PL238038B1 - Sposób rozróżniania karagenów typu kappa, iota i lambda - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób rozróżniania karagenów typu kappa, iota i lambda, przydatny w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym. Typ karagenu (kappa, jota lub lambda) oznacza się na podstawie linii kalibracyjnych. Linie te otrzymuje się w oparciu o krzywe spektrofotometrycznego miareczkowania wzorcowych roztworów karagenu kappa, jota oraz lambda o różnych stężeniach (C) mianowanym roztworem Błękitu Toluidynowego (BT). Odczytując wartości objętości titranta potrzebne do osiągnięcia zadanej wartości absorbancji (VBT) buduje się zależności C=f(VBT), które dla różnych typów karagenu różnią się nachyleniem względem osi. Oznaczenie typu karagenu polega na zmiareczkowaniu roztworu badanego karagenu o określonym stężeniu mianowanym roztworem BT do osiągnięcia zadanej wartości absorbancji i odniesieniu objętości barwnika w punkcie końcowym do zestawu krzywych wzorcowych.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób rozróżniania karagenów typu kappa, iota i lambda, przydatny w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, farmaceutycznym.

Karagen to ogólna nazwa grupy związków o charakterze naturalnych polisacharydów i strukturze liniowej. Występuje w odmianach kappa (k), jota (i), lambda (λ), mi (μ) oraz ni (v), różniących się stosunkiem ilościowym grup siarczanowych i cząsteczek galaktozy. Największe zastosowanie praktyczne znajdują trzy pierwsze spośród wymienionych typów. Odmiany kappa- i jota- posiadają właściwości żelujące (κ-karagen tworzy żele silne, stałe, a i-karagen daje żele miękkie), natomiast λ-karagen nie ulega żelowaniu, lecz ma zdolność zagęszczania roztworów poprzez zwiększanie ich lepkości. Z tego względu karageny są używane w przemyśle jako stabilizatory, zagęstniki i środki żelujące. Karageny stosuje się w przemysłach: spożywczym jako dodatek (E407 oraz E466) [1] do wędlin, konserw mięsnych, sosów, produktów o obniżonej zawartości tłuszczu, deserów mlecznych, niektórych napojów, dżemów, galaretek, kosmetycznym jako dodatek do past do zębów, szamponów, kremów, farmaceutycznym [2] do produkcji opatrunków, tabletek, preparatów farmaceutycznych o przedłużonym uwalnianiu.

Źródłem karagenów są wodorosty. Niektóre z nich produkują karagen określonego typu, np. i-karagen jest pozyskiwany z Eucheuma cottoni lub Eucheuma spinosum, κ-karagen otrzymuje się z różnych gatunków należących do rodzajów Gigartina i Chondrus, a λ-karagen ze sporofitycznych grup wodorostów. Z kolei wodorosty gametofityczne wytwarzają hybrydowy typ jota- i kappa- o różnych proporcjach składników. Karageny stosowane w przemyśle najczęściej mają postać półrafinowaną lub rafinowaną.

Analizę karagenów można przeprowadzić różnymi technikami [3, 4]. Metoda FTIR umożliwia rozróżnienie wszystkich typów karagenu przy użyciu minimalnej ilości próbki. Oznaczenie jest względnie proste, ale wymaga umiejętnej interpretacji wyników, m.in. w celu eliminacji pływu matrycy. Metodę 1H-NMR oraz 13C-NMR stosuje się do oznaczania stosunku karagenów kappa i jota w mieszaninie karagenów [5, 6]. Technika ta nie pozwala na oznaczenie karagenu lambda.

P r z y k ł a d 1 [5]

Mieszaninę karagenów analizowano metodą 13C-NMR w temperaturze ok. 80°C. Otrzymane widmo było sumą widm karagenów kappa i jota, natomiast nie posiadało sygnałów pochodzących od karagenu lambda. Metoda umożliwia zatem określenie w mieszaninie stosunku ilościowego karagenów kappa i jota, lecz nie daje możliwości identyfikacji karagenu lambda.

Analizę uzupełniono o badanie metodą spektroskopii IR. W uzyskanym widmie pasmo przy 1250 cm^-1 odpowiadające sumie grup siarczanowych było znacznie bardziej intensywne dla karagenu lambda niż dla kappa i jota. Dodatkowo pasma przy 845, 830, 820 i 805 cm^-1 umożliwiły rozróżnienie poszczególnych grup siarczanowych. Jako sygnał analityczny przyjęto st osunek absorbancji przy 845/1250 cm^-1, który jest wrażliwy na dodatek karagenu lambda do mieszaniny karagenów kappa i jota.

