4, (Apr 2010), 297-301). In turn, W. L. Haisler will develop the above method by developing a protocol for the cultivation of levitating cell clusters on a multi-well plate, using iron nanoparticles directly connected to cells and a magnetic field. No negative influence of the low intensity magnetic field (30-500 G) on cell proliferation and metabolism was observed, while the presence of magnetic forces binding cells contributed to the formation of compact, stable cell structures. (WL. Haisler et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation, Nature Protocols, 8, 10, (Oct 2013), 1940-9). The above methods make it possible to co-culture clusters or cell spheroids of undifferentiated structure and non-vascularized conditions in stationary conditions using cell lines or primary cells, but without affecting the morphological structure of the tissue. The use of stem cells in the culture of levitating spheroids allowed for obtaining differentiated cell structures, the so-called ventricular organoids

PL 240 748 B1 kowych (Alexes C. Daquinag, Adipose Tissue Engineering in Three-Dimensional Levitation Tissue Culture System Based on Magnetic Nanoparticles, Tissue Engineering Part C: Methods, 19, 5, 2013). Kolejny problem stanowi automatyzacja i standaryzacja metod hodowli, która wymagana jest w procedurach medycznych, a która warunkuje powtarzalność wyników i redukcję kosztów jednostkowych badań diagnostycznych.PL 240 748 B1 (Alexes C. Daquinag, Adipose Tissue Engineering in Three-Dimensional Levitation Tissue Culture System Based on Magnetic Nanoparticles, Tissue Engineering Part C: Methods, 19, 5, 2013). Another problem is the automation and standardization of breeding methods, which is required in medical procedures, and which determines the repeatability of results and reduction of unit costs of diagnostic tests.

Hodowle w mikroskali zapewniają lepszą, precyzyjną kontrolę warunków rozwoju komórek i wzajemnej ich interakcji, co pozwala na ich standaryzację i automatyzację, a przede wszystkim prowadzenie hodowli w warunkach przepływowych, w układzie dynamicznym - wiernie naśladującym zjawiska in vivo, co w istotny sposób wpływa na morfologię komórek. Mikrofluidalne układy do hodowli tkankowych dają możliwość ograniczenia wykorzystania modeli zwierzęcych w badaniach nowych leków oraz przyspieszenia badań przedklinicznych z uwagi na wysoką powtarzalność wyników i zgodność sztucznych tkanek z materiałem genetycznym człowieka. Mikrosystemy te nie tylko w lepszy sposób naśladują trójwymiarową mikroarchitekturę tkanek niż hodowle klasyczne, ale są w stanie oddać specyficzne dla danej tkanki warunki fizyczne np. ich pracę mechaniczną. Ponadto ograniczają zużycie reagentów oraz materiału biologicznego pozwalają na wyprowadzenie hodowli z niewielkiej liczby komórek w krótkim czasie. (Low, L. A., Tagle, D. A., Tissue chips - innovative tools for drug development and disease modeling, Lab Chip, 2017, 17, 3026-3036). Tym niemniej, obecnie wykorzystywane układy mikrofluidalne do hodowli komórkowych są w stanie formować (modelować) jedynie nieunaczynione tkanki o prostej budowie morfologicznej lub proste kanały opłaszczone komórkami śródbłonka - tzw. modele naczyń krwionośnych, (TakashiMiura, Ryuji Yokokawa, Tissue culture on a chip: Developmentalbiology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices, Develop. Growth Differ. (2016) 58, 505-515).Microscale cultures provide better, precise control of the conditions of cell development and their mutual interaction, which allows their standardization and automation, and above all, conducting culture under flow conditions, in a dynamic system - faithfully imitating in vivo phenomena, which significantly affects the morphology cells. Microfluidic systems for tissue culture make it possible to limit the use of animal models in the research of new drugs and to speed up preclinical research due to the high reproducibility of the results and the compatibility of artificial tissues with human genetic material. These microsystems not only better imitate the three-dimensional microarchitecture of tissues than classical cultures, but are also able to reflect the specific physical conditions for a given tissue, e.g. their mechanical work. In addition, they reduce the consumption of reagents and biological material, and allow the emergence of cultures from a small number of cells in a short time. (Low, L. A., Tagle, D. A., Tissue chips - innovative tools for drug development and disease modeling, Lab Chip, 2017, 17, 3026-3036). Nevertheless, the currently used microfluidic systems for cell culture are able to form (model) only non-vascular tissues with a simple morphological structure or simple channels coated with endothelial cells - the so-called blood vessel models, (TakashiMiura, Ryuji Yokokawa, Tissue culture on a chip: Developmentalbiology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices, Develop. Growth Differ. (2016) 58, 505-515).

Do wytwarzania urządzeń mikrofluidalnych wykorzystywanych jest obecnie szereg metod, do najważniejszych należą: fotolitografia miękka z wykorzystaniem PDMS, formowanie wtryskowe tworzyw sztucznych, fabrykacja na bazie materiałów celulozowych, grawerowanie laserowe oraz druk 3D. Formowanie wtryskowe jest stosowane do produkcji wielkoseryjnej urządzeń mikrofluidalnych o powtarzalnych parametrach, wysokiej jakości oraz niskich kosztach jednostkowych produkcji. Ze względu na wysokie koszty inwestycyjne wtryskarek oraz form wtryskowych metoda ta nie jest stosowana do wytwarzania urządzeń prototypowych i produkcji krótkoseryjnej. Fabrykacja na bazie materiałów celulozowych ma zastosowanie jedynie do produkcji prostych urządzeń mikrofluidalnych o ograniczonej funkcjonalności. Litografia miękka pozwala na wytwarzanie złożonych mikroukładów z elementami automatyki przepływu (zawory, pompy itp.), jednak jest pracochłonna wieloetapowa, kosztowna i nie daje możliwości automatyzacji procesu wytwórczego. W odróżnieniu od powyższych metod grawerowanie laserowe oraz drukowanie 3D są jedynymi metodami wytwórczymi, dla których proces projektowania i wytwarzania jest w pełni zdigitalizowany i zautomatyzowany, co pozwala na wytwarzanie prototypowych egzemplarzy urządzeń o zindywidualizowanej konstrukcji w prosty i automatyczny sposób. Drukowanie 3D ze względu na ograniczoną precyzję i jakość uzyskiwanych powierzchni oraz ograniczoną gamę biokompatybilnych materiałów o dobrych właściwościach optycznych ma ograniczone zastosowanie w produkcji urządzeń diagnostycznych i bioczipów. (N. Bhattachaijee, A. Urrios, S. Kanga and A. Folch, The upcoming 3D-printing revolution in microfluidics. Lab Chip, 2016, 16, 1720). Metody laserowe umożliwiają z kolei wykorzystanie w procesie wytwórczym certyfikowanych do zastosowań medycznych, biokompatybilnych, powszechnie dostępnych, tanich prefabrykowanych metodą wtryskową elementów i materiałów o powtarzalnych, doskonałych właściwościach optycznych i dobrej przenikalności magnetycznej oraz wysokiej jakości powierzchni.A number of methods are currently used for the production of microfluidic devices, the most important of which are: soft photolithography with the use of PDMS, injection molding of plastics, fabrication based on cellulose materials, laser engraving and 3D printing. Injection molding is used for large-scale production of microfluidic devices with repeatable parameters, high quality and low unit production costs. Due to the high investment costs of injection molding machines and injection molds, this method is not used for the production of prototype devices and short series production. Fabrication based on cellulosic materials is only applicable to the production of simple microfluidic devices with limited functionality. Soft lithography allows for the production of complex microcircuits with elements of flow automation (valves, pumps, etc.), however, it is labor-intensive, multi-stage, expensive and does not allow for the automation of the manufacturing process. In contrast to the above methods, laser engraving and 3D printing are the only manufacturing methods for which the design and production process is fully digitized and automated, which allows the production of prototype devices with individualized design in a simple and automatic way. Due to the limited precision and quality of the obtained surfaces and the limited range of biocompatible materials with good optical properties, 3D printing has a limited application in the production of diagnostic devices and biochips. (N. Bhattachaijee, A. Urrios, S. Kanga and A. Folch, The upcoming 3D-printing revolution in microfluidics. Lab Chip, 2016, 16, 1720). In turn, laser methods make it possible to use in the manufacturing process certified for medical applications, biocompatible, widely available, cheap, prefabricated injection-molded elements and materials with repeatable, excellent optical properties, good magnetic permeability and high-quality surfaces.

W amerykańskim opisie patentowym US6197575 B1 opisano urządzenie mikrofluidalne w postaci płytki wielodołkowej do prowadzenia hodowli tkankowych oraz sposób jego wytwarzania. Urządzenie umożliwia hodowlę tkanek z wykorzystaniem porowatych podłoży (rusztowań) na których hodowane są komórki i wykorzystuje zjawisko perfuzji medium hodowlanego przez zwartą strukturę komórkową. Urządzenie nie umożliwia precyzyjnej kontroli położenia komórek w formowanej tkance ani hydrodynamicznego formowania jej struktury. Nie daje też możliwości formowania naczyń przepływowych w tkance w zaprojektowany sposób. Urządzenie nie daje możliwości bezpośredniej obserwacji i prowadzenia badań z wykorzystaniem uformowanej tkanki w układzie przepływowym, pod mikroskopem optycznym i metodami epifluorescencyjnymi. Sposób wytwarzania urządzenia wykorzystuje mikroobróbkę tworzyw, mikroodlewanie, wytłaczanie, elektrodepozycję i druk 3D. Opisane metody wytwarzania nie umożliwiają szybkiego i bezpośredniego wytwarzania spersonalizowanych układów mikrofluidalnych z wykorzystaniem tanich prefabrykowanych elementów o doskonałych właściwościach optycznych i ichUS 6197575 B1 describes a microfluidic device in the form of a multi-well plate for the cultivation of tissue culture and a method for its production. The device enables the growth of tissues with the use of porous substrates (scaffolds) on which cells are grown and uses the phenomenon of perfusion of the culture medium through a compact cell structure. The device does not allow precise control of the position of cells in the formed tissue, nor the hydrodynamic formation of its structure. It also does not allow for the formation of flow vessels in the tissue in a designed manner. The device does not allow direct observation and research with the use of formed tissue in a flow system, under an optical microscope and epifluorescence methods. The method of manufacturing the device uses plastics micro-machining, micro-casting, extrusion, electrodeposition and 3D printing. The described manufacturing methods do not allow the quick and direct production of personalized microfluidic systems using cheap prefabricated elements with excellent optical properties and their

