PL237494B1

PL237494B1 - Flow microsystem for a layered culture of normal and cancer cells

Info

Publication number: PL237494B1
Application number: PL426675A
Authority: PL
Inventors: Magdalena Bułka; Elżbieta Jastrzębska; Kamil Żukowski; Artur Dybko; Zbigniew Brzózka
Original assignee: Politechnika Warszawska
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2021-04-19
Also published as: PL426675A1

Abstract

Mikrosystem przepływowy do warstwowej hodowli komórek prawidłowych nowotworowych składa się z trzech płytek: hydrofilowej dolnej płytki szklanej (3), hydrofobowej płytki środkowej (2) z polimeru, wyposażonej w sześć okrągłych otworów zagłębiających (7) oraz hydrofobowej płytki górnej (1) z polimeru, wyposażonej w dwa liniowe mikrokanały (1a) z trzema mikrodołkami (4) każdy w kształcie zbliżonym do owalu. Otwory zagłębiające (7) znajdują się w miejscu odpowiadającym środkowi mikrodołków (4) w górnej płytce (1), ponadto mikrokanały (1a) na wejściu zaopatrzone są w otwory wlotowe (5) a na wyjściu mikrokanały (1a) łączą się i kończą się otworem wylotowym (6). Płytki (1, 2 i 3) są ze sobą trwale połączone przy użyciu generatora plazmy tlenowej a układ komór hodowlanych (4) w mikrosystemie jest liniowy, dwurzędowy i zgodny z układem dołków hodowlanych na standardowej płytce wielodołkowej Sarstedt 5022411.The flow microsystem for the layered culture of normal cancer cells consists of three plates: a hydrophilic lower glass plate (3), a hydrophobic middle plate (2) made of polymer, equipped with six circular pit holes (7) and a hydrophobic top plate (1) made of polymer, equipped with two linear microchannels (1a) with three microwells (4) each of an oval shape. The sink holes (7) are located in a place corresponding to the center of the microwells (4) in the upper plate (1), moreover, the microchannels (1a) at the entrance are provided with inlet holes (5) and at the exit the microchannels (1a) connect and end with a hole outlet (6). The plates (1, 2 and 3) are permanently connected with each other using an oxygen plasma generator, and the arrangement of the culture chambers (4) in the microsystem is linear, double-row and compatible with the arrangement of the culture wells on the standard Sarstedt 5022411 multi-well plate.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest mikrosystem przepływowy do warstwowej hodowli komórek prawidłowych i nowotworowych typu Lab-on-a-chip do wielowarstwowej hodowli komórek prawidłowych oraz nowotworowych różnych typów w postaci monokultury lub kokultury komórkowej. Tego typu mikrosystemy znajdują zastosowanie w dziedzinie inżynierii tkankowej i komórkowej, a także w bioanalityce i medycynie. Przedmiot wynalazku może przyczynić się do tworzenia zaawansowanych modeli komórkowych i tkankowych użytecznych w badaniach komórkowych in vitro.The subject of the invention is a flow microsystem for layered Lab-on-a-chip cell culture of normal and neoplastic cells for multilayered cultivation of normal and neoplastic cells of various types in the form of a monoculture or cell co-culture. These types of microsystems are used in the field of tissue and cell engineering, as well as in bioanalytical and medicine. The subject matter of the invention may contribute to the creation of advanced cell and tissue models useful in in vitro cellular research.

