PL237304B1 - Zastosowanie markerów biochemicznych do diagnozowania porodu przedwczesnego - Google Patents

Abstract

Zgłoszenie dotyczy zastosowania markerów biochemicznych BLC, IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP-3b oraz VCAM-1 do diagnozowania porodu przedwczesnego u kobiety ciężarnej z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego, które obejmuje określenia kolejno stężeń w surowicy krwi biomarkeru BLC, a następnie stężeń jednego lub więcej z biomarkerów IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP-3b oraz VCAM-1.

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania markerów biochemicznych do diagnozowania porodu przedwczesnego z uwzględnieniem diagnostyki różnicowej z porodem fałszywym. Wynalazek oparty jest na nieanalizowanym i niepraktykowanym do tej pory łącznym zastosowaniu wielu markerów biochemicznych i ich wzajemnych interakcji w organizmie kobiety ciężarnej podczas rozwoju porodu przedwczesnego.

TŁO

Poród przedwczesny jest jednym z największych problemów współczesnego położnictwa, ponieważ 85% zgonów noworodków w okresie okołoporodowym spowodowanych jest wcześniactwem. 30% dzieci urodzonych przed 29 tygodniem ciąży które przeżyją, wykazuje zaburzenia neurologiczne, zaburzenia słuchu i wzroku oraz zdolności intelektualnych. Wcześniactwo jest najczęstszą przyczyną hospitalizacji noworodków w oddziałach intensywnej opieki medycznej. Wcześniactwo nie jest tylko problemem medycznym, lecz także, w szerokim tego słowa znaczeniu socjoekonomicznym. Programy skriningowe połączone z leczeniem zakażeń jak również monitorowanie ciężarnych z bezobjawowymi infekcjami dróg rodnych prowadzą nie tylko do znaczącego obniżenia odsetka porodów przedwczesnych, lecz także do oszczędności w bezpośrednich kosztach związanych z wcześniactwem. Diagnostyka porodu przedwczesnego w większości przypadków opiera się jedynie na kryteriach klinicznych. Z uwagi na subiektywną ocenę nasilenia skurczów jak również zmian w szyjce macicy, rozpoznanie - a w konsekwencji leczenie zagrażającego porodu przedwczesnego często odbywa się uznaniowo. Prowadzi to do niepotrzebnej hospitalizacji i leczenia znaczącej liczby ciężarnych, u których poród przedwczesny w efekcie końcowym jest fałszywy.

W przypadku porodu przedwczesnego nie dysponujemy badaniem przesiewowym, takim jak mammografia w diagnostyce wczesnych postaci raka sutka, czy badanie cytologiczne w diagnostyce stanów przedrakowych szyjki macicy, pozwalającym wcześnie wykryć patologię, najlepiej w fazie przedklinicznej. Trudności w diagnostyce porodu przedwczesnego wynikają z faktu, że wczesne objawy są bardzo podobne do występujących w porodzie przedwczesnym fałszywym, oceniane są subiektywnie zarówno przez ciężarną jak i lekarza.

Istnieje coraz więcej dowodów, że przyczyny porodu przedwczesnego wynikają z cyklu reakcji biochemicznych zachodzących w komórkach szyjki macicy, doczesnej i błon płodowych. Wyspecjalizowane cytokiny prozapalne stymulują wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej ECM zawierającej proteazy np. kolagenazy, oraz wzmacniają działanie IL-8. IL-8 może być odpowiedzialna za mobilizację leukocytów wielojądrzastych, wpływających z kolei na wzrost aktywności elastaz. Elastazy, podobnie jak proteazy mogą działać zarówno na szyjkę macicy, jak i na błony płodowe, powodując skracanie i rozwieranie szyjki macicy, a w konsekwencji do porodu przedwczesnego. Znajomość czynników i poznanie markerów biochemicznych swoistych dla porodu przedwczesnego wydaje się mieć kluczowe znaczenie dla różnicowania z porodem przedwczesnym fałszywym i podejmowania leczenia tylko u kobiet z rzeczywistym zagrożeniem.

Aktualnie na świecie prowadzonych jest wiele badań nad poszukiwaniem swoistych markerów porodu przedwczesnego oraz ich wzajemnych oddziaływaniach. Wielkie nadzieje wiąże się z szybko rozwijającymi się metodami biologii molekularnej. Od wielu lat prowadzone są badania nad markerami, które pozwoliłyby wskazać początek procesów prowadzących do porodu przedwczesnego. Patogeneza molekularna tej choroby jest jeszcze słabo poznana, jednakże tak jak w innych chorobach prawdopodobnie postępuje etapami. Ideałem byłoby rozpoznanie zagrożenia porodem przedwczesnym jeszcze w stadium przedklinicznym, przed wystąpieniem skurczów mięśnia macicy.

Do chwili obecnej nie odnotowano markerów swoistych dla porodu przedwczesnego. Podejmowane są próby badawcze stosowania oznaczeń różnych markerów, jednakże ich dotychczasowe wyniki są niejednoznaczne. Dzieje się tak dlatego, że poród przedwczesny może mieć różne mechanizmy rozwoju i dotychczasowe próby diagnostyki porodu przedwczesnego w oparciu o ocenę wartości pojedynczych markerów są niezadowalające. Literatura skupia się na małych populacjach kobiet i analizuje wybrane, pojedyncze czynniki lub grupy czynników, choroby współistniejące, czy też czynniki środowiskowe. Istnieje zatem potrzeba całościowego szerokiego podejścia dla zdiagnozowania porodu przed

PL 237 304 B1 wczesnego, możliwie mało inwazyjnego dla pacjentek, uwzględniającego zarówno kilka lub więcej markerów biochemicznych, wzajemnie ze sobą powiązanych, jak i czynników ryzyka porodu przedwczesnego zebranych w wywiadzie u pacjentek.

Ze zgłoszenia patentowego P-408305 znane jest zastosowanie ceramidu C16 (C16-Cer) jako biomarkera w predykcji porodu przedwczesnego.

Założeniem niniejszego wynalazku była kompleksowa analiza czynników ryzyka porodu przedwczesnego w połączeniu z poszukiwaniem zależności pomiędzy wybranymi markerami biochemicznymi a porodem przedwczesnym, pozwalającymi na różnicowanie kobiet z rozpoczynającym się porodem przedwczesnym od tych z porodem przedwczesnym fałszywym.

PODSUMOWANIE

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania in vitro markerów biochemicznych BLC, IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP-3b oraz VCAM-1 do diagnozowania porodu przedwczesnego u kobiety ciężarnej z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego, obejmującego określenie kolejno stężenia w surowicy krwi kobiety ciężarnej z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego biomarkeru BLC, a następnie stężeń jednego lub więcej z biomarkerów IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP-3b oraz VCAM-1.

Zastosowanie markerów biochemicznych rozpoczyna się od oznaczenia stężenia w surowicy krwi markera BLC, gdzie uzyskany wynik BLC > 42,27 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni, a stężenie w surowicy krwi BLC < 42,27 pg/ml wym aga dalszego oznaczenia stężenia markera IGFBP-1.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml wynik stężenia IGFBP-1 > 18,37 pg/ml wymaga następowego oznaczenia stężenia markera MIP-1d, gdzie otrzymana wartość MIP-1d < 31,25 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 > 18,37 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia MIP-1d > 31,25 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.

Przy stężeniu BLC < 42,27, stężeniu IGFBP -1 < 18,37 pg/ml, należy oznaczyć stężenie markera BDNF, uzyskany wynik stężenia BDNF > 46,70 pg/ml wymaga dalszego oznaczenia stężenia markera MIP-3b, uzyskany w takim wariancie wynik stężenia MIP-3b < 68,19 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF > 46,70 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia MIP-3b > 68,19 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, należy oznaczyć stężenie markera ICAM-1, a uzyskany w takim wariancie wynik stężenia ICAM-1 < 27,97 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, stężeniu ICAM-1 > 27,97 pg/ml, należy oznaczyć marker VCAM-1, a uzyskany w takim wariancie wynik stężenia VCAM-1 > 53,53 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

Przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, stężeniu ICAM-1 > 27,97 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia VCAM-1 < 53,53 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.

Łącznie stosowanie wspomnianych markerów biochemicznych (wszystkich lub niektórych z nich) z uwzględnieniem ich wzajemnych relacji nie było dotychczas rozważane w literaturze przedmiotu dla celów diagnozowania porodu przedwczesnego.

OPIS RYSUNKÓW

Ryc. 1 Liczba kobiet rodzących przedwcześnie w poszczególnych grupach wiekowych

Ryc. 2 Struktura grupy rodzących przedwcześnie w zależności od liczby przebytych ciąż

Ryc. 3 Struktura badanej grupy kobiet rodzących przedwcześnie w zależności

Ryc. 4 Częstość występowania zakażeń dróg moczowych w przebiegu ciąży w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym oraz w grupie referencyjnej

PL 237 304 B1

Ryc. 5 Częstość występowania krwawień z dróg rodnych w przebiegu ciąży w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 6 Występowanie Bacterial vaginosis przed 20 tygodniem w przebiegu ciąż w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 7 Występowanie częstych skurczów macicy w przebiegu ciąży w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 8 Częstość palenia papierosów w przebiegu ciąży w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 9 Częstość palenia papierosów przed ciążą w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 10 Częstość spożywania alkoholu przed ciążą w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 11 Wykształcenie pacjentek w grupie z porodem przedwczesnym, porodem przedwczesnym fałszywym i grupie referencyjnej

Ryc. 12 Częstość subiektywnego poczucia złej sytuacji materialnej w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 13 Częstość występowania obciążenia przebytym porodem przedwczesnym w grupie kobiet z porodem przedwczesnym, przedwczesnym fałszywym, oraz grupie referencyjnej

Ryc. 14 Krzywa decyzyjna analizy stężeń IGFBP-1

Ryc. 15 Krzywa ROC dla stężeń IGFBP-1

Ryc. 16 Odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem IGFBP-1, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny)

Ryc. 17 Krzywa decyzyjna analizy stężeń IGFBP-2

Ryc. 18 Krzywa ROC dla stężeń IGFBP-2

Ryc. 19 Krzywa decyzyjna analizy stężeń L-Selektyny

Ryc. 20 Krzywa ROC dla stężeń L-Selektyny

Ryc. 21 Krzywa decyzyjna analizy stężeń MIP-1d

Ryc. 22 Krzywa ROC dla stężeń MIP-1d

Ryc. 23 Odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem MIP-1d, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny)

Ryc. 24 Krzywa decyzyjna analizy stężeń BDNF

Ryc. 25 Krzywa ROC dla stężeń BDNF

Ryc. 26 Odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem BDNF, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny)

Ryc. 27 Krzywa decyzyjna analizy stężeń BLC

Ryc. 28 Krzywa ROC dla stężeń BLC

Ryc. 29 Odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem BLC, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny)

Ryc. 30 Krzywa decyzyjna analizy stężeń Eotaksyny-1

Ryc. 31 Krzywa ROC dla stężeń Eotaksyny-1 Prewalancja- 0,689

Ryc. 32 Odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem Eotaksyny-1, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny)

Ryc. 33 Krzywa decyzyjna analizy stężeń Eotaksyny-2

Ryc. 34 Krzywa ROC dla stężeń Eotaksyny-2

Ryc. 35 Krzywa decyzyjna analizy stężeń E-Selektyny

Ryc. 36 Krzywa ROC dla stężeń E-Selektyny

Ryc. 37 Krzywa decyzyjna analizy stężeń ICAM-1

Ryc. 38 Krzywa ROC dla stężeń ICAM-1

Ryc. 39 Krzywa decyzyjna analizy stężeń MIP-3b

Ryc. 40 Krzywa ROC dla stężeń MIP-3b

Ryc. 41 Krzywa decyzyjna analizy stężeń PECAM-1

Ryc. 42 Krzywa ROC dla stężeń PECAM-1

Ryc. 43 Krzywa decyzyjna analizy stężeń VCAM-1

Ryc. 44 Krzywa ROC dla stężeń VCAM-1

Ryc. 45 Krzywa decyzyjna analizy stężeń CRP

Ryc. 46 Krzywa decyzyjna analizy stężeń CRP

PL 237 304 B1

Ryc. 47 Model diagnostyczny różnicowania porodu przedwczesnego od porodu przedwczesnego fałszywego w oparciu o stężenia markerów biochemicznych według wynalazku.

