PL238658B1

PL238658B1 - Modified with boron clusters analogues of human insulin having increased affinity for human albumin

Info

Publication number: PL238658B1
Application number: PL426638A
Authority: PL
Inventors: Janusz BORATYŃSKI; Janusz Boratyński; Krzysztof Fink; Tomasz GOSZCZYŃSKI; Tomasz Goszczyński; Konrad Kowalski; Zbigniew LEŚNIKOWSKI; Zbigniew Leśnikowski
Original assignee: Inst Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk; Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2018-08-10
Filing date: 2018-08-10
Publication date: 2021-09-20
Also published as: PL426638A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest produkt reakcji koniugacji klasterów boru z bioaktywnym peptydem mający na celu zmianę jego właściwości biologicznych. Wynalazek obejmuje koniugaty metalokarboranów z ludzką insuliną (HI) mające na celu pożądaną zmianę jej właściwości i farmakokinetyki, dzięki podwyższeniu siły wiązania z albuminą ludzką (HSA).The subject of the invention is the product of the conjugation of boron clusters with a bioactive peptide in order to change its biological properties. The invention includes human insulin (HI) metallocarborate conjugates with the aim of desirably altering its properties and pharmacokinetics by increasing the strength of binding to human albumin (HSA).

Peptydy oraz białka o znaczeniu terapeutycznym odgrywają obecnie coraz większą rolę w medycynie, szczególnie leczeniu infekcji wirusowych, chorób nowotworowych czy autoimmunologicznych. Rozwój tego typu terapii hamowany jest przez szereg trudności związanych w naturą fizykochemiczną cząsteczek o charakterze peptydowym. Cechują się one niewystarczającą stabilnością i trwałością, a w organizmie wykazują niską biodostępność oraz wrażliwość na trawienie proteolityczne. Próby systemowego zahamowania aktywności proteolitycznej podczas terapii bioaktywnymi białkami i peptydami okazały się umiarkowanie skuteczne. Jednocześnie, niemożliwe jest powstrzymanie biernej filtracji kłębuszkowej w nerkach będącej głównym mechanizmem usuwania peptydów terapeutycznych z organizmu. W rezultacie, leki biologiczne cechują się zazwyczaj wyjątkowo krótkim okresem półtrwania w ustroju. Cecha ta, w połączeniu z wysokim kosztem ich produkcji stanowi jedno z głównych ograniczeń ich szerszego zastosowania (Kratz 2008).Currently, peptides and proteins of therapeutic importance play an increasingly important role in medicine, especially in the treatment of viral infections, cancer and autoimmune diseases. The development of this type of therapy is hampered by a number of difficulties related to the physicochemical nature of peptide molecules. They are characterized by insufficient stability and durability, and in the body they show low bioavailability and sensitivity to proteolytic digestion. Attempts at systemic inhibition of proteolytic activity during therapy with bioactive proteins and peptides have proved to be moderately successful. At the same time, it is impossible to stop the passive glomerular filtration in the kidney as the main mechanism for removing therapeutic peptides from the body. As a result, biological drugs tend to have an extremely short half-life in the body. This feature, combined with the high cost of their production, is one of the main limitations of their wider application (Kratz 2008).

Obecnie, modyfikacja poprzez koniugację jest najpowszechniejszym sposobem modulacji właściwości biologicznych (szczególnie farmakokinetycznych oraz farmakodynamicznych) terapeutycznych białek i peptydów.Currently, modification by conjugation is the most common method of modulating biological (especially pharmacokinetic and pharmacodynamic) properties of therapeutic proteins and peptides.