Badania laboratoryjne nowoopracowywanych związków terapeutycznych o potencjalnym charakterze przeciwnowotworowym w szerokim zakresie wykonywane są na dwuwymiarowych (2D) modelach komórkowych, dalekich od struktur naśladujących budowę tkanki nowotworowej in vivo. W warunkach fizjologicznych strukturę tkanki nowotworowej tworzą zarówno komórki nowotworowe, jak i komórki prawidłowe, które stanowią tzw. łącznotkankowo-naczyniowe podścielisko dla nowotworu. Komórki tkanki łącznej, dzięki swoim specyficznych właściwościom, są podstawą wzrostu komórek nowotworowych, zapewniają zachowanie integralności nowotworu i stymulują jego komórki do proliferacji. Opracowanie modeli tkankowych naśladujących specyfikę żywego organizmu jest współcześnie jednym z głównych celów inżynierii komórkowej i tkankowej. Jednym z nowatorskich rozwiązań, które pozwalają na usprawnienie badań w zakresie tych dziedzin nauki jest wykorzystanie mikrosystemów typu Lab-on-a-chip. W literaturze jest mało przykładów nowych rozwiązań technologicznych pozwalających na precyzyjne modelowanie tkanki nowotworowej w warunkach in vitro. Odpowiedzią na to zapotrzebowanie jest mikrosystem przepływowy według wynalazku, który umożliwia hodowlę komórkowego modelu nowotworu 3D jak i 2D w postaci wielowarstwy komórkowej.Laboratory studies of newly developed therapeutic compounds of potential antitumor nature are carried out in a wide range on two-dimensional (2D) cell models, far from structures that mimic the structure of neoplastic tissue in vivo. Under physiological conditions, the structure of neoplastic tissue consists of both neoplastic cells and normal cells, which constitute the so-called the connective tissue-vascular strom for the tumor. Connective tissue cells, thanks to their specific properties, are the basis for the growth of neoplastic cells, they ensure the integrity of the tumor and stimulate its cells to proliferate. The development of tissue models imitating the specificity of a living organism is nowadays one of the main goals of cell and tissue engineering. One of the innovative solutions that allow to improve research in these fields of science is the use of Lab-on-a-chip microsystems. There are few examples in the literature of new technological solutions allowing for precise modeling of neoplastic tissue in in vitro conditions. The answer to this need is the microsystem of the flow according to the invention, which enables the cultivation of a 3D as well as a 2D cell tumor model in the form of a cell multilayer.

Mikrosystem według wynalazku stanowi hybrydowy układ składający się z trzech głównych elementów: hydrofilowej dolnej płytki szklanej, korzystnie ze szkła sodowego o grubości 170 μm, hydrofobowej płytki środkowej z polimeru, korzystnie poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), wyposażonej w sześć okrągłych otworów zagłębiających oraz hydrofobowej płytki górnej z polimeru, korzystnie poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), wyposażonej w dwa liniowe mikrokanały z trzema mikrodołkami każdy w kształcie zbliżonym do owalu. Otwory zagłębiające znajdują się w miejscu odpowiadającym środkowi mikrodołków w górnej płytce . Mikrokanały na wejściu zaopatrzone są w otwory wlotowe a na wyjściu mikrokanały łączą się i kończą się otworem wylotowym. Płytki są ze sobą trwale połączone przy użyciu generatora plazmy tlenowej. Układ komór hodowlanych w mikrosystemie jest liniowy, dwurzędowy i zgodny z układem dołków hodowlanych na standardowej płytce wielodołkowej Sarstedt 5022411.The inventive microsystem is a hybrid system consisting of three main elements: a hydrophilic bottom glass plate, preferably 170 μm thick sodium glass, a hydrophobic middle plate made of a polymer, preferably poly (dimethyl siloxane) (PDMS), provided with six circular countersinks, and a hydrophobic a top plate made of polymer, preferably poly (dimethylsiloxane) (PDMS), provided with two linear microchannels with three microwells each with an approximately oval shape. The countersink holes are at the center of the microwells in the top plate. The input microchannels are provided with inlet openings, and at the output the microchannels connect and end with an outlet opening. The plates are permanently connected to each other using an oxygen plasma generator. The arrangement of the culture chambers in the microsystem is linear, two-row, and is compatible with the arrangement of the culture wells on the standard Sarstedt 5022411 multi-well plate.

Korzystnie mikrokanały (1a) mają wysokość 200 μm.Preferably, the microchannels (1a) have a height of 200 µm.

Korzystnie mikrokomory (4) mają wymiary 2000 μm x 6900 μm i wysokość 200 μm.Preferably, the microchamber (4) has dimensions of 2000 µm x 6900 µm and a height of 200 µm.

Korzystnie otwory zagłębiające (7) mają średnicę 2,0 mm lub 1,2 mm.Preferably the countersink holes (7) have a diameter of 2.0 mm or 1.2 mm.