SZCZEGÓŁOWY OPIS

Ocena kliniczna porodu przedwczesnego stanowi wyzwanie. Ocena objawów (nasilenie skurczów czy zmian w szyjce macicy) jest subiektywna, co sprawia, że leczenie zagrażającego porodu przedwczesnego odbywa się w znacznej mierze uznaniowo. Opisane tu sposoby i wyniki stanowią dowód, że łączne zastosowanie opisanych tu biomarkerów jest przydatne do diagnozowania porodu przedwczesnego i różnicowania kobiet z rozpoczynającym się porodem przedwczesnym od tych z porodem przedwczesnym fałszywym.

Definicje

Definicja wcześniactwa ze względu na swoją niedoskonałość w praktyce lekarskiej, ulegała kilkakrotnie zmianie. Przedwczesnym określa się poród występujący przed osiągnięciem wieku ciążowego w którym płód uzyskuje optymalną zdolność do życia w środowisku pozamacicznym. Dla celów klinicznych próbowano stosować różne kryteria, jak np. masa urodzeniowa. W 1948 roku [4] Światowa Organizacja Zdrowia podała definicję według której za wcześniaka uznano noworodka o masie ciała równej lub mniejszej niż 2500 g. Takie kryterium przyjęto w celu uzyskania statystyk porównawczych z różnych rejonów świata, gdzie ze względów kulturowych i społecznych często czas trwania ciąży nie był możliwy do ustalenia.

Jednakże ocena dojrzałości noworodków oparta tylko na masie ciała obarczona była dużym błędem, gdyż nie uwzględniała zarówno możliwości wewnątrzmacicznej hipotrofii jak i hipertrofii. Ponadto wadą powyższej klasyfikacji był jej retrospektywny charakter, a tym samym mała przydatność kliniczna, gdyż dokładna ocena masy ciała płodu możliwa jest dopiero po urodzeniu [5]. Dlatego w roku 1961 [6] eksperci Komitetu Opieki nad Matką i Dzieckiem Światowej Organizacji Zdrowia określili noworodki o masie ciała poniżej 2500 g jako dzieci o niskiej masie urodzeniowej, a za kryterium wcześniactwa przyjęto kryterium czasu trwania ciąży, tj: odbycia porodu przed ukończeniem 37 tygodnia ciąży. Wadą tej metody były trudności z określeniem daty poczęcia, dlatego w 1976 roku [7] pojawiły się koncepcje stworzenia definicji kompromisowej, łączącej w sobie dwa kryteria:

- masy ciała poniżej 2500 g;

- wieku ciążowego poniżej 37 tygodnia.

Po kolejnych latach obradująca pod przewodnictwem Dunna [8] komisja Światowej Organizacji Zdrowia zaproponowała przyjęcie wieku ciążowego 22 tygodnie lub masę ciała 500 g jako granicę między poronieniem i porodem.

Zgodnie z aktualną definicją Światowej Organizacji Zdrowia [9] mianem porodu przedwczesnego określa się przedwczesne zakończenie ciąży w okresie miedzy 22 a 37 tygodniem jej trwania. Z porodów tych rodzą się noworodki niedonoszone (wcześniaki), nie przygotowane w pełni do życia poza organizmem matki, o wadze od 500 g do 2500 g. Granica 37 tyg. została ustalona nieco arbitralnie, bardziej ze względu na zachorowalność i umieralność noworodków niż na jakiekolwiek znaczenie statystyczne. Obecnie jednak w nowoczesnych ośrodkach opieki neonatalnej zachorowalność i śmiertelność noworodków urodzonych po 32 tyg. ciąży jest znikoma [9].

Kryteria rozpoznania porodu przedwczesnego

Diagnostyka porodu przedwczesnego w większości przypadków opiera się jedynie na kryteriach klinicznych. Z uwagi na subiektywną ocenę nasilenia skurczów jak również zmian w szyjce macicy, rozpoznanie - a w konsekwencji leczenie zagrażającego porodu przedwczesnego często odbywa się uznaniowo [10]. Według Carbonne [10] istnieje potrzeba stworzenia czułych metod diagnostycznych pozwalających określić prawdziwe ryzyko porodu przedwczesnego, co pozwoliłoby na znaczną redukcję liczby niepotrzebnie leczonych z tego powodu kobiet ciężarnych. Współcześnie niektóre techniki, jak na przykład ultrasonograficzny pomiar długości szyjki macicy czy oznaczanie stężenia fibronektyny w wydzielinie szyjkowej zostały włączone do praktyki klinicznej w celu poprawy predykcji ryzyka porodu przedwczesnego [11]. Według Maul'a i wsp. [12] dla ustalenia kryteriów porodu przedwczesnego mogą być pomocne badania właściwości mechanicznych szyjki macicy, oparte na fluorescencyjnym pomiarze zawartości kolagenu w szyjce.

PL 237 304 B1

Jednak pomimo to, do chwili obecnej nie udało się stworzyć modelu diagnostycznego porodu przedwczesnego opartego na dowodach, który pozwoliłby na różnicowanie rozpoczynającego się porodu przedwczesnego od porodu fałszywego, a tym samym uniknięcie niepotrzebnej hospitalizacji i leczenia znaczącej liczby kobiet.

Dla celów klinicznych, w zależności od stopnia zaawansowania wyróżnia się trzy etapy porodu przedwczesnego [13]:

1. Zagrażający poród przedwczesny - który stanowi wczesną fazę porodu, charakteryzującą się szerokim zakresem objawów i niejednolitymi kryteriami diagnostycznymi. Diagnoza oparta jest na podstawie 30-60 min rejestracji czynności skurczowej macicy za pomocą kardiotokografii i ultrasonograficznego pomiaru długości szyjki macicy (w cm) i jej rozwarcia;

2. Poród przedwczesny w toku - charakteryzujący się regularną czynnością skurczową połączoną z równoczesnym rozwieraniem się szyjki macicy; najczęściej stosowane kryterium to: regularne bolesne skurcze występujące nie rzadziej niż co ok. 10 minut, powodujące rozwieranie szyjki macicy;

3. Poród przedwczesny dokonany.

Zagrażający poród przedwczesny jest wczesną fazą porodu przedwczesnego, możliwą do czasowego zahamowania, na ogół od kilkunastu godzin do kilku dni [14]. Charakteryzuje się szerokim zakresem objawów i niejednolitymi kryteriami diagnostycznymi.

Najczęściej proponowane przez wielu autorów [14-17] kryteria rozpoznawania to:

1. Od 4 do 7 skurczów na godzinę - kryterium trudne do weryfikacji stopnia nasilenia skurczu, często ocenianego subiektywnie, zarówno przez ciężarną jak i lekarza;

2. Stan szyjki macicy poniżej 10 pkt. w skali Bishopa;

3. Rozwarcie szyjki macicy powyżej 3 cm - kryterium dość czułe u nieródek. U wieloródek wartość diagnostyczna tego parametru jest mniejsza;

4. Skrócenie szyjki poniżej 60%.

Wydaje się, że obiektywną diagnozę zagrażającego porodu przedwczesnego można postawić na podstawie wywiadu i badania ginekologicznego obejmującego: badanie we wziernikach - ocena długości części pochwowej i ujścia zewnętrznego, palpacyjne badanie szyjki - ocena konsystencji szyjki oraz rozwarcia, ultrasonograficzny pomiar długości szyjki, oraz 30-60 minutową kardiotokograficzną rejestrację czynności skurczowej macicy i akcji serca płodu.

Poród przedwczesny w toku jest zaawansowaną fazą porodu przedwczesnego, trudną do zahamowania. Charakteryzuje się, nasilającą się czynnością skurczową macicy i postępującym rozwieraniem się szyjki macicy. Niestety przy niewydolności cieśniowo-szyjkowej rozwieranie szyjki może dokonywać się bez nasilenia skurczów macicy, dlatego też monitorowanie czynności skurczowej w tej sytuacji nie jest główną metodą wykrywającą zagrażający poród przedwczesny. Według Czajki [18] zjawiskiem utrudniającym różnicowanie (według kryteriów klinicznych) ciężarnych z zagrażającym porodem przedwczesnym od ciężarnych z porodem fałszywym są fizjologiczne skurcze Alvareza oraz Braxtona - Hicksa, których ocena jest subiektywna.

Epidemiologia

Pomimo dużego postępu, jaki dokonał się w okresie ostatnich kilkunastu lat w zakresie profilaktyki i leczenia porodów przedwczesnych, ich częstość w krajach rozwiniętych utrzymuje się na prawie niezmienionym poziomie. Na świecie odsetek porodów przedwczesnych waha się od 3,5% (Holandia) do 34% (Indie) i jest związany prawdopodobnie ze statusem socjoekonomicznym ciężarnej [19-21].

Według aktualnych danych z badań przeprowadzonych w USA [22] istotne różnice w częstości występowania porodów przedwczesnych występują pomiędzy odmiennymi rasami oraz grupami etnicznymi. Może to być wynikiem wielu różniących się czynników jak: odżywianie, używki, warunki pracy i aktywność fizyczna, jednak nie sposób pominąć czynników socjologicznych pojawiających się w krajach rozwiniętych w ostatniej dekadzie. Trend do rodzenia w coraz późniejszym wieku prowadzi do wzrostu odsetka ciąż uzyskanych w wyniku zastosowania technik wspomaganego rozrodu, w wyniku czego wzrasta odsetek ciąż mnogich, zwykle kończących się przed 37 tygodniem.

W USA częstość występowania porodów przedwczesnych wynosi 8-10% [23]. Jak wynika z danych Głównego Urzędu Statystycznego [24] w Polsce odsetek porodów przedwczesnych utrzymuje się

PL 237 304 B1 na wysokim poziomie (6-8,5%) i jest zdecydowanie wyższy niż w innych krajach Europy Zachodniej, gdzie wynosi 3-5%. Z opracowań Instytutu Matki i Dziecka poświęconych umieralności okołoporodowej wczesnej płodów i noworodków (raport za lata 1999-2006) wiadomo, że wcześniactwo stanowi najczęstszą przyczynę zgonów noworodków (47%) przed wadami rozwojowymi (24%), chorobami dróg oddechowych (8%) oraz chorobami zakaźnymi. Podobnie jest na całym świecie, gdzie poród przedwczesny jest najczęstszą przyczyną okołoporodowej zachorowalności i umieralności noworodków.

Według Szamatowicza M. [24] znaczącego postępu w perinatologii dokonano w odniesieniu do ograniczenia konfliktu serologicznego, rozpoznawania i leczenia wewnątrzmacicznej hipotrofii płodu, prowadzenia ciąż i porodów u matek z cukrzycą a także rozpoznawania i leczenia niektórych wad płodu. Niestety takiego postępu nie osiągnięto w profilaktyce porodu przedwczesnego. Problem ten jest bardzo istotny. Jeśli rodzi się noworodek z masą urodzeniową poniżej 1500 g to ryzyko zgonu w pierwszym roku życia jest 200-krotnie wyższe w porównaniu z noworodkami o masie powyżej 2500 g. U wcześniaków występuje 10-krotnie wyższe ryzyko powikłań neurologicznych, rozwoju psychoruchowego, zaburzeń słuchu, wzroku, chorób płuc itp. Przedwczesne zakończenie ciąży skutkuje licznymi powikłaniami u wcześniaka, z dominującymi zaburzeniami funkcji płuc i mózgu.

Wdrożone w latach 90 programy poprawy opieki perinatalnej, testy skriningowe, program zwalczania niedoboru kwasu foliowego, promocja karmienia piersią i szczepienia ochronne zaowocowały widoczną poprawą wskaźnika umieralności okołoporodowej oraz wskaźnika umieralności niemowląt. Wskaźnik umieralności okołoporodowej zmniejszył się z 17,5% w roku 1990 do 8% w 2006, a wskaźnik umieralności niemowląt z 19,3% do 6,8%. Należy jednak dodać, że w tym samym czasie szereg krajów zachodnioeuropejskich osiągnął postęp w tej dziedzinie i stąd też Polska zajmuje końcowe pozycje w rankingu Wspólnoty Europejskiej [24].

Według Szamatowicza M. [24] prowadzone w ostatnich latach zmiany organizacyjne w ochronie zdrowia zaowocowały rozdrobnieniem i niestabilnością instytucji i placówek sprawujących opiekę nad kobietą ciężarną. Nowe podziały, przy niejasności kompetencji osób, które powinny prowadzić ciążę, skutkują szeregiem nieprawidłowości. Jak wynika z analiz dotyczących udzielania pomocy specjalistycznej kobietom ciężarnym, najpoważniejszym błędem jest kierowanie pacjentki z porodem przedwczesnym do szpitala o nieodpowiednim stopniu referencyjności [24]. Takie postępowanie uniemożliwia udzielenie natychmiastowej pomocy na najwyższym poziomie, a przede wszystkim nie pozwala zapobiec skutkom porodu przedwczesnego lub urodzenia dziecka z małą masą urodzeniową. Według danych Instytutu Matki i Dziecka, tylko 50,5% porodów noworodków z masą ciała poniżej 1000 g odbywa się w ośrodkach o trzecim stopniu referencyjności. Dlatego zmiana w funkcjonowaniu i organizacji opieki nad kobietą ciężarną wyznacza kierunek działania na najbliższą przyszłość.

Dzięki rozwojowi intensywnej terapii neonatologicznej, która wymaga ogromnych nakładów finansowych na wysoce specjalistyczną aparaturę oraz leki, przeżywa coraz więcej dzieci urodzonych z coraz mniej zaawansowanych ciąż. Nadal jednak głównym problemem jest walka z zespołem zaburzeń oddechowych (RDS), którego pochodną są wszelkie inne powikłania wcześniactwa.

Czynniki ryzyka porodu przedwczesnego

Pomimo nagromadzenia wielu faktów i powstania nowych teorii w dalszym ciągu nie udało się jednoznacznie ustalić i wyjaśnić przyczyn występowania przedwczesnej czynności skurczowej macicy. Istnieją doniesienia o roli czynników genetycznych predysponujących do wystąpienia porodu przedwczesnego [25]. Bezsporną tezą jest istnienie licznych czynników ryzyka tej choroby, zarówno przed ciążą jak i w trakcie jej trwania. Poznanie czynników ryzyka porodu przedwczesnego oraz skutecznych metod wczesnego wykrywania, to jedna z głównych przesłanek pracy. Określenie poziomu rzeczywistego zagrożenia porodem przedwczesnym na podstawie występowania określonych czynników ryzyka może mieć wpływ na poprawę wskaźników zachorowalności oraz wyniki leczenia. Ale czy możemy wyniki badań uzyskane w innych, często odmiennych kulturowo populacjach przenosić wiarygodnie na populację polską? Czy tak zwane duże czynniki ryzyka są tak samo istotne w Polsce i np. na Tajwanie?

Kryteria podziału czynników ryzyka są niejasne. Chamberlain [26], podzielił na przykład czynniki ryzyka wystąpienia porodu przedwczesnego na 4 zasadnicze grupy:

Czynniki występujące w ciąży:

- zakażenia dróg moczowych. Dowody na znaczenie odmiedniczkowego zapalenia nerek w patogenezie porodu przedwczesnego przedstawił w 1971 roku Koval'chuk i wsp. [27] według których pełnoobjawowe zakażenie dróg moczowych nie jest jedyną postacią kliniczną infekcji dróg

PL 237 304 B1 moczowych, mogącą powodować poród przedwczesny. Istotnym czynnikiem ryzyka porodu przedwczesnego jest także bakteriuria bezobjawowa [28]. W materiale Moutquin'a [29] infekcje dróg moczowych w ciąży były ważnym czynnikiem ryzyka porodu przedwczesnego (OR 4,3). Jednak publikowane dane dotyczące znaczenia zakażeń dróg moczowych w prognozowaniu porodu przedwczesnego wymagają zachowania ostrożności, ponieważ właściwa analiza predykcji tego czynnika wymaga uwzględnienia czasu wystąpienia infekcji w przebiegu ciąży [28]; - krwawienia z dróg rodnych we wczesnej ciąży. Istnieje zależność pomiędzy występowaniem krwawień z dróg rodnych w I i II trymestrze ciąży, a występowaniem porodów przedwczesnych. Według Hossain'a i wsp. [30] takie krwawienia znacząco zwiększają ryzyko porodu przedwczesnego, jednak publikowane doniesienia są heterogenne. Heterogenność wynika z niejednorodnego raportowania incydentów krwawień, jak również różnic między badanymi populacjami [31]; - bacterial vaginosis. Współistnienie porodu przedwczesnego i Bacterial Vaginosis (BV) prawdopodobnie zmienia się w różnych populacjach. Pomimo udowodnienia związku pomiędzy porodem przedwczesnym i BV, wartość predykcyjna BV dotąd nie została określona w sposób zadowalający [32]. Z uwagi na duże różnice między populacjami próba korelacji występowania BV z porodem przedwczesnym nie przyniosła oczekiwanych wyników [33]. Zachęca to do badań nad możliwościami klinicznego wykorzystania markerów biochemicznych subklinicznej infekcji, których wartość predykcyjna może być wyższa od klinicznego potwierdzenia BV;

- przewlekłe choroby nerek. Przyjmuje się, że problem ten może mieć istotne znaczenie u ciężarnych z poziomem kreatyniny powyżej 1,5 mg/dl. Według Kurata i wsp. [34] takie stężenie zwiększa ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego 4,4-krotnie. Białkomocz powyżej 3 g/dobę zwiększa to ryzyko aż 11,7-krotnie. Przy takich wartościach stężenia kreatyniny w surowicy krwi oraz białkomoczu, ryzyko to jest takie samo zarówno u kobiet przed przeszczepem nerek jak i u ciężarnych po przeszczepach [34];

- wady rozwojowe macicy u ciężarnej. Niewydolność cieśniowo-szyjkowa, liczne lub dużych rozmiarów mięśniaki, przegrody i inne wady rozwojowe macicy powodują zwiększone niebezpieczeństwo wystąpienia porodu przedwczesnego [35];

- ciąża mnoga. Odsetek przedwczesnego porodu u kobiet z ciążami wielopłodowymi jest znacząco wyższy niż u tych z ciążą pojedynczą. Uważa się, że podobnie jak u pacjentek z wielowodziem nadmierne rozciągnięcie mięśnia macicy w przebiegu ciąż wielopłodowych zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia przedwczesnej czynności skurczowej mięśnia macicy [35];

- obciążony wywiad położniczy. Według Lo i wsp. [36] wystąpienie jednego porodu przedwczesnego w przeszłości zwiększa ryzyko ponownego porodu przedwczesnego czterokrotnie, dwa porody przedwczesne - zwiększają ryzyko aż szesnastokrotnie. Istotne znaczenie w określaniu prawdopodobieństwa wystąpienia porodu przedwczesnego mogą mieć także przebyte martwe urodzenia oraz poronienia. Według Hubnera'a [37] niepowodzenia położnicze jak przebyte poronienia zwiększają ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego w bieżącej ciąży. Zarówno w przebiegu poronień jak i porodów przedwczesnych w surowicy krwi ciężarnych stwierdza się podwyższone stężeniaprozapalnych cytokin związanych bezpośrednio z procesem aktywacji reakcji kaskadowej prostaglandyn i wyzwolenia skurczów mięśnia macicy [38];

- nadciśnienie tętnicze w ciąży. Problem ten dość często łączy się z rozwojem stanu przed rzucawkowego i koniecznością wcześniejszego ukończenia ciąży, prowadząc do jatrogennego wcześniactwa. Według Matsushita i wsp. [39] u kobiet ze stanem przedrzucawkowym ryzyko porodu przedwczesnego wzrasta średnio 12,3-krotnie. Znaczenia nadciśnienia tętniczego jako czynnika ryzyka porodu przedwczesnego dowiedziono w licznych badaniach opartych o metodę wielokrotnej regresji logistycznej, wskazujących jednoznacznie na istotny wzrost ryzyka konieczności wcześniejszego rozwiązania ciąży i jatrogennego wcześniactwa u kobiet z nadciśnieniem tętniczym [40-43]. Podobnie, z koniecznością wcześniejszego rozwiązania ciąży należy liczyć się przy współistnieniu wymienionych poniżej jednostek chorobowych, jednak można je analizować jedynie jako przyczyny wcześniactwa, a nie porodu przedwczesnego;

- wewnątrzmaciczne zahamowanie wzrostu płodu (IUGR), lub zespół ograniczonego wzrastania płodu (FGR - fetal growth restriction). Jak dotąd nie udało się bezpośrednio powiązać problemu IUGR z porodem przedwczesnym. Istniejąca zależność, która pojawia się pomiędzy tymi jednostkami chorobowymi w modelach regresyjnych prawdopodobnie wynika z łączącego te dwa stany wspólnego czynnika etiologicznego, jakim jest palenie tytoniu [44];

PL 237 304 B1

- łożysko przodujące. Klinicznie zależność pomiędzy przodowaniem łożyska i porodem przedwczesnym wynika głównie z potrzeby wcześniejszego rozwiązania ciąży na skutek krwotoków powodowanych łożyskiem przodującym, ale nie tylko. Kompleksowe badania morfologiczne łożysk przodujących wykazują zmiany typowe dla przedwczesnego dojrzewania łożyska, niektóre wręcz typowe dla łożysk z ciąż dojrzałych, powikłanych przez IUGR [45]. Najistotniejsze z nich to: obecność zawałów łożyska, obrzęk kosmków, zwiększona zawartość fibrynoidów, zmniejszenie powierzchni mikrokosmków, aktywność pinocytarna syncytiotrofoblastu, zcieńczenie błony podstawowej ze zwiększoną ilością włókien kolagenowych w podścielisku. Takie łożysko produkuje większe ilości CRH, stymulując procesy porodowe;

- przedwczesne oddzielenie łożyska. Powikłanie to zwiększa ryzyko wcześniactwa średnio 7,9krotnie [36];

- konflikt serologiczny. Narastające miano przeciwciał anty RhD (rzadziej w układzie grup głównych ABO) powyżej 28 tygodnia ciąży zwykle wymaga wcześniejszego rozwiązania ciąży, będąc powodem wcześniactwa (nie porodu przedwczesnego);

- powikłana cukrzyca. U kobiet chorych na cukrzycę powikłaną zmianami naczyniowymi, ryzyko wcześniactwa wzrasta średnio 5,7-krotnie [37]. Według Melamed'a i wsp. [46] ryzyko to nie podlega modyfikacji poprzez szczególną opiekę przedkoncepcyjną, jak i opiekę oraz leczenie w przebiegu ciąży.

Czynniki socjalne:

- niski status socjo-ekonomiczny ciężarnej. Pojęcie to jest względne, ponieważ indywidualne potrzeby materialne każdego człowieka są różne. Obserwuje się jednak częstsze występowanie porodu przedwczesnego u kobiet z niskim wykształceniem, ciężko pracujących fizycznie, źle i słabo odżywianych w czasie poczęcia i ciąży. Znaczenie czynników socjoekonomicznych i demograficznych w predykcji porodu przedwczesnego przedstawił Ogunyemi [47]. Autor podkreślił jednak dużą zmienność znaczenia czynników socjalnych w różnych populacjach. Istotność niedożywienia ciężarnej w patogenezie porodu przedwczesnego wykazała Stepanova i wsp. [48], dowodząc odsetka 35% porodów przedwczesnych wśród kobiet z przyrostem masy ciała w ciąży poniżej 1 kilograma miesięcznie. Z problemem niskiego statusu socjo-ekonomicznego ciężarnej częściej łączy się problem przemocy oraz fizycznego i psychicznego znęcania się nad ciężarną. Incydenty fizycznej lub psychicznej przemocy wobec kobiety w ciąży zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego 4,1-krotnie [49];

- wiek matki. Wiek jest znanym i udowodnionym czynnikiem ryzyka porodu przedwczesnego [50]. Częstsze występowanie porodu przedwczesnego stwierdza się zarówno w młodym wieku, poniżej 16 roku życia, jak i w grupie kobiet po 34 roku życia, o ile jest to pierwsza ciąża;

- wielorodność. Niektóre dane literaturowe sugerują związek pomiędzy wielorodnością a występowaniem porodu przedwczesnego. Według Mazza i wsp. [51] przebycie więcej niż 4 porodów zwiększa prawdopodobieństwo przedwczesnego zakończenia ciąży;

- stan cywilny wolny. W niektórych społecznościach czynnik ten może być przyczyną braku akceptacji społecznej, wywołując przewlekły stres u ciężarnej, poczucie winy, a tym samym wzrost ryzyka porodu przedwczesnego [52];

- stosowanie używek (palenie papierosów, picie alkoholu, zażywanie narkotyków). Palenie papierosów, używanie narkotyków, oprócz tego, że zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego, wpływają negatywnie na masę urodzeniową noworodka, wywołując hipotrofię wewnątrzmaciczną. Palenie papierosów przez ciężarną wywołuje hipoksję wewnątrzmaciczną i znacząco zwiększa ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego [53]. Dym tytoniowy zawiera bardzo dużo związków chemicznych, które w znacznym stopniu działają toksycznie na organizm człowieka. Najważniejszym związkiem jest nikotyna i jej główny metabolit - kotonina jak również tlenek węgla, formaldehyd, metale ciężkie i rakotwórcze węglowodory aromatyczne. Zarówno czynne jak i bierne palenie wywołuje stres oksydacyjny, co ma niekorzystny wpływ na organizm kobiety ciężarnej i rozwój samego płodu. Dym tytoniowy działa na dziecko w okresie wewnątrzłonowym w bardzo złożony sposób. Nikotyna wpływa na zmniejszenie ukrwienia macicy i łożyska, a pośrednio również płodu. Jeden papieros powoduje zmniejszenie się przepływu krwi przez łożysko o 20% [54]. Ryzyko to jest większe u kobiet palących nieprzerwanie niż u tych które rzuciły palenie w I trymestrze ciąży. Znaczenie ma też liczba wypalanych papierosów. Przyjmuje się, że palenie powyżej 10 sztuk papierosów dziennie w ciąży zwiększa ryzyko

PL 237 304 B1 porodu przedwczesnego od 2 do 6-krotnie [55-57]. Znaczenie spożywania alkoholu jako czynnika ryzyka porodu przedwczesnego podkreślił Becker-Christensen [58]. Jednak na chwilę obecną nie istnieją dane pozwalające jednoznacznie stwierdzić w jakim stopniu spożywanie alkoholu przez kobiety wpływa na ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego.

Czynniki środowiskowe:

- czynniki fizyczne. Promieniowanie radioaktywne, promieniowanie termiczne, promieniowanie jonizujące, pola elektromagnetyczne, wibracje i hałas zwiększają ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego. Ciężka praca fizyczna lub taka, która naraża pacjentkę na stres może powodować wystąpienie porodu przedwczesnego. Szczególnie narażone są kobiety poddane wibracjom i bezpośredniemu działaniu fal elektromagnetycznych o dużym natężeniu. Badania przeprowadzone wśród kobiet obsługujących zgrzewarki, czyli narażone na przebywanie w polu elektromagnetycznym o częstotliwości 27,12 MHz (PEM) dowiodły u tych kobiet zwiększonego odsetka porodów przedwczesnych. Jednocześnie ekspozycja kobiet na pole elektromagnetyczne o takiej częstotliwości nie zwiększa ryzyka poronień samoistnych [59];

- czynniki chemiczne. Istotny wpływ na wzrost ryzyka wystąpienia porodu przedwczesnego ma przebywanie kobiety ciężarnej w środowisku skażonym związkami siarki, fluoru i metalami ciężkimi [60].

Czynniki psychogenne:

- okoliczności wywołujące przewlekły stres. Można wymienić tu szereg sytuacji życiowych takich jak: istniejące choroby własne i w rodzinie, śmierć bliskiej osoby, sytuacje konfliktowe wynikające ze stanu wolnego, sytuacje konfliktowe ze współmałżonkiem lub z rodzicami, stres związany z nadmiernym obciążeniem obowiązkami zawodowymi i domowymi, zła sytuacja mieszkaniowa i materialna, obciążony wywiad położniczy, który często wywołuje lęk przed potencjalną utratą ciąży, lęk o losy ciąży z powodu aktualnie występujących objawów klinicznych zagrażającego porodu przedwczesnego, sytuacje stresowe wynikające z niedostatecznej opieki nad ciężarną. Badane wpływu wymienionych czynników na wystąpienie porodu przedwczesnego w polskiej populacji przeprowadzone zostały przez Biernacką i wsp. [61], w wyniku których zwrócono uwagę na wysokie znaczenie stresu związanego z pracą zawodową, jako głównego psychosocjalnego czynnika ryzyka porodu przedwczesnego wśród Polek.

Ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia porodu przedwczesnego wiążą się niektóre schorzenia ciężarnej. Według Lettieri'ego i wsp. [62] zakażenie dróg moczowych oraz inne infekcje np. zapalenie płuc, wyrostka robaczkowego, górnych dróg oddechowych - występują w około 10% porodów przedwczesnych. Kilkuprocentowy udział w czynnikach prowadzących do porodów przedwczesnych ma także niedokrwistość, nadczynność tarczycy, choroby i wady serca.

Z ryzykiem porodu przedwczesnego należy liczyć się w przypadku stwierdzenia wady rozwojowej płodu (7%), urazu lub zabiegu chirurgicznego u ciężarnej (3%). Według cytowanych powyżej autorów częściej do porodu przedwczesnego dochodzi przy współistnieniu patologii łożyska, zarówno prowadzących do przedwczesnego oddzielania jak również nieprawidłowego umiejscowienia (przodowania) - odsetek ten określili na około 40% przypadków. Jednak najczęstszym czynnikiem, stwierdzanym w 47% porodów przedwczesnych jest zakażenie wewnątrzmaciczne, często przebiegające z przedwczesnym pęknięciem błon płodowych i odpływaniem płynu owodniowego [62].

Patogeneza

Poród przedwczesny jest zazwyczaj wypadkową kilku różnych procesów biochemicznych, które ostatecznie doprowadzają do wystąpienia porodu przed ukończeniem 37 tygodnia ciąży. Czynność skurczowa macicy jest zależna od układu dokrewnego, centralnego układu nerwowego oraz jednostki łożyskowo-płodowej. Jednostce łożyskowo-płodowej przypisuje się rolę nadrzędną z uwagi na szczególną aktywność hormonalną łożyska i płodu. Wystąpienie samoistnej czynności skurczowej mięśnia macicy w ciąży o przebiegu fizjologicznym jest związane z dojrzałością płodu i łożyska.

W procesie tym istotną rolę odgrywa kortykoliberyna (CRH) łożyskowego pochodzenia, której ekspresja genu kodującego była przedmiotem badań [63]. W badaniach Ellis'a i wsp. [64] potwierdzono

PL 237 304 B1 korelację pomiędzy poziomem łożyskowego CRH w surowicy krwi ciężarnej, a czasem wystąpienia porodu. U ciężarnej obecność receptorów dla łożyskowego CRH stwierdza się nie tylko w przysadce mózgowej, lecz także bezpośrednio w myometrium [65].

W ciąży zarówno o przebiegu fizjologicznym jak i powikłanej, produkowane jest białko wiążące CRH (CRHBP), którego stężenie obniża się w okresie poprzedzającym poród. Powoduje to wzrost biodostępności CRH i inicjację czynności porodowej. Proces ten jest modulowany przez wiele czynników, jak na przykład stres. Stres wywołany chorobą matki lub płodu powoduje uwolnienie hormonów nadnerczowych i podwzgórzowych. Prowadzi to do obniżenia stężenia CRHBP i wzrostu stężenia wolnego CRH. Wykazano także, że stres stymuluje produkcję prostaglandyn przez komórki owodni, kosmówki i doczesnej, co z kolei wywołuje skurcze macicy.

W mechanizmie porodowym istotną rolę pełnią białka CAP50 (contraction-associated proteins), które promują reakcje pomiędzy aktyną i miozyną oraz zwiększają wrażliwość komórek myometrium na bodźce. Białka CAP50 wywierają także dodatni wpływ na przekazywanie impulsów pomiędzy komórkami mięśnia macicy, co umożliwia synchronizację skurczów [65].

Rola czynników zapalnych w patogenezie porodu przedwczesnego

O wystąpieniu czynności porodowej, również fizjologicznej o czasie, decydują różne czynniki. Houben i wsp. [66] dowiedli, że spontanicznej czynności porodowej w ciążach donoszonych towarzyszą histologiczne zmiany zapalne w popłodzie, jak również wzmożona ekspresja prozapalnych cytokin w płynie owodniowym. Tak więc procesy zapalne stanowią część składową mechanizmów porodowych. Nie jest to jednoznaczne z zakażeniem. Uaktywnienie reakcji kaskadowej prostaglandyn (reakcja zapalna), prowadzącej do wyzwolenia czynności skurczowej mięśnia macicy, jest możliwe bez udziału antygenów bakteryjnych lub wirusowych. W przeciwieństwie do porodów w ciążach donoszonych, w porodach przedwczesnych mechanizmy zapalenia związane z zakażeniem spotyka się częściej. Według Laudańskiego i wsp. [67] zakażenia o subklinicznym przebiegu stanowią główną przyczynę spontanicznych porodów przedwczesnych.

Istnieje prawdopodobieństwo, że problem ten dotyczy głównie porodów do 30 tygodnia ciąży. Wskazują na to uzyskane własne wyniki badań histologicznych popłodów [68], w których wykazano nacieki zapalne w 90% popłodów z porodów przedwczesnych odbytych w 22-23 tygodniu. Znacznie rzadziej obserwowano nacieki zapalne w błonach płodowych lub łożysku pomiędzy 34-36 tygodniem ciąży. Podobne zmiany stwierdzono tylko w 4 do 16% łożysk z porodów o czasie. Jest to zgodne z badaniami Goldenberga i wsp. [69], według których zmiany zapalne występują w 19 do 74% łożysk z porodów przedwczesnych, przy czym częstość ich występowania maleje wraz ze wzrostem wieku ciąży, w którym nastąpił poród.

Wyniki badań morfologicznych są zbieżne z wynikami badań mikrobiologicznych. U 80% kobiet rodzących przed 30 tygodniem ciąży wykazano bakteryjną infekcję płynu owodniowego (MIAC - microbial invasion of the amniotic cavity) i/lub błon płodowych, podczas gdy w porodach w 37 tygodniu zjawisko to nie przekracza 30% [70]. Zakażenie płynu owodniowego może prowadzić do zapalenia kosmówki, które spotyka się tym częściej, im krótszy jest czas trwania ciąży w którym doszło do infekcji płynu owodniowego. Zapalenie kosmówki występuje także znacznie częściej u kobiet z przedwczesnym pęknięciem pęcherza płodowego [69].

Patogenność zakażenia w rozwoju porodu przedwczesnego polega między innymi na uwalnianiu przez czynniki zakaźne toksyn, enzymów proteolitycznych i kolagenolitycznych oraz stosunkowo dużej oporności na leczenie. Produkowana przez większość bakterii wywołujących zakażenia wewnątrzmaciczne Egzotoksyna A2, odpowiedzialna jest za hamowanie biosyntezy białek i desynchronizację procesów oddechowych w mitochondriach. Jednak główne znaczenie w rozwoju reakcji zapalnych, prowadzących do porodu przedwczesnego, w przebiegu zakażeń wewnątrzmacicznych przypisuje się uwalnianym przez bakterie lipopolisacharydom (LPS). Li i wsp. [71] zwrócili uwagę na rolę receptora TLR4 (z ang: Toll-like receptor 4) w indukowanych bakteryjnymi lipopolisacharydami porodach przedwczesnych. Pobudzenie receptora TLR4 poprzez połączenie z ligandem lipopolisacharydowym powoduje gwałtowną ekspresję biorących udział w procesie zapalnym komórek: CD45(+)CD86(+),

CD3(+)CD69(+) oraz CD49b(+)CD69(+) we krwi, a także komórek: CD45(+)CD86(+),

CD45(+)CD49b(+) oraz CD49b(+)CD69(+) w łożysku. Zastosowane przez autorów na modelach zwierzęcych blokery receptora TLR4 prawie całkowicie wyeliminowały porody przedwczesne podczas zakażeń z obecnością lipopolisacharydów.

PL 237 304 B1

W 1981 roku Siegel i wsp. [72] zwrócili uwagę na znaczenie Fosfolipazy A2 w kontekście korelacji zakażeń wewnątrzmacicznych z występowaniem porodów przedwczesnych. Fosfolipaza A2 będąc enzymem aktywującym reakcję kaskadową prostaglandyn, jest w stanie wywołać bezpośrednio czynność skurczową mięśnia macicy.

Przebieg kliniczny zakażenia wewnątrzmacicznego może przybierać różne formy. ChmielnicaKopaczyk i wsp.[73] wyróżnili 4 różniące się klinicznie postacie zakażenia wewnątrzmacicznego:

1. Zmiany morfologiczne typowe dla zakażenia mogą być obecne zarówno w łożysku jak i u płodu;

2. Przy zakażeniu łożyska możliwy jest brak klinicznych i morfologicznych cech zakażenia płodu;

3. Zakażenie płodu może przebiegać bez cech morfologicznych infekcji łożyska;

4. Brak morfologicznych wykładników zakażenia zarówno w łożysku jak i u płodu, pomimo klinicznie udokumentowanej infekcji z bakteriemią lub wiremią u matki.

Zdaniem autorów podczas bakteriemii w przebiegu infekcji u matki (często towarzyszącej ropniom tkankowym lub odmiedniczkowym zapaleniom nerek) wyjątkowo rzadko dochodzi do powikłania pod postacią zapalenia łożyska, gdyż płód jest chroniony przez System Makrofagów Jednojądrzastych (MPS) i krążące leukocyty. Częściej dochodzi w takich sytuacjach do pośredniego uszkodzenia płodu przez krążące toksyny i zaburzenia metaboliczne. Uwalniane na skutek zakażeń bakteryjnych endo i exotoksyny przebudowują macierz zewnątrzkomórkową (ECM-extracellular matrix) doczesnej, szyjki macicy a także błon płodowych. W efekcie możliwymi następstwami mogą być w tych sytuacjach: rozwieranie szyjki, pęknięcie błon płodowych oraz oddzielenie łożyska i błon od tkanek matczynych [74, 75].

Spośród czynników zapalnych bezpośrednio związanych z patogenezą porodu przedwczesnego, największą grupę stanowią cytokiny. Termin cytokiny określa dużą i zróżnicowaną rodzinę hormonopodobnych peptydów i niskocząsteczkowych białek, wpływających na funkcję komórek i warunkujących ich wzajemne oddziaływanie [76]. Są one wytwarzane głównie przez komórki układu odpornościowego - aktywowane limfocyty i makrofagi. Cytokiny wydzielane przez limfocyty określa się mianem limfokin, a uwalniane przez makrofagi nazywane są monoklinami. Główna funkcja cytokin to regulacja wzrostu i różnicowania różnych komórek w ustroju [77]. Ogólnie cytokiny można podzielić na interferony, interleukiny, czynniki martwicy nowotworów, czynniki wzrostu oraz czynniki chemotaktyczne (chemokiny) [78].

W zakażeniu wewnątrzmacicznym cytokiny wpływają na wszystkie fazy odpowiedzi immunologicznej, poprzez działanie na proliferację, różnicowanie i aktywację limfocytów B,T, komórek NK, monocytów- makrofagów i granulocytów. Regulują zarówno odpowiedź komórkową jak i humoralną. Wpływają również na funkcję dojrzałych neutrofilów poprzez aktywację molekuł adhezyjnych, stymulację reakcji tlenowych i migrację tych komórek. Różne cytokiny mogą działać antagonistycznie, addycyjnie lub synergistycznie na te same procesy biologiczne. Dotyczy to zwłaszcza reakcji na obce antygeny i reakcje „ostrej fazy”. Większość cytokin nie działa specyficznie na jeden rodzaj komórek, lecz ma działanie plejotropowe [79]. Cytokiny wywierają efekt biologiczny na komórki docelowe za pośrednictwem znajdujących się na nich receptorów. Mutacje genów kodujących receptory cytokinowe mogą mieć znaczenie w patogenezie niektórych chorób, również porodu przedwczesnego [80].

Podczas zakażenia wewnątrzmacicznego dochodzi do uwalniania przez komórki układu odpornościowego licznych cytokin jak: Tumor Necrosis Factor (TNFa), lnterleukina-1(IL-1), lnterleukina-6 (IL6), które stymulują syntezę prostaglandyn oraz uwalnianie metaloproteaz. Prowadzi to do wyzwolenia czynności skurczowej macicy, rozwoju zapalenia błon płodowych i pęknięcia pęcherza płodowego oraz do przebudowy kolagenu szyjki macicy, wskutek czego staje się bardziej podatna na rozwieranie [70].

Taki przebieg zakażenia wewnątrzmacicznego nie jest jedyną możliwą drogą wywołania zaburzeń przez drobnoustroje w przebiegu ciąży. Istnieją tak zwane „następstwa niezapalne infekcji wewnątrzmacicznej” np. embriopatia różyczkowa, czy inne powikłania zakażeń drobnoustrojami TORCH. Kwestią sporną jest, czy przy podejrzeniu jakiejkolwiek infekcji bakteryjnej związanej z porodem, można starać się zmniejszyć ryzyko jej wystąpienia w następnej ciąży. Skuteczność profilaktycznego podawania antybiotyków w oparciu o analizę kliniczną zakażenia w poprzedniej ciąży nie została potwierdzona. Stwierdzono jednak, że właściwe leczenie potwierdzonych infekcji w obecnej ciąży, zarówno objawowych jak i bezobjawowych, może obniżyć częstość występowania porodów przedwczesnych [81-83]. Dlatego, u kobiet obciążonych wywiadem przebytego porodu przedwczesnego konieczne jest mikrobiologiczne monitorowanie ciąży [84].

PL 237 304 B1

Możliwe jest, że przy krwawieniach z macicy w przebiegu zagrażającego poronienia lub porodu przedwczesnego, zakażenie odgrywa znacznie większą rolę, niż do tej pory zakładano. Według najnowszych badań Vigeh'a i wsp. [85] krwawienie z dróg rodnych w przebiegu ciąży stanowi „wrota” dla infekcji wewnątrzmacicznej drogą wstępującą. Zakażenie wstępujące może powodować skurcze macicy, uruchamiając zjawiska uprzednio opisane oraz powodując częściowe oddzielenie łożyska i nasilając krwawienie. Prowadzi to do formowania krwiaka podkosmówkowego i niewydolności maciczno-łożyskowej oraz niedotlenienia płodu. Niewydolność maciczno-łożyskowa stymuluje wydzielanie płodowo-łożyskowego CRH, a następnie produkcję prostaglandyn. W tej sytuacji oprócz prostaglandyn, komórki owodni, kosmówki i komórki doczesnej mogą uwalniać również proteazy - silnie działające na szyjkę macicy, powodując rozwieranie się ujścia. Proteazy te działają również na błony płodowe, promując ich pęknięcie. W zagrażającym porodzie przedwczesnym krwawienie może także powodować uaktywnienie makrofagów i uwolnienie cytokin np. IL-1, TNFa, oraz Interferonu gamma (IFN-γ) - kluczowych mediatorów stanów zapalnych. Jednym z mechanizmów ich działania jest pobudzanie ekspresji genu heparanazy, co wpływa na adhezję międzykomórkową, oraz na czynność skurczową naczyń [86]. TNFa jest cytokiną produkowaną głównie przez monocyty i makrofagi, które biorą udział w systemowych stanach zapalnych. Należy też do grupy cytokin stymulujących reakcję fazy ostrej i indukuje proces zapalny. TNFa wpływa na ekspresję różnych czynników angiogennych, takich jak interleukina8 (II-8) i Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).

W obrębie krwiaka podkosmówkowego dochodzi do uaktywnienia trombiny w skrzepie. Prowadzi to do dalszego wytwarzania przez doczesną proteaz i prostaglandyn. W procesie rozpadu krwiaka uwalniana jest peroksydaza lipidowa oraz wolne rodniki, które mogą powodować lokalne uszkodzenie tkanki, wpływając na produkcję endotelin, prostaglandyn i proteaz. Indukowana przez TNF-a, oraz IFN-γ heparanaza jest Endo-3-d-glukoronidazą zdolną do degradacji bocznych łańcuchów siarczanu heparanu. Jej działanie obserwuje się w wielu rodzajach tkanek i komórek. Działanie heparanazy ma związek z neowaskularyzacją, autoimmunizacją, a także z migracją komórek śródbłonka naczyniowego i aktywowanych komórek systemu immunologicznego [87,88]. Barwienie immunohistochemiczne heparanazy przy użyciu znakowanych przeciwciał wykazało, że komórki śródbłonka są w środowisku eksperymentalnym głównym źródłem tego enzymu.

W komórkach naczyń śródbłonka zachodzi ekspresja specyficznych dla śródbłonka cząsteczek adhezyjnych (integryn): L-Selektyny, E-Selektyny, ICAM-1, VCAM-1, PECAM, [89]. Ich działanie poprzez regulację przylegania międzykomórkowego w obrębie śródbłonka wpływa zarówno na migrację, jak i przenikalność krwinek przez śródbłonek do komórek śródmiąższowych. Proces ten może odgrywać ważną rolę w patogenezie porodu przedwczesnego poprzez udział w formowaniu nacieków zapalnych w popłodach.

L-Selektyna (CD62L) jest białkiem określanym jako: Cząstka Adhezji Komórkowej. Znajduje się na powierzchni leukocytów i bierze udział w procesach zapalnych poprzez wiązanie grup sialowych węglowodanów. Odgrywa ważną rolę w adhezji leukocytarno-endotelialnej, ułatwiając przenikanie leukocytów i tworzenie nacieków [90]. Jej znaczenie w patogenezie porodu przedwczesnego zostało udokumentowanie w regulacyjnym modelu Kittipatarin'a i WSP [91], który zakłada że lnterleukina-7 (IL-7) za pośrednictwem zwiększonej ekspresji genu Cdc25A stymuluje proliferację komórek T, co redukuje ekspresję L-Selektyny i migrację komórek T do krwioobiegu. Wzrost ekspresji L-Selektyny powoduje zwiększone uwalnianie do krążenia komórek T i progresję reakcji zapalnych.

W warunkach „in vitro” wykazano, że komórki wykazujące ekspresję L-Selektyny stanowią populację pośrednią w procesie dojrzewania komórek NK, których rola w patogenezie porodu przedwczesnego jest udowodniona [92].

E-Selektyna (CD62E) swoją ekspresję przejawia jedynie na komórkach endotelium aktywowanego cytokinami. Kodowana jest przez gen SELE, podobnie jak inne selektyny odgrywa ważną rolę w procesach zapalnych poprzez rekrutację leukocytów do miejsca zapalenia [93]. Poziom ekspresji ESelektyny ulega zmianom w zakażeniach patogenami zawierającymi lipopolisacharydy [94], kluczowe cząsteczki w patogenezie porodu przedwczesnego. Znacznie większe od E-Selektyny powinowactwo do bakteryjnych lipopolisacharydów (potencjalnych czynników wywołujących poród przedwczesny) wykazują białka ICAM-1 oraz VCAM-1.

ICAM-1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1) znana także jako CD54, jest białkiem będącym ligandem dla znajdującej się na powierzchni leukocytów integryny LFA-1, dzięki czemu wiąże krążące leukocyty z endotelium tkanek objętych procesem zapalnym. Fizjologiczne znajduje się w niewielkich

PL 237 304 B1 ilościach na powierzchni śródbłonka naczyń, jej stężenie gwałtownie narasta pod wpływem ll-1 oraz TNFa [95], przez co może odgrywać ważną rolę w formowaniu nacieków w obrębie popłodu.

VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), jest sialoglykoproteiną znaną jako CD106. Pośredniczy w procesie adhezji limfocytów, monocytów, eozynofili oraz bazofili do komórek śródbłonka naczyniowego. Bierze udział w procesie transdukcji leukocytarno-endotelialnej. Do wzmożonej transkrypcji genu VCAM-1 dochodzi pod wpływem TNF-α oraz IL-1 [95], dając tym samym podstawy do przewidywania jej udziału w procesach zapalnych w obrębie popłodu i patogenezie porodu przedwczesnego.

Za pośrednictwem ICAM-1 oraz VCAM-1 bakteryjne lipopolisacharydy wpływają na ekspresję selektyny E, prowadząc do uszkodzenia śródbłonka naczyń, jakie obserwuje się w naczyniach łożyska przebiegu zapaleniu popłodu.

PECAM-1(CD31) jest czynnikiem adhezji płytek. Odgrywa rolę w eliminacji starzejących się neutrofili poprzez wiązanie ich z makrofagami, a następnie w procesie regeneracji tkanek uszkodzonych zapalnie [96]. We wczesnej ciąży ekspresja PECAM-1 na powierzchni komórek cytotrofoblastu jest niezbędna do prawidłowej inwazji macicznych tętnic spiralnych i ich przemiany w naczynia niskooporowe [97].

Mechanizmy zaburzeń inwazji trofoblastu pośredniczonej przez PECAM-1 nie są dobrze poznane, jednak aktualna wiedza pozwala podejrzewać, że odgrywają rolę w rozwoju stanu przedrzucawkowego, IUGR oraz porodu przedwczesnego [97].

W przyłączaniu leukocytów do komórek śródbłonka, pośredniczonym przez selektywny E i L, ICAM-1, VCAM-1 oraz PECAM-1, obserwuje się kilka etapów: wstępne przyłączanie i tzw. toczenie się leukocytów poprzez ich interakcję z integrynami; następnie dochodzi do ścisłego połączenia, które warunkuje wiązanie leukocytów do komórek śródbłonka, w którym pośredniczą cząsteczki adhezyjne na leukocytach i integryny na komórkach śródbłonka. Ostatnim etapem jest transmigracja pośredniczona przez kilka rodzajów cząsteczek [89]. Procesy te są aktywowane podczas zakażenia wstępującego błon płodowych i doczesnej, które wywołuje wytwarzanie endotoksyn i cytokin (IL-1, TNF-α). Zwiększają one wytwarzanie IL-6 i prostaglandyn w komórkach owodni, kosmówki i doczesnej. IL-6 również wpływa na wzrost wytwarzania prostaglandyn i endoteliny-1 [89], przyczyniając się do wystąpienia skurczów macicy.

Cytokiny pro zapalne stymulują wydzielanie macierzy zewnątrzkomórkowej ECM zawierającej proteazy np. kolagenazy, oraz wzmacniają działanie IL-8. IL-8 może być odpowiedzialna za mobilizację leukocytów wielojądrzastych, wpływających z kolei na wzrost aktywności elastaz. Elastazy, podobnie jak proteazy mogą działać zarówno na szyjkę macicy, jak i na błony płodowe, powodując skracanie i rozwieranie szyjki macicy. Mogą także prowadzić do pęknięcia błon płodowych. Badania Bańkowskiej i wsp. [98] wykazały, że elastaza jest wczesnym markerem zagrożenia pPROM, jak również oznaczanie w surowicy krwi stężeń elastazy u kobiet po wystąpieniu pPROM ma wartość predykcyjną w diagnostyce chorioamnionitis. Wiele uwagi poświęca się roli szyjki macicy zarówno w porodzie o czasie, jak i w porodzie przedwczesnym oraz roli takich czynników jak np. VEGF, biorących udział w rozwieraniu się szyjki macicy [99].

Pęknięcie błon płodowych w ciąży niedonoszonej stanowi oddzielny. Może ono być zarówno przyczyną jak i następstwem zakażenia wewnątrzmacicznego. Lamont i wsp. [100] stwierdzili, że u kobiet z porodem przedwczesnym często stwierdza się obecność Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum i Chlamydia trachomatis. Obecność tych mikroorganizmów zauważono zarówno w przypadkach porodów przedwczesnych, jak i w poronieniach samoistnych i nawykowych. Szereg dowodów wskazuje na to, że reakcje zapalne prowadzące ostatecznie do rozwoju zapalenia błon płodowych, ich pęknięcia i porodu przedwczesnego, mają charakter przewlekły a nie ostry - jak dotąd sądzono [101]. Podobnie pojawiają się dowody na znaczenie wczesnych zakażeń w ciąży, które niekiedy przez miesiące pozostają niewykryte aż do momentu wystąpienia czynności porodowej [102]. Według Correia i wsp. [103] zakażenia we wczesnej ciąży mogą być także przyczyną autyzmu u dziecka poprzez zaburzenie funkcji neurotropin, głównie BDNF.

Istnieje coraz więcej dowodów, że przyczyny porodu przedwczesnego mogą wynikać z cyklu reakcji biochemicznych zachodzących w komórkach szyjki macicy, doczesnej i błon płodowych [104]. Komórki owodni, kosmówki oraz komórki doczesnej reagują na bodźce miejscowe i ogólnoustrojowe, zarówno ze strony matki, jak i płodu. Oprócz prostaglandyn (takich jak: PGE2 i PGF2 alfa), mogą one wytwarzać inne substancje wywołujące skurcze macicy. W syntezie PGE2 z kwasu arachidonowego kluczową rolę odgrywają dwie cyklooksygenazy: COX-1 oraz COX-2 [104, 105]. COX-1 podlega kon

PL 237 304 B1 stytutywnej ekspresji w większości tkanek. COX-2 jest aktywowana w komórkach zapalnych przez cytokiny, mediatory stanu zapalnego. COX-2 wytwarzana jest nie tylko przez komórki układu odpornościowego, zdolność do jej produkcji posiadają także komórki nowotworowe [105].

Chemokiny, jako czynniki związane z procesami zapalnymi, mogą również odgrywać rolę w patogenezie porodu przedwczesnego [106].

MIP-1d (CCL15) jest cytokiną znaną także jako leukotaktyna-1. Działa chemotaktycznie na neutrofile, monocyty i limfocyty oraz promuje ich wiązanie z komórkami docelowymi poprzez receptory CCR1 i CCR3. Gen kodujący dla MIP-1d znajduje się na chromosomie 17 [107]. Jej główna rola to udział w procesach angiogenezy [108], jednak poprzez wpływ na migrację limfocytów może mieć wpływ na formowanie nacieków, a tym samym poród przedwczesny.

MIP-3b (macrophage inflammatory protein-3-beta) określane także CCL19, jest hemokiną należącą do grupy CC. Działa poprzez receptor CCR7, uaktywniając komórki układu immunologicznego między innymi komórki dendrytyczne i związane z antygenem limfocyty B. Może odgrywać rolę nie tylko w reakcjach zapalnych, lecz również w naturalnym procesie krążenia leukocytów [109]. Istnieją wstępne doniesienia o obniżeniu stężenia MIP-3b w surowicy krwi u kobiet rodzących przedwcześnie [110]. Eotaksyna-1 (CCL11) jest cytokiną należącą do grupy chemokin CC. Wywołuje selektywną rekrutację eozynofili poprzez zwiększanie ich chemotaksji. Wiąże się z receptorami CCR2, CCR3 oraz CCR5. Gen kodujący CCL11(scya11) jest zlokalizowany na chromosomie17 [111]. W ciąży eotaksyna-1 wydzielana jest między innymi przez płodowe fibroblasty płucne [112]. Rola jaką odgrywa w przebiegu ciąży nie jest poznana. W patogenezie porodu przedwczesnego może brać udział poprzez działanie chemotaktyczne na komórki zapalne. Eotaksyna-2 (CCL24) jest znana także pod nazwą: myeloid progenitor inhibitory factor 2 (MPIF 2). CCL24 wchodzi w interakcję z receptorem CCR3 indukując chemotaksję eozynofili. Jest także silnie chemotaktyczna dla spoczynkowych limfocytów T oraz częściowo dla neutrofili [111], co może mieć znaczenie w procesie formowania nacieków zapalnych. BLC (B lymphocyte chemoattractant) jest niewielką cytokiną należącą do chemokin z grupy CXC, znaną pod nazwą: CXCL13. Wywołuje selektywną chemotaksję komórek B (zarówno B-1 jak i B-2) i wyzwala ich bioaktywność poprzez wiązanie z receptorem CXCR5. BLC kontroluje formowanie limfocytów B w tkankach limfoidalnych. Chemokina ta jest wydzielana przez komórki dendrytyczne. Gen kodujący CXCL13 znajduje się na chromosomie 4 [113]. BLC jest silnie działającą hemokiną, produkowaną przez dojrzałe, zrekrutowane do miejsc zapalnych makrofagi. Działa bakteriobójczo i antyangiogennie. Jej obecność stwierdza się w płynie owodniowym, przy czym stężenie wzrasta gwałtownie przy zakażeniu wewnątrzmacicznym [114]. W przeciwieństwie do innych chemokin stężenie BLC w surowicy krwi nie ulega zmianie podczas porodów w ciążach donoszonych, o przebiegu fizjologicznym.

Wymienione chemokiny: MIP-1d, MIP-3b, Eotaksyna-1, Eotaksyna-2 oraz BLC, będące przedmiotem tego badania, są grupą homologicznych cząsteczek cytokinowych wiążących heparynę, które zostały opisane dzięki swojej roli w pośredniczeniu przyciągania leukocytów do miejsc zapalnych. Biorą one także udział w patogenezie szeregu stanów chorobowych, takich jak: przewlekłe stany zapalne, kolagenozy, nowotwory, czy endometrioza [111].

W układzie rozrodczym MIP-ld, MIP-3b, Eotaksyna-1, Eotaksyna-2 oraz BLC współdziałają z licznymi peptydami indukującymi czynność skurczową mięśni gładkich. Są aktywne biologicznie poprzez interakcję z receptorami błonowymi wiążącymi białko G (receptorami chemokin), które znajdują się wybiórczo na powierzchniach komórek docelowych [115]. Chemokiny te, uwalniane przez uszkodzone na skutek procesu zapalnego komórki, tworzą swoisty gradient stężeń. Komórki efektorowe poruszają się zgodnie ze wzrostem ich gradientu.

Oprócz szczegółowo opisanych powyżej białek powierzchniowych biorących udział w transdukcji leukocytarno-endotelialnej oraz chemokin, trzecią grupą potencjalnych markerów biochemicznych, które będą przedmiotem badań w prezentowanej pracy są białka krążące o zmiennej ekspresji podczas fazy zapalnej: IGFBP-1, IGFBP-2, BDNF. Mogą być związane z formowaniem nacieków zapalnych w obrębie doczesnej, błon płodowych, łożyska i/lub sznura pępowinowego, i bierze udział w patogenezie porodu przedwczesnego.

IGFBP-1 (Insulin-like growth factor-binding protein 1) wiąże insulinopodobny czynnik wzrostu IGFs I i II, zmieniając ich interakcję z receptorami komórkowymi. W ostrej fazie zapalnej dochodzi do wzrostu ekspresji IGFBP-1 genu wzmożonego wiązania IGFs, co tłumaczy zwiększenie nasilenia katabolizmu towarzyszące procesom zapalnym [116]. W badaniach Tagore'a i wsp. [117] wykazano, że u ciężarnych pomiędzy 17 a 37 tygodniem ciąży, białko wiążące IGF może być wykorzystane jako mar

PL 237 304 B1 ker w prognozowaniu przedwczesnego pęknięcia błon płodowych o 87,5% czułości, oraz 94,4% swoistości. IGFBP-2 jest białkiem o podobnej budowie i funkcji do IGFBP-1. Wiąże IGF II. Jego wzmożona ekspresja łączy się ze zmniejszeniem proliferacji komórek zapalnych, jest kodowane przez IGFBP-2 gen [118]. Białko to u kobiet ciężarnych podlega procesowi proteolizy zależnej od białka-A [119], zdolnego do wiązania regionu Fc cząsteczki immunoglobuliny oraz interferencji w opsonizacji i fagocytozie w przebiegu zakażeń wewnątrzmacicznych [120].

BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) w procesach zapalnych bierze udział poprzez wiązanie się receptorem kinazy tyrozynowej (TrkB) i modulowanie jej działania. Białko to należy do grupy neurotropin, biorących udział w procesie neurogenezy. Ponadto wywiera wpływ na mechanizmy regulujące apoptozę, dzięki wiązaniu z receptorem p75NTR. Gen kodujący BDNF jest zlokalizowany na chromosomie 11 [121]. W badaniach eksperymentalnych modelujących zakażenie u matki wykazano zmiany stężeń BDNF, co może tłumaczyć zaburzenia rozwoju ośrodkowego układu nerwowego u noworodków z ciąż powikłanych zakażeniami [122].

Infekcja wewnątrzmaciczną często ma charakter przewlekły, zwykle bezobjawowy do czasu wystąpienia czynności skurczowej mięśnia macicy lub pęknięcia błon płodowych. Dlatego wczesna identyfikacja procesu zapalnego ma kluczowe znaczenie stwarzając szansę na wdrożenie leczenia, które mogłoby zapobiec wystąpieniu porodu przedwczesnego. Dotychczas powszechnie stosowane metody wykrywania zapalenia oparte są na inwazyjnej metodzie amniocentezy lub posiadającym niedostateczną czułość oznaczaniu mediatorów stanu zapalnego w surowicy krwi lub innych płynach ustrojowych ciężarnej. Pojawienie się nowych technik badawczych w dziedzinie biologii molekularnej spowodowało poprawę szybkości uzyskiwania wyników co umożliwia ich praktyczne wykorzystanie w działalności klinicznej. Jednocześnie stworzyły one możliwość oceny bardzo wielu genów lub białek, które mogą stać się nowymi, przydatnymi markerami stanu zapalnego prowadzącego do porodów przedwczesnych [123].

Cel ogólny i cele szczegółowe wynalazku

Celem ogólnym pracy, której zwieńczeniem jest niniejszy wynalazek, była ocena znaczenia wybranych markerów biochemicznych dla ryzyka dokonania się porodu u kobiet z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego.

Cel zrealizowano poprzez ocenę stężeń w surowicy krwi następujących czynników zapalnych, związanych z formowaniem nacieków zapalnych w obrębie doczesnej, błon płodowych, łożyska i/lub sznura pępowinowego:

a. Białek krążących o zmiennej ekspresji podczas fazy zapalnej: IGFBP-1, IGFBP-2, BDNF;

b. Białek powierzchniowych biorących udział w transdukcji leukocytarno-endotelialnej: L- Selektyny, E-Selektyny, ICAM-1, PECAM, VCAM-1;

c. Chemokin: MIP-1d, MIP-3b, Eotaksyny-1, Eotaksyny-2, BLC.

Materiał, metoda

Badaną grupę (B) stanowiły 622 kobiety ciężarne hospitalizowane z powodu zagrażającego porodu przedwczesnego w Wojewódzkim Szpitalu w Przemyślu, w latach 2005-2009. Rozpoznanie zagrażającego porodu przedwczesnego opierano o kryteria kliniczne według Czajki [10]:

1. Od 4 do 7 skurczów na godzinę;

2. Stan szyjki macicy poniżej 10 pkt. w skali Bishopa;

3. Rozwarcie szyjki macicy do 4 cm (powyżej 4 cm poród w toku);

4. Skrócenie kanału szyjki poniżej 25 mm i/lub rozwieranie ujścia wewnętrznego z wpuklaniem do kanału pęcherza płodowego potwierdzone badaniem USG.

Wystąpienie co najmniej dwóch z czterech wymienionych stanów klinicznych u ciężarnej w wieku ciążowym 22-37 tygodni decydowało o rozpoznaniu zagrażającego porodu przedwczesnego.

Wszystkie pacjentki z rozpoznanym zagrażającym porodem przedwczesnym były leczone według jednorodnego schematu: Nifedypina 4 dawki po 10 mg co 20 min, następnie 10 mg co 8 godzin do ustąpienia skurczów lub wystąpienia porodu w toku.

W grupie tej 422 ciężarne urodziły przedwcześnie (B-l), w czasie od kilku godzin do 7 dni od wdrożenia leczenia. U pozostałych 200 występował poród przedwczesny fałszywy (B-ll). O ostatecznym

PL 237 304 B1 rozpoznaniu porodu przedwczesnego fałszywego decydowało całkowite ustąpienie czynności skurczowej i dokonanie się porodu u tych pacjentek po skończonym 37 tygodniu ciąży.

W odróżnieniu od porodu przedwczesnego fałszywego, poród przedwczesny skutecznie leczony może zostać opóźniony na ogół tylko o kilka dni [130] co jednak umożliwia podanie ciężarnej sterydów w celu poprawy stanu ogólnego noworodka.

Wyniki odniesiono do danych uzyskanych w grupie referencyjnej, którą stanowiło 99 porodów o przebiegu fizjologicznym. Wszystkie pacjentki zostały wyczerpująco poinformowane o celu oraz przebiegu badania i wyraziły pisemną zgodę na udział w badaniu. Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku.

Za kryterium „Poród Przedwczesny” (B-l) przyjęto spontaniczną czynność skurczową mięśnia macicy występującą, co 20 minut lub częściej (potwierdzoną badaniem kardiotokograficznym), lub przedwczesne pęknięcie błon płodowych (pPROM) pomiędzy ukończonym 22 a 37 tygodniem ciąży, zakończone urodzeniem noworodka. W przypadku pPROM maksymalny czas od odpłynięcia płynu owodniowego do wystąpienia skurczów mięśnia macicy nie przekraczał 2 godzin.

Za kryterium „Poród Przedwczesny Fałszywy” (B-ll) przyjęto spontaniczną czynność skurczową mięśnia macicy występującą co 20 minut lub częściej (potwierdzoną badaniem kardiotokograficznym) pomiędzy ukończonym 22 a 37 tygodniem ciąży, która nie doprowadziła do urodzenia noworodka. W podgrupie tej porody odbyły się po ukończeniu 37 tygodni ciąży.

Grupę referencyjną stanowiły porody z ciąż o przebiegu fizjologicznym. Za kryterium „Poród o przebiegu fizjologicznym” (R) przyjęto spontaniczny, samoistny poród odbyty w ciąży donoszonej pomiędzy 37 tygodni 0 dni a 41 tygodni 6 dni.

Zarówno do grupy badanej jak i grupy referencyjnej włączano tylko pacjentki, u których wiek ciąży określony według daty ostatniej miesiączki był zgodny z wiekiem udokumentowanym badaniem USG w I trymestrze ciąży sondą endowaginalną.

Z badania wykluczono pacjentki:

- z klinicznymi objawami infekcji (temperatura powyżej 37°C, kaszel, dreszcze);

- u których stosowano antybiotykoterapię w okresie do 3 tygodni przed badaniem;z łożyskiem przodującym;

- przedwczesnym oddzieleniem łożyska;

- ciążą mnogą;

- rodzące, u których okres od pęknięcia błon płodowych do wystąpienia pierwszych skurczów mięśnia macicy przekraczał 2 godziny;

- z niewydolnością szyjki macicy. O wyłączeniu z badanej grupy ciężarnych z tym istotnym czynnikiem ryzyka porodu przedwczesnego, zadecydowały nieprecyzyjne kryteria jakie były zastosowane przez lekarzy prowadzących ciąże przy ustalaniu rozpoznania niewydolności, różniący się między pacjentkami wiek ciążowy w chwili rozpoznania oraz różne metody postępowania leczniczego (część ciężarnych miała założone szwy okrężne, część była prowadzona zachowawczo). Zgodnie z Rekomendacjami PTG i PTMP [181] rozpoznanie niewydolności szyjki macicy powinno opierać się o stwierdzenie długości kanału szyjki macicy w badaniu USG poniżej 25 mm (poniżej 10 percentyla) między 16 a 24 tygodniem ciąży. Nie wszystkie ciężarne z rozpoznaniem niewydolności miały udokumentowane takie badanie pomiędzy 16 a 24 tygodniem. Wątpliwości te ostatecznie przesądziły o wyłączeniu tych ciężarnych z badania z powodu braku jednorodności.

Badania biochemiczne krwi

Pobieranie materiału do badań:

W chwili przyjęcia do oddziału i rozpoznaniu zagrażającego porodu przedwczesnego, ciężarnym pobierano z żyły odłokciowej 15 ml krwi pełnej do dwóch probówek: 5 ml na surowicę do probówki z separatorem SST (Serum Separating Tube) i 10 ml na osocze do probówki z EDTA. W grupie referencyjnej pobierano krew na początku porodu. We wszystkich grupach próbki pobierano przed podaniem ciężarnym jakichkolwiek leków, przy rozwarciu szyjki macicy do 3 cm. Bezpośrednio po pobraniu, z probówki z EDTA po lekkim wymieszaniu odpipetowywano 2 x 2,5 ml, resztę odwirowywano razem z surowicą (pobraną do probówki z separatorem), przy 3000 obrotów/5 min w temperaturze 4°C. Surowicę oraz osocze wersenianowe miareczkowano 10 x 250 pl, każde osobno. Tak przygotowany materiał

PL 237 304 Β1 natychmiastowo zabezpieczano do oznaczeń w temperaturze -80°C. Oznaczenia poziomu markerów biochemicznych wykonano w surowicy krwi. Pozostałe osocze (10 x 250 μΙ), osad z probówek z EDTA, oraz krew pełną (2 x 2,5 ml) pozostawiono zabezpieczoną w temperaturze -80°C na wypadek konieczności powtórzenia oznaczeń. Transport surowicy do laboratorium firmy RayBiotech, Norcross, GA, USA w celu oznaczeń stężeń biomarkerów wykonywano w suchym lodzie.

Oznaczanie stężenia markerów biochemicznych w surowicy krwi

Badanie poziomu wymienionych markerów biochemicznych przeprowadzono przy użyciu makromacierzy białkowej, w oparciu o szczegółową specyfikację producenta, stosując zastaw „Ouantibody Humań Cytokine array II” (QAH-CYT- 2) firmy RayBiotech, Norcross, GA, USA. W metodzie tej wychwytywane przeciwciało jest pierwotnie wiązane do powierzchni płytki. Po inkubacji z badaną próbką dochodzi do związania badanych markerów z podłożem. Następnie dodawane są znakowane biotyną swoiste przeciwciała, tworząc kompleks marker-przeciwciało-biotyna, który z kolei wykrywa się za pomocą skanera laserowego.

Opis szczegółowy: Po 30 min inkubacji wstępnej płytek w temperaturze pokojowej, nakładano na nie swoiste przeciwciała przeciwko badanym markerom, a następnie dodawano po 100 μΙ surowicy. Każda próbka została przygotowana w 4 powtórzeniach. Po godzinnej inkubacji i intensywnym płukaniu obecnym w zestawie QAH-CYT- 2 zmywaczem, dodawano stabilizowany biotyną detektor przeciwciał na okres 1 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie płukano, po czym w celu uwidocznienia kompleksów marker-przeciwciało-biotyna, inkubowano 1 godzinę ze sprzężonym ze streptawidyną Alexa Fluor 555 (Cy3 ekwiwalent). Pomiary wykonano z zastosowaniem laserowego skanera Genepix(Axon Instruments, FosterCity, CA, USA). Badane markery kwantyfikowano komputerowo stosując program Scanalyze Software (Stanford University, Stanford, CA, USA) w odniesieniu do standardowej, ośmiopunktowej krzywej dla każdego markera.

Tabela 1. Seryjne stężenia standardowe poszczególnych markerów biochemicznych (pg/ml)

(pg/ml)	Cntr 1	Std7	Std 6	Std5	Std4	Std3	Std2	Stdl
BDNF	0	3	8	25	74	222	667	2,000
BLC	0	3	8	25	74	222	667	2,000
Eotaksyna-1	0	5	16	49	148	444	1,333	4,000
Eotaksyna-2	0	1	4	12	37	111	333	1,000
E-Sclcktyna	0	55	165	494	1,481	4,444	13,333	40,000
ICAM-1	0	137	412	1,235	3,704	11,111	33,333	100,000
IGFBP-1	0	11	33	99	296	889	2,667	8,000
IGFBP-2	0	27	82	247	741	2,222	6,667	20,000
L-Selektyna	0	137	412	1,235	3,704	11,111	33,333	100,000
MlP-ld	0	8	25	74	222	667	2,000	6,000
MlP-3b	0	27	82	247	741	2,222	6,667	20,000
PECAM-1	0	55	165	494	1,481	4,444	13,333	40,000
YCAM-l	0	274	823	2,469	7,407	22,222	66,667	200,000

Badane markery generowały sygnał tylko w przypadku wiązania z komplementarnym przeciwciałem.

Obliczenia wykonano za pomocą pakietu statystycznego StatSoft, Inc. (2008). STATISTICA (data analysis software system), version 8.0 oraz arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel. Istotność występowania wybranych czynników ryzyka badano za pomocą testu Chi2.

Etapy statystycznej analizy

Analiza porównawcza częstości występowania czynników ryzyka

Analizie statystycznej poddano zebrane w kwestionariuszu i wywiadzie charakterystyki badanych kobiet, w sumie 18 czynników, które mogą mieć wpływ na wzrost lub obniżenie ryzyka wystąpienia

PL 237 304 Β1 porodu przedwczesnego. Analizy porównawcze częstości występowania badanych, potencjalnych czynników ryzyka przeprowadzone były w trzech grupach pacjentek:

1. pacjentki z porodem przedwczesnym i pacjentki z porodem przedwczesnym fałszywym;

2. pacjentki z porodem przedwczesnym i pacjentki z grupy referencyjnej;

3. pacjentki z porodem przedwczesnym fałszywym i pacjentki z grupy referencyjnej.

Modelowanie ryzyka porodu przedwczesnego w oparciu o analizę czynników ryzyka

Analiza w modelu regresji logistycznej

We wstępnym etapie analizy badano wpływ każdego z 18 badanych czynników (zmienne niezależne) na ryzyko wystąpienia porodu przedwczesnego wykorzystując Model regresji logistycznej. Do oceny ryzyka porodu przedwczesnego wykorzystano Ilorazy szans OR (odds ratio, OR - różne od jedności) oraz ich 95% przedziały ufności, obliczane według modelu regresji logistycznej. Za miarę zależności pomiędzy badanymi czynnikami a ryzykiem porodu przedwczesnego przyjmowano wartość ilorazu szans.

Analiza badania stężeń markerów biochemicznych

W analizie badań biochemicznych krwi posłużono się klasycznymi miarami położenia takimi jak średnia arytmetyczna i mediana, a także miarami zmienności jak odchylenie standardowe, błąd standardowy oraz rozstęp i rozstęp kwartylowy. Normalność rozkładu zmiennych i równość wariancji badanej cechy w grupach badano odpowiednio testem W Shapiro-Wilka i testem równości wariancji.

Przy porównaniu dwóch grup dla danych ilościowych, które nie pochodziły z rozkładu normalnego posłużono się testem U Manna-Whitneya a dla danych o rozkładzie normalnym testem t-Studenta.

We wszystkich testach statystycznych za poziom statystycznej istotności przyjęto p<0,05. Ocenę poprawności klasyfikatora zmiennych przeprowadzono za pomocą krzywych ROC (ReceiverOperating Characteristic). Krzywa ROC opisuje zależność pomiędzy odsetkami wyników prawdziwie i fałszywie dodatnich analizowanych w badaniu czynników. Wybrano krzywe ROC, ponieważ metody te są lepszym sposobem opisywania i porównywania przydatności diagnostycznej słabych zmiennych, niż czułość i swoistość. Obszar pod krzywą odpowiada zdolności rozdzielczej danej zmiennej. W idealnym teście diagnostycznym pole pod krzywą ROC powinno być równe 1; jeśli jest równe 0,5 (pole powierzchni pod krzywą wynosi 50%), to test działa zupełnie przypadkowo. Gdy pole powierzchni tego obszaru jest równe 100% (1,0), to test wykazuje 100% czułości i swoistości. W celu wyznaczenia optymalnej wartości progu odcięcia dodatkowo posłużono się diagramami czułości i swoistości jako funkcji progu odcięcia. Wartości progów przyjęto dla krzywych ROC powyżej 0,7. Dla tych progów odcięcia wyróżniono zbiory wyników prawdziwie pozytywnych (PP), oraz fałszywie negatywnych (FN), prawdziwie negatywnych (PN) oraz fałszywie pozytywnych (FP).

Schematyczne zestawienie wyników badań stężeń markerów biochemicznych w grupie porodów przedwczesnych oraz porodów przedwczesnych fałszywych, czyli macierz decyzyjną ocenianego testu względem ostatecznego rozpoznania, przedstawiono w tabeli:

Tabela 2. Dwudzielna tabela macierzy decyzyjnej wyników ocenianych

Wynik badania stężania markeru	Rozpoznanie ostateczne
Poród przedwczesny	Poród przedwczesny fałszywy
Pozytywny	Prawdziwie Pozytywny	Fałszywie Pozytywny
Negatywny	Fałszywie Negatywny	Prawdziwie Negatywny

Na podstawie zestawienia liczebności poszczególnych zbiorów z macierzy decyzyjnej wyliczono wskaźniki skuteczności badania: czułość, swoistość, wartość przewidywania pozytywnego (WPP) oraz wartość przewidywania negatywnego (WPN).

Czułość - definiowaną jako frakcja wyników prawdziwie pozytywnych wśród badanych z porodem przedwczesnym, obliczano według wzoru: PP/PP+FN. Określa prawdopodobieństwo prawidłowego rozpoznania porodu przedwczesnego.

PL 237 304 B1

Swoistość - definiowaną jako frakcja wyników prawdziwie negatywnych wśród wszystkich badanych z porodem przedwczesnym fałszywym, obliczano według wzoru: PN/PN+FP. Określa prawdopodobieństwo wykluczenia dokonania porodu przedwczesnego.

Wartość Przewidywania Pozytywnego - definiowaną jako frakcja wyników prawdziwie pozytywnych wśród wszystkich badanych z pozytywnym wynikiem testu, obliczano według wzoru: PP/PP+FP. Oznacza prawdopodobieństwo rzeczywistego dokonania porodu przedwczesnego w przypadku pozytywnego wyniku testu.

Wartość Przewidywania Negatywnego - definiowaną jako frakcja wyników prawdziwie negatywnych wśród wszystkich badanych z negatywnym wynikiem testu, obliczano według wzoru: PN/PN+FN. Oznacza prawdopodobieństwo wykluczenia dokonania porodu przedwczesnego w przypadku negatywnego wyniku testu.

Częstość występowania choroby w badanej populacji określa się mianem prewalencji choroby. W odniesieniu do uprzednio wyprowadzonych pojęć prewalencja odpowiada prawdopodobieństwu (P) a priori, natomiast wartości przewidywania odpowiadają prawdopodobieństwu a posteriori. Korzystając z zależności między prawdopodobieństwem (P) i szansą (O) oraz wykorzystując macierz decyzyjną, określono wskaźniki prawdopodobieństwa LR (likelihood ratio) testu diagnostycznego: LR dla wyniku pozytywnego (LR+) obliczano według wzoru: czułość/(1-swoistość).

LR dla wyniku negatywnego (LR-) obliczano według wzoru: (1 -czułość)/swoistość.

Modelowanie systemów diagnostycznych porodu przedwczesnego w oparciu o stężenia markerów biochemicznych

Następnie stworzono wieloczynnikowy model prognostyczny przy zastosowaniu metody krokowej regresji logistycznej, w której zmienne, wykazujące znamienne statystycznie ilorazy szans w analizie indywidualnej, włączono do modelu wieloczynnikowego. Metodą optymalizacji wieloczynnikowego modelu regresji logistycznej doprowadzono do usunięcia z modelu markerów biochemicznych, które nie miały istotnego związku z ryzykiem porodu przedwczesnego (p > 0,05). Następnie, metodą krokową wsteczną wybierano najlepszy podzbiór markerów biochemicznych związanych z ryzykiem dokonania porodu przedwczesnego.

Do symulacji sztucznych sieci neuronowych oraz algorytmów genetycznych użyto narzędzia StatSoft Statistica Neural Networks.

W analizie wieloczynnikowej najlepszych markerów biochemicznych porodu przedwczesnego, jako ewentualnych wejść modelu sztucznej sieci neuronowej zastosowano metodę symulacji opartej na algorytmach genetycznych. Jako drugi sposób oceny wartości predykcyjnej badanych markerów biochemicznych zastosowano metody analizy dyskryminacyjnej, którą przeprowadzono zarówno metodą standardową jak i metodą krokową postępującą. Dla badanych markerów określono lambdę Wilksa (jest to standardowa statystyka stosowana do wyznaczenia istotności statystycznej mocy dyskryminacyjnej aktualnego modelu. Jej wartość mieści się w zakresie od 1 (brak mocy dyskryminacyjnej) do 0 (maksymalna moc dyskryminacyjna), cząstkową lamdę Wilksa (opisującą swoisty wkład danej zmiennej do dyskryminacji grup: im ta wartość jest bliższa zeru, tym większy wkład tej zmiennej do dyskryminacji), oraz wartości tolerancji (opisujące nadmiarowość danej zmiennej. Jeśli tolerancja jest równa 0 oznacza to, że wkład danej zmiennej do dyskryminacji jest minimalny w świetle wkładu pozostałych) dla zmiennych włączanych do modelu. Ponadto wartość predykcyjną badanych markerów oceniano w oparciu o budowę modelów drzew klasyfikacyjnych.

Podjęto także próbę zbudowania modelu skoringowego ryzyka porodu przedwczesnego w oparciu o zadane czynniki predykcyjne.

PL 237 304 Β1

Wyniki

Charakterystyka badanej populacji:

Badany czynnik	Parametry statyst.	Poród przedw -czesny	Poród fałszywy	Grupa Referen -cyjna	Pi	P2
Wiek pacjentek (lata)	średnia odch. stand. min- max	26,4 5,22 16-41	25,1 5,62 18-39	24,4 7,4 19-34	0,241	0,182
Która ciąża	średnia odch. stand, min- max	2 1,04 1-6	1,8 1,18 1 -4	1,6 1,12 1 -3	0,112	0,075
Wiek ciąży (tygodnie)	średnia odch. stand. min- max	31,1 3,96 22-36	28,3 5,9 23 -36	39,6 1,4 38-41	0,068	0,003
Masa ciała płodu w badaniu USG(g)	średnia odch. stand. min- max	1761 658 507- 2482	1642 757 612 - 2420	3620 578 3238- 4230	0,136	<0,001
Wzrost pacjentki (cm)	średnia odch. stand. min- max	162,5 5,98 150- 175	164,2 8,18 153 - 181	166,3 8,60 163-178	0.231	0,160
Masa ciała pacjentki obecnie (kg)	średnia odch. stand. min- max	66,1 12,18 47-99	61,1 15,5 52 - 94	72,2 7,14 64-98	0,083	0,032

PL 237 304 Β1

Badany czynnik	Parametry statyst·	Poród przedw -czesny	Poród fałszywy	Grupa Referen -cyjna	Pi	pi
Masa ciała pacjentki przed ciążą (kg)	średnia odch. stand. min- max	57,9 10,47 42-90	54,4 14,2 45-79	62,2 14,0 54- 72	0,061	0,072
pH pochwy	średnia odch. stand. min- max	5,4 0,84 4,2- 7,2	5,3 1,23 4,2 - 5,9	5,0 1,12 4,3-5,8	0,133	0,096
Poziom Hemoglobiny wc krwi (g%)	średnia odch. stand. min- max	11,6 0,84 9,8- 13,8	11,2 1,12 10,2-14,1	H,5 1,54 10,313,7	0,074	0,103
Poziom Leukocytów wc krwi (/Imm3)	średnia odch. stand. min- max	7271 6385,15 534026000	6830 5948 4800- 14000	8300 5233 6200- 10800	0,212	0,178
pH moczu	średnia odch. stand. min- max	6,3 0,64 5-8	5,? 1,43 5 -7	6,0 1,7 5,2-6,8	0,061	0,078

pl - (prawdopodobieństwo) porównanie grupy z porodem przedwczesnym (B-l) i grupy z porodem przedwczesnym fałszywym (B-ll).

p2 - (prawdopodobieństwo) porównanie grupy z porodem przedwczesnym (B-l) i grupy referencyjnej (R).

Średni wiek kobiet rodzących przedwcześnie wynosił 26,4 lat (skrajne od 16 do 41) i nie różnił się istotnie od wieku ciężarnych z porodem przedwczesnym fałszywym oraz rodzących w grupie referencyjnej. Nie istniały również istotne różnice pomiędzy grupami w liczbie przebytych ciąż, wzroście kobiet, masie ciała przed ciążą, a także wartościach pH pochwy i moczu oraz parametrami hematologicznymi.

PL 237 304 Β1

Różnice występowały jedynie pomiędzy grupą porodów przedwczesnych a grupą referencyjną w parametrach wynikających z różnego wieku ciążowego, to jest: tygodniach ciąży w czasie badania, masach ciała płodów i wadze ciężarnych.

82% rodzących przedwcześnie stanowiły kobiety w wieku 19-34 lat (Ryc. 1).

26,5% kobiet rodzących przedwcześnie stanowiły pierwiastki; 22,2% przebyło 1 poród; 10,1% stanowiły kobiety z dwoma porodami w wywiