PL238016B1

PL238016B1 - Crystal, zinc-free form of insulin glargine and method of its preparation

Info

Publication number: PL238016B1
Application number: PL426224A
Authority: PL
Inventors: Jacek Pstrzoch; Radosław DARŁAK; Radosław Darłak; Agnieszka HERNIK-MAGOŃ; Agnieszka Hernik-Magoń; Paweł ŚWIECA; Paweł Świeca; Konrad SOŁTYSEK; Konrad Sołtysek; Agnieszka LEDER; Agnieszka Leder; Tomasz KAPTUROWSKI; Tomasz Kapturowski; Edyta KUBERA; Edyta Kubera; Urszula KOSTRUBIEC; Urszula Kostrubiec
Original assignee: Bioton Spolka Akcyjna
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2018-07-06
Publication date: 2021-06-28
Also published as: PL426224A1; WO2020009594A1

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania krystalicznej postaci insuliny glargine bezcynkowej, która powinna znaleźć zastosowanie w wytwarzaniu preparatów farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia cukrzycy.The invention relates to a process for the preparation of a crystalline form of insulin glargine without zinc, which should find application in the production of pharmaceutical preparations intended for the treatment of diabetes.

Stan technikiState of the art

Insulina glargine (znana również jako Lantus®) to analog ludzkiej insuliny, w której występujący w pozycji 21 łańcucha A kwas asparaginowy został zastąpiony glicyną Gly (A21) natomiast sekwencję łańcucha B przedłużono o dodatkowe dwa aminokwasy, tj. dodając dwie argininy, Arg (B31) i Arg (B32). Wprowadzone modyfikacje zmieniają punkt izoelektryczny uzyskiwanego analogu z pH 5,4 na pH 6,7, dzięki czemu posiada on lepszą rozpuszczalność w roztworze o pH kwaśnym (zwłaszcza wynoszącym około 4) niż o pH fizjologicznym (wynoszącym około 7,4). W efekcie, po podskórnym wstrzyknięciu kwaśnego roztworu tego analogu, np. o pH około 4) wytrąca się on w miejscu wstrzyknięcia tworząc tzw. depot, z którego później następuje stopniowe uwalnianie białka do organizmu. Dlatego insulina glargine jest stosowana do wytwarzania preparatów insuliny o spowolnionym uwalnianiu przeznaczonych do leczenia cukrzycy.Insulin glargine (also known as Lantus®) is a human insulin analog in which the aspartic acid at position 21 of the A chain has been replaced with Gly glycine (A21) and the B chain sequence has been extended by an additional two amino acids, i.e. by adding two arginines, Arg (B31 ) and Arg (B32). The introduced modifications change the isoelectric point of the obtained analog from pH 5.4 to pH 6.7, thanks to which it has better solubility in an acidic solution (especially about 4) than in a physiological pH (about 7.4). As a result, after subcutaneous injection of an acidic solution of this analogue, e.g. with a pH of about 4), it precipitates at the injection site, forming the so-called depot, from which there is a gradual release of protein into the body later. Therefore, insulin glargine is used in the manufacture of sustained-release insulin preparations for the treatment of diabetes mellitus.

Ze względów praktycznych, takich jak lepsza stabilność i trwałość białka, szczególnie pożądane jest otrzymywanie insuliny i jej analogów w postaci krystalicznej. Dotyczy to w szczególności insuliny glargine.For practical reasons such as improved protein stability and stability, it is especially desirable to obtain insulin and its analogs in crystalline form. This is especially true of insulin glargine.

W zgłoszeniu WO2015084694 opisano sposób krystalizacji insuliny glargine z zasadowego roztworu (o pH wyższym o co najmniej 1 od wartości punktu izoelektrycznego analogu insuliny) zawierającego czynnik stabilizujący kryształy (związek fenolowy) oraz rozpuszczalnik organiczny mieszający się z wodą (taki jak: etanol, metanol, aceton lub izopropanol) przy czym krystalizacja inicjowana jest poprzez dodanie soli cynku.The application WO2015084694 describes a method of crystallizing insulin glargine from an alkaline solution (with a pH higher by at least 1 than the isoelectric point value of the insulin analog) containing a crystal stabilizing agent (phenolic compound) and a water-miscible organic solvent (such as: ethanol, methanol, acetone). or isopropanol), the crystallization being initiated by the addition of a zinc salt.