Ważnymi narzędziami stosowanymi do charakterystyki surowców są też metody chromatograficzne (HPLC i HPAEC), umożliwiające półilościową oraz ilościową analizę karagenów po depolimeryzacji. Inną ważną techniką jest dwuwymiarowa elektroforeza, która pozwala na oznaczanie półilościowe bez depolimeryzacji. Z kolei u podstaw metod spektrofotometrycznych leży dysocjacja makrocząsteczek, skutkiem czego jest pojawienie się w roztworze polianionów posiadających zdolność tworzenia trwałych par jonowych z barwnikami kationowymi [7-10]. Z uwagi na to, że wszystkie typy karagenu rozpuszczają się w wodzie i ulegają reakcji kompleksowania, klasyczne metody spektrofotometryczne umożliwiają jedynie oznaczenia ilościowe sumy karagenów. Zaletą tych metod są natomiast małe wymagania sprzętowe. Najbardziej znana wśród metod spektrofotometrycznych jest ta z użyciem Błękitu Metylenowego [8], popularna ze względu na swoją czułość i łatwość wykonania. Do analizy polimerów anionowych można wykorzystać technikę miareczkowania spektrofotometrycznego, stosując jako titrant barwnik kationowy [9].

P r z y k ł a d 2 [8]

Do ilościowego oznaczania hydrokoloidów, w tym karagenów, alginianu oraz karboksymetylocelulozy w roztworach wodnych zastosowano Błękit Metylenowy. Podstawą metody jest przesunięcie maksimum widma absorpcji barwnika z 610 i 664 mn do 559 nm na skutek tworzenia się rozpuszczal

PL 238 038 Β1 nych kompleksów barwnik-polianion, przy czym absorbancja kompleksu przy 559 nm jest proporcjonalna do stężenia hydrokoloidu. Zaletą procedury jest rozpuszczalność kompleksów, wynikająca z zastosowania małych stężeń barwnika i polianionu.

Przykład 3 [71

Do spektrofotometrycznego oznaczania stężeń polimerów anionowych w roztworach wodnych zastosowano wodny roztwór barwnika - Błękitu Metylenowego. Porcję analitu o znanej objętości miareczkuje się roztworem barwnika, rejestrując w sposób ciągły absorbancję mieszaniny roztworów przy długości fali z zakresu od 660 do 670 nm. Miareczkowanie prowadzi się do momentu osiągnięcia zadanej wartości absorbancji. Stężenie polimeru (C) odczytuje się z krzywej kalibracyjnej w postaci C=f(VBM) (gdzie Vbm - objętość barwnika w punkcie równoważnikowym), wykreślonej dla tej samej zadanej wartości absorbancji.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest oznaczenie typu karagenu na podstawie wyników spektrofotometrycznego miareczkowania wodnego roztworu karagenu Błękitem Toluidynowym (BT). W przypadku karagenów różnych typów, tj. różniących się ilością i rozmieszczeniem grup siarczanowych, kompleksowa nie polimeru z barwnikiem zachodzi w odmienny sposób, co determinuje postać krzywej wzorcowej.

Podstawę oznaczenia stanowi miareczkowanie próbek wzorcowych karagenów typu kappa, jota oraz lambda o różnych stężeniach mianowanym roztworem BT (optymalnie c=1 mM), z jednoczesnym pomiarem absorbancji układu przy długości fali z zakresu 640±20 nm. Punktem końcowym miareczkowania jest objętość barwnika, przy której osiągnięto zadaną wartość absorbancji (A). Następnie, na podstawie krzywych miareczkowania (fig. 1), wykreśla się zależność stężenia roztworu karagenu od objętości BT w punkcie końcowym (fig. 2). Typ karagenu odczytuje się z rys. 2, na podstawie miareczkowania wodnego roztworu badanej próbki karagenu o określonym stężeniu (optymalnie 10-40 mg/L) roztworem BT do osiągnięcia zadanej wartości absorbancji. W celu identyfikacji karagenu jota zadana wartość absorbancji powinna być większa od jedności (optymalnie 1,5-2). Aby rozróżnić karageny typu kappa i lambda zadana wartość absorbancji nie powinna przekraczać 1 (optymalnie 0,5-0,7). Stężenie miareczkowanej próbki oraz objętość BT w punkcie końcowym pozwalają rozpoznać typ karagenu.

Korzystnymi skutkami rozwiązania według wynalazku, jest prostota i szybkość wykonania, oraz brak potrzeby stosowania skomplikowanej aparatury analitycznej.

Fig. 1 przedstawia przykładowe krzywe miareczkowania wodnych roztworów i-karagenu o różnych stężeniach roztworem Błękitu Toluidynowego.

Fig. 2 przedstawia krzywe do rozróżniania typu karagenu, wyznaczone na podstawie wyników miareczkowania (rys. 1) dla określonej wartości absorbancji oraz sposób wyznaczania typu karagenu.

Fig. 3 przedstawia wyniki oznaczenia typu karagenu. Linie oznaczają krzywe wzorcowe dla poszczególnych typów karagenu, a punkty ilustrują wyniki oznaczenia (O - κ-karagen, · - i-karagen, ·- λ-karagen).

Wynalazek przedstawiono bliżej w przykładzie realizacji.