PL 240 748 B1 kastomizacji za pomocą skupionej wiązki laserowej. Z amerykańskiego opisu patentowego US7229820 B1 znany jest bioreaktor do prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych na podłożu umożliwiającym immobilizację komórek, dający możliwość zabezpieczenia hodowli przed kontaminacją oraz krioprotekcję hodowli komórkowej. Urządzenie jednak nie daje możliwości kontroli położenia komórek oraz formowania struktur komórkowych o zadanej budowie morfologicznej, jak również nie umożliwia bezpośrednich obserwacji mikroskopowych struktury komórkowej. W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20040029266 A1 autorzy zaprezentowali planarne urządzenie do prowadzenia kultur tkankowych w warunkach stacjonarnych. Z kolei w amerykańskim opisie patentowym US9226494 B2 opisano modularny bioreaktor do hodowli unaczynionych tkanek w warunkach przepływowych. Urządzenie złożone jest z trzech oddzielonych komór położonych jedna nad drugą, przy czym hodowlę komórkową prowadzi się w komorze środkowej wyposażonej w siatkę podporową macierzy komórkowej. Metoda hodowli unaczynionej tkanki wykorzystuje mikrofragmenty naczyń krwionośnych uprzednio wyseparowane z tkanek i wprowadzane do komory hodowlanej. Urządzenie nie daje możliwości precyzyjnej kontroli położenia komórek oraz formowania struktur komórkowych o zadanej budowie morfologicznej, jak również nie umożliwia bezpośrednich obserwacji mikroskopowych struktury komórkowej. W zgłoszeniu patentowym US20090181200 A1 ujawniono metodę wytwarzania półokrągłych kanałów tworzących system naczyniowy w warstwach polimeru oraz wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne złożone z szeregu warstw. Przedstawiona metoda jest modyfikacją klasycznej metody fotolitograficznej wytwarzania urządzeń mikrofluidalnych. W amerykańskich opisach patentowych uS5032508 B2 i uS4963489 B2 opisano system do prowadzenia trójwymiarowych hodowli komórkowych z wykorzystaniem siatek nylonowych jako suportów. Z kolei zgłoszenie patentowe US20140186414 A1 ujawnia metodę hodowli tkanek z wykorzystaniem mikroimplantów zwierzęcych. Z kolejnego zgłoszenia amerykańskiego US20140154703A1 znany jest mikrosystem do separacji i frakcjonowania komórek nowotworowych z krwi pacjentów oraz ich hodowli. Separacja komórek prowadzona jest z wykorzystaniem macierzy pręcików modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi przeciw specyficznym antygenom występującym na powierzchni komórek nowotworowych. W zgłoszeniu US20130149724 A1 ujawniono mikrofluidalne urządzenie wielosekcyjne umożliwiające jednoczesną dysocjację tkanki, hodowlę, separację i manipulację komórkami oraz prowadzenia badań z ich wykorzystaniem. Urządzenie umożliwia inspekcję hodowli za pomocą mikroskopu optycznego, jednak nie umożliwia precyzyjnego pozycjonowania komórek. Ze zgłoszenia patentowego US20180141047 A1 znane jest wielodołkowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia trójwymiarowych hodowli komórek w warunkach stacjonarnych, wykorzystujące materiały podporowe do immobilizacji komórek. Do centralnie położonych komór hodowlanych poprowadzone zostały mikrokanały doprowadzające substancje stymulujące wzrost i proliferację komórek. W zgłoszeniu patentowym US20100267136 A1 opisano metodę wytwarzania unaczynionej tkanki bazującą na odlewach polimerowych dwuwymiarowej struktury naczyniowej wykonanych w PDMS metodą litografii miękkiej, a następnie zasiedlaniu struktury złożonej z dwóch warstw funkcjonalnych przedzielonych membraną, komórkami. Metoda ta umożliwia budowę urządzeń mikronaczyniowych naśladujących żywą tkankę. W kolejnym zgłoszeniu patentowym US20130143230 A1 opisano platformę mikrofluidalną do badania wpływu czynników fizykochemicznych i biologicznych na kultury i kokultury komórkowe. Hodowle komórkowe były prowadzone w układzie stacjonarnym i przepływowym na syntetycznych rusztowaniach. Ze zgłoszenia patentowego US20080233607 A1 znane jest przepływowe urządzenie mikrofluidalne w postaci prostego kanału posiadającego szereg przegród, do prowadzenia hodowli komórkowych w laminarnym przepływie medium hodowlanego, a zgłoszenie patentowe US20110086427A1 dotyczy urządzenia mikrofluidalnego do prowadzenia hodowli komórkowych, które wyposażone jest w komorę retencji komórek o strukturyzowanej powierzchni ułatwiającej zatrzymanie komórek w jej obrębie oraz kanał do perfuzji medium hodowlanego w obrębie hodowli komórkowej. Z kolei w zgłoszeniu patentowym US20090023608 A1 opisano urządzenie mikrofluidalne posiadające macierzowy układ komór hodowlanych do prowadzenia szeregu jednoczesnych badań i hodowli komórkowych. Układ umożliwiał obserwację hodowli pod mikroskopem optycznym. Podobnie, w zgłoszeniu patentowym US20120003732 A1 przedstawiono system zaopatrzony w macierzowy układ komór hodowlanych do jednoczesnego prowadzenia badań z wykorzystaniem szeregu kultur komórkowych pod mikroskopem optycznym. W amerykańskim zgłoszeniu patentowym US20070084706 A1 opisano urządzenie mikrofluidalne oraz metodę prowadzenia hodowli komórkowych na porowatej membranie.And customization by means of a focused laser beam. From the US patent US7229820 B1 there is known a bioreactor for carrying out cell culture and co-cultures on a medium that allows the immobilization of cells, which enables the protection of the culture against contamination and cryoprotection of the cell culture. The device, however, does not allow for the control of the location of cells and the formation of cell structures with a given morphological structure, as well as it does not allow direct microscopic observations of the cell structure. In the US patent application US20040029266 A1, the authors presented a planar device for conducting tissue cultures in stationary conditions. In turn, US9226494 B2 describes a modular bioreactor for growing vascularized tissues under flow conditions. The device consists of three separate chambers arranged one above the other, where the cell culture is carried out in a central chamber equipped with a support net of the cell matrix. The method of growing vascularized tissue uses microfragments of blood vessels previously separated from the tissues and introduced into the culture chamber. The device does not allow precise control of the location of cells and the formation of cell structures with a given morphological structure, and does not allow direct microscopic observations of the cell structure. Patent application US20090181200 A1 discloses a method of producing semicircular channels forming a vascular system in polymer layers and a multilayer microfluidic device composed of several layers. The presented method is a modification of the classical photolithographic method for producing microfluidic devices. The US patents uS5032508 B2 and uS4963489 B2 describe a system for conducting three-dimensional cell cultures using nylon nets as supports. In turn, the patent application US20140186414 A1 discloses a method of tissue culture using animal microimplants. From another US application US20140154703A1 a microsystem for the separation and fractionation of neoplastic cells from the blood of patients and their culture is known. Cell separation is carried out with the use of a matrix of surface modified rods with monoclonal antibodies against specific antigens present on the surface of tumor cells. The application US20130149724 A1 discloses a microfluidic multi-section device enabling the simultaneous dissociation of tissue, culture, separation and manipulation of cells and conducting research using them. The device allows for inspection of the culture using an optical microscope, but it does not allow for precise positioning of the cells. From the patent application US20180141047 A1, a multi-well microfluidic device is known for carrying out three-dimensional cell cultures under stationary conditions, using support materials for cell immobilization. Microchannels supplying substances stimulating the growth and proliferation of cells were led to centrally located culture chambers. The patent application US20100267136 A1 describes a method of producing vascularized tissue based on polymer casts of a two-dimensional vascular structure made in PDMS by soft lithography, and then populating the structure consisting of two functional layers separated by a membrane and cells. This method enables the construction of microvascular devices that mimic living tissue. Another patent application US20130143230 A1 describes a microfluidic platform for studying the influence of physicochemical and biological factors on cell cultures and co-cultures. Cell cultures were carried out in a stationary and flow-through system on synthetic scaffolds. From patent application US20080233607 A1 there is known a microfluidic flow device in the form of a straight channel having a number of baffles for carrying out cell cultures in a laminar flow of a culture medium, and patent application US20110086427A1 relates to a microfluidic device for conducting cell cultures, which is equipped with a cell retention chamber with a structured surface facilitating the retention of cells within it and a channel for perfusion of the culture medium within the cell culture. In turn, patent application US20090023608 A1 describes a microfluidic device having an array of culture chambers for carrying out a series of simultaneous studies and cell cultures. The system enabled observation of the culture under an optical microscope. Similarly, patent application US20120003732 A1 discloses a system provided with an array of culture chambers for the simultaneous conduct of research using a series of cell cultures under an optical microscope. US patent application US20070084706 A1 describes a microfluidic device and a method for carrying out cell cultures on a porous membrane.

Żadne ze znanych rozwiązań konstrukcyjnych oraz metod prowadzenia hodowli tkankowych w przepływowych układach mikrofluidalnych nie umożliwia precyzyjnej kontroli położenia i efektywnegoNone of the known design solutions and methods of tissue culture in flow microfluidic systems allows for precise position control and effective

PL 240 748 B1 zatrzymania komórek oraz formowania klastrów komórkowych o zróżnicowanej budowie morfologicznej i pożądanym kształcie plastrów o zadanej grubości tworzących unaczynioną sztuczną tkankę w obrębie komór hodowlanych i bez użycia struktur podporowych, rusztowań, hydrożeli lub membran półprzepuszczalnych, a jedynie dzięki formowaniu i kontroli pola prędkości płynu, mikropola magnetycznego o niskim natężeniu i dyskretnym rozkładzie oraz powszechnie dostępnych biokompatybilnych, immunoreaktywnych, modyfikowanych powierzchniowo biotylowanymi przeciwciałami mikrokapsułek polimerowych zawierających w rdzeniu nanocząstki o właściwościach ferromagnetycznych, uprzednio połączonych w aglomeraty mikrokapsułka-komórka w selektywny sposób trwale lub rozłącznie z błoną komórkową komórek określonych rodzajów dzięki tworzeniu kompleksów immunologicznych antygen-przeciwciało. Ponadto dotychczas znane konstrukcje nie dają możliwości prowadzenia obserwacji mikroskopowych wewnątrz czipa mikrofluidalnego i bez konieczności wstępnego przygotowania próbki, w łatwy i efektywny sposób, dzięki wykorzystaniu materiałów konstrukcyjnych o doskonałych właściwościach optycznych w postaci cienkich warstw oraz ograniczonej wysokości komory hodowlanej, co umożliwia prowadzenie powtarzalnych, wysokiej dokładności badań i analiz z wykorzystaniem standardowych technik badawczych wykorzystywanych w biologii, medycynie, farmacji oraz inżynierii biomedycznej, a w szczególności optycznej mikroskopii epifluorescencyjnej o dużych powiększeniach optycznych i bez zniekształceń obrazu oraz spektrofluorymetrii, a nie wymaga zastosowania kosztownych metod mikroskopii konfokalnej stosowanych do analizy próbek o dużej miąższości.The retention of cells and the formation of cell clusters of different morphological structure and the desired shape of the slices of a given thickness, forming vascularized artificial tissue within the culture chambers and without the use of supporting structures, scaffolds, hydrogels or semi-permeable membranes, only thanks to the formation and control of the velocity field fluid, low intensity magnetic micropfield and discrete distribution and commonly available biocompatible, immunoreactive, surface-modified biotylated antibodies polymer microcapsules containing nanoparticles with ferromagnetic properties in the core, previously agglomerated microcapsule-cell in a selective manner, permanently or disjointly with specific types of cell membrane due to the formation of antigen-antibody immune complexes. In addition, the previously known constructions do not allow for conducting microscopic observations inside the microfluidic chip and without the need for preliminary sample preparation, in an easy and effective way, thanks to the use of construction materials with excellent optical properties in the form of thin layers and a limited height of the culture chamber, which allows for repeatable, high accuracy of tests and analyzes using standard research techniques used in biology, medicine, pharmacy and biomedical engineering, in particular optical epifluorescence microscopy with high optical magnification and without image distortion and spectrofluorimetry, and does not require the use of expensive confocal microscopy methods used for the analysis of large samples thickness.

Ponadto, żaden ze znanych sposobów hodowli sztucznych tkanek nie umożliwia hodowli organoidów, organów i guzów nowotworowych w mikroobjętościach z ograniczonej, niewielkiej liczby komórek linii komórkowych lub komórek pierwotnych pobranych od pacjenta bez konieczności ich wstępnej hodowli zawiesinowej, co ogranicza do minimum ich straty oraz liczbę koniecznych podziałów komórkowych, a tym samym skraca czas wymagany dla wytworzenia funkcjonalnej struktury tkankowej. Dodatkowo, żadna ze znanych metoda hodowli sztucznych tkanek w czipach mikrofluidalnych nie wykorzystuje wysokiej jakości prefabrykowanych elementów czipów mikrofluidalnych jednorazowego użytku, których parametry w prosty i bezpośredni sposób mogą być indywidualnie i w zautomatyzowany sposób dostosowywane (kastomizowane), co skraca i upraszcza procedurę hodowli i daje możliwość jej standaryzacji i automatyzacji, a przez to nie są znane metody umożliwiające wytwarzania zindywidualizowanych modeli tkankowych dla rutynowych badań w medycynie spersonalizowanej.Moreover, none of the known methods of culturing artificial tissues allows the cultivation of organoids, organs and neoplastic tumors in micro-volumes from a limited, small number of cells of cell lines or primary cells taken from the patient without the need for their initial suspension culture, which minimizes their losses and the number of necessary cell division and thus shortens the time required to produce a functional tissue structure. In addition, none of the known methods of culturing artificial tissues in microfluidic chips does not use high-quality prefabricated elements of disposable microfluidic chips, the parameters of which can be easily and directly adapted (customizable) individually and automatically, which shortens and simplifies the culture procedure and gives the possibility of its standardization and automation, and thus no methods are known to enable the production of individualized tissue models for routine research in personalized medicine.

Ponadto, żadna ze znanych metod wytwarzania mikrosystemów nie opisuje metody wytwarzania generatora dyskretnego mikropola magnetycznego oraz przepływowego czipa mikrofluidalnego z nim współpracującego wykorzystującego wysokiej jakości, tanie prefabrykowane elementy podlegające jedynie modyfikacji i dostosowaniu z wykorzystaniem laserowej stacji grawerującej z laserem CO2 o długości fali 10,6 lub 9,3 mikrometra, co umożliwia wytwarzanie zindywidualizowanego układu mikrokanałów, komór i ich przegród w czipach mikrofluidalnych oraz zindywidualizowanego układu trzpieni ferromagnetycznych generatora pola magnetycznego, a przez to umożliwia tworzenie zindywidualizowanych, prototypowych konstrukcji formujących spersonalizowane, sztuczne zmiany nowotworowe, w zautomatyzowany, powtarzalny sposób i z zadowalającą precyzją dla każdego pacjenta w placówce opieki zdrowotnej przez wyszkolony personel medyczny, na podstawie zdjęć tomograficznych, symulacji komputerowej lub założeń projektowych, a co nie jest osiągalne innymi znanymi metodami fabrykacji układów mikrofluidalnych, które wymagają specjalistycznej wiedzy i długoletniego doświadczenia o charakterze projektowo-inżynierskim.In addition, none of the known methods of producing microsystems describes a method of producing a discrete magnetic micropfield generator and a flow microfluidic chip cooperating with it using high-quality, cheap prefabricated elements only subject to modification and adaptation using a CO2 laser engraving station with a wavelength of 10.6 or 9.3 micrometers, which enables the production of an individualized system of microchannels, chambers and their partitions in microfluidic chips, and of an individualized system of ferromagnetic pins of the magnetic field generator, thus enabling the creation of individualized, prototype structures forming personalized, artificial neoplastic lesions in an automated, repeatable and automated manner satisfactory precision for each patient in a healthcare facility by trained medical personnel, based on tomographic images, computer simulation or design assumptions, and what it is not achievable with other known methods of fabrication of microfluidic systems, which require specialist knowledge and many years of experience in design and engineering.

Celem wynalazku było opracowanie nowego rozwiązania konstrukcyjnego w postaci magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej i sposobu jej wytwarzania. Dodatkowo postanowiono opracować nowy sposób hodowli sztucznych tkanek na potrzeby medycyny spersonalizowanej, który rozwiązywałby powyżej wskazane problemy.The aim of the invention was to develop a new construction solution in the form of a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform and a method of its production. In addition, it was decided to develop a new method of culture of artificial tissues for the needs of personalized medicine, which would solve the above-mentioned problems.

Magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna składająca się z prefabrykowanych elementów wieka i postawy oraz skastomizowanej warstwy funkcjonalnej, a wieko czipa składa się z pokrywy, arkusza szkła i wężyków przyłączeniowych, podczas gdy podstawa czipa składa się z osłony podstawy oraz arkusza szkła, a warstwa funkcjonalna czipa składa się z cienkiej warstwy PDMS (polidimetylosiloksanu), charakteryzuje się tym, że składa się z przepływowego czipa mikrofluidalnego wyposażonego w mikrokanały, komorę hodowlaną i gniazdo generatora mikropola magnetycznego oraz jednego lub dwóch generatorów mikropola magnetycznego, przy czym każdy z generatorów mikropola magnetycznego złożony jest z magnesu stałego, szeregu trzpieni ferromagnetycznych i bloku generatora posiadającego wtyk; przy czym układ mikrokanałów i komór hodowlanych w czipie mikrofluidalnymMagnetic-hydrodynamic microfluidic platform consisting of prefabricated lid and base elements and a customizable functional layer, and the chip lid consists of a cover, a glass sheet and connection tubes, while the chip base consists of a base cover and a glass sheet, and the chip functional layer consists of is made of a thin layer of PDMS (polydimethylsiloxane), characterized by the fact that it consists of a flow microfluidic chip equipped with microchannels, a culture chamber and a magnetic micropfield generator socket, and one or two magnetic micropfield generators, each of the magnetic micropfield generators is composed of a magnet a fixed series of ferromagnetic pins and a generator block having a plug; the arrangement of microchannels and growth chambers in a microfluidic chip

PL 240 748 B1 oraz układ trzpieni ferromagnetycznych generatora mikropola magnetycznego jest wzajemnie skorelowany w ten sposób, że trzpienie ferromagnetyczne w platformie przebiegają równolegle od powierzchni komory hodowlanej czipa do powierzchni magnesu stałego.The magnetic field generator and the arrangement of the ferromagnetic pins of the magnetic field generator are mutually correlated such that the ferromagnetic pins in the platform extend parallel from the surface of the culture chamber of the chip to the surface of the permanent magnet.

Korzystnie gniazdo generatora mikropola obejmuje obszar komory hodowlanej czipa mikrofluidalnego.Preferably, the seat of the micropfield generator comprises the rearing chamber area of the microfluidic chip.

Korzystnie gniazdo generatora mikropola wykonane jest w osłonie podstawy oraz w pokrywie czipa mikrofluidalnego.Preferably, the seat of the micropole generator is made in the base cover and in the cover of the microfluidic chip.

Korzystnie wewnątrz komór hodowlanych rozlokowane są przegrody formujące pole prędkości i wirowości płynu w jej wnętrzu.Preferably, partitions are located inside the rearing chambers, forming a field of velocity and vorticity of the fluid inside it.

Korzystnie arkusze szkła wieka i podstawy czipa wykonane zostały ze szkła borosilikatowego do epifluorescencji o grubości nie większej niż 150 mikrometrów.Preferably, the glass sheets of the lid and the base of the chip are made of borosilicate epifluorescence glass with a thickness of not more than 150 micrometers.

Korzystnie wtyk generatora mikropola posiada wyniesioną płaszczyznę równoległą do powierzchni komory hodowlanej czipa, dopasowaną kształtem i położeniem do gniazda generatora w pokrywie wieka i osłonie podstawy czipa mikrofluidalnego.Preferably, the plug of the micropfield generator has an elevated plane parallel to the surface of the chip's rearing chamber, matching in shape and position to the generator socket in the lid cover and the base cover of the microfluidic chip.

Korzystnie powierzchnia wtyku generatora mikropola jest odsunięta od powierzchni magnesu stałego na odległość od 5 do 50 mm.Preferably, the plug surface of the micropole generator is spaced from the surface of the permanent magnet by a distance of 5 to 50 mm.

Korzystnie otwory trzpieni ferromagnetycznych rozlokowane są w obszarze wtyku generatora mikropola magnetycznego.Preferably, the holes of the ferromagnetic pins are located in the plug area of the magnetic field generator.

Korzystnie powierzchnia otworu pozycjonującego magnes stały w podstawie generatora obejmuje obszar komory hodowlanej czipa mikrofluidalnego.Preferably, the surface of the hole for positioning the permanent magnet in the generator base comprises the area of the culture chamber of the microfluidic chip.

Korzystnie stosuje się magnesy płytowe z grupy od N35 do N52.Preferably, plate magnets from the group N35 to N52 are used.

Korzystnie trzpienie ferromagnetyczne wykonane są ze stali ferromagnetycznej, najkorzystniej typu SS 430.Preferably the ferromagnetic pins are made of ferromagnetic steel, most preferably of the SS 430 type.

Korzystnie trzpienie ferromagnetyczne mają średnicę od 100 do 500 mikrometrów.Preferably, the ferromagnetic pins are 100 to 500 microns in diameter.

Korzystnie trzpienie ferromagnetyczne ustawione są prostopadle do powierzchni komory hodowlanej czipa mikrofluidalnego.Preferably, the ferromagnetic pins are perpendicular to the surface of the growth chamber of the microfluidic chip.

Korzystnie trzpienie ferromagnetyczne są rozłożone nad i/lub pod komorą hodowlaną czipa mikrofluidalnego we wzajemnych odległościach nie mniejszych niż dwukrotność średnicy trzpienia ferromagnetycznego.Preferably, the ferromagnetic pins are distributed above and / or below the rearing chamber of the microfluidic chip at mutual distances not less than twice the diameter of the ferromagnetic pin.

Korzystnie dwa współpracujące generatory mikropola magnetycznego ustawione są naprzeciwległe nad i pod czipem mikrofluidalnym.Preferably, two cooperating magnetic field generators are positioned opposite above and below the microfluidic chip.

Sposób wytwarzania magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej polega na tym, że na podstawie zdjęć tomograficznych lub wyników symulacji komputerowych albo projektu sztucznej tkanki, przygotowuje się dwuwymiarowe mapy grawerowania lub cięcia prefabrykowanych elementów konstrukcyjnych platformy mikrofluidalnej: prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej oraz bloków generatora, które są bezpośrednio i automatycznie grawerowane lub kastomizowane wiązką lasera i w ten sposób powstają mikrokanały i komory hodowlane oraz ich przegrody, a także otwory przelotowe trzpieni ferromagnetycznych generatora mikropola magnetycznego, a następnie wszystkie prefabrykowane i skastomizowane elementy platformy mikrofluidalnej są ze sobą łączone.The method of producing a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform consists in preparing two-dimensional maps of engraving or cutting of the prefabricated structural elements of the microfluidic platform: the prefabricated functional layer and generator blocks, which are directly and automatically engraved or customizable with a laser beam, thus creating microchannels and breeding chambers and their partitions, as well as through holes of the ferromagnetic mandrels of the magnetic micro-field generator, and then all prefabricated and customizable elements of the microfluidic platform are connected with each other.

Korzystnie warstwa funkcjonalna czipa mikrofluidalnego wykonana została z prefabrykowanego zespołu warstwy funkcjonalnej poprzez kastomizację warstwy PDMS wiązką lasera CO2 o długości fali 10,6 lub 9,3 mikrometra oraz następnie usunięcie folii poliestrowej.Preferably, the functional layer of the microfluidic chip is made of a prefabricated functional layer assembly by customizing the PDMS layer with a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 or 9.3 micrometers and then removing the polyester film.

Korzystnie podczas kastomizacji warstwy PDMS prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej czipa grawerowana lub wycinana jest w warstwie PDMS struktura mikrokanałów, komór hodowlanych i ich przegród formujących pole prędkości i wirowości medium hodowlanego.Preferably, during the customization of the PDMS layer of the prefabricated functional layer of the chip, the structure of microchannels, culture chambers and their partitions forming the velocity and vortex field of the culture medium is engraved or cut into the PDMS layer.

Korzystnie pokrywa czipa oraz osłona podstawy zostały połączone z arkuszami szkła w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny metodą zgrzewania.Preferably, the chip cover and the base cover have been connected to the glass sheets in a hydraulically tight and inseparable manner by welding.

Korzystnie podczas kastomizacji bloków generatora grawerowane są otwory przelotowe trzpieni ferromagnetycznych od powierzchni wtyku generatora do powierzchni magnesu stałego za pomocą wiązki lasera CO2 o długości fali 10,6 lub 9,3 mikrometra.Preferably, during customization of the generator blocks, the through holes of the ferromagnetic pins are engraved from the surface of the generator plug to the surface of the permanent magnet by means of a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 or 9.3 micrometers.

Korzystnie trzpienie ferromagnetyczne wprowadzane są w otwory przelotowe trzpieni ferromagnetycznych i łączone trwale z blokiem generatora za pomocą kleju.Preferably, the ferromagnetic pins are inserted into the through holes of the ferromagnetic pins and permanently connected to the generator block by means of an adhesive.

Istotą wynalazku jest również sposób hodowli sztucznych tkanek w mikropolu magnetycznym, który polega na tym, że w pierwszym etapie przeprowadza się separację i/lub koncentrację komórek ludzkich lub zwierzęcych z ich zawiesiny za pomocą mikrokapsułek magnetycznych, które łączą się z komórkami, w drugim etapie zawiesinę aglomeratów mikrokapsułka-komórka zatłacza się do czipaThe essence of the invention is also a method of culturing artificial tissues in a magnetic micro-field, which consists in the first stage separating and / or concentrating human or animal cells from their suspension by means of magnetic microcapsules that connect with the cells, and in the second stage, the suspension microcapsule-cell agglomerates are injected into the chip

PL 240 748 B1 mikrofluidalnego tworzącego zespół z generatorem mikropola magnetycznego, a aglomeraty są zatrzymywane i pozycjonowane wewnątrz komory hodowlanej czipa w obszarach zdeterminowanych rozlokowaniem rdzeni ferromagnetycznych, w trzecim etapie prowadzi się hodowlę komórek z których dynamicznie formuje się tkankę w postaci klastrów za pomocą kontrolowanego przegrodami pola prędkości i wirowości medium hodowlanego w czipie, przy czym hodowlę prowadzi się w temperaturze 37°C, w kolejnych etapach ponownie wprowadza się do czipa mikrofluidalnego zawiesinę aglomeratów mikrokapsułka-komórka tego samego i/lub innego typu i prowadzi się hodowlę aż do uzyskania wymaganej struktury tkankowej, w ostatnim etapie prowadzi się badania w czipie mikrofluidalnym z wykorzystaniem utworzonej sztucznej tkanki.In the third stage, the cells are cultured from which the tissue is dynamically formed in the form of clusters by means of a field controlled by partitions. speed and vortex of the culture medium in the chip, where the culture is carried out at a temperature of 37 ° C, in subsequent stages, a suspension of microcapsule-cell agglomerates of the same and / or different type is reintroduced into the microcapsule-cell agglomerates and the culture is carried out until the required tissue structure is obtained , in the last stage, tests are carried out in a microfluidic chip using the created artificial tissue.

Korzystnie średnica mikrokapsułek magnetycznych zawiera się w przedziale od 1 do 3 mikrometrów.Preferably, the diameter of the magnetic microcapsules is in the range of 1 to 3 micrometers.

Korzystnie powierzchnia mikrokapsułek magnetycznych modyfikowana jest powierzchniowo za pomocą biotylowanych przeciwciał monoklonalnych przeciw antygenom występującym na powierzchni komórek człowieka lub na powierzchni komórek zwierzęcych, najkorzystniej przeciw antygenom EpCam, CD45, CD31, CD34.Preferably, the surface of the magnetic microcapsules is surface modified with biotylated monoclonal antibodies against antigens found on the surface of human cells or on the surface of animal cells, most preferably against the antigens EpCam, CD45, CD31, CD34.

Korzystnie komórki podlegające aglomeracji są komórkami prawidłowymi lub nowotworowymi linii człowieka lub linii zwierzęcych lub też są komórkami pierwotnymi człowieka lub zwierzęcymi, najkorzystniej do aglomeracji wykorzystuje się komórki ludzkich fibroblastów, komórki śródbłonka oraz komórki macierzyste.Preferably the agglomerated cells are normal or neoplastic cells of human or animal lineage or are human or animal primary cells, most preferably human fibroblast cells, endothelial cells and stem cells are used for agglomeration.

Korzystnie hodowlę prowadzi się przez okres od 3 godzin do 7 dni w warunkach przepływowych. Korzystnie utworzony klaster komórkowy ma postać cienkiego plastra o grubości od 0,02 do 0,5 mm. Korzystnie natężenie przepływu zawiesiny komórka-mikrokapsułka wprowadzanej do czipa mikrofluidalnego zawiera się w przedziale od 0,5 ml/min do 10 ml/min.Preferably, the cultivation is carried out for 3 hours to 7 days under flow conditions. Preferably, the formed cell cluster is in the form of a thin slice with a thickness of 0.02 to 0.5 mm. Preferably, the flow rate of the cell-microcapsule suspension introduced into the microfluidic chip is in the range of 0.5 ml / min to 10 ml / min.

Korzystnie natężenie przepływu medium hodowlanego podczas hodowli komórek zawiera się w przedziale od 0,1 ml/godzinę do 10 ml/godzinę.Preferably, the flow rate of the culture medium during cell cultivation is in the range of 0.1 ml / hour to 10 ml / hour.

Korzystnie przepływ medium hodowlanego przez czip mikrofluidalny podczas hodowli komórkowej wymusza się za pomocą pompy strzykawkowej.Preferably, the flow of the culture medium through the microfluidic chip during cell culture is forced by a syringe pump.

Korzystnie hodowlę komórek na czipie prowadzi się w cieplarce.Preferably, the cultivation of the cells on the chip is carried out in an incubator.

Korzystnie koncentracja zawiesiny aglomeratów mikrokapsułka-komórka wprowadzanej do mikrosystemu zawiera się w przedziale od 1x106 do 1x107 aglomeratów na mililitr.Preferably, the concentration of the suspension of microcapsule-cell agglomerates introduced into the microsystem is in the range from 1x106 to 1x107 agglomerates per milliliter.

Korzystnie zawiesina aglomeratów mikrokapsułka-komórka jest ich zawiesiną w referencyjnym medium hodowlanym dla zaglomerowanych komórek.Preferably, the microcapsule-cell agglomerate suspension is a suspension thereof in the reference culture medium for the agglomerated cells.

Korzystnie klastry komórkowe są formowane z agregatów mikrokapsułka-komórka wewnątrz komór hodowlanych bezpośrednio nad trzpieniami ferromagnetycznymi lub pomiędzy naprzeciwległe ulokowanymi trzpieniami ferromagnetycznymi w postaci wysp lub słupków o średnicy równej średnicy trzpienia ferromagnetycznego.Preferably, the cell clusters are formed from microcapsule-cell aggregates inside the growth chambers directly above the ferromagnetic pins or between opposed ferromagnetic pins in the form of islands or pillars with a diameter equal to the diameter of the ferromagnetic pin.

Konstrukcja platformy umożliwia prowadzenie kohodowli komórkowych w łatwy i wydajny sposób, w długim okresie czasu przy współpracy z powszechnie dostępnym, standardowym sprzętem wykorzystywanym do prowadzenia hodowli komórkowych w laboratoriach diagnostycznych, ośrodkach zdrowia i jednostkach naukowo-badawczych tj. z wykorzystaniem cieplarek i pomp infuzyjnych. Konstrukcja platformy zapewnia ponadto możliwość wprowadzania dowolnych substancji czynnych do środowiska hodowli oraz prowadzenie obserwacji mikroskopowych oraz badań i analiz z wykorzystaniem standardowych technik badawczych wykorzystywanych w biologii, medycynie, farmacji oraz inżynierii biomedycznej, a w szczególności optycznej mikroskopii epifluorescencyjnej i spektrofluorymetrii.The structure of the platform allows for the conduct of cell co-cultures in an easy and efficient way, over a long period of time, in cooperation with commonly available, standard equipment used to conduct cell cultures in diagnostic laboratories, health centers and research and development units, i.e. with the use of heaters and infusion pumps. The structure of the platform also provides the possibility of introducing any active substances into the culture environment and conducting microscopic observations as well as research and analysis using standard research techniques used in biology, medicine, pharmacy and biomedical engineering, in particular optical epifluorescence microscopy and spectrofluorimetry.

W szczególności, platforma umożliwia wytworzenie hydrodynamicznego mikrośrodowiska przepływowego formującego (modelującego) strukturę tkankową, właściwego do prowadzenia kohodowli komórkowych w długim okresie czasu, umożliwiającego proliferację wzrost i różnicowanie komórek, umożliwia wytworzenie środowiska o stałych lub zmiennych w czasie warunkach i kontrolowanych parametrach, takich jak: rozkład prędkości i wirowości płynu w komorze hodowlanej, przestrzenny rozkład komórek o zróżnicowanej budowie morfologicznej, w tym różnych rodzajów komórek człowieka, oraz umożliwia kontrolowane formowanie wewnątrztkankowych struktur naczyniowo-przepływowych. Jest to osiągane bez wykorzystania struktur podporowych, w szczególności nie wymaga zastosowania hydrożeli, półprzepuszczalnych membran i rusztowań, a możliwe jest dzięki formowaniu i kontroli pola prędkości płynu w komorze, zastosowaniu ferromagnetycznych mikrokapsułek polimerowych o zmodyfikowanych właściwościach powierzchniowych, przez co adherujących z komórkami, które umożliwiająIn particular, the platform makes it possible to create a hydrodynamic flow microenvironment that shapes (modeling) the tissue structure, suitable for long-term cell co-culture, enabling the proliferation, growth and differentiation of cells, enables the creation of an environment with constant or time-varying conditions and controlled parameters, such as: distribution of fluid velocity and vortex in the culture chamber, spatial distribution of cells with different morphological structure, including various types of human cells, and allows for the controlled formation of intra-tissue vascular-flow structures. This is achieved without the use of supporting structures, in particular, it does not require the use of hydrogels, semi-permeable membranes and scaffolds, and it is possible thanks to the formation and control of the fluid velocity field in the chamber, the use of ferromagnetic polymer microcapsules with modified surface properties, thus adhering with cells that allow

PL 240 748 B1 utrzymywanie aglomeratów mikrokapsułka-komórka oraz ich klastrów w określonych miejscach w obrębie przepływowych komór mikrosystemu za pomocą mikropola magnetycznego wytwarzanego przez generator pola.The maintenance of the microcapsule-cell agglomerates and their clusters at specific locations within the flow chambers of the microsystem by means of a magnetic micropfield generated by a field generator.

Magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna do hodowli i badań sztucznych tkanek według wynalazku umożliwia formowanie i hodowlę sztucznych tkanek w przepływowych, jednorazowych, kastomizowalnych, biokompatybilnych czipach mikrofluidalnych w dyskretnym mikropolu magnetycznym generowanym w komorach hodowlanych czipa mikrofluidalnego za pomocą generatorów mikropola magnetycznego o niskim natężeniu, które umożliwiają precyzyjną kontrolę położenia i efektywne zatrzymanie agregatów komórka-mikrokapsułka oraz formowanie zwartych klastrów komórkowych o zróżnicowanej budowie morfologicznej w bezpośrednim sąsiedztwie trzpieni ferromagnetycznych wewnątrz komory hodowlanej, a przez to formowanie i hodowlę trójwymiarowych, przestrzennych, przepływowych funkcjonalnych struktur komórkowych wyższego poziomu złożonych z uformowanych klastrów komórkowych, a powstających w całej objętości komory hodowlanej, tzw. sztucznych tkanek, organoidów lub organów na czipie, cechujących się pożądanym kształtem cienkich plastrów o zadanej grubości, a przegrody wewnątrz komór hodowlanych umożliwiają ich hydrodynamiczne modelowanie, przy czym aglomeraty komórka-mikrokapsułka otrzymywane są znanymi metodami w prosty sposób dzięki wykorzystaniu powszechnie dostępnych biokompatybilnych, immunoreaktywnych, modyfikowanych powierzchniowo biotyIowanymi przeciwciałami mikrokapsułek polimerowych zawierających w rdzeniu nanocząstki o właściwościach ferromagnetycznych, które łączą się w selektywny sposób trwale lub rozłącznie z błoną komórkową komórek określonych rodzajów dzięki tworzeniu kompleksów immunologicznych antygen-przeciwciało; ponadto konstrukcja platformy mikrofluidalnej daje możliwości prowadzenia obserwacji mikroskopowych wewnątrz czipa mikrofluidalnego i bez konieczności wstępnego przygotowania próbki, w łatwy i efektywny sposób, dzięki wykorzystaniu materiałów konstrukcyjnych o doskonałych właściwościach optycznych w postaci cienkich warstw szkła oraz ograniczonej wysokości komory hodowlanej, co umożliwia prowadzenie powtarzalnych, wysokiej dokładności badań i analiz z wykorzystaniem standardowych technik badawczych wykorzystywanych w biologii, medycynie, farmacji oraz inżynierii biomedycznej, a w szczególności optycznej mikroskopii epifluorescencyjnej o dużych powiększeniach optycznych i bez zniekształceń obrazu oraz spektrofluorymetrii; ponadto metoda hodowli sztucznych tkanek w mikropolu magnetycznym umożliwia hodowlę guzów nowotworowych w mikroobjętościach z ograniczonej, niewielkiej liczby komórek linii komórkowych lub komórek pierwotnych pobranych od pacjenta bez konieczności ich wstępnej hodowli zawiesinowej, co ogranicza do minimum ich straty oraz liczbę koniecznych podziałów komórkowych, a tym samym skraca czas wymagany dla wytworzenia funkcjonalnej struktury tkankowej, który dodatkowo ulega skróceniu dzięki wykorzystaniu prefabrykowanych elementów czipów mikrofluidalnych, których parametry w prosty i bezpośredni sposób mogą być indywidualnie i w zautomatyzowany sposób dostosowywane (kastomizowane), co upraszcza procedurę hodowli i daje możliwość jej standaryzacji i automatyzacji, a przez to umożliwia jej rutynowe wykorzystanie w medycynie spersonalizowanej, która to procedura kastomizacji umożliwia wytwarzanie zindywidualizowanego układu mikrokanałów, komór i ich przegród w czipach mikrofluidalnych oraz zindywidualizowanego układu trzpieni ferromagnetycznych generatora pola magnetycznego, a przez to umożliwia tworzenie zindywidualizowanych, prototypowych konstrukcji formujących spersonalizowane, sztuczne zmiany nowotworowe, w zautomatyzowany, powtarzalny sposób i z zadowalającą precyzją dla każdego pacjenta w placówce opieki zdrowotnej przez wyszkolony personel medyczny, na podstawie zdjęć tomograficznych, symulacji komputerowej lub założeń projektowych.The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform for the cultivation and research of artificial tissues according to the invention enables the formation and cultivation of artificial tissues in flow-through disposable, customizable, biocompatible microfluidic chips in a discrete magnetic micropole generated in the culture chambers of the microfluidic chip by means of magnetic micro-field generators that allow precise control of the location and effective stopping of cell-microcapsule aggregates and the formation of compact cell clusters of different morphological structure in the immediate vicinity of ferromagnetic pins inside the breeding chamber, and thus the formation and cultivation of three-dimensional, three-dimensional, flow functional cell structures of a higher level composed of formed cell clusters, and arising in the entire volume of the breeding chamber, the so-called artificial tissues, organoids or organs on the chip, characterized by the desired shape of thin slices of a given thickness, and the partitions inside the culture chambers enable their hydrodynamic modeling, while the cell-microcapsule agglomerates are obtained by known methods in a simple way thanks to the use of commonly available biocompatible, immunoreactive, surface-modified biotylated antibodies polymer microcapsules containing nanoparticles with ferromagnetic properties in the core that selectively bind permanently or releasably to the cell membrane of certain types of cells by the formation of antigen-antibody immune complexes; in addition, the structure of the microfluidic platform allows for conducting microscopic observations inside the microfluidic chip and without the need for preliminary sample preparation, in an easy and effective way, thanks to the use of construction materials with excellent optical properties in the form of thin glass layers and a limited height of the culture chamber, which allows for repeatable, high accuracy of research and analysis using standard research techniques used in biology, medicine, pharmacy and biomedical engineering, in particular optical epifluorescence microscopy with high optical magnification and without image distortion and spectrofluorimetry; in addition, the method of culturing artificial tissues in a magnetic micro-field enables the cultivation of neoplastic tumors in micro-volumes from a limited, small number of cells of cell lines or primary cells taken from the patient without the need for their initial suspension culture, which minimizes their losses and the number of necessary cell divisions, and thus reduces the time required to create a functional tissue structure, which is additionally shortened thanks to the use of prefabricated elements of microfluidic chips, the parameters of which can be easily and directly adjusted (customizable) individually and automatically, which simplifies the culture procedure and allows for its standardization and automation, and thus enables its routine use in personalized medicine, which customization procedure enables the production of an individualized system of microchannels, chambers and their partitions in microfluidic chips and indives idualized system of ferromagnetic pins of the magnetic field generator, and thus enables the creation of individualized, prototype structures forming personalized, artificial neoplastic lesions in an automated, repeatable manner and with satisfactory precision for each patient in a healthcare facility by trained medical personnel, based on tomographic images, simulations computer or design assumptions.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania oraz na rysunku na którym:The subject of the invention is presented in more detail in the exemplary embodiments and in the drawing in which:

fig. 1 przedstawia magnetyczno-hydrodynamiczną platformę mikrofluidalną z jednym gene- ratorem mikropola magnetycznego, fig. 2 przedstawia eksplodowany rysunek magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikro- fluidalnej z dwoma naprzeciwległymi generatorami mikropola magnetycznego, fig. 3 przedstawia eksplodowany rysunek czipa mikrofluidalnego z dwoma gniazdami gene- ratora mikropola magnetycznego, fig. 4 przedstawia eksplodowany rysunek generatora dyskretnego mikropola magnetycznego, fig. 5 przedstawia prefabrykowany blok generatora mikropola magnetycznego, fig. 6 przedstawia eksplodowany rysunek wieka czipa mikrofluidalnego, fig. 7 przedstawia eksplodowany rysunek podstawy czipa mikrofluidalnego, fig. 8 przedstawia eksplodowany rysunek prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej,Fig. 1 shows a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform with one magnetic micro-field generator, Fig. 2 shows an exploded drawing of a magnetic-hydrodynamic micro-fluidized platform with two opposing magnetic micro-field generators, Fig. 4 shows an exploded drawing of a discrete magnetic micro-field generator, Fig. 5 shows a prefabricated magnetic micropfield generator block, Fig. 6 shows an exploded drawing of the lid of a microfluidic chip, Fig. 7 shows an exploded drawing of the base of a microfluidic chip, Fig. 8 shows an exploded drawing of a prefabricated functional layer,

PL 240 748 B1PL 240 748 B1

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Wieko czipa mikrofluidalnego zostało przedstawione na rysunku fig. 6, poniżej mówiono jego budowę oraz sposób wytwarzania. Wieko 4 złożone jest z pokrywy czipa 18 wykonanej z PMMA o wymiarach 60/24/10 mm (długość/szerokość/wysokość), arkusza szkła wieka 19 ze szkła borosilikatowego o wymiarach 59/23/0,1 (długość/szerokość/wysokość) mm oraz dwóch wężyków przyłączeniowych 20 (zasilającego i wypływowego) wykonanych z polietylenu o średnicy wewnętrznej fi 0,4 mm i grubości ścianki 0,3 mm oraz długości 100 mm. W pokrywie 18 wykonane zostały dwa cylindryczne, zamknięte od góry zbiorniki odpowietrzające 21 o średnicy 3,9 mm i wysokości 3 mm, połączone z bocznymi kanałami czipa 22 (zasilającym i wypływowym) o średnicy 1 mm. Pokrywa 18 posiada gniazdo generatora 23 o wymiarach 18,9/11 mm (długość/szerokość) w postaci otworu przelotowego 24 nad obszarem komory hodowlanej 8. W arkuszu szkła 19 zostały wykonane, w osi zbiorników odpowietrzających 21 dwa otwory przelotowe 24 o średnicy równej średnicy tych zbiorników 21. W czterech narożnikach pokrywy 18 oraz arkusza szkła 19 wykonane zostały przelotowe otwory pozycjonujące 17 o średnicy 0,4 mm, w odpowiadających sobie miejscach w pokrywie 18 i arkuszu szkła 19, które służą do wzajemnego, precyzyjnego pozycjonowania elementów mikrosystemu z wykorzystaniem trzpieni pozycjonujących 3 wprowadzanych w otwory 17. Elementy wieka zostały połączone po uprzednim wzajemnym spozycjonowaniu, w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny: pokrywa czipa 18 z arkuszem szkła 19 metodą zgrzewania oraz pokrywa czipa 18 z wężykami przyłączeniowymi 20 po wprowadzeniu końcówek wężyków do otworów bocznych kanałów czipa 22 (wlotowego i wylotowego) za pomocą biokompatybilnego kleju fotoutwardzalnego. Elementy wieka tworzą prefabrykowany, standaryzowany element czipa mikrofluidalnego. Prefabrykowane elementy wieka wykonane z PMMA zostały wykonane metodą formowania wtryskowego.The lid of the microfluidic chip is shown in Fig. 6, its structure and manufacturing method are discussed below. The lid 4 consists of a chip cover 18 made of PMMA, dimensions 60/24/10 mm (length / width / height), a glass sheet of the lid 19 made of borosilicate glass, dimensions 59/23 / 0.1 (length / width / height) mm and two connection hoses 20 (supply and outlet) made of polyethylene with an internal diameter of 0.4 mm, a wall thickness of 0.3 mm and a length of 100 mm. In the cover 18 there are two cylindrical venting tanks 21 closed at the top, 3.9 mm in diameter and 3 mm in height, connected to the side channels of the chip 22 (feeding and outflow) with a diameter of 1 mm. The cover 18 has a generator seat 23 with dimensions of 18.9 / 11 mm (length / width) in the form of a through hole 24 over the area of the rearing chamber 8. In the glass sheet 19, two through holes 24 with a diameter equal to the diameter were made in the glass sheet 19 in the axis of the vent tanks 21 of these tanks 21. In the four corners of the cover 18 and the glass sheet 19, positioning holes 17 with a diameter of 0.4 mm were made in corresponding places in the cover 18 and the glass sheet 19, which serve for the mutual, precise positioning of the microsystem elements with the use of pins positioning 3 inserted into the holes 17. The lid elements were connected, after prior mutual positioning, in a hydraulically tight and inseparable manner: chip cover 18 with a glass sheet 19 by welding and a chip cover 18 with connection hoses 20 after inserting the hose ends into the side openings of the chip channels 22 (inlet and outlet) with a biocompatible adhesive photocurable. The lid elements form a prefabricated, standardized microfluidic chip element. Prefabricated PMMA lid elements were made by injection molding.

Podstawa czipa 18 została przedstawiona na rysunku fig. 7, poniżej omówiono jej budowę oraz sposób wytwarzania. Podstawa 18 złożona jest z osłony podstawy 25 wykonanej z PMMA o wymiarach 60/24/10 mm (długość/szerokość/wysokość) oraz arkusza szkła 26 ze szkła borosilikatowego o wymiarach 59/23/0,1 (długość/szerokość/wysokość) mm. Osłona podstawy 25 posiada gniazdo generatora 27 pod obszarem komory hodowlanej 8 w postaci otworu przelotowego 24 o wymiarach 18,9/11 mm (długość/szerokość). W czterech narożnikach osłony 25 oraz arkusza szkła 26 wykonane zostały przelotowe otwory pozycjonujące 17 o średnicy 0,4 mm, w odpowiadających sobie miejscach w osłonie 25 i arkuszu szkła 26, które służą do wzajemnego, precyzyjnego pozycjonowania elementów mikrosystemu z wykorzystaniem trzpieni pozycjonujących 3 wprowadzanych w otwory 17. Elementy zespołu podstawy 6 zostały połączone po uprzednim wzajemnym spozycjonowaniu, w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny metodą zgrzewania. Elementy podstawy 6 tworzą prefabrykowany, standaryzowany element czipa mikrofluidalnego. Prefabrykowane elementy zespołu wykonane z PMMA zostały wykonane metodą formowania wtryskowego.The base of the chip 18 is shown in Fig. 7, its structure and manufacturing method is discussed below. The base 18 consists of a 60/24/10 mm (length / width / height) PMMA base cover and a 26 mm borosilicate glass sheet with dimensions of 59/23 / 0.1 (length / width / height) mm. . The base shell 25 has a generator seat 27 under the area of the rearing chamber 8 in the form of a through-hole 24 with dimensions of 18.9 / 11 mm (length / width). In the four corners of the cover 25 and the glass sheet 26, through positioning holes 17 with a diameter of 0.4 mm were made in corresponding places in the cover 25 and the glass sheet 26, which serve for the mutual, precise positioning of the microsystem elements with the use of positioning pins 3 introduced in the openings 17. The elements of the base assembly 6 were connected after being positioned to each other in a hydraulically tight and non-separable manner by welding. The base elements 6 form a prefabricated, standardized microfluidic chip element. Prefabricated PMMA components were made by injection molding.

Prefabrykowana warstwa funkcjonalna czipa 5 mikrofluidalnego została przedstawiona na rysunku fig. 8, poniżej omówiono jej budowę oraz sposób wytwarzania. Prefabrykowana warstwa czipa 5 złożona jest z arkusza folii nośnej 28 wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) o wymiarach 60/24/0,1 mm (długość/szerokość/wysokość) mm oraz folii PDMS 29 o wymiarach 59/23/0,5 mm (długość/szerokość/wysokość) wykonanej z polidimetylosiloksanu (PDMS) metodą powlekania obrotowego folii nośnej ciekłym polidimetylosiloksanem w powlekaczu obrotowym, a następnie utwardzonej w suszarce szafkowej w temp. 70°C przez okres 1 godziny. W czterech narożnikach folii nośnej 28 oraz folii PDMS 29 wykonane zostały przelotowe otwory pozycjonujące 17 o średnicy 0,4 mm, w odpowiadających sobie miejscach w obu foliach, które służą do wzajemnego, precyzyjnego pozycjonowania elementów mikrosystemu z wykorzystaniem trzpieni pozycjonujących 3 wprowadzanych w otwory 17. Folia nośna z folią PDMS połączone są ze sobą w sposób rozłączny dzięki siłom adhezji powierzchniowej.The prefabricated functional layer of the microfluidic chip is shown in Fig. 8, its structure and manufacturing method are discussed below. The prefabricated chip layer 5 consists of a carrier foil 28 made of polyethylene terephthalate (PET) with dimensions of 60/24 / 0.1 mm (length / width / height) mm and a PDMS 29 film with dimensions of 59/23 / 0.5 mm (length / width / height) made of polydimethylsiloxane (PDMS) by spin coating the carrier foil with liquid polydimethylsiloxane in a spin coater, and then cured in a cabinet dryer at 70 ° C for 1 hour. In the four corners of the carrier foil 28 and PDMS 29 foil, through positioning holes 17 with a diameter of 0.4 mm were made in corresponding places in both foils, which are used for mutual, precise positioning of the microsystem elements using positioning pins 3 inserted into the holes 17. The carrier foil and the PDMS foil are connected to each other in a detachable manner thanks to the forces of surface adhesion.

Czip mikrofluidalny 2 został przedstawiony na rysunku fig. 3, poniżej omówiono jego budowę oraz sposób wytwarzania. Czip mikrofluidalny 2 złożony jest z wieka czipa 4, warstwy funkcjonalnej czipa 5 oraz podstawy czipa 6. Przed przystąpieniem do kastomizacji prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej przedstawionej na fig. 8, wykonano projekt w środowisku CAD struktury sztucznej tkanki i na podstawie projektu przygotowano dwuwymiarową mapę grawerowania folii PDMS 29. Następnie mapa ta została automatycznie wyeksportowana do stacji grawerującej i automatycznie przeniesiona na folię PDMS 29 zgodnie z powszechnie znaną procedurą. Warstwa funkcjonalna czipa 5 została wykonana z prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej poprzez kastomizację warstwy PDMS 29 na folii PET 28 za pomocą wiązki lasera CO2 o długości fali 10,6 mikrometra. W wyniku kastomizacji w warstwie PDMS zostały wycięte krawędzie mikrokanałów 7 (zasilającego i odpływowego) o szerokości 3,9 mm zaokrąglonychThe microfluidic chip 2 is shown in Fig. 3, its structure and production method are discussed below. The microfluidic chip 2 consists of a chip lid 4, a chip functional layer 5 and a chip base 6. Before the customization of the prefabricated functional layer shown in Fig. 8, a design was made in the CAD environment of the artificial tissue structure and based on the design, a two-dimensional PDMS foil engraving map was prepared 29. The map was then automatically exported to the engraving station and automatically transferred to the PDMS 29 foil according to a commonly known procedure. The functional layer of the chip 5 was made of a prefabricated functional layer by customizing the PDMS layer 29 on the PET film 28 with a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 micrometers. As a result of customization in the PDMS layer, the edges of the microchannels 7 (supply and outlet) with a width of 3.9 mm rounded were cut

PL 240 748 B1 na swych zakończeniach, komory hodowlanej 8 o szerokości 6,7 mm i długości 15 mm, połączonej z mikrokanałami 7 (doprowadzającym i odprowadzającym) oraz dwóch przegród 9 komory hodowlanej o wymiarach 0,7/1 mm (szerokość/wysokość), a PDMS z wnętrza kanałów i komory został mechanicznie usunięty, tak by na folii PET 28 pozostały jego fragmenty tworzące przegrody komory hodowlanej 8. Wieko czipa 4 i podstawa czipa 6 oraz skastomizowana warstwa funkcjonalna czipa 5 zostały wzajemnie połączone w sposób hydraulicznie szczelny i nierozłączny, w ten sposób, że ich właściwości powierzchniowe zostały zmodyfikowane za pomocą plazmy powietrznej w niskociśnieniowej komorze plazmowej zgodnie z ogólnie znaną procedurą. Warstwa funkcjonalna czipa 5 została spozycjonowana z wykorzystaniem otworów pozycjonujących 17 oraz trzpieni pozycjonujących 3 i złączona z wiekiem czipa 4 od strony arkusza szkła 19, a następnie dociśnięta z siła 1 kg/cm² i pozostawiona pod naciskiem przez okres 10 min, po czym usunięto arkusz foli nośnej 28. Następnie w ten sposób odsłoniętą powierzchnię folii PDMS 29 zmodyfikowano za pomocą plazmy powietrznej w niskociśnieniowej komorze plazmowej zgodnie z tą samą procedurą, spozycjonowano z podstawą czipa 6 od strony arkusza szkła 26, złączono i pozostawiono pod naciskiem o sile 1 kg/cm² na okres 10 min.At its ends, a rearing chamber 8 6.7 mm wide and 15 mm long, connected to microchannels 7 (supply and discharge) and two partitions 9 of the rearing chamber with dimensions of 0.7 / 1 mm (width / height) , and the PDMS from the inside of the channels and the chamber was mechanically removed so that its fragments forming partitions of the rearing chamber 8 remain on the PET film 28. in that their surface properties were modified by means of air plasma in a low pressure plasma chamber according to a generally known procedure. The functional layer of chip 5 was positioned with the use of positioning holes 17 and positioning pins 3 and bonded to the lid of the chip 4 on the side of the glass sheet 19, then pressed with a force of 1 kg / cm ² and left under pressure for a period of 10 minutes, after which the sheet was removed of the support foil 28. Then, the thus exposed surface of the PDMS 29 foil was modified with air plasma in a low-pressure plasma chamber according to the same procedure, positioned with the base of the chip 6 on the side of the glass sheet 26, bonded and left under a pressure of 1 kg / cm. ² for 10 minutes.