W zgłoszeniu WO2014122653 opisano sposób krystalizacji insuliny glargine z 30% roztworu izopropanolu z zastosowaniem pH7 i jonów cynku do jej inicjacji.WO2014122653 describes a method for crystallizing insulin glargine from a 30% isopropanol solution using pH7 and zinc ions for its initiation.

Znane metody uzyskiwania krystalicznej insuliny glargine wiążą się z problemem zawartości cynku w uzyskiwanej tymi sposobami substancji aktywnej na poziomie 0,2 do 0,6%, co wymusza uwzględnianie jego zawartości przy przygotowywaniu gotowej formy leku.Known methods of obtaining crystalline insulin glargine are associated with the problem of zinc content in the active substance obtained by these methods, at the level of 0.2 to 0.6%, which necessitates taking into account its content when preparing the finished form of the drug.

Cel wynalazkuObject of the invention

Celem wynalazku jest dostarczenie krystalicznej postaci insuliny glargine niezawierającej cynku i wytworzonej bez stosowania fenolu na etapie krystalizacji, spełniającej wymagania farmakopealne dla tej substancji aktywnej, stabilnej przez co najmniej 12 miesięcy w zakresie wymagań farmakopealnych określonych dla tej substancji aktywnej oraz łatwo rozpuszczalnej.The object of the invention is to provide a zinc-free crystalline form of insulin glargine, prepared without the use of phenol in the crystallization step, meeting the pharmacopoeial requirements for this active substance, stable for at least 12 months within the scope of the pharmacopoeial requirements for this active substance and easily soluble.

Nieoczekiwanie, określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.Unexpectedly, the above-defined object has been achieved with the present invention.

Istota wynalazkuThe essence of the invention

Przedmiotem wynalazku jest postać stała insuliny glargine bez zawartości cynku, korzystnie, krystaliczna postać insuliny glargine niezawierająca cynku.The invention relates to a zinc-free solid form of insulin glargine, preferably a zinc-free crystalline form of insulin glargine.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania postaci krystalicznej insuliny glargine charakteryzujący się tym, że przygotowuje się mieszaninę krystalizacyjną stanowiącą wodny roztwór zawierający izopropanol, cytrynian sodu i insulinę glargine, a następnie przez stopniowe rozcieńczanie mieszaniny krystalizacyjnej inicjuje się i kontynuuje proces krystalizacji, po którego zakończeniu oddziela się otrzymaną postać krystaliczną insuliny glargine niezawierającą cynku.Another subject of the invention is a method of obtaining a crystalline form of insulin glargine, characterized in that a crystallization mixture is prepared consisting of an aqueous solution containing isopropanol, sodium citrate and insulin glargine, and then by gradual dilution of the crystallization mixture, the crystallization process is initiated and continued, after which the crystallization process is separated, followed by separation. the obtained crystalline form of insulin glargine free of zinc.

Sposób według wynalazku polega na przygotowaniu mieszaniny, w której insulina glargine jest rozpuszczona, a następnie zainicjowaniu krystalizacji przez rozcieńczenie mieszaniny wodą.The method of the invention consists in preparing a mixture in which insulin glargine is dissolved and then initiating crystallization by diluting the mixture with water.

Korzystnie, mieszanina w warunkach początkowych stanowi wodny roztwór następujących składników:Preferably, the mixture under initial conditions is an aqueous solution of the following components:

- insulina glargine w stężeniu 5 do 20 mg/ml,- insulin glargine at a concentration of 5 to 20 mg / ml,

- izopropanol w stężeniu od 20 do 40%,- isopropanol in a concentration of 20 to 40%,

- cytrynian sodu w stężeniu od 0,1 do 0,5 M.- sodium citrate in a concentration of 0.1 to 0.5 M.

Korzystnie, stosuje się pH z zakresu od 6 do 9.Preferably, a pH in the range of 6 to 9 is used.