Aktualnie stosowane strategie pozwalające na poprawę właściwości farmakokinetycznych ludzkiej insuliny opierają się na jej modyfikacji długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi. Na cząsteczce albuminy ludzkiej znajduje się pięć miejsc wiązania (nisz hydrofobowych) kwasów tłuszczowych charakteryzujących się stałymi wiązania w zakresie 107-10⁸. Bioaktywny peptyd zmodyfikowany odpowiednim kwasem tłuszczowym dysponuje zatem potencjałem kompleksowania względem HSA krążącej w surowicy wpływając bezpośrednio na jej powolne uwalnianie (Fanali et al. 2012). W momencie gdy koniugaty związane są z albuminą w ustroju, chronione są sterycznie przed proteolityczną degradacją i jednocześnie uwalniane stopniowo do krwiobiegu. Dzięki temu poprawia się profil farmakokinetyczny koniugatów, wydłuża się ich czas półtrwania oraz przedłuża się kinetyka uwalniania (Markussen et al. 1996). Modyfikacje występującymi naturalnie w diecie, w pełni metabolizowalnymi kwasami tłuszczowymi uważane są powszechnie za bezpieczne. Najwięcej tego typu badań poświęconych zostało modyfikacjom chemicznym ludzkiej insuliny. Pierwszym zatwierdzonym lekiem uzyskanym w wyniku lipidacji był Detemir. Analog ten został otrzymany poprzez acylację 16 węglowym kwasem mirystynowym na lizynie B29 przy jednoczesnym usunięciu C-końcowej treoniny B30. W rezultacie uzyskany koniugat cechuje się okresem półtrwania wynoszącym 5-7 godzin podczas gdy czas półtrwania niemodyfikowanej insuliny to jedynie kilka minut. (Duckworth et al. 1998; Brunner et al. 2000).Currently used strategies to improve the pharmacokinetic properties of human insulin are based on its modification with long-chain fatty acids. For human albumin molecule has five binding sites (hydrophobic niche) of fatty acids characterized by a binding constant in the range of ⁸ 107-10. Thus, a bioactive peptide modified with an appropriate fatty acid has the complexing potential against HSA circulating in the serum, directly affecting its slow release (Fanali et al. 2012). When conjugates are bound to albumin in the body, they are sterically protected against proteolytic degradation and, at the same time, gradually released into the bloodstream. As a result, the pharmacokinetic profile of the conjugates is improved, their half-life is extended and the kinetics of release prolonged (Markussen et al. 1996). Modifications naturally occurring in the diet with fully metabolizable fatty acids are generally considered safe. Most of this type of research has been devoted to chemical modifications of human insulin. Detemir was the first approved lipid-derived drug. This analog was obtained by acylation with 16 carbon myristic acid on lysine B29 while removing the C-terminal threonine B30. As a result, the resulting conjugate has a half-life of 5-7 hours while the half-life of unmodified insulin is only a few minutes. (Duckworth et al. 1998; Brunner et al. 2000).

Przedmiotem zgłoszenia są koniugaty insuliny ludzkiej z klasterami boru których synteza miała na celu zmianę ich właściwości biologicznych. W 1982 roku zespół Mizusawa et al. jako pierwszy przeprowadził syntezę koniugatu klasterów boru z przeciwciałem (swoistym względem antygenu rakowo-płodowego) (Mizusawa et al. 1982). W następnych latach badania były kontynuowane, prowadząc do uzyskania wysokoobciążonych atomami boru koniugatów z przeciwciałami monoklonalnymi celem ich przyszłego zastosowania w BNCT. Uzyskano koniugaty o specyficzności m.in. względem wysokocząsteczkowych antygenów związanym z czerniakiem (Tamat et al. 1989) czy komórek raka okrężnicy (Pak et al. 1995; Primus et al. 1996). Pierwsze wnikliwe badania dotyczące zmiany właściwości fizykochemicznych białek w wyniku przyłączenia klasterów boru przeprowadzone zostały przez zespół Boratyński et al. na lizozymie jaja kurzego (Goszczyński et al. 2015, Kowalski et al. 2015) poprzedzone uzyskanymi patentami na zastosowanie adduktów oksoniowych klasterów boru dla uzyskania wspomnianych koniugatów (PL224408B1, PL223504B1). Dowiedziono, że modyfikacja białka pojedynczym klasterem boru owocuje znaczącymi zmianami w jego właściwościach fizykochemicznych w tym szczególnie tendencją do agregacji będącą efektem niekowalencyjnych oddziaływań białko-klaster boru (Goszczyński et al. 2015, Kowalski et al. 2015). Po raz pierwszy oddziaływania pomiędzy klasteramu boru a białkami, na przykładzie albuminy dostrzegł zespół Soloway et al. już w 1967 roku. Zaobserwowali oni wyjątkowo silne oddziaływanie pomiędzy surowiczą albuminą bydlęcą (BSA) a oboma badanymi anionami klasterów boru [B12H12]^2- oraz [B12H11SH]^2-. Powstałe kompleksy nie poddawały się dializie oraz nie ulegały rozdzieleniu wskutek precypitacji białka kwasem trichlorooctowym. Jednocześnie zastosowanie chroThe subject of the application are conjugates of human insulin with boron clusters, the synthesis of which was aimed at changing their biological properties. In 1982, the team of Mizusawa et al. he was the first to synthesize a conjugate of boron clusters with an antibody (specific for the carcinoembryonic antigen) (Mizusawa et al. 1982). In the following years, the research was continued, leading to obtaining highly loaded boron atoms of conjugates with monoclonal antibodies for future use in BNCT. Conjugates with the specificity of, inter alia, against high molecular weight antigens associated with melanoma (Tamat et al. 1989) or colon cancer cells (Pak et al. 1995; Primus et al. 1996). The first in-depth research on changes in the physicochemical properties of proteins as a result of the attachment of boron clusters was carried out by the team of Boratyński et al. on hen egg lysozyme (Goszczyński et al. 2015, Kowalski et al. 2015) preceded by the obtained patents for the use of oxonium adducts of boron clusters to obtain the mentioned conjugates (PL224408B1, PL223504B1). It has been proven that the modification of a protein with a single boron cluster results in significant changes in its physicochemical properties, especially a tendency to aggregation resulting from non-covalent interactions between the protein and the boron cluster (Goszczyński et al. 2015, Kowalski et al. 2015). For the first time, the interaction between a boron cluster and proteins, based on the example of albumin, was noticed by the team of Soloway et al. as early as 1967. They observed an exceptionally strong interaction between bovine serum albumin (BSA) and both anions of the boron clusters [B12H12] ^2- and [B12H11SH] ^2- studied. The resulting complexes did not undergo dialysis and did not separate due to the precipitation of the protein with trichloroacetic acid. At the same time, the use of chro

PL 238 658 B1 matografii jonowymiennej pozwoliło na uwolnienie ze struktury BSA jedynie klasteru [B12H12]^2- bezpośrednio wskazując na różnice mechanizmów oddziaływania pomiędzy białkiem a oboma badanymi związkami (Soloway et al. 1967). Dziewięć lat później obserwacje te rozstały powtórzone i dyskutowane w podzielonym na trzy części artykule opublikowanym przez Nakagawa i Nagai (Nakagawa i Nagai 1976). Dowiedziono w nim, że oddziaływanie [B12H11SH]^2- z albuminą ma charakter wiązania kowalencyjnego w postaci mostka disiarczkowego podczas gdy oddziaływanie z anionem [B12H12]^2- ma najprawdopodobniej charakter oddziaływań jonowych. Te zapomniane wyniki badań zostały niezależnie potwierdzone współcześnie przez analizę oddziaływań albuminy z anionami klasterów boru [B20H18]^2-, [B20H17OH]^4- oraz [B20H17SH]^4- (McVey et al. 2008) oraz ostatecznie zweryfikowane oraz opisane w badaniach zespołu Boratyński et al. (Goszczyński et al. 2017). Badania te wykazały bardzo silne oddziaływanie nisz hydrofobowych albuminy z cząsteczkami zawierającymi klastery boru, szczególnie klastery metalokarboranowe (Goszczyński et al. 2017). Wyniki te stanowiły punkt wyjścia dla syntezy koniugatów klasterów boru z ludzką insuliną jako sposobu na zmianę jej właściwości biologicznych.Using ion exchange matography allowed to release only the [B12H12] ^2- cluster from the BSA structure, directly pointing to the differences in the mechanisms of interaction between the protein and both tested compounds (Soloway et al. 1967). Nine years later, these observations were repeated and discussed in a three-part article published by Nakagawa and Nagai (Nakagawa and Nagai 1976). It was proved that the interaction of [B12H11SH] ^2- with albumin is a covalent bond in the form of a disulfide bridge, while the interaction with the anion [B12H12] ^2- is most likely of ionic nature. These forgotten research results have been independently confirmed today by the analysis of the interactions of albumin with the anions of boron clusters [B20H18] ^2- , [B20H17OH] ^4- and [B20H17SH] ^4- (McVey et al. 2008) and finally verified and described in the research of the Boratyński et al. al. (Goszczyński et al. 2017). These studies have shown a very strong interaction of albumin hydrophobic niches with particles containing boron clusters, especially metallocarborate clusters (Goszczyński et al. 2017). These results were the starting point for the synthesis of boron cluster conjugates with human insulin as a way to change its biological properties.

Przedmiotem wynalazku jest koniugat składający się z insuliny ludzkiej lub jej znanego analogu oraz przyłączonego do niej kowalencyjnie metalokarboranu o wzorze [Co(C2B9Hn)2], przy czym metalokarboran połączony jest kowalencyjne z insuliną za pomocą 3-okso-pentano-1,5-diylu powstającego w wyniku reakcji metalokarboranu w formie oksoniowego adduktu dioksanowego z resztą aminokwasową insuliny.The subject of the invention is a conjugate consisting of human insulin or a known analogue thereof and a metal carborate covalently attached to it of the formula [Co (C2B9Hn) 2], wherein the metallocarborate is covalently linked to the insulin by means of 3-oxo-pentane-1,5-diyl formed by the reaction of the metallocarborate in the form of an oxonium dioxane adduct with the amino acid residue of insulin.

Korzystnie, koniugat według wynalazku jest produktem reakcji koniugacji metalokarboranu stanowiącego anion bis (1,2-dikarbolido)kobaltan (III) z adduktem dioksanowym z roztworem insuliny zawierającym DMSO, korzystnie w stosunku molowym metalokarboranu do insuliny wynoszącym 2:1.Preferably, the conjugate of the invention is the product of a bis (1,2-dicarbolido) cobaltate anion (III) anion conjugation reaction with a dioxane adduct with an insulin solution containing DMSO, preferably in a 2: 1 molar ratio of metallocarborate to insulin.

Okazało się, iż niniejszy wynalazek pozwala na stworzenie szeregu nowych cząsteczek terapeutycznych - analogów insuliny - opartych o koniugację z klasterami boru, posiadających zwiększone powinowactwa względem albuminy ludzkiej.It turned out that the present invention allows for the creation of a series of new therapeutic molecules - insulin analogues - based on conjugation with boron clusters, having increased affinities for human albumin.

Ujawnione analogi ludzkiej insuliny, o zwiększonym powinowactwie względem albuminy ludzkiej, zmodyfikowane klasterami boru, stanowią koniugat insuliny, rekombinowanej ludzkiej insuliny lub analogu insuliny z przyłączonym do niej kowalencyjnie metalokarboranowym klasterem boru.The disclosed human insulin analogs with increased affinity for human albumin, modified with boron clusters, are conjugates of insulin, recombinant human insulin or an insulin analog with a boron metallocarborate cluster covalently attached thereto.

Związkiem insulinowym jest insulina analog insuliny lub rekombinowana ludzka insulina, a klasterem boru jest klaster metalokarboranowy o wzorze [Co(C2B9Hii)2], zawierający skoordynowany atom kobaltu.The insulin compound is an insulin analogue or recombinant human insulin, and the boron cluster is a metallocarborate cluster of formula [Co (C2B9Hii) 2] containing a cobalt coordinated atom.

Klaster boru połączony jest kowalencyjne ze związkiem insulinowym za pomocą 3-okso-pentano-1,5-diylu lub pentano-1,5-diylu.The boron cluster is covalently linked to the insulin compound by means of 3-oxo-pentane-1,5-diyl or pentane-1,5-diyl.

Poniżej przedstawiono przykłady zarówno przygotowania analogów według wynalazku, jak i wyniki badania ich powinowactwa do ludzkiej albuminy.The following are examples of both the preparation of the analogs of the invention and the results of testing their affinity for human albumin.

P r z y k ł a d IP r z k ł a d I

Modyfikacja ludzkiej insuliny klasterem metalokarboranowym oraz jej zdolność do wiązania z albuminą ludzką w porównaniu do analogu insuliny detemir.Modification of human insulin with a metallocarborate cluster and its ability to bind to human albumin compared to the insulin detemir analogue.

Metalokarboran (anion bis (1,2-dikarbolido)kobaltan (III) z adduktem dioksanowym) rozpuszczono w czystym DMSO w stężeniu 10 m/mL. Ludzką insulinę (HI) w formie formulacji farmaceutycznej rozpuszczono w wodzie ultraczystej w stężeniu 100 mg/mL a następnie poddano dializie w wężu dializacyjnym (3 kDa) względem 0,1% kwasu mrówkowego. Wydializowany preparat białka następnie zamrożono oraz poddano liofilizacji celem usunięcia pozostałości kwasu mrówkowego (Alpha 2-4 LSC, Crist, Niemcy) pod ciśnieniem 0,1 bar w temperaturze pokojowej. Tak uzyskany preparat białka rekonstytuowano w buforze HEPES (10 mM; pH 7,5), a dokładne stężenie białka wyznaczono spektrofotometrycznie (A276) przy użyciu spektrofotometru Specord 250 (Analytic Jena, Niemcy) przy założeniu molowego współczynnika absorbcji ε = 16 960 cm^-1 M^-1 (Fasma 1989). Roztwór wyjściowy HI rozcieńczono następnie do stężenia 0,2 mM w mieszaninie DMSO i buforu HEPES (10 mM; pH 7,5) z dodatkiem 0,4 mM ZnCl2 w stosunku objętościowym 20:80 dla zachowania struktury heksamerycznej białka. Reakcję koniugacji poprowadzono poprzez dodanie odpowiedniej objętości roztworu wyjściowego koniugatu klasteru boru z dioksanem (DMSO) do roztworu roboczego HI dla uzyskania stosunku molowego wynoszącego 2:1. Tak uzyskaną mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 1 h w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano poprzez 10-krotne rozcieńczenie w 0,1% kwasie mrówkowym. Nieskoniugowane z białkiem klastery boru, nierozpuszczalne w tych warunkach oddzielono poprzez wirowanie (16 000 g) przez 5 minut z użyciem wirówki Eppendorf 5424. Właściwy etap oczyszczania przeprowadzono z użyciem systemu Dionex Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific, USA) z kolekcją frakcji,Metallocarborane (bis (1,2-dicarbolido) cobaltate (III) anion with dioxane adduct) was dissolved in neat DMSO at a concentration of 10m / mL. Human insulin (HI) in the form of a pharmaceutical formulation was dissolved in ultrapure water at a concentration of 100 mg / mL and then dialyzed in a dialysis tube (3 kDa) against 0.1% formic acid. The dialyzed protein preparation was then frozen and lyophilized to remove residual formic acid (Alpha 2-4 LSC, Crist, Germany) at 0.1 bar pressure at room temperature. The thus obtained protein preparation was reconstituted in HEPES buffer (10 mM; pH 7.5), and the exact protein concentration was determined spectrophotometrically (A276) using the Specord 250 spectrophotometer (Analytic Jena, Germany) assuming the molar absorption coefficient ε = 16 960 cm ^-1 M ^-1 (Fasma 1989). The HI stock solution was then diluted to 0.2 mM in a mixture of DMSO and HEPES buffer (10 mM; pH 7.5) with 0.4 mM ZnCl2 in a 20:80 volume ratio to maintain the hexameric structure of the protein. The conjugation reaction was performed by adding the appropriate volume of the boron dioxane cluster conjugate (DMSO) stock solution to the HI working solution to obtain a 2: 1 molar ratio. The thus obtained reaction mixture was incubated for 1 h at room temperature. The reaction was stopped by diluting 10 times in 0.1% formic acid. The non-protein conjugated boron clusters, insoluble under these conditions, were separated by centrifugation (16,000 g) for 5 minutes using an Eppendorf 5424 centrifuge. The actual purification step was carried out using the Dionex Ultimate 3000 system (Thermo Fisher Scientific, USA) with a collection of fractions,

PL 238 658 B1 w oparciu chromatografię w odwróconym układzie faz na kolumnie C18 (4,6 x 150 mm). Rozdziały chromatograficzne prowadzono w temperaturze pokojowej przy przepływie 0,8 mL/min w liniowym gradiencie (5-90% B) 0,1% kwasu mrówkowego (A) oraz acetronitrylu z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego (B) stosując 50 pL objętości nastrzyku. Jako detektor wykorzystano DAD obserwując sygnały A280 dla białka oraz A300 i A320 charakterystyczne dla metalokarboranów. Zebrano wyłącznie frakcje jednokrotnie podstawionych klasterem boru koniugatów. Roztwory koniugatów następnie poddano zamrożeniu w ciekłym azocie oraz liofilizacji celem usunięcia pozostałości kwasu mrówkowego oraz acetonitrylu. Suchą pozostałość przeznaczono do badań analiz lokalizacji podstawienia oraz oddziaływań z albuminą. Czystość uzyskanych jednokrotnie podstawionych koniugatów insuliny z klasterem metalokarboranowym przeprowadzono techniką LC-DAD oraz LC-MS (fig. 1 i fig. 2).Based on reverse phase chromatography on a C18 column (4.6 x 150 mm). Chromatographic separations were carried out at room temperature with a flow of 0.8 mL / min in a linear gradient (5-90% B) of 0.1% formic acid (A) and acetronitrile with 0.1% formic acid (B) using 50 pL of volume injection. DAD was used as a detector by observing A280 signals for the protein as well as A300 and A320 characteristic for metallocarborates. Only fractions of conjugates once substituted with a boron cluster were collected. Conjugate solutions were then frozen in liquid nitrogen and lyophilized to remove residual formic acid and acetonitrile. The dry residue was used for the analysis of the location of the substitution and the interaction with albumin. The purity of the obtained monosubstituted insulin conjugates with a metallocarborate cluster was performed by LC-DAD and LC-MS (Fig. 1 and Fig. 2).

Na fig. 1. przedstawiono chromatogramy rozdziału frakcji jednokrotnie podstawionych koniugatów ludzkiej insuliny z klasterem metalokarboranowym od wolnej insuliny i klasterów boru podczas oczyszczania na kolumnie C18 (A) oraz po oczyszczeniu (B).Figure 1 shows the chromatograms separating the fractions of monosubstituted human insulin conjugates with a metallocarborate cluster from free insulin and boron clusters during C18 column purification (A) and after purification (B).

Na fig. 2 przedstawiono chromatogram ESI-MS-TOF oczyszczonej frakcji jednokrotnie podstawionych koniugatów insuliny ludzkiej z klasterem metalokarboranowym po redukcji mostków dwusiarczkowych. Widma ESI-MS-TOF przedstawiają odpowiednio: 1. niezmodyfikowany łańcuch A, 2. niezmodyfikowany łańcuch B, 3-5 łańcuch B zmodyfikowany klasterem metalokarboranowym.Figure 2 shows the ESI-MS-TOF chromatogram of the purified fraction of monosubstituted human insulin conjugates with a metallocarborate cluster after reduction of disulfide bridges. The ESI-MS-TOF spectra show: 1. unmodified A chain, 2. unmodified B chain, 3-5 B chain modified with a metallocarborate cluster.

Analiza ESI-MS-TOF oczyszczonej frakcji jednopodstawionych koniugatów Hl-BC3 poddanych redukcji wskazała na obecność zarówno niezmodyfikowanych łańcuchów A i B oraz łańcucha B zmodyfikowanego metalokarboranowym najprawdopodobniej w trzech różnych centrach nukleofilowych. Ze względu na niską intensywność nie wykryto zmodyfikowanego łańcucha A. Niemniej, obecność niskiego sygnału od niezmodyfikowanego łańcucha B może świadczyć pośrednio o modyfikacji również łańcucha A.ESI-MS-TOF analysis of the purified fraction of reduced monosubstituted Hl-BC3 conjugates indicated the presence of both unmodified A and B chains and a metallocarborate modified B chain probably at three different nucleophilic sites. Due to the low intensity, the modified A-chain was not detected. However, the presence of a low signal from the unmodified B-chain may indirectly indicate a modification of the A-chain as well.