PDMS jest biokompatybilnym, nietoksycznym, transparentnym i przepuszczalnym dla gazów materiałem polimerowym, który dzięki specyficznym właściwościom daje możliwość odwzorowywania skomplikowanych mikrostruktur metodą odlewu, korzystnie metodą replikacyjną. Metoda replikacyjna polega na przygotowaniu mieszaniny prepolimeru PDMS z czynnikiem sieciującym w stosunku 10:1, a następnie wykonaniu odlewu do wcześniej przygotowanej formy wyposażonej w wypukły wzór odpowiadający ostatecznej strukturze mikrosystemu. Formę dla wytworzenia mikrosystemu według wynalazku wykonano w płytce polimerowej z polimetakrylanu metylu) (PMMA), metodą mikrofrezowania. Mikrofezowanie jest metodą mechanicznej obróbki bezpośredniej i polega ona na stopniowym usuwaniu warstw polimeru z powierzchni materiału za pomocą obracającego się mikrofrezu. Po wykonaniu odlewu następuje etap sieciowania PDMS w podwyższonej temperaturze (ok. 70°C). Płytkę polimerową wyposażoną w otwory zagłębiające wykonano metodą odlewu cienkiej warstwy PDMS między dwiema płytkami z PMMA, wyposażonymi w zagłębienie. Otwory zagłębiające wykonano w ściśle określonych miejscach, odpowiadających lokalizacji mikrokomór w pierwszej płytce, za pomocą precyzyjnego dziurkacza punktowego typu Uni-Core. Trzy główne elementy mikrosystemu: dwie płytki polimerowe i płytka szklana, zostały ze sobą trwale połączone, dzięki aktywacji ich powierzchni plazmą tlenową wytworzoną przy użyciu generatora plazmy tlenowej.PDMS is a biocompatible, non-toxic, transparent and gas-permeable polymer material which, thanks to its specific properties, enables the mapping of complex microstructures by casting, preferably by replication. The replication method consists in preparing a mixture of PDMS prepolymer with a cross-linking agent in the ratio of 10: 1, and then making a cast into a previously prepared mold equipped with a convex pattern corresponding to the final structure of the microsystem. The mold for the production of the microsystem according to the invention was made in a polymer plate from polymethyl methacrylate (PMMA) by the method of micro-milling. Microfezing is a method of direct mechanical processing and it consists in the gradual removal of polymer layers from the surface of the material by means of a rotating microfiber. After the casting is made, the PDMS cross-linking step takes place at an increased temperature (approx. 70 ° C). The polymer plate with countersink holes was made by casting a thin PDMS layer between two PMMA plates with a recess. The countersinking holes were made in strictly defined places, corresponding to the location of the microcells in the first plate, using a precise Uni-Core punch. The three main elements of the microsystem: two polymer plates and a glass plate, were permanently connected to each other thanks to the activation of their surfaces with oxygen plasma generated by an oxygen plasma generator.

Mikrosystem według wynalazku został zaprojektowany w taki sposób, że możliwe jest uzyskanie w tym samym mikroukładzie dwuwymiarowej (2D - monowarstwa) lub trójwymiarowej (3D przestrzennej, wielowarstwowej) hodowli komórek prawidłowych, nowotworowych lub ich kokultury (jednoczesnej hodowli dwóch typów komórek w tej samej komorze hodowlanej). Odpowiednie typ yThe microsystem according to the invention has been designed in such a way that it is possible to obtain, in the same microcircuit, a two-dimensional (2D - monolayer) or three-dimensional (3D three-dimensional, multilayer) culture of normal, cancer cells or their co-culture (simultaneous cultivation of two types of cells in the same culture chamber) ). Corresponding types of y