Korzystnie, krystalizację inicjuje się poprzez stopniowe dodawanie wody.Preferably, crystallization is initiated by the gradual addition of water.

Korzystnie, że rozcieńczanie prowadzi się do osiągnięcia wartości stężenia rozpuszczalnika organicznego poniżej 70% wartości jego stężenia w momencie inicjacji krystalizacji, korzystnie nie więcej niż 50% stężenia początkowego.Preferably, the dilution is carried out to a concentration value of the organic solvent below 70% of its concentration value at the time of crystallization initiation, preferably not more than 50% of the initial concentration.

PL 238 016 B1PL 238 016 B1

Korzystnie, że krystalizację prowadzi się w zakresie temperatur od 10°C do 20°C.Preferably, the crystallization is carried out in a temperature range of 10 ° C to 20 ° C.

Szczegółowy opis wynalazkuDetailed Description of the Invention

Dla celów niniejszego opisu przyjęto następujące rozumienie poniższych pojęć.For the purposes of this description, the following terms have been understood.

Insulina glargine bezcynkowa - postać krystaliczna insuliny glargine, dla której zawartość cynku oznaczona dostępną metodą analityczną jest poniżej czułości tej metody, w szczególności wynosi poniżej 0,01% masowego.Zinc-free insulin glargine - a crystalline form of insulin glargine, for which the zinc content, determined by an available analytical method, is below the sensitivity of this method, in particular below 0.01% by weight.

Inicjacja krystalizacji - moment rozpoczęcia procesu krystalizacji obserwowany jako zmętnianie mieszaniny krystalizacyjnej. Zmętnienie to następuje przy określonym składzie oraz określonych wartościach pH i temperatury osiągniętych w trakcie rozcieńczania mieszaniny krystalizacyjnej przez dodawanie wody.Initiation of crystallization - the moment of starting the crystallization process, observed as clouding of the crystallization mixture. This turbidity occurs at a certain composition and certain pH and temperature values achieved during the dilution of the crystallization mixture by adding water.

Proces krystalizacji - proces stopniowego rozcieńczania mieszaniny krystalizacyjnej do osiągnięcia ustalonego składu, pH i temperatury mieszaniny, mający na celu uzyskanie insuliny glargine w postaci krystalicznej.Crystallization process - the process of gradual dilution of the crystallization mixture to achieve the set composition, pH and temperature of the mixture, aimed at obtaining insulin glargine in a crystalline form.

Oznaczanie zawartości cynku w uzyskanym preparacie krystalicznej insuliny glargine wykonano metodą absorpcyjnej spektroskopii atomowej zgodnie z Farmakopeą Europejską (2.2.23 Metoda I). Zawartość cynku została określona w % masowych, gdzie limit detekcji (LOD) dla tej metody wynosi 0,01%.Determination of the zinc content in the obtained preparation of crystalline insulin glargine was performed by atomic absorption spectroscopy in accordance with the European Pharmacopoeia (2.2.23, Method I). The zinc content was determined in mass%, with the detection limit (LOD) for this method being 0.01%.

Mieszaninę krystalizacyjną uzyskuje się przez zmieszanie, w określonej temperaturze, wodnego roztworu białka z rozpuszczalnikiem organicznym i solą. Po korekcie pH do zadanej wartości mieszanina jest gotowa do zainicjowania krystalizacji. Kolejność dodawania składników nie ma większego znaczenia, ale najkorzystniej jest, gdy do roztworu białka dodaje się jako pierwszy rozpuszczalnik organiczny.The crystallization mixture is obtained by mixing, at a certain temperature, an aqueous protein solution with an organic solvent and salt. After adjusting the pH to the set value, the mixture is ready to initiate crystallization. The order in which the components are added is not critical, but it is most preferred that the first organic solvent is added to the protein solution.

Inicjacja krystalizacji i sam proces krystalizacji następują przez rozcieńczenie mieszaniny wodą, co powoduje zmniejszenie stężenia rozpuszczalnika organicznego i soli.The crystallization initiation and the crystallization process itself take place by diluting the mixture with water, which reduces the concentration of the organic solvent and salt.

