PL240159B1 - Sposób otrzymywania prolaktyny - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania prolaktyny polegający na tym, że do ekstrakcji stosuje się liofilizowane przysadki świńskie z zastosowaniem mieszanki zawierającej aceton zakwaszony kwasem solnym, a ekstrakt strąca się nadmiarem acetonu w ilości 2 - 10 objętości, korzystnie 3 - 5, o temp. 20°C, korzystnie w temp. (-15)-(-20°C), po czym uzyskany odwirowany kwaśny proszek acetonowy (KPA) suszy się acetonem i rozpuszcza się w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,05 M do 0,5 M, zaś część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem, a surową prolaktynę strąca się przy PH 4,8 - 5,8, po czym nadsącz oddziela się wirowaniem i liofilizuje, następnie osad surowej prolaktyny rozpuszcza się w kwasie octowym o stężeniu 0,05 M do 0,5 M, doprowadza się do pH - 2,6 i sączy się przez filtr membranowy o wielkości porów 0,8 µm do 1,2 µm, charakteryzuje się tym, że uzyskany przesącz poddaje się co najmniej jednej ultrafiltracji z zastosowaniem kaset, po ultrafiltracji koncentrat sączy się jałowo przez filtr sterylizujący, korzystnie 0,22 µm i rozlewa do opakowań jednostkowych, zamraża w temperaturze -40°C i liofilizuje poprzez ogrzewanie do temperatury +35°C, ponadto w tym sposobie stosuje się dynamiczną ekstrakcje liofilizowanych przysadek świńskich, zaś wartość pH koncentratu wynosi 2,6, a uzyskana wydajność prolaktyny o masie cząsteczkowej 23 kDa wynosi 97,4%, natomiast zawartość izomeru prolaktyny o masie cząsteczkowej 20 kDa wynosi 2,6%.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania prolaktyny, w szczególności czystej prolaktyny, z przysadek mózgowych zwierzęcych, w tym świńskich.

Znany jest z wynalazku PL204072B1 sposób ekstrakcji przysadek mózgowych zwierzęcych liofilizowanych lub świeżych zalkalizowanym wodnym alkoholem etylowym o stężeniu od 70% do 80%. Stosunek surowca do ekstrahenta wynosi od 1:4 do 1:20, a wartość pH wynosi od 9,0 do 10,5. Otrzymuje się osad prolaktyny. Znany jest również sposób ekstrakcji przysadek, w którym przysadki świńskie ekstrahuje się zakwaszonym acetonem, a po oddzieleniu nierozpuszczalnej części ekstrakt doprowadza się acetonem do 90%. Uzyskany osad kwaśnego proszku acetonowego (KPA) rozpuszcza się w 0,1 M roztworze kwasu octowego, a klarowny nadsącz doprowadza się do pH 4,8-5,8 i w ten sposób uzyskuje się surową prolaktynę.

Znane jest wielokierunkowe działanie prolaktyny. Obecnie opisanych jest ok. 300 funkcji prolaktyny u kręgowców, z czego ok. 80 u człowieka. Mimo różnic gatunkowych nie jest swoista gatunkowo. Do najważniejszego działania hormonu należy: mammogeneza, inicjacja i podtrzymywanie laktacji oraz udział w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej, ponadto prolaktyna może być stosowana w: stymulacji czynności szpiku kostnego zahamowanej przez chemioterapię, przeszczepu szpiku kostnego, oparzeniach i chorobie immunosupresyjnej, immunoterapii raka, infekcjach, może być stosowana również jako adiuwant limfocytów B in vivo. Prolaktyna rokuje perspektywę w terapii przeciwzawałowej, w regeneracji komórek wysp Largenhansa, a także w normalizacji gęstości kości. Szerokie działanie prolaktyny daje perspektywę stosowania hormonu w preparatach weterynaryjnych oraz przeznaczonych dla ludzi. Znane jest z wynalazku PL205012B1 zastosowanie prolaktyny w płynie do perfuzji i prezerwacji narządów i tkanek. Płyn zawierający prolaktynę wydłuża okres przechowywania narządów i tkanek oraz pozwala ograniczyć proces degradacji komórek graftu i tkanek. W opisie patentowym EP2179743B1 przedstawiono zastosowanie prolaktyny ze względu na jej udział regulacji reakcji immunologicznej organizmu, w postaci roztworu podawanego per os dla zwiększenia zdrowotności jednodniowych prosiąt ssących. Podstawą zastosowania prolaktyny w medycynie i weterynarii jest uzyskanie czystego, trwałego apirogennego hormonu.

Celem wynalazku jest sposób otrzymywania czystej prolaktyny poprzez oczyszczenie surowej prolaktyny.

Sposób otrzymywania prolaktyny według wynalazku polega na tym, że do ekstrakcji stosuje się liofilizowane przysadki świńskie z zastosowaniem mieszanki zawierającej aceton zakwaszony kwasem solnym. Sposób otrzymywania prolaktyny polega na dynamicznej ekstrakcji liofilizowanych przysadek świńskich. Uzyskany ekstrakt strąca się nadmiarem acetonu w ilości 2-10 objętości, a korzystniej 3-5, o temp. -20°C, a korzystnie w temp. (-15)-(-20°C), a uzyskany odwirowany osad suszy się acetonem, rozpuszcza się w wodnym roztworze kwasu octowego, część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem, a surową prolaktynę strąca się przy pH 4,8-5,8. Nadsącz oddziela się wirowaniem i liofilizuje, a osad prolaktyny rozpuszcza się w roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,05M do 0,5M. Uzyskany roztwór poddaje się wyjaławiającej filtracji przez sączek membranowy o wielkości porów od 0,8 do 1,2 μm w celu usunięcia z roztworu zanieczyszczeń mikrobiologicznych oraz substancji nierozpuszczalnych. Uzyskany jałowy roztwór zawiera prolaktynę o m. cz. 23 kDa, izomer prolaktyny o m.cz. 20 kDa oraz fragment o m.cz. 17 kDa i substancje o różnej masie cząsteczkowej. Po czym oddziela się zanieczyszczenia stosując co najmniej jedną ultrafiltrację z użyciem kasety Pellicon-XL 100 kDa lub Pellicon-XL 50 kDa lub Pellicon-XL 30 kDa lub Pellicon-XL 10 kDa.

Pozwala uzyskać prolaktynę o czystości 96,53% określoną metodą elektroforezy SDS (PAGE).

Korzystnie do koncentratu dodaje się albuminę i mannitol, a pH doprowadza się do wartości 3,5 lub 11,5, a uzyskaną mieszaninę poddaje się liofilizacji.

Po filtracji koncentrat sączy się jałowo przez filtr sterylizujący 0,22 μm i rozlewa do opakowań jednostkowych (szklane fiolki), zamraża w temperaturze -40°C i liofilizuje poprzez ogrzewanie do temperatury +35°C.

Oczyszczona prolaktyna zawiera hormon prolaktynę o masie cząsteczkowej 23 kDa (80,03%) oraz izohormon o masie cząsteczkowej 20 kDa (16,5%). Łączna zawartość procentowa prolaktyny wobec sumy wszystkich prążków wynosi 96,53%. Uzyskaną prolaktynę należy przechowywać w suchym pomieszczeniu, w temperaturze poniżej 20°C. Okres trwałości w temperaturze (-20°C) wynosi 5 lat, a w 2-8°C - 2 lata.

PL 240 159 B1

W procesie zgodnym z opisem wynalazku uzyskuje się prolaktynę o czystości na poziomie 96,53% wyznaczoną z zastosowaniem metody elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (SDS PAGE). Oczyszczona prolaktyna zawiera monomer prolaktyny o masie cząsteczkowej 23 kDa (46%) i fragment o masie 20 kDa.

Sposób według wynalazku jest przedstawiony w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d I. 500 g liofilizowanych przysadek świńskich zawieszono w 3 litrach mieszanki ekstrakcyjnej składającej się z 2,4 litra acetonu i 0,6 litra 2 molowego kwasu solnego. Całość przeniesiono do kolumny ekstrakcyjnej. Zawartość kolumny przemywano kolejnymi porcjami mieszanki ekstrakcyjnej. Uzyskany ekstrakt w ilości 5 litrów schłodzono do temp. (-20)°C, a następnie dodano 20 litrów schłodzonego acetonu. Odwirowano osad - kwaśny proszek acetonowy (KPA) i przemyto acetonem, a następnie wysuszono. Uzyskano 59,2 g KPA. Z 1 kg świeżych przysadek uzyskuje się 170 g przysadek liofilizowanych. Z 1 kg przysadek liofilizowanych otrzymuje się 20-30 g KPA. KPA rozpuszcza się w 6,0 l 0,1 molowego kwasu octowego. Część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem, a klarowny nadsącz poddaje się liofilizacji. Uzyskano 22,5 g proszku zawierającego surową prolaktynę o aktywności biologicznej 12-15 j.m. (czyli zawiera 24-30% czystej PRL).

Uzyskaną surową prolaktynę w ilości 42,0 g rozpuszcza się w 2,20 litra 0,2 molowego roztworu kwasu octowego. Część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem 30 min/ 5°C/ 3000 ob./min., a otrzymany nadsącz sączy się jałowo przez sączek membranowy o średnicy porów 1,2 μm. Uzyskany klarowny przesącz poddano ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL 30 kDa. Odbierano koncentrat zawierający prolaktynę oraz dializat o masie poniżej 10 kDa. Koncentrat zawiera prolaktynę o masie cząsteczkowej 23 kDa z wydajnością od 40 do 90% i czystością od 60 do 96%. Dializat zawierający substancje balastowe odrzucono. Po filtracji koncentrat sączy się jałowo przez filtr sterylizujący 0,22 μm i rozlewa do opakowań jednostkowych szklanych fiolek, zamraża w temperaturze -40°C i liofilizuje poprzez ogrzewanie do temperatury +35°C.

P r z y k ł a d II. Sposób różni się od przykładu I tym, że do 26,5 ml uzyskanego koncentratu w dodaje się 40 mg albuminy ludzkiej, 160 mg mannitolu, a pH roztworu doprowadza się do pH 3,5. Mieszaninę po 6-godzinnej inkubacji poddaje się liofilizacji w standardowych warunkach temperatury i próżni. Uzyskano 185 mg liofilizatu zawierającego 373 mg PRL o m.cz. 23 kDa, 45 mg izomeru o m.cz. 20 kDa oraz 13 mg albuminy i 120 mg mannitolu. Badanie właściwości wykazało trwałość PRL - 2 lata w t-rze 2-8°C, a zawartość PRL o m.cz. 23 kDa - 60-90%.

P r z y k ł a d III. Sposób różni się od przykładu I tym, że do 26 ml uzyskanego koncentratu dodano 39 mg albuminy, 470 mg mannitolu, a pH doprowadzono do wartości 11,5. Po 6 godzinnej inkubacji mieszaninę poddano liofilizacji w standardowych warunkach temperatury i próżni. Uzyskano liofilizat zawierający 214 mg PRL o m.cz. 23 kDa, 11,2 mg albuminy, 68 mg PRL o m.cz. 20 kDa, 49 mg fragmentu o m.cz. 17 kDa oraz 410 mg mannitolu. Stosunek Tyr:Trp (współczynnik czystości) - 3,1 czyli 88,5%. Stabilność w t-rze 20°C wynosi 2,1 roku.

P r z y k ł a d IV. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL 100 kDa.

P r z y k ł a d V. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL 50 kDa.

P r z y k ł a d VI. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL 10 kDa.

P r z y k ł a d VII. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano dwukrotnej ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL.

P r z y k ł a d VIII. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano trzykrotnej ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL.

P r z y k ł a d IX. Sposób różni się od przykładu I-III tym, że uzyskany klarowny przesącz poddano czterokrotnej ultrafiltracji na kasecie Pellicon-XL.

Claims (8)

1. Sposób otrzymywania prolaktyny polegający na tym, że do ekstrakcji stosuje się liofilizowane przysadki świńskie z zastosowaniem mieszanki zawierającej aceton zakwaszony kwasem solnym, a ekstrakt strąca się nadmiarem acetonu w ilości 2-10 objętości, korzystnie 3-5, o temp.

PL 240 159 B1

-20°C, korzystnie w temp. (-15)-(-20°C), po czym uzyskany odwirowany kwaśny proszek acetonowy (KPA) suszy się acetonem i rozpuszcza się w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,05M do 0,5M, zaś część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem, a surową prolaktynę strąca się przy pH 4,8-5,8, po czym nadsącz oddziela się wirowaniem i liofilizuje, następnie osad surowej prolaktyny rozpuszcza się w kwasie octowym o stężeniu 0,05M do 0,5M, doprowadza się do pH - 2,6 i sączy się przez filtr membranowy o wielkości porów 0,8 μm do 1,2 μm, znamienny tym, że uzyskany przesącz poddaje się co najmniej jednej ultrafiltracji z zastosowaniem kaset, po ultrafiltracji koncentrat sączy się jałowo przez filtr sterylizujący, korzystnie 0,22 μm i rozlewa do opakowań jednostkowych, zamraża w temperaturze -40°C i liofilizuje poprzez ogrzewanie do temperatury +35°C, ponadto w tym sposobie stosuje się dynamiczną ekstrakcje liofilizowanych przysadek świńskich, zaś wartość pH koncentratu wynosi 2,6, a uzyskana wydajność prolaktyny o masie cząsteczkowej 23 kDa wynosi 97,4%, natomiast zawartość izomeru prolaktyny o masie cząsteczkowej 20 kDa wynosi 2,6%.

2. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że kwaśny proszek acetonowy (KPA) rozpuszcza się w 0,1 molowym kwasie octowym, a surową prolaktynę strąca się przy pH 4,9-5,1.

3. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że surową prolaktynę rozpuszcza się w 0,2 molowym kwasie octowym, po czym część nierozpuszczalną oddziela się wirowaniem, a klarowny nadsącz poddaje się sterylizującej filtracji przez sączek membranowy o wielkości porów 1,2 μm.

4. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że do koncentratu dodaje się albuminę i mannitol, a pH doprowadza się do wartości 3,5 lub 11,5, a uzyskaną mieszaninę poddaje się liofilizacji.

5. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskany przesącz poddaje się dwukrotnej ultrafiltracji z zastosowaniem kaset.

6. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskany przesącz poddaje się trzykrotnej ultrafiltracji z zastosowaniem kaset.

7. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskany przesącz poddaje się czterokrotnej ultrafiltracji z zastosowaniem kaset.

8. Sposób otrzymywania prolaktyny według zastrz. 1, znamienny tym, że klarowny przesącz poddaje się ultrafiltracji z zastosowaniem kasety Pellicon-XL 100 kDa lub Pellicon-XL 50 kDa lub Pellicon-XL 30 kDa lub Pellicon-XL 10 kDa.