Krzywe wzorcowe wykonano używając oczyszczonych karagenów, z których przygotowano po kilka roztworów wodnych o stężeniach z zakresu 6-40 mg/L. Jako próbki badane wykorzystano karageny (κ-karagen, CAS 11114-20-8, i-karagen, CAS 9062-07-1, λ-karagen, CAS 9064-57-7), z których przygotowano roztwory wodne o stężeniach 12, 20 i 30 mg/L. Roztwór barwnika o stężeniu 1 mM otrzymano przez rozpuszczenie naważki Błękitu Toluidynowego O, C.l. 52040 (Panreac Ouimica Sau) w wodzie destylowanej.

Wykonanie krzywych wzorcowych:

Do kuwety pomiarowej o pojemności 30 cm³ wprowadzano 20 cm³ wzorcowego roztworu karagenu. Kuwetę umieszczono w przystawce Ti spektrofotometru Spekol. Za pomocą titratora Radelkis OP-930/1 do kuwety dozowano barwnik BT porcjami o objętości 8 pL z interwałem 30 s. Odczytu absorbancji dokonywano przy długości fali 640 nm. Z uzyskanych krzywych miareczkowania odczytano objętości titranta odpowiadające absorbancji 0,5 oraz 1,5 i na tej podstawie wykreślono krzywe wzorcowe pokazane na fig. 3.

Wykonanie oznaczenia: Z badanych próbek karagenu przygotowano roztwory o stężeniach 12, 20 i 30 mg/L. Próbki zmiareczkowano analogicznie jak roztwory wzorcowe. Z krzywych miareczkowania odczytano objętości titranta odpowiadające absorbancji 0,5 oraz 1,5 i na tej podstawie oznaczono typ karagenu w badanych próbkach. Wyniki ilustruje fig. 3.

PL 238 038 B1

[1] Z. Sikorski (red.), Chemiczne i funkcjonalne właściwości składników żywności, WNT, Warszawa 1996, s. 161.

[2] S. Kohlmunzer, Farmakognozja: podręcznik dla studentów farmacji, wyd. V unowocześnione, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003, s. 669.

[3] M. A. Roberts, B. Quemener, Measurement of carrageenans in food: challenges, progress, and trends in analysis, Trends in Food Science & Technology 1999, 10, 169-181.

[4] L. Pereira, A. T. Critchley, A. M. Amado, P. J. A. Ribeiro-Claro, A comparative analysis of phycocolloids produced by underutilized versus industrially utilized carrageenophytes (Gigartinales, Rhodophyta), J. Appl. Phycol. 2009, 21,599-605.

[5] T. Turquois, S. Acquistapace, F. Arce Vera, D. H. Welti, Composition of carrageenan blends inferred from 13C-NMR and infrared spectroscopic analysis, Carhohydrare Polymer 1996, 31,269-278.

[6] F. van de Velde, S.H. Knutsen, A.I. Usov, H.S. Rollemay, A.S. Cerezo, 1H and 13C high resolution NMR spectroscopy of carrageenans: application in research and industry, Trends in Food Science & Technology 2002, 13, 73-92.

[7] D. Ziółkowska, A. Shyichuk, D. Żygowska, Sposób ilościowego oznaczania polimerów anionowych w roztworach wodnych, zgł. pat. P.408914.

[8] H.S. Soedjak, Colorimetric Determination of Carrageenans and Other Anionic Hydrocolloids with Methylene Blue, Anal.Chem. 1994, 66, 4514-4518.

[9] D. Ziółkowska, A. Shyichuk, D. Żygowska, Sposób ilościowego oznaczania polimerów aniono- wych w roztworach wodnych, zgł. pat. P.410721.

[10] D. Ziółkowska, A. Shyichuk, Sposób ilościowego oznaczania polimerów anionowych w roztworach wodnych o podwyższonej wartości siły jonowej, zgł. pat. P.412374.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób rozróżniania karagenów, znamienny tym, że wodny roztwór karagenu o stężeniu (Ckar) z zakresu 10-40 mg/L miareczkuje się wodnym roztworem barwnika - Błękitu Toluidynowego o stężeniu 1 mM z ciągłą rejestracją absorbancji mieszaniny przy długości fali z zakresu od 640±20 nm i na podstawie objętości barwnika w punkcie końcowym (Vpk) odczytuje się typ karagenu z krzywej wzorcowej.
2. 2. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że punktem końcowym miareczkowania jest moment osiągnięcia zadanej wartości absorbancji roztworu.
3. 3. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że krzywe wzorcowe w postaci Ckar=f(VPK) wyznacza się oddzielnie dla różnych typów karagenu i dla tej samej wartości absorbancji, jaką przyjęto za punkt końcowy miareczkowania roztworów badanych.
4. 4. Sposób wg zastrz. 2, znamienny tym, że przy odróżnianiu karagenu typu jota od kappa i lambda zadana wartość absorbancji jest >1, korzystnie 1,5-2.
5. 5. Sposób wg zastrz. 2, znamienny tym, że przy rozróżnianiu karagenów typu kappa i lambda zadana wartość absorbancji jest <1, korzystnie 0,5-0,7.