Najważniejszy wpływ na przebieg sposobu według wynalazku mają następujące parametry: stężenie insuliny glargine, pH, stężenie rozpuszczalnika organicznego, stężenie soli, temperatura mieszaniny, ale na jakość uzyskanych wyników mogą wpływać również takie parametry jak intensywność mieszania podczas procesu krystalizacji oraz szybkość rozcieńczania wodą.The following parameters have the most important influence on the course of the method according to the invention: concentration of insulin glargine, pH, concentration of organic solvent, salt concentration, temperature of the mixture, but the quality of the obtained results may also be influenced by parameters such as the intensity of mixing during the crystallization process and the rate of dilution with water.

Stężenie insuliny glargine w mieszaninie krystalizacyjnej powinno wynosić od 5 do 20 mg/ml.The concentration of insulin glargine in the crystallization mixture should be between 5 and 20 mg / ml.

Jako rozpuszczalnik organiczny stosowano izopropanol w stężeniu od 20 do 40%.Isopropanol at a concentration of 20 to 40% was used as the organic solvent.

Jako sól zastosowano cytrynian sodu w stężeniu od 0,1 do 0,5 M.Sodium citrate was used as the salt at a concentration of 0.1 to 0.5 M.

Temperatura krystalizacji ma wpływ na moment inicjacji krystalizacji i na jej wydajność i powinna wynosić od 10 do 20°C.The crystallization temperature affects the moment of crystallization initiation and its efficiency, and should be in the range of 10 to 20 ° C.

Wartość pH powinna wynosić od 6,0 do 9,0. Zbyt wysoka wartość pH, zwłaszcza powyżej 9, może znacząco przyspieszyć degradację insuliny glargine.The pH value should be between 6.0 and 9.0. Too high a pH value, especially above 9, can significantly accelerate the degradation of insulin glargine.

Korzystne jest, aby mieszanina krystalizacyjna przed rozpoczęciem rozcieńczania była klarowna - zapobiega to wypadaniu białka z mieszaniny krystalizacyjnej w postaci amorficznej, która może już nie przejść do formy krystalicznej, obniżając wydajność i/lub utrudniając odsączenie kryształów.It is preferred that the crystallization mixture is clear before starting dilution - this prevents the protein from falling out of the crystallization mixture in amorphous form, which may no longer convert to crystalline form, reducing yield and / or making it difficult to filter the crystals.

Na przebieg procesu krystalizacji może mieć również wpływ sposób mieszania. Forma krystaliczna tworzy się zarówno przy stosowaniu mieszania jak i bez mieszania. Korzystnie krystalizację przeprowadza się jednak z mieszaniem. Mieszanie przyspiesza ujednolicenie składu mieszaniny w całej objętości podczas dodawania wody, co powoduje że uzyskany materiał krystaliczny jest bardziej jednorodny, a jego krystalizacja przebiega szybciej.The course of the crystallization process may also be influenced by the method of mixing. A crystalline form is formed both with and without agitation. Preferably, however, the crystallization is carried out with stirring. Stirring accelerates the homogenization of the composition of the mixture in the whole volume during the addition of water, which makes the obtained crystalline material more homogeneous and its crystallization proceeds faster.

Czas krystalizacji zależy od szybkości rozcieńczania oraz od czasu potrzebnego na osiągnięcie stanu równowagi pomiędzy formą krystaliczną a rozpuszczonym białkiem. Im wolniejsze tempo rozcieńczania rozpuszczalnika organicznego i soli, tym większe uzyskuje się kryształy. Dlatego korzystne jest powolne dodawanie wody do mieszaniny.The time of crystallization depends on the rate of dilution and the time needed to achieve equilibrium between the crystalline form and the dissolved protein. The slower the rate at which the organic solvent and salt are diluted, the larger the crystals obtained. Therefore, it is preferable to slowly add water to the mixture.