Prefabrykowany blok generatora 10 został przedstawiony na rysunku fig. 5, poniżej omówiono jego budowę oraz sposób wytwarzania. Blok generatora 10 o wymiarach całkowitych 60/24/62 mm (długość/szerokość/wysokość) wykonany został z PMMA metodą formowania wtryskowego i posiada wtyk generatora 14 o wysokości 10 mm dopasowany wymiarami i położeniem do gniazda generatora 23 i 27 w czipie mikrofluidalnym 2 oraz podstawę generatora 15 o wysokości 52 mm. W podstawie 15 od spodu wykonany został prostopadłościenny otwór pozycjonujący magnes 16 o wymiarach 12/12/12 mm (szerokość/wysokość/głębokość) dopasowany wymiarami do wymiaru magnesu stałego 12. W czterech narożnikach podstawy 15 wykonane zostały przelotowe otwory pozycjonujące 17 o średnicy 0,4 mm, które służą do wzajemnego, precyzyjnego pozycjonowania elementów magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej z wykorzystaniem trzpieni pozycjonujących 3 wprowadzanych w otwory pozycjonujące 17.The prefabricated generator block 10 is shown in Fig. 5, its structure and manufacturing method is discussed below. The generator block 10 with total dimensions of 60/24/62 mm (length / width / height) was made of PMMA by injection molding and has a generator plug 14 with a height of 10 mm, matched with dimensions and location to the generator socket 23 and 27 in the microfluidic chip 2 and generator base 15 52 mm high. In the base 15, from the bottom, a rectangular hole for positioning the magnet 16 with dimensions 12/12/12 mm (width / height / depth) was made, adjusted to the dimensions of the permanent magnet 12. In four corners of the base 15, positioning holes 17 with a diameter of 0 were made, 4 mm, which are used for mutual, precise positioning of the elements of the magnetic-hydrodynamic microfluidic platform with the use of positioning pins 3 inserted into the positioning holes 17.

Generator mikropola magnetycznego 1 został przedstawiony na rysunku fig. 4, poniżej omówiono jego budowę oraz sposób wytwarzania. Generator złożony jest z bloku generatora 10, dziewiętnastu cylindrycznych trzpieni ferromagnetycznych 11 o średnicy fi 0,1 mm i długości 50 mm wykonanych ze stali SS430 oraz neodymowego sześciennego magnesu stałego 12 o wymiarach 12/12/12 mm typu N52. Przed przystąpieniem do kastomizacji prefabrykowanego bloku generatora mikropola magnetycznego 1 przedstawionego na fig. 5, wykonano projekt w środowisku CAD struktury sztucznej tkanki i na podstawie projektu przygotowano dwuwymiarową mapę grawerowania bloku generatora. Następnie mapa ta została automatycznie wyeksportowana do stacji grawerującej i automatycznie przeniesiona na blok generatora zgodnie z powszechnie znaną procedurą. Blok generatora 10 został wykonany z prefabrykowanego bloku generatora mikropola magnetycznego poprzez kastomizację za pomocą wiązki lasera CO2 o długości fali 10,6 mikrometra. W wyniku kastomizacji w blokach generatora 10 zostały wykonane zgodnie z ogólnie znaną procedurą przelotowe otwory trzpieni ferromagnetycznych 13 o średnicach dopasowanych do średnicy trzpieni ferromagnetycznych 11 i w miejscach przewidzianych w projekcie. Następnie, w tak przygotowane otwory wprowadzone zostały trzpienie ferromagnetyczne 11 w ten sposób, by płaszczyzny ich zakończeń były zlicowane z górną powierzchnią wtyku generatora 14. Następnie do otworu pozycjonującego magnes 16 w podstawie generatora 15, w obrębie trzpieni ferromagnetycznych 11 wprowadzono 0,05 ml kleju fotoutwardzalnego, a następnie wprowadzono w otwór pozycjonujący magnes 16 magnes stały 12, po czym klej utwardzono pod lampą UV przez 1 minutę i w ten sposób trwale zespolono wszystkie elementy.The magnetic microfield generator 1 is shown in Fig. 4, its structure and production method are discussed below. The generator consists of a generator block 10, nineteen cylindrical ferromagnetic pins 11 with a diameter of 0.1 mm and a length of 50 mm made of SS430 steel and a cubic neodymium permanent magnet 12 with dimensions of 12/12/12 mm type N52. Prior to the customization of the prefabricated magnetic micropfield generator block 1 shown in Fig. 5, a CAD design of the artificial tissue structure was made and a two-dimensional generator block engraving map was prepared on the basis of the design. The map was then automatically exported to the engraving station and automatically transferred to the generator block according to a well-known procedure. The generator block 10 was made from a prefabricated magnetic micropfield generator block by customization with a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 micrometers. As a result of the customization, in the generator blocks 10, in accordance with the generally known procedure, through holes of the ferromagnetic pins 13 with diameters matching the diameter of the ferromagnetic pins 11 and in the places provided for in the design. Then, ferromagnetic pins 11 were introduced into the holes prepared in such a way that the planes of their ends were flush with the upper surface of the generator plug 14. Then, 0.05 ml of glue was introduced into the hole positioning the magnet 16 in the generator base 15, within the ferromagnetic pins 11. and then the permanent magnet 12 was inserted into the positioning hole of the magnet 16, then the adhesive was hardened under a UV lamp for 1 minute, and thus all elements were permanently bonded.

Magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna została przedstawiona na rysunku fig. 1, poniżej omówiono jej budowę oraz sposób wytwarzania. Platforma złożona jest z generatora mikropola magnetycznego 1, czipa mikrofluidalnego 2 oraz czterech trzpieni pozycjonujących 3. Czip mikrofluidalny 2 został spozycjonowany na generatorze mikropola magnetycznego 1 z wykorzystaniem otworów pozycjonujących 17 i wprowadzonych w otwory trzpieni pozycjonujących 3 o średnicy 0,35 mm i długości 60 mm, w ten sposób by wtyk generatora 14 wprowadzony został w gniazdo generatora 27 w podstawie czipa 6 i ściśle przylegał do powierzchni arkusza szkła podstawy 26.The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform is shown in Fig. 1, its structure and production method are discussed below. The platform consists of a magnetic field generator 1, a microfluidic chip 2 and four positioning pins 3. The microfluidic chip 2 was positioned on the magnetic field generator 1 using positioning holes 17 and positioning pins 3 with a diameter of 0.35 mm and a length of 60 mm inserted into the holes. so that the plug of the generator 14 is inserted into the socket of the generator 27 in the base of the chip 6 and flattened against the surface of the sheet of glass of the base 26.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Sposób prowadzenia hodowli sztucznej tkanki nowotworowej w postaci przepływowego, unaczynionego klastra o grubości 0,5 mm w mikropolu magnetycznym z wykorzystaniem magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej złożonej z czipa mikrofluidalnego 2 i jednego generatora mikropola magnetycznego 1 polega na tym, że:The method of culturing an artificial neoplastic tissue in the form of a 0.5 mm thick vascularized flow-through cluster in a magnetic micro-field with the use of a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform consisting of a microfluidic chip 2 and one magnetic micro-field generator 1 is as follows:

PL 240 748 B1PL 240 748 B1

1. W pierwszym etapie przeprowadzono separację i koncentrację w probówce komórek prawidłowych fibroblastów człowieka linii Hs 578Bst z 5 ml ich zawiesiny o koncentracji 1x10⁵ komórek w referencyjnym medium hodowlanym z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikrokapsułek magnetycznych o średnicy jednego mikrometra, modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi BerEP4 przeciw antygenowi człowieka EpCAM zgodnie z referencyjną procedurą separacji zalecaną przez producenta. Następnie agregaty mikrokapsułka-komórka ponownie zawieszono w medium hodowlanym o objętości 0,5 ml, w ten sposób uzyskując ich 10 krotną koncentrację w stosunku do wyjściowej zawiesiny komórkowej. Następnie przeprowadzono separację i koncentrację w probówce komórek nowotworowych raka piersi linii człowieka SK-BR-3 z 2 ml ich zawiesiny o koncentracji 1x106 komórek w referencyjnym medium hodowlanym z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikrokapsułek magnetycznych o średnicy jednego mikrometra, modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi BerEP4 przeciw antygenowi człowieka EpCAM zgodnie z referencyjną procedurą separacji zalecaną przez producenta. Następnie agregaty mikrokapsułka-komórka ponownie zawieszono w medium hodowlanym o objętości 0,1 ml, w ten sposób uzyskując ich 20 krotną koncentrację w stosunku do wyjściowej zawiesiny komórkowej. Następnie przeprowadzono separację i koncentrację w probówce pierwotnych, prawidłowych komórek śródbłonka (HUVEC) człowieka z 1 ml ich zawiesiny o koncentracji 5x105 komórek w referencyjnym medium hodowlanym z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikrokapsułek magnetycznych o średnicy trzech mikrometrów, modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi przeciw antygenowi człowieka CD31 zgodnie z referencyjną procedurą separacji zalecaną przez producenta. Następnie agregaty mikrokapsułka-komórka ponownie zawieszono w medium hodowlanym o objętości 0,1 ml, w ten sposób uzyskując ich 10 krotną koncentrację w stosunku do wyjściowej zawiesiny komórkowej.1. In the first stage, the separation and concentration of normal human fibroblasts of the Hs 578Bst line from 5 ml of their suspension with the concentration of 1x10 ⁵ cells in the reference culture medium were separated and concentrated in a test tube using commercially available magnetic microcapsules with a diameter of one micrometer, surface-modified with BerEP4 monoclonal antibodies against the antigen human EpCAM according to the manufacturer's recommended separation procedure. Then, the microcapsule-cell aggregates were resuspended in the culture medium with a volume of 0.5 ml, thus obtaining a 10-fold concentration of the original cell suspension. Then, the separation and concentration in a test tube of human breast cancer SK-BR-3 tumor cells from 2 ml of their suspension with a concentration of 1x106 cells in a reference culture medium was performed using commercially available magnetic microcapsules with a diameter of one micrometer, surface-modified with BerEP4 monoclonal antibodies against human antigen EpCAM in accordance with the manufacturer's recommended separation procedure. Then, the microcapsule-cell aggregates were resuspended in the culture medium with a volume of 0.1 ml, thus obtaining a concentration of 20 times compared to the original cell suspension. Subsequently, the separation and concentration in a test tube of human primary normal endothelial cells (HUVEC) was performed from 1 ml of their suspension with a concentration of 5x105 cells in the reference culture medium using commercially available magnetic microcapsules with a diameter of three micrometers, surface-modified with monoclonal antibodies against the human antigen CD31 in accordance with the reference separation procedure recommended by the manufacturer. Subsequently, the microcapsule-cell aggregates were resuspended in the culture medium with a volume of 0.1 ml, thus obtaining a 10-fold concentration of the original cell suspension.

2. W drugim etapie pobrano za pomocą strzykawki z probówki 0,5 ml skoncentrowanej zawiesiny agregatów mikrokapsułka-komórka prawidłowych fibroblastów linii Hs 578Bst i zatłoczono do wężyka przyłączeniowego 20 sterylnego czipa mikrofluidalnego 2 umieszczonego na generatorze mikropola magnetycznego 1 w ciągu 1 minuty. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego 2 na wysokości trzpieni ferromagnetycznych 11 w postaci klastrów komórkowych, a nadmiar medium hodowlanego wypłyną poza układ wężykiem przyłączeniowym 20 (wypływowym).2. In the second step, 0.5 ml of a concentrated suspension of microcapsule-cell aggregates of normal fibroblasts of the Hs 578Bst line was taken from the test tube by means of a syringe and injected into the connection tube 20 of the sterile microfluidic chip 2 placed on the magnetic micropfield generator 1 for 1 minute. The microcapsule-cell aggregates are stopped within the growth chamber 8 of the microfluidic chip 2 at the height of the ferromagnetic pins 11 in the form of cell clusters, and the excess of the culture medium will flow out of the connection tube 20 system (outflow).

3. W trzecim etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 na wlocie czipa mikrofluidalnego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 48 godzin w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy zmiennym natężeniu przepływu. Natężenie przepływu medium hodowlanego było ustawione w ten sposób, że pierwszy dwugodzinny interwał był bez przepływu medium, a następujący po nim drugi dwugodzinny interwał był z przepływem medium o natężeniu 0,1 ml/godzinę. Interwały powtarzały się cyklicznie kolejno po sobie.3. In the third stage, the connection tube 20 at the inlet of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for 48 hours in an incubator at 37 ° C with varying intensity. flow. The flow rate of the culture medium was set such that the first two-hour interval was without media flow, and the second two-hour interval that followed was with a media flow of 0.1 ml / hour. The intervals were repeated in succession.