PL 237 494 B1 komórek wprowadzane są równolegle dwoma otworami wlotowymi w postaci zawiesiny komórkowej w medium hodowlanym. Otwory wlotowe przechodzą w sieć mikrokanałów, umożliwiających przepływ medium hodowlanego oraz zawiesiny komórkowej. Mikrosystem został wyposażony w dwa otwory wlotowe, tak aby w jednym układzie możliwa była równoległa i niezależna hodowla dwóch różnych typów komórek. Dodatkowo każdy z typów komórek może być hodowany jednocześnie w trzech komorach hodowlanych, odpowiadających trzem powtórzeniom pomiarowym. Każda komora hodowlana składa się z otworu zagłębiającego, który jest docelowym miejscem hodowli komórek oraz przestrzeni nad otworem zagłębiającym, wypełnionej medium hodowlanym, niezbędnym do utrzymania funkcji życiowych komórek. Otwór zagłębiający umożliwia prowadzenie w mikrosystemie hodowli prawidłowych komórek podstawnych, wykazujących dużą wrażliwość na przepływ, przez minimalizację stresu hydrodynamicznego.The cells are introduced in parallel with two inlets in the form of a cell suspension in the culture medium. The inlet openings go into a network of microchannels that allow the culture medium and cell suspension to flow. The microsystem has been equipped with two inlet openings, so that in one system it is possible to simultaneously and independently cultivate two different types of cells. Additionally, each type of cell can be cultured simultaneously in three culture chambers, corresponding to three measuring replications. Each culture chamber consists of a cavity, which is the target cell culture site, and a space above the cavity, filled with the culture medium necessary to maintain the vital functions of the cells. The tapping hole enables the cultivation of normal basal cells in the microsystem, showing high flow sensitivity, by minimizing hydrodynamic stress.

Mikrosystem według wynalazku daje możliwość prowadzenia w tym samym mikroukładzie hodowli komórek w monowarstwie (2D) jak i ułożeniu przestrzennym (3D). W celu uzyskania hodowli 2D komórki prawidłowe lub nowotworowe zawieszane są w medium hodowlanym, a następnie wprowadzane do mikrosystemu za pomocą pompy perystaltycznej. W celu uzyskania hodowli 3D komórki prawidłowe (korzystnie fibroblasty, o charakterze łącznotkankowo-naczyniowym, zdolne do intensywnego wytwarzania macierzy zewnątrzkomórkowej) zawieszane są w medium hodowlanym i wprowadzane do mikroukładu. Po 24 h komórki prawidłowe ulegają adhezji a następnie komórki nowotworowe zawieszane są w medium hodowlanym i wprowadzane do mikrosystemu. Komórki nowotworowe ulegają adhezji częściowo do warstwy komórek prawidłowych, częściowo do warstwy podłoża, po czym rozpoczyna się proces ich intensywnej proliferacji, na skutek stymulacji przez komórki prawidłowe. Następuje wytworzenie trójwymiarowej (3D) wielowarstwy kokultury komórek.The microsystem according to the invention makes it possible to conduct monolayer (2D) and spatial arrangement (3D) cell culture in the same microcircuit. In order to obtain a 2D culture, normal or neoplastic cells are suspended in the culture medium and then introduced into the microsystem by means of a peristaltic pump. In order to obtain a 3D culture, normal cells (preferably fibroblasts, connective-vascular in nature, capable of intensively producing extracellular matrix) are suspended in the culture medium and introduced into the microcircuit. After 24 h, normal cells are adhered and then tumor cells are suspended in the culture medium and introduced into the microsystem. Neoplastic cells adhere partially to the layer of normal cells, partially to the substrate layer, and then the process of their intensive proliferation begins, as a result of stimulation by normal cells. The formation of a three-dimensional (3D) multilayer of the co-culture of cells takes place.

Mikrosystem według wynalazku daje możliwość prowadzenia przestrzennej hodowli kokultury dwóch typów komórek: prawidłowych i nowotworowych. Hodowla komórek w mikrosystemie daje możliwość wykorzystania mikrosystemu jako potencjalnego narzędzia do badania właściwości nowoopracowywanych leków, do szybkich przesiewowych badań cytotoksyczności oraz do testowania terapii przeciwnowotworowych w warunkach in vitro.The microsystem according to the invention makes it possible to conduct spatial co-culture of two types of cells: normal and neoplastic. The cultivation of cells in the microsystem makes it possible to use the microsystem as a potential tool for studying the properties of newly developed drugs, for rapid screening for cytotoxicity and for testing anti-cancer therapies in vitro.