P r z y k ł a d IIP r x l a d II

Badania oddziaływania wytworzonego koniugatu insulinyInvestigation of the effect of the produced insulin conjugate

Badania oddziaływania koniugatu insuliny z BSA przeprowadzono techniką zahamowania fluorescencji. Roztwór wyjściowy surowiczej albuminy bydlęcej (0,67 mM) otrzymano poprzez dializę białka względem buforu węglanowego (NaHCO3) o stężeniu 100 mM i pH 8,4. Dokładne stężenie białka wyznaczono spektrofotometrycznie (A278) przy użyciu spektrofotometru Specord 250 (Analytic Jena, Niemcy) przy założeniu molowego współczynnika absorbcji ε = 44 300 cm^-1 M^-1. Do pomiarów wygaszania fluorescencji roztwór wyjściowy BSA rozcieńczono w buforze węglanowym (100 mM, pH 8,4) do uzyskania stężenia 10,5 pM.Investigations of the interaction of insulin conjugate with BSA were performed using the fluorescence inhibition technique. Stock bovine serum albumin (0.67 mM) was obtained by dialysis of the protein against 100 mM carbonate buffer (NaHCO3) at pH 8.4. The exact protein concentration was determined spectrophotometrically (A278) using a Specord 250 spectrophotometer (Analytic Jena, Germany) assuming a molar absorption coefficient of ε = 44,300 cm ^-1 M ^-1 . For fluorescence quench measurements, BSA stock solution was diluted in carbonate buffer (100 mM, pH 8.4) to a concentration of 10.5 pM.

Analog ludzkiej insuliny detemir (HI detemir) (Novo Nordisk, Dania) w formie formulacji farmaceutyczycznej (®Levemir) został przygotowany analogicznie do wcześniejszej przygotowanej HI. Formulację rozpuszczono w wodzie ultraczystej w stężeniu 100 mg/mL a następnie poddano dializie w wężu dializacyjnym (3 kDa) względem 0,1% kwasu mrówkowego. Wydializowany preparat białka następnie zamrożono oraz poddano liofilizacji celem usunięcia pozostałości kwasu mrówkowego (Alpha 2-4 LSC, Crist, Niemcy) pod ciśnieniem 0,1 bar w temperaturze pokojowej. Tak uzyskany preparat białka w buforze węglanowym (100 mM, pH 8,4), a dokładne stężenie białka wyznaczono spektrofotometrycznie (A276) przy użyciu spektrofotometru Specord 250 (Analytic Jena, Niemcy) przy założeniu molowego współczynnika absorbcji ε = 16 960 cm^-1 M^-1.The human insulin detemir analog (HI detemir) (Novo Nordisk, Denmark) in the form of a pharmaceutical formulation (® Levemir) was prepared analogously to the previously prepared HI. The formulation was dissolved in ultrapure water at a concentration of 100 mg / mL and then dialyzed in a dialysis tube (3 kDa) against 0.1% formic acid. The dialyzed protein preparation was then frozen and lyophilized to remove residual formic acid (Alpha 2-4 LSC, Crist, Germany) at 0.1 bar pressure at room temperature. The thus obtained protein preparation in a carbonate buffer (100 mM, pH 8.4), and the exact protein concentration was determined spectrophotometrically (A276) using the Specord 250 spectrophotometer (Analytic Jena, Germany) assuming a molar absorption coefficient of ε = 16 960 cm ^-1 M ^-1 .

Wszystkie badane związki bezpośrednio przed doświadczeniem zostały rozcieńczone w buforze węglanowym (100 mM, pH 8,4) z 2% dodatkiem DMSO w zakresie stężeń 0-10,5 pM. Finalnie dla żadnego z badanych związków nie przekroczono maksymalnego stosunku stechiometrycznego większego niż 1:1 ze względu na minimalizację nieswoistych oddziaływań.All tested compounds were diluted in carbonate buffer (100 mM, pH 8.4) with 2% addition of DMSO in the concentration range of 0-10.5 pM immediately before the experiment. Ultimately, the maximum stoichiometric ratio greater than 1: 1 was not exceeded for any of the compounds tested due to the minimization of non-specific interactions.

Pomiary fluorescencji przeprowadzono z użyciem spektropolarymetru dichroizmu kołowego Jasco 815 (Jasco, Japonia) z detektorem fluorescencyjnym. Próbkę (2,5 mL) umieszczonej w kuwecie kwarcowej (droga optyczna 10 mm) poddano wzbudzeniu światłem o długości fali Lex = 280 nm. Detekcję widma fluorescencji (1 sekunda integracji sygnału) przy napięciu 600V przeprowadzono zakresie 300-500 nm. Detekcję stopnia wygaszania fluorescencji dla każdej próbki przeprowadzono przy trzech temperaturach 25°C, 31°C oraz 37°C (3 minuty czasu inkubacji). Każdą próbkę poddano korekcji poprzez równoległą analizę próby ślepej (NaHCO3100 mM, pH 8,4 z 2% dodatkiem DMSO) w danych warunkach temperatury. Zależności ilości dodanego związku względem intensywności emisji fluorescencji obliczono dla maksimum fluorescencji BSA przy długości fali Lem = 355 nm.Fluorescence measurements were performed using a Jasco 815 circular dichroism spectropolarimeter (Jasco, Japan) with a fluorescence detector. A sample (2.5 mL) placed in a quartz cuvette (optical path 10 mm) was excited with light with a wavelength of Lex = 280 nm. Detection of the fluorescence spectrum (1 second of signal integration) at 600V was performed in the 300-500nm range. Detection of the degree of fluorescence quenching for each sample was performed at three temperatures of 25 ° C, 31 ° C and 37 ° C (3 minutes incubation time). Each sample was corrected by parallel blank analysis (NaHCO 3100 mM, pH 8.4 with 2% DMSO addition) under the given temperature conditions. The dependencies of the amount of the added compound against the intensity of the fluorescence emission were calculated for the maximum fluorescence of BSA at the wavelength Lem = 355 nm.

Uzyskane parametry wiązania względem albuminy (BSA) dla koniugatu (HI-BC3) oraz insuliny detemir przedstawiono poniżej:The obtained binding parameters against albumin (BSA) for the conjugate (HI-BC3) and insulin detemir are presented below:

PL 238 658 Β1PL 238 658 Β1

T|K] T | K] K,v [M-i χ 10η K, v [M-i χ 10η Kb[M¹]Kb [M ¹ ] AG°i^a[kJ mol·¹]AG ° i ^a [kJ mol · ¹ ] AG°2^b [kJ mol·¹]AG ° 2 ^b [kJ mol · ¹ ] ΔΗ° [kJ mol·¹]ΔΗ ° [kJ mol · ¹ ] Δ8° [kJ mol·¹ K·¹]Δ8 ° [kJ mol · ¹ K · ¹ ] HI-BC3 HI-BC3 298 298 9,16 9.16 4,54 χ 10« 4.54 χ 10 « -26,5 -26.5 -26,5 -26.5 39,5 39.5 221,5 221.5 304 304 9,26 9.26 5,55*10* 5.55 * 10 * -27,8 -27.8 -27,6 -27.6 310 310 9,87 9.87 8,43*10* 8.43 * 10 * •29,2 • 29.2 29,2 29.2 HI detemir HI detemir 298 298 0,36 0.36 2,11 x 102 2.11 x 102 -12,4 -12.4 -13,3 -13.3 184,3 184.3 660 660 304 304 0,41 0.41 3,31 *102 3.31 * 102 -16,4 -16.4 -14,7 -14.7 310 310 0,43 0.43 3,80*10³ 3.80 * 10 ³ -20,4 -20.4 -21,3 -21.3

W przypadku analogu HI-BC3 oraz HI detemir odnotowano dodatnią korelację pomiędzy Ksv a temperaturą. Zależność ta jest charakterystyczna dla dynamicznego wygaszania fluorescencji, w którym wyższa temperatura jest związana ze zwiększonym współczynnikiem dyfuzji oraz ułatwionym transferem elektronowym. Podsumowując, mechanizm oddziaływania obu analogów insuliny z HSA jest identyczny. Jednocześnie koniugat HI-BC3 wygasza fluorescencję HSA prawie 30- krotnie silniej niż insulina detemir co bezpośrednio wskazuje na wyższą siłę wiązania.In the case of the HI-BC3 and HI detemir analogs, a positive correlation was found between Ksv and temperature. This relationship is characteristic of dynamic fluorescence quenching, where higher temperature is associated with an increased diffusion coefficient and facilitated electron transfer. In conclusion, the mechanism of the interaction of both insulin analogs with HSA is identical. At the same time, the HI-BC3 conjugate quenches the HSA fluorescence almost 30 times more strongly than insulin detemir, which directly indicates a higher binding strength.

Bibliografia:Bibliography:

Nakagawa T., Nagai T. (1976): Interaction between serum albumin and mercaptoundecahydrododecaborate ion (an agent for boron-neutron capture therapy of brain tumor), Chemical and Pharmaceutical Bulletin 24/12, s. 2934-2954.Nakagawa T., Nagai T. (1976): Interaction between serum albumin and mercaptoundecahydrododecaborate ion (an agent for boron-neutron capture therapy of brain tumor), Chemical and Pharmaceutical Bulletin 24/12, pp. 2934-2954.

Soloway A. H., Hatanaka H., Davis M. A. (1967): Penetration of brain and brain tumor. VII. Tumorbinding sulfhydryl boron compounds, Journal of Medicinal Chemistry 10/4, s. 714-717.Soloway A. H., Hatanaka H., Davis M. A. (1967): Penetration of brain and brain tumor. VII. Tumorbinding sulfhydryl boron compounds, Journal of Medicinal Chemistry 10/4, pp. 714-717.

Tamat S. R., et al. (1989): Boronated monoclonal antibody 225.28S for potential use in neutron capture therapy of malignant melanoma, Pigment Celi & Melanoma Research 2/4, s. 278-280.Tamat S. R., et al. (1989): Boronated monoclonal antibody 225.28S for potential use in neutron capture therapy of malignant melanoma, Pigment Cell & Melanoma Research 2/4, pp. 278-280.

Pak R. H., et al. (1996): Bispecific antibody mediated targeting of nido-carboranes to human colon carcinoma Cells, Bioconjugate Chemistry 7, s. 532-535.Pak R. H., et al. (1996): Bispecific antibody mediated targeting of nido-carboranes to human colon carcinoma Cells, Bioconjugate Chemistry 7, pp. 532-535.

Fanali G., et al. (2012): Human serum albumin: from bench to bedside, Molecular Aspects of Medicine 33/3, s. 209-290.Fanali G., et al. (2012): Human serum albumin: from bench to bedside, Molecular Aspects of Medicine 33/3, pp. 209-290.

Primus F. J., et al. (1996): Bispecific antibody mediated targeting of nido-carboranes to human colon carcinoma cells, Bioconjugate Chemistry 7/5, s. 532-535.Primus F. J., et al. (1996): Bispecific antibody mediated targeting of nido-carboranes to human colon carcinoma cells, Bioconjugate Chemistry 7/5, pp. 532-535.

Markussen J., et al. (1996): Soluble, fatty acid acylated insulins bind to albumin and show protracted action in pigs, Diabetologia 39/3, s. 281-288.Markussen J., et al. (1996): Soluble, fatty acid acylated insulins bind to albumin and show protracted action in pigs, Diabetologia 39/3, pp. 281-288.

Mizusawa E., et al. (1982): Neutron-capture therapy of human cancer: in vitro results on the preparation of boron-labeled antibodies to carcinoembryonic antigen, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 79, s. 3011-3014.Mizusawa E., et al. (1982): Neutron-capture therapy of human cancer: in vitro results on the preparation of boron-labeled antibodies to carcinoembryonic antigen, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 79, pp. 3011-3014.

Brunner G. A., et al. (2000): Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of long-acting insulin analogue NN304 in comparison to NPH insulin in humans, Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 108/2, s. 100-105.Brunner G. A., et al. (2000): Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of long-acting insulin analogue NN304 in comparison to NPH insulin in humans, Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes 108/2, pp. 100-105.

Duckworth W. C., Bennett R. G., Hamel F. G. (1998): Insulin degradation: progress and potential, Endocrine Reviews 19/5, s. 608-624.Duckworth W. C., Bennett R. G., Hamel F. G. (1998): Insulin degradation: progress and potential, Endocrine Reviews 19/5, pp. 608-624.

Goszczyński T.M., et al. (2015): Solid State, thermal synthesis of site-specific protein-boron cluster conjugates and their physicochemical and biochemical properties, Biochimica et Biophysica Acta, 1850/2, s. 411-418.Goszczyński T.M., et al. (2015): Solid State, thermal synthesis of site-specific protein-boron cluster conjugates and their physicochemical and biochemical properties, Biochimica et Biophysica Acta, 1850/2, pp. 411-418.

Kowalski K., et al. (2015): Synthesis of lysozyme-metallacarborane conjugates and the effect of boron cluster modification on protein structure and function, Chembiochem, 16/3, s. 424-431 Shechter Y., et al. (2005): Albumin-insulin conjugate releasing insulin slowly under physiological conditions: a new concept for long-acting insulin, Bioconjugate Chemistry, 16/5, s. 913-920.Kowalski K., et al. (2015): Synthesis of lysozyme-metallacarborane conjugates and the effect of boron cluster modification on protein structure and function, Chembiochem, 16/3, pp. 424-431 Shechter Y., et al. (2005): Albumin-insulin conjugate releasing insulin slowly under physiological conditions: a new concept for long-acting insulin, Bioconjugate Chemistry, 16/5, pp. 913-920.

Kratz F. Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates and nanoparticles. J Control Release. 2008 18; 132(3): 171-83.Kratz F. Albumin as a drug carrier: design of prodrugs, drug conjugates and nanoparticles. J Control Release. 2008 18; 132 (3): 171-83.

Claims

Patent claims

1. A conjugate consisting of human insulin or a known analogue thereof and a metallocarborate covalently attached to it of the formula [Co (C2BgHn) 2], wherein the metallocarborate is covalently linked to the insulin by 3-oxo-pentane-1,5-diyl formed by reacting the metallocarborane in the form of an oxonium dioxane adduct with the amino acid residue of insulin.

2. The conjugate of claim 1 The process of claim 1, characterized in that it is the product of a bis (1,2-dicarbolido) cobaltate anion conjugation reaction with a dioxane adduct with an insulin solution containing DMSO, preferably in a 2: 1 molar ratio of metallocarborate to insulin.