4. W czwartym etapie, po odłączeniu pompy strzykawkowej do wężyka przyłączeniowego 20 czipa mikrofluidalnego 2 i połączeniu ze strzykawką, wprowadzono za jej pomocą 0,1 ml uprzednio przygotowanej skoncentrowanej zawiesiny agregatów komórka-mikrokapsułka komórek nowotworowych raka piersi linii człowieka SK-BR-3 z natężeniem 1 ml/minutę. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego 2 w rejonie rdzeni ferromagnetycznych 11 opłaszczając dookoła uprzednio utworzone klastry komórkowe złożone z komórek prawidłowych.4. In the fourth step, after disconnecting the syringe pump from the connection tube 20 of the microfluidic chip 2 and connecting it to the syringe, 0.1 ml of a previously prepared concentrated suspension of cell-microcapsule aggregates of the human breast cancer SK-BR-3 line with at a rate of 1 ml / minute. Microcapsule-cell aggregates arrested within the growth chamber 8 of the microfluidic chip 2 in the area of ferromagnetic cores 11, wrapping around previously formed cell clusters composed of normal cells.

5. W piątym etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 (wlotowy) czipa mikrofluidlanego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 24 godzin w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy stałym natężeniu przepływu o wartości 0,5 ml/godzinę.5. In the fifth step, the connection tube 20 (inlet) of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for a period of 24 hours in an incubator at 37 ° C at a constant temperature. a flow rate of 0.5 ml / hour.

6. W szóstym etapie, po odłączeniu pompy strzykawkowej, do wężyka przyłączeniowego 20 (wlotowego) czipa mikrofluidlanego 2 wprowadzono za pomocą strzykawki 0,1 ml uprzednio przygotowanej skoncentrowanej zawiesiny agregatów komórka-mikrokapsułka komórek śródbłonka człowieka HUVEC z natężeniem z natężeniem 6 ml/minutę. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego 2 w rejonie rdzeni ferromagnetycznych 11 opłaszczając dookoła uprzednio utworzone klastry komórkowe złożone z komórek prawidłowych i komórek nowotworowych.6. In the sixth step, after disconnecting the syringe pump, 0.1 ml of the previously prepared concentrated suspension of HUVEC human endothelial cells cell-microcapsule aggregates was introduced into the connection tube (inlet) of the microfluidic chip 2 with a syringe at the rate of 6 ml / minute. Microcapsule-cell aggregates arrested within the growth chamber 8 of the microfluidic chip 2 in the region of ferromagnetic cores 11, wrapping around previously formed cell clusters composed of normal cells and tumor cells.

PL 240 748 B1PL 240 748 B1

7. W siódmym etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 (wlotowy) czipa mikrofluidalnego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 7 dni w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy stałym natężeniu przepływu o natężeniu 1 ml/godzinę. Medium w strzykawce uzupełniano okresowo co 24 h.7. In the seventh step, the connection tube 20 (inlet) of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for a period of 7 days in an incubator at 37 ° C at a constant temperature. a flow rate of 1 ml / hour. The medium in the syringe was replenished periodically every 24 hours.

8. W ósmym etapie przeprowadzono badania z wykorzystaniem utworzonego modelu zmiany nowotworowej, w ten sposób, że czip mikrofluidalny 2 po odłączeniu pompy strzykawkowej, rozłączono z generatorem mikropola magnetycznego 1, komórki w mikrosystemie wybarwiono z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu live/dead zgodnie ze standardową procedurą, a następnie umieszczono pod odwróconym epifluorescencyjnym mikroskopem optycznym i obserwowano obszary nekrotryczne w obrębie sztucznej tkanki nowotworowej.8. In the eighth stage, studies were carried out with the use of the created model of the neoplastic lesion, in such a way that the microfluidic chip 2, after disconnecting the syringe pump, was disconnected with the magnetic micropfield generator 1, cells in the microsystem were stained using a commercially available live / dead kit according to the standard procedure and then placed under an inverted epifluorescence optical microscope and necrotic areas within the artificial tumor tissue were observed.

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Wieko czipa 4 mikrofluidalnego zostało wykonane zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą, że wysokość pokrywy czipa 18 wynosiła 3 mm oraz wysokość arkusza szkła 19 ze szkła borosilikatowego wynosiła 0,15 mm. W pokrywie wykonane zostały dwa cylindryczne, zamknięte od góry zbiorniki odpowietrzające 21 o średnicy 3,9 mm i wysokości 2 mm, połączone z bocznymi kanałami czipa 22 (zasilającym i wypływowym) o średnicy 1 mm.The lid of the microfluidic chip 4 was made according to the parameters and procedure of Embodiment 1, except that the height of the lid of the chip 18 was 3 mm and the height of the borosilicate glass sheet 19 was 0.15 mm. Two cylindrical venting tanks 21 with a diameter of 3.9 mm and a height of 2 mm, connected to the side channels of the chip 22 (feeding and outflow) with a diameter of 1 mm, are made in the cover.

Podstawa czipa mikrofluidalnego 6 została wykonana zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą, że wysokość osłony podstawy 25 wynosi 3 mm, wysokość arkusza szkła 19 ze szkła borosilikatowego wynosi 0,15 mm.The base of the microfluidic chip 6 was made according to the parameters and procedure of Embodiment 1, except that the height of the base skirt 25 is 3mm, the height of the borosilicate glass sheet 19 is 0.15mm.

Prefabrykowana warstwa funkcjonalna czipa 5 mikrofluidalnego została wykonana zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą, że wysokość warstwy PDMS 29 wynosi 0,02‘mm.The prefabricated functional layer of the microfluidic chip was made according to the parameters and procedure of embodiment 1, with the difference that the height of the PDMS layer 29 is 0.02 'mm.

Czip mikrofluidalny 2 i sposób jego wytwarzania, został wykonany zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1 z tą różnicą, że warstwa funkcjonalna czipa 5 została wykonana z prefabrykowanej warstwy funkcjonalnej 5 poprzez kastomizację warstwy PDMS 29 na folii PET 28 za pomocą wiązki lasera CO2 o długości fali 9,3 mikrometra.The microfluidic chip 2 and the method of its production were made according to the parameters and the procedure presented in the embodiment 1, with the difference that the functional layer of the chip 5 was made of a prefabricated functional layer 5 by customizing the PDMS layer 29 on the PET film 28 by means of a CO2 laser beam. with a wavelength of 9.3 micrometers.

Prefabrykowany blok generatora 10 mikropola magnetycznego został wykonany zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą że całkowita wysokość bloku generatora 10 wynosi 17 mm, wysokość wtyku generatora 14 wynosi 3 mm, a wysokość podstawy generatora 15 wynosi 14 mm.The prefabricated magnetic micropfield generator block 10 was fabricated according to the parameters and procedure of Embodiment 1, except that the overall height of the generator block 10 is 17mm, the height of the generator pin 14 is 3mm, and the height of the generator base 15 is 14mm.

Generator mikropola magnetycznego 1 został wykonany zgodnie z parametrami i procedurą przedstawioną w przykładzie realizacji 1, z tą różnicą, że średnica trzpieni ferromagnetycznych 11 wynosi 0,5 mm, a długość 5 mm. Blok generatora 10 został wykonany z prefabrykowanego bloku generatora 10 mikropola magnetycznego poprzez kastomizację za pomocą wiązki lasera CO2 o długości fali 9,3 mikrometra. Wykorzystano magnes neodymowy typu N35.The magnetic field generator 1 was made according to the parameters and procedure of embodiment 1, with the difference that the diameter of the ferromagnetic pins 11 is 0.5 mm and the length is 5 mm. The generator block 10 was made from the prefabricated magnetic micropfield generator block 10 by customization with a CO2 laser beam with a wavelength of 9.3 micrometers. The N35 type neodymium magnet was used.

Magnetyczno-hydrodynamiczna platforma mikrofluidalna została przedstawiona na rysunku fig. 2. Platforma złożona jest z dwóch naprzeciwległych generatorów mikropola magnetycznego 1, czipa mikrofluidalnego 2 oraz czterech trzpieni pozycjonujących 3. Czip mikrofluidalny 2 został spozycjonowany na generatorze mikropola magnetycznego 1 z wykorzystaniem otworów pozycjonujących 17 i wprowadzonych w otwory trzpieni pozycjonujących 3 o średnicy 0,35 mm i długości 40 mm, w ten sposób by wtyki generatorów 14 wprowadzone zostały w gniazda generatora w osłonie podstawy 27 i w pokrywie 23 i ściśle przylegały do powierzchni arkusza szkła 26 i 19 w podstawie 6 i wieku czipa 4.The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform is shown in Fig. 2. The platform is composed of two opposing magnetic micropfield generators 1, a microfluidic chip 2 and four positioning pins 3. The microfluidic chip 2 was positioned on the magnetic micro-field generator 1 using positioning holes 17 and introduced into the holes of the positioning pins 3 with a diameter of 0.35 mm and a length of 40 mm, in such a way that the generator pins 14 are inserted into the generator sockets in the base cover 27 and in the cover 23 and tightly adhere to the surface of the glass sheet 26 and 19 in the base 6 and the lid chip 4.

P r z y k ł a d 4P r z k ł a d 4

Sposób prowadzenia hodowli sztucznej tkanki w postaci przepływowego, unaczynionego klastra o grubości 0,02 mm w mikropolu magnetycznym z wykorzystaniem magnetyczno-hydrodynamicznej platformy mikrofluidalnej złożonej z czipa mikrofluidalnego 2 i dwóch generatorów mikropola magnetycznego 1 polega na tym, że:The method of culturing artificial tissue in the form of a flow, vascularized cluster with a thickness of 0.02 mm in a magnetic micropole with the use of a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform consisting of a microfluidic chip 2 and two generators of a magnetic micropfield 1 consists in:

1. W pierwszym etapie przeprowadzono separację i koncentrację w probówce komórek prawidłowych fibroblastów człowieka linii Hs 578Bst z 10 ml ich zawiesiny o koncentracji 5x10⁵komórek w referencyjnym medium hodowlanym z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikrokapsułek magnetycznych o średnicy jednego mikrometra, modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi BerEP4 przeciw antygenowi człowieka EpCAM zgodnie z referencyjną procedują separacji zalecaną przez producenta. Następnie agregaty mikrokapsułka-komórka ponownie zawieszono w medium hodowlanym o objętości 0,5 ml, w ten1. In the first stage, the separation and concentration of normal human fibroblasts of the Hs 578Bst line from 10 ml of their suspension with the concentration of 5x10 ⁵ cells in the reference culture medium were separated and concentrated in a test tube using commercially available magnetic microcapsules with a diameter of one micrometer, surface-modified with BerEP4 monoclonal antibodies against the antigen human EpCAM in accordance with the reference separation procedure recommended by the manufacturer. The microcapsule-cell aggregates were then resuspended in 0.5 ml culture medium therein

PL 240 748 B1 sposób uzyskując ich 20 krotną koncentrację w stosunku do wyjściowej zawiesiny komórkowej. Następnie przeprowadzono separację i koncentrację w probówce pierwotnych, prawidłowych komórek śródbłonka (HUVEC) człowieka z 1 ml ich zawiesiny o koncentracji 5x105 komórek w referencyjnym medium hodowlanym z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych mikrokapsułek magnetycznych o średnicy trzech mikrometrów, modyfikowanych powierzchniowo przeciwciałami monoklonalnymi przeciw antygenowi człowieka CD31 zgodnie z referencyjną procedurą separacji zalecaną przez producenta. Następnie agregaty mikrokapsułka-komórka ponownie zawieszono w medium hodowlanym o objętości 0,5 ml, w ten sposób uzyskując ich 2 krotną koncentrację w stosunku do wyjściowej zawiesiny komórkowej.The result was a 20-fold concentration with respect to the initial cell suspension. Subsequently, the separation and concentration in a test tube of human primary normal endothelial cells (HUVEC) was performed from 1 ml of their suspension with a concentration of 5x105 cells in the reference culture medium using commercially available magnetic microcapsules with a diameter of three micrometers, surface-modified with monoclonal antibodies against the human antigen CD31 in accordance with the reference separation procedure recommended by the manufacturer. Then the microcapsule-cell aggregates were resuspended in the culture medium with a volume of 0.5 ml, thus obtaining a 2-fold concentration of the original cell suspension.

2. W drugim etapie pobrano za pomocą strzykawki z probówki 0,5 ml skoncentrowanej zawiesiny agregatów mikrokapsułka-komórka prawidłowych fibroblastów linii Hs 578Bst i zatłoczono do wężyka przyłączeniowego 20 (wlotowego) sterylnego czipa mikrofluidalnego 2 umieszczonego pomiędzy dwoma generatorami mikropola magentycznego 1 platformy mikrofluidalnej w ciągu 3 sekund. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego 2 na wysokości trzpieni ferromagnetycznych 11 w postaci klastrów komórkowych, a nadmiar medium hodowlanego wypłyną poza układ wężykiem przyłączeniowym 20 (wypływowym).2. In the second stage, 0.5 ml of a concentrated suspension of microcapsule-cell aggregates of normal fibroblasts of the Hs 578Bst line was taken from the test tube by means of a syringe and pumped into the connection tube 20 (inlet) of the sterile microfluidic chip 2 placed between the two generators of the magentic micro-field and the microfluidic platform in the line 3 seconds. The microcapsule-cell aggregates are stopped within the growth chamber 8 of the microfluidic chip 2 at the height of the ferromagnetic pins 11 in the form of cell clusters, and the excess of the culture medium will flow out of the connection tube 20 system (outflow).

3. W trzecim etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 (wlotowy) czipa mikrofluidalnego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 3 godzin w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy stałym natężeniu przepływu medium hodowlanego wynoszącym 10 ml/godzinę.3. In the third step, the connection tube 20 (inlet) of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for a period of 3 hours in an incubator at 37 ° C at a constant temperature. a flow rate of the culture medium of 10 ml / hour.

4. W czwartym etapie, po odłączeniu pompy strzykawkowej od wężyka przyłączeniowego 20 czipa mikrofluidalnego 2 i połączeniu ze strzykawką, ponownie wprowadzono za pomocą strzykawki 0,5 ml skoncentrowanej zawiesiny agregatów mikrokapsułka-komórka prawidłowych fibroblastów linii Hs 578Bst i zatłoczono do wężyka przyłączeniowego 20 na wlocie do sterylnego czipa mikrofluidalnego 2 umieszczonego pomiędzy dwoma generatorami mikropola magnetycznego 1 platformy mikrofluidalnej w ciągu 10 sekund. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego na wysokości trzpieni ferromagnetycznych 11 opłaszczając dookoła uprzednio utworzone klastry komórkowe, a nadmiar medium hodowlanego wypłyną poza układ wężykiem przyłączeniowym 20 (wylotowym) z czipa mikrofluidalnego 2.4. In the fourth step, after disconnecting the syringe pump from the connection tube 20 of the microfluidic chip 2 and connecting it to the syringe, 0.5 ml of a concentrated suspension of microcapsule-cell aggregates was reintroduced with a syringe of normal fibroblasts of the Hs 578Bst line and pumped into the connection tube 20 at the inlet to a sterile microfluidic chip 2 placed between two magnetic micropfield generators and a microfluidic platform within 10 seconds. The microcapsule-cell aggregates are stopped within the growth chamber 8 of the microfluidic chip at the height of the ferromagnetic pins 11, wrapping around the previously formed cell clusters, and the excess of the culture medium will flow out of the system through the connection tube 20 from the microfluidic chip 2.

5. W piątym etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 (wlotowy) czipa mikrofluidalnego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 48 godzin w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy stałym natężeniu przepływu o wartości 0,3 ml/godzinę.5. In the fifth step, the connection tube 20 (inlet) of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for 48 hours in an incubator at 37 ° C at a constant temperature. a flow rate of 0.3 ml / hour.

6. W szóstym etapie, po odłączeniu pompy strzykawkowej od wężyka przyłączeniowego 20 czipa mikrofluidalnego 2 i połączeniu ze strzykawką, wprowadzono za jej pomocą 0,1 ml uprzednio przygotowanej skoncentrowanej zawiesiny agregatów komórka-mikrokapsułka komórek śródbłonka człowieka HUVEC z natężeniem 6 ml/min. Agregaty mikrokapsułka-komórka zatrzymały się w obrębie komory hodowlanej 8 czipa mikrofluidalnego 2 w rejonie rdzeni ferromagnetycznych 11 opłaszczając dookoła uprzednio utworzone klastry komórkowe złożone z komórek prawidłowych.6. In the sixth step, after disconnecting the syringe pump from the connection tube 20 of microfluidic chip 2 and connecting it to the syringe, 0.1 ml of the previously prepared concentrated suspension of cell-microcapsule HUVEC human endothelial cells was introduced with the help of the syringe at the rate of 6 ml / min. Microcapsule-cell aggregates arrested within the growth chamber 8 of the microfluidic chip 2 in the area of ferromagnetic cores 11, wrapping around previously formed cell clusters composed of normal cells.

7. W siódmym etapie połączono wężyk przyłączeniowy 20 (wlotowy) czipa mikrofluidalnego 2 ze strzykawką o objętości 50 ml, umieszczoną w pompie strzykawkowej, wypełnioną referencyjnym medium hodowlanym i prowadzono hodowlę komórek przez okres 24 godzin w cieplarce, w temperaturze 37°C, przy stałym natężeniu przepływu o natężeniu 1 ml/godzinę.7. In the seventh step, the connection tube 20 (inlet) of the microfluidic chip 2 was connected to a 50 ml syringe placed in the syringe pump, filled with the reference culture medium, and the cells were cultured for 24 hours in an incubator at 37 ° C at a constant temperature. a flow rate of 1 ml / hour.

8- 15. Następnie w etapach od osiem do piętnaście czterokrotnie sekwencyjnie powtarzano czynności opisane w etapach sześć i siedem.8-15. Steps six and seven were then repeated four times sequentially in steps eight to fifteen.

16. W szesnastym etapie przeprowadzono badania z wykorzystaniem utworzonej sztucznej tkanki, w ten sposób, że czip mikrofluidalny 2 odłączono od generatorów mikropola magentycznego 1 platformy mikrofluidalnej bez odłączania od pompy strzykawkowej, a następnie umieszczono pod mikroskopem optycznym i obserwowano przepływ medium w naczyniach sztucznej tkanki.16. In the sixteenth step, tests were carried out with the artificial tissue formed, in such a way that the microfluidic chip 2 was disconnected from the generators of the magnetic field and the microfluidic platform without disconnecting it from the syringe pump, and then placed under an optical microscope and the flow of the medium in the artificial tissue vessels was observed.

Claims

PL 240 748 B1

Patent claims

1. Magnetic-hydrodynamic microfluidic platform consisting of prefabricated elements of the lid (4) and base (6) and a customizable functional layer (5), and the lid (4) consists of a cover (18), a glass sheet of a lid (19) and tubes (20), while the base (6) consists of the base shell (25) and the base glass sheet (26), and the functional layer (5) consists of a thin PDMS (polydimethylsiloxane) layer (29) characterized by consists of a flow-through microfluidic chip (2) equipped with a growing chamber (8) and a magnetic micropfield generator seat (23), and one or two magnetic field generators (1), each of the magnetic field generators (1) consisting of a permanent magnet ( 12), a series of ferromagnetic pins (11) and a generator block (10) having a generator plug (14); the system of microchannels (7) and culture chambers (8) in the flow-through microfluidic chip (2) and the system of ferromagnetic pins (11) of the magnetic microfield generator (1) are mutually correlated in such a way that the ferromagnetic pins (11) in the platform run in parallel from the surface of the growing chamber (8) to the surface of the permanent magnet (12).

2. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1. Characterized in that the generator seat (23) comprises an area of the growth chamber (8) of the flow-through microfluidic chip (2).

3. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, The socket of claim 1, characterized in that the generator socket in the lid (23) is formed in the base shell (25) and in the cover (18).

4. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 3. The method of claim 1, characterized in that inside the rearing chambers (8) there are partitions (9) which form a field of velocity and vorticity of the fluid inside it.

5. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 5. The glass sheet of claim 1, wherein the glass sheets of the lid (19) and base (26) are made of borosilicate glass for epifluorescence with a thickness of not more than 150 micrometers.

6. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, Characterized in that the generator plug (14) has an elevated plane parallel to the surface of the rearing chamber (8), matching in shape and position to the generator socket in the lid (23) and to the generator socket in the base (27).

7. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 3. The generator plug surface (14) is spaced from the surface of the permanent magnet (12) by a distance of 5 to 50 mm from the surface of the permanent magnet (12).

8. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1. The method of claim 1, characterized in that the holes of the ferromagnetic pins (13) are located in the area of the generator plug (14).

9. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1. 3. The surface of the permanent magnet positioning hole (16) in the base of the generator (15) comprises the area of the rearing chamber (8) as claimed in claim 1.

10. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 9. The plate magnet according to claim 9, characterized in that plate magnets from the group N35 to N52 are used.

11. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1. A material according to claim 1, characterized in that the ferromagnetic pins (11) are made of ferromagnetic steel, most preferably of the SS 430 type.

12. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 2. A method according to claim 1, characterized in that the ferromagnetic pins (11) have a diameter of 100 to 500 micrometers.

13. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1, 3. The apparatus of claim 1, characterized in that the ferromagnetic pins (11) are perpendicular to the surface of the rearing chamber (8).

14. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 1. The method of claim 1, characterized in that the ferromagnetic mandrels (11) are distributed above and / or below the rearing chamber (8) at mutual distances not less than twice the diameter of the ferromagnetic mandrel (11).

PL 240 748 B1

15. The magnetic-hydrodynamic microfluidic platform according to claim 15. The method of claim 1, characterized in that the two co-operating magnetic micropfield generators (1) are positioned opposite above and below the flow-through microfluidic chip (2).

16. The method of producing a magnetic-hydrodynamic microfluidic platform, characterized in that on the basis of tomographic images or the results of computer simulations or artificial tissue design, two-dimensional maps of engraving or cutting of prefabricated structural elements of the microfluidic platform: a prefabricated functional layer (5) and generator blocks (10) are prepared. ), which are directly and automatically engraved or customized with a laser beam, thus creating microchannels (7) and culture chambers (8) and their partitions (9), as well as through holes of ferromagnetic pins (13) of the magnetic micropfield generator (1), and then all the prefabricated and customizable elements of the microfluidic platform are connected to each other.

17. The method according to p. Characterized in that the functional layer (5) is made of a prefabricated functional layer assembly by customizing the PDMS layer (29) with a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 or 9.3 micrometers and then removing the carrier foil (28).

18. The method according to p. 16, characterized in that during the customization of the PDMS layer (29) of the prefabricated functional layer (5), the structure of microchannels (7), breeding chambers (8) and their partitions (9) forming the velocity and vortex field is engraved or cut into the PDMS layer (29) breeding medium.

19. The method according to p. 16, characterized in that the cover (18) and the base cover (25) are connected to the glass sheets in a hydraulically tight and non-detachable manner by welding.

20. The method according to p. 16, characterized in that during the customization of the generator blocks (10), the through holes of the ferromagnetic pins (13) are engraved from the surface of the generator plug (14) to the surface of the permanent magnet (12) by means of a CO2 laser beam with a wavelength of 10.6 or 9.3 micrometer.

21. The method according to p. 16, characterized in that the ferromagnetic pins (11) are inserted into the through holes of the ferromagnetic pins (13) and permanently connected to the generator block (10) by means of an adhesive.

22. A method of culturing artificial tissues in a magnetic micropole, characterized in that in the first step, the separation and / or concentration of human or animal cells from their suspension is carried out by means of magnetic microcapsules that connect with the cells, and in the second step, the suspension of microcapsule-cell agglomerates is injected to the flow microfluidic chip (2) forming a unit with the magnetic micropfield generator (1), and the agglomerates are retained and positioned inside the culture chamber (8) in the areas determined by the location of ferromagnetic pins (11), in the third stage the cells are cultivated dynamically and dynamically the tissue is formed in the form of clusters by means of the velocity and vortex field of the culture medium controlled by partitions (9) in the flow microfluidic chip (2), the culture is carried out at a temperature of 37 ° C, and in subsequent stages it is reintroduced into the flow microfluidic chip (2) ) a suspension of microcapsule agglomerates the same and / or a different type of a cola-cell and the cultivation is carried out until the required tissue structure is obtained, in the last stage the research is carried out in the flow microfluidic chip (2) with the use of the artificial tissue created.

23. The method according to p. 22, characterized in that the diameter of the magnetic microcapsules is in the range of 1 to 3 micrometers.

24. The method according to p. The method of claim 22, characterized in that the surface of the magnetic microcapsules is surface modified with biotylated monoclonal antibodies against antigens present on the surface of human cells or on the surface of animal cells.

25. The method according to p. 24, characterized in that the surface of the magnetic microcapsules is modified with antibodies to the antigens EpCam, CD45, CD31, CD34.

26. The method according to p. 22. characterized in that the agglomerated cells are normal or neoplastic cells of a human or animal lineage or are human or animal primitive cells.

PL 240 748 B1

27. The method according to p. The method of claim 26, wherein the agglomeration uses human fibroblast cells, endothelial cells, and stem cells.

28. The method according to p. 22, characterized in that the culturing is carried out for a period of 3 hours to 7 days under flow conditions.

29. The method according to p. 22, characterized in that the formed cell cluster is in the form of a thin slice with a thickness of 0.02 to 0.5 mm.

30. The method according to p. 22 characterized in that the flow rate of the cell-microcapsule suspension introduced into the flow microfluidic chip (2) ranges from 0.5 ml / min to 10 ml / min.

31. The method according to p. The method of claim 22, wherein the flow rate of the culture medium ranges from 0.1 ml / hour to 10 ml / hour during the culturing of the cells.

32. The method according to p. 22, characterized in that the flow of the culture medium through the flow microfluidic chip (2) during cell culture is forced by a syringe pump.

33. The method according to p. 22, characterized in that the cultivation of the cells in a flow-through microfluidic chip (2) is carried out in an incubator.

34. The method according to p. 22, characterized in that the concentration of the microcapsule-cell agglomerate suspension introduced into the microfluidic flow chip (2) ranges from 1x106 to ^1x107 agglomerates per milliliter.

35. The method according to p. 22 and 34 characterized in that the suspension of the microcapsule-cell agglomerates is a suspension thereof in a reference culture medium for the agglomerated cells.

36. The method according to p. 22, characterized in that the cell clusters are formed from microcapsule-cell aggregates inside the culture chambers (8) directly above the ferromagnetic pins (11) or between opposed ferromagnetic pins (11) in the form of islands or pillars with a diameter equal to the diameter of the ferromagnetic pin (11) .