Mikrosystem według wynalazku został zilustrowany na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia widok perspektywiczny kolejnych warstw mikrosystemu, Fig. 2 przedstawia widok mikrosystemu z góry a Fig. 3 przedstawia przekrój poprzeczny przez środek mikrokomory hodowlanej.The microsystem according to the invention is illustrated in the drawing, in which Fig. 1 shows a perspective view of successive layers of the microsystem, Fig. 2 shows a top view of the microsystem and Fig. 3 shows a cross-section through the center of the rearing microchamber.

Mikrosystem stanowi hybrydowy układ składający się z trzech głównych elementów: hydrofilowej dolnej płytki szklanej 3 ze szkła sodowego o grubości 170 pm, hydrofobowej płytki środkowej 2 z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), wyposażonej w sześć okrągłych otworów zagłębiających 7 oraz hydrofobowej płytki górnej 1 z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS), wyposażonej w dwa liniowe mikrokanały 1a z trzema mikrodołkami 4 każdy w kształcie zbliżonym do owalu. Otwory zagłębiające 7 znajdują się w miejscu odpowiadającym środkowi mikrodołków 4 w górnej płytce 1. Mikrokanały 1a na wejściu zaopatrzone są w otwory wlotowe 5 a na wyjściu mikrokanały łączą się i kończą się otworem wylotowym 6. Płytki są ze sobą trwale połączone przy użyciu generatora plazmy tlenowej. Układ komór hodowlanych 4 w mikrosystemie jest liniowy, dwurzędowy i zgodny z układem dołków hodowlanych na standardowej płytce wielodołkowej Sarstedt 5022411.The microsystem is a hybrid system consisting of three main elements: a 170 µm hydrophilic bottom glass plate 3 made of sodium glass, a hydrophobic middle plate 2 made of poly (dimethyl siloxane) (PDMS), equipped with six circular countersinks 7, and a hydrophobic upper plate 1 with poly (dimethylsiloxane) (PDMS), equipped with two linear microchannels 1a with three microwells 4 each with an approximately oval shape. The countersink holes 7 are located at the center of the microwells 4 in the upper plate 1. The input microchannels 1a are provided with inlet holes 5 and at the exit the microchannels connect and end with an outlet opening 6. The plates are permanently connected to each other using an oxygen plasma generator. . The arrangement of the culture chambers 4 in the microsystem is linear, two-row, and is compatible with the arrangement of culture wells on a standard Sarstedt 5022411 multi-well plate.

Mikrosystem wykonano z dwóch płytek polimerowych górnej 1 i środkowej 2 oraz dolnej płytki szklanej 3. Wytworzenie mikrosystemu rozpoczyna się od zaprojektowania odpowiednich wzorów mikrostruktur w programie AutoCAD. Zaprojektowany model CAD został przetłumaczony na język maszynowy przy pomocy modułu CAM - SolidCAM. Następnie, wzór geometrii mikrosystemu odwzorowano w formie za pomocą metody mechanicznej na drodze mikrofrezowania. W tym celu wykorzystano płytkę z PMMA o wymiarach 100 mm x 100 mm. W pierwszym etapie usunięto wierzchnią warstwę PMMA o grubości około 125 pm, a następnie wyfrezowano właściwą wypukłą formę, korzystanie pieczątkę. Pieczątkę wykonano frezem o średnicy 500 pm, wirującym z prędkością 15 000 obrotów na minutę i poruszającym się w płaszczyźnie równoległej do frezowanej powierzchni z liniową prędkością 500 mm/min. Zachodzenie frezu przy sąsiednich przejazdach nastawiono na 70%. Dzięki takim parametrom zminimalizowano chropowatość powierzchni powstałą w wyniku frezowania. W wyniku tych działań powstał wypukły model sieci mikrokanałów o wysokości 200 pm. Usunięto wióry oraz umyto i osuszono formę. Płynny PDMS wylano na formę i pozostawiono do usieciowania. Usieciowaną strukturę w płytce polimerowej zamrożono w ciekłym azocie, a następnie wywiercono otwory wlotowe 5 służące do wprowadzania zawiesiny komórkowej, medium hodowlanego i badanych substancji do mikrosystemu oraz otwór wylotowy 6. Płytkę polimerową 2The microsystem was made of two polymer plates, the upper 1 and the middle 2, and the lower glass plate 3. The creation of the microsystem begins with designing the appropriate microstructure patterns in AutoCAD. The designed CAD model was translated into the machine language using the CAM - SolidCAM module. Then, the pattern of the geometry of the microsystem was mapped in the mold using a mechanical method by micro-milling. For this purpose, a PMMA plate with dimensions of 100 mm x 100 mm was used. In the first step, the top layer of PMMA with a thickness of about 125 µm was removed, and then the correct convex form was milled, using a stamp. The stamp was made with a milling cutter with a diameter of 500 µm, rotating at a speed of 15,000 revolutions per minute and moving in a plane parallel to the milled surface at a linear speed of 500 mm / min. The cutter overlap on adjacent passes was set to 70%. Thanks to such parameters, the surface roughness resulting from milling has been minimized. As a result of these activities, a convex model of the microchannel network with a height of 200 pm was created. Chips were removed and the mold was washed and dried. Liquid PDMS was poured into a mold and allowed to cross-link. The cross-linked structure in the polymer plate was frozen in liquid nitrogen, and then inlet 5 holes were drilled for introducing the cell suspension, culture medium and test substances into the microsystem, and an outlet hole 6. Polymer plate 2

PL 237 494 B1 wycięto z odlanej cienkiej membrany z PDMS powstałej w wyniku usieciowania PDMS między dwiema płytkami z PMMA, wyposażonymi w zagłębienie o wysokości 200 μm. W cienkiej membranie wykonano 6 otworów zagłębiających, posługując się dziurkaczem precyzyjnym typu Uni-Core, umożliwiającym wykonywanie otworów o średnicy 1,2 mm lub 2,0 mm. Obie płytki polimerowe 1 i 2 połączono z płytką szklaną 3 za pomocą plazmy tlenowej, a w wykonanych otworach umieszczono wężyki. Płytki 1,2 i 3 miały wymiary 60 mm x 24 mm.The PL 237 494 B1 was cut from the cast PDMS thin membrane resulting from PDMS cross-linking between two PMMA plates provided with a 200 µm deep cavity. In the thin diaphragm, 6 countersinking holes were made, using a precision Uni-Core punch, which allows for making holes with a diameter of 1.2 mm or 2.0 mm. Both polymer plates 1 and 2 were connected to the glass plate 3 by means of oxygen plasma, and hoses were placed in the holes made. The plates 1, 2 and 3 were 60 mm x 24 mm.

Mikrosystem według wynalazku wykorzystano do hodowli w monowarstwie (2D) oraz w ułożeniu przestrzennym wielowarstwowym (3D) prawidłowych fibroblastów jajnika (HOF) oraz komórek nowotworu jajnika (A2780 oraz SCOV-3) w postaci monokultury (2D) lub kokultury (3D) komórkowej. Do wysterylizowanego mikroukładu wprowadzono medium hodowlane. Następnie, do mikrokomór hodowlanych wprowadzono przez otwory wlotowe zawiesiny komórek jajnika przygotowane w medium hodowlanym, o gęstości około 1 ·10⁶ komórek mL^-1 (dla komórek nowotworowych) lub około 1 ·10⁵ komórek mL^-1 (dla komórek prawidłowych). Wprowadzone komórki inkubowano przez 24 h w inkubatorze w T = 37°C, CO2 = 5%. Przez otwory wlotowe wprowadzano roztwór odczynnika AlamarBlue, w celu określenia żywotności komórek. W trzeciej i czwartej dobie hodowli (po 48 h i po 72 h) codziennie wprowadzano roztwór odczynnika w celu sprawdzenia stopnia proliferacji komórek. Ostatniego dnia hodowli otworami wlotowymi wprowadzano do komórek roztwór jodku propidyny i kalceinyAM, w celu jakościowego określenia żywotności komórek hodowanych w hodowli 2D i 3D. Otrzymany mikrosystem wykorzystano także do oceny skuteczności terapii fotodynamicznej. W tym celu do mikrosystemu wprowadzono zawiesinę dwóch linii komórkowych, a następnie po 24 h do komórek wprowadzono roztwór związku fotouczulającego meso-tetrafenyloporfiryny i naświetlano komórki przez transparentne ściany mikroukładu światłem o długości fali 640 nm, w celu aktywacji zakumulowanego w komórkach związku. Żywotność komórek w mikrosystemie po przeprowadzeniu procedur terapeutycznych analizowano w analogiczny sposób, za pomocą testu AlamarBlue oraz różnicowego barwienia barwnikami fluorescencyjnymi.The microsystem according to the invention was used for the cultivation in monolayer (2D) and spatial multilayer arrangement (3D) of normal ovarian fibroblasts (HOF) and ovarian tumor cells (A2780 and SCOV-3) in the form of a monoculture (2D) or a co-culture (3D) of cells. A culture medium was introduced into the sterilized microcircuit. Subsequently, an ovarian cell suspension prepared in a culture medium with a density of about 1 × 10 ⁶ mL ^-1 cells (for cancer cells) or about 1 × 10 ⁵ cells mL ^-1 (for normal cells) was introduced through the inlet holes into the culture microcells. The loaded cells were incubated for 24 h in an incubator at T = 37 ° C, CO2 = 5%. AlamarBlue reagent solution was introduced through the inlets to determine cell viability. On the third and fourth day of cultivation (48 h and 72 h), the reagent solution was introduced daily in order to check the degree of cell proliferation. On the last day of culture, a solution of propidium iodide and calcein AM was introduced into the cells through the inlets to qualitatively determine the viability of the cells grown in 2D and 3D cultures. The obtained microsystem was also used to evaluate the effectiveness of photodynamic therapy. For this purpose, a suspension of two cell lines was introduced into the microsystem, and then, after 24 h, a solution of the photosensitizing compound mesotetraphenylporphyrin was introduced into the cells and the cells were irradiated through the transparent walls of the microcircuit with light with a wavelength of 640 nm, in order to activate the compound accumulated in the cells. The viability of cells in the microsystem following therapeutic procedures was analyzed in an analogous manner using the AlamarBlue assay and differential staining with fluorescent dyes.

Claims

1. Flow microsystem for layered culture of normal and neoplastic cells, having a system of microchannels and microwells as well as inlet and outlet openings, characterized by the fact that it consists of three plates: a hydrophilic lower glass plate (3), a hydrophobic middle plate (2) made of polymer , equipped with six circular countersinks (7) and a hydrophobic upper polymer plate (1), equipped with two linear microchannels (1a) with three microwells (4) each approximately oval in shape and the countersink holes (7) in place corresponding to the center of the microwells (4) in the upper plate (1), moreover, the inlet microchannels (1a) are provided with inlet openings (5) and at the exit the microchannels (1a) connect and end with an outlet opening (6), the plates ( 1, 2 and 3) are permanently connected with each other using an oxygen plasma generator and the arrangement of the culture chambers (4) in the microsystem is linear, two-row and compatible with the arrangement of culture wells on a standard p Sarstedt multi-well plate 5022411.

2. The microsystem according to claim The method of claim 1, characterized in that the hydrophilic lower glass plate (3) is made of 170 μm thick sodium glass.

3. The microsystem according to claim The method of claim 1, wherein the hydrophobic central plate (2) is made of poly (dimethylsiloxane).

4. The microsystem according to claim The method of claim 1, wherein the hydrophobic top plate is made of poly (dimethylsiloxane).

5. The microsystem according to claims The method of claim 1, characterized in that the microchannels (1a) have a height

200 μm.

6. The microsystem according to claims The process of claim 1, characterized in that the microchamber (4) has dimensions

2000 μm x 6900 μm and a height of 200 μm.

7. The microsystem according to claims The method of claim 1, characterized in that the countersinking holes (7) have a diameter of 2.0 mm or 1.2 mm.