P r z y k ł a d yExamples

Dla lepszego zrozumienia jego istoty wynalazek został dodatkowo wyjaśniony na poniższych przykładach.For a better understanding of its essence, the invention is additionally explained on the following examples.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Do wodnego roztworu zawierającego białko o stężeniu ok. 8 mg/ml, izopropanol w stężeniu 20% i 0,5 M cytrynian sodu, o pH 8,5 i temperaturze ok. 20°C w ciągu 4 godzin dodawano porcjami wodę do końcowego stężenia białka wynoszącego ok. 4 mg/ml.To the aqueous solution containing the protein at a concentration of approx. 8 mg / ml, isopropanol at a concentration of 20% and 0.5 M sodium citrate, at pH 8.5 and at a temperature of approx. 20 ° C, water was added in portions to the final protein concentration over 4 hours of approximately 4 mg / ml.

PL 238 016 B1PL 238 016 B1

Uzyskano w ten sposób insulinę glargine w postaci krystalicznej. Otrzymane kryształy zostały przedstawione na Fig. 1, która prezentuje ich obraz mikroskopowy uzyskany za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse 80i z obiektywem Nikon Plan Apo 100x/1.4.In this way, crystalline form of insulin glargine was obtained. The obtained crystals are shown in Fig. 1, which shows their microscopic image obtained with a Nikon Eclipse 80i microscope with a Nikon Plan Apo 100x / 1.4 objective.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Do wodnego roztworu zawierającego białko o stężeniu ok. 16 mg/ml, izopropanol w stężeniu 40% i 0,1 M cytrynian sodu, o pH 6,5 i temperaturze ok. 10°C w ciągu 2 godzin dodawano porcjami wodę do końcowego stężenia białka wynoszącego ok. 8 mg/ml.To the aqueous solution containing the protein at a concentration of approx. 16 mg / ml, isopropanol at a concentration of 40% and 0.1 M sodium citrate, pH 6.5 and temperature approx. 10 ° C, water was added in portions to the final protein concentration over 2 hours. of approximately 8 mg / ml.

Uzyskano w ten sposób insulinę glargine w postaci krystalicznej. Otrzymane kryształy zostały przedstawione na Fig. 2, która prezentuje ich obraz mikroskopowy uzyskany za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse 80i z obiektywem Nikon Plan Apo 100x/1.4.In this way, crystalline form of insulin glargine was obtained. The obtained crystals are shown in Fig. 2, which shows their microscopic image obtained with a Nikon Eclipse 80i microscope with a Nikon Plan Apo 100x / 1.4 objective.

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Kryształy z przykładu 2 odsączono, przemyto wodą i wysuszono próżniowo. Uzyskany osad odważono w ilości 77 mg i dodano 3 ml wody o pH ok. 3. Osad rozpuścił się dając klarowny roztwór o stężeniu ok. 25 mg/ml.The crystals from example 2 were filtered off, washed with water and dried under vacuum. The obtained precipitate was weighed in the amount of 77 mg and 3 ml of water with a pH of approx. 3 was added. The precipitate dissolved to give a clear solution with a concentration of approx. 25 mg / ml.

Claims

1. Solid form insulin glargine without zinc.

2. The form of insulin glargine according to claim 1 The process of claim 1, which is in a crystalline form.

The method of obtaining the crystalline form of insulin glargine, characterized by preparing a crystallization mixture consisting of an aqueous solution containing isopropanol, sodium citrate and insulin glargine, and then by gradual dilution of the crystallization mixture, the crystallization process is initiated and continued, after which the obtained form is separated. Zinc-free crystalline insulin glargine.

4. The method according to p. 3. A process as claimed in claim 3, characterized in that the mixture under the initial conditions is an aqueous solution of the following components:

- insulin glargine at a concentration of 5 to 20 mg / ml,

- isopropanol in a concentration of 20 to 40%,

- sodium citrate in a concentration of 0.1 to 0.5 M.

5. The method according to p. The process of claim 3, wherein the pH is in the range 6 to 9.

6. The method according to p. The process of claim 3, wherein the crystallization is initiated by the gradual addition of water.

7. The method according to p. The method of claim 6, characterized in that the dilution is carried out to a concentration value of the organic solvent below 70% of its concentration value at the time of initiating the crystallization, preferably not more than 50% of the initial concentration.

8. The method according to p. The process of claim 3, characterized in that the crystallization is carried out in a temperature range from 10 ° C to 20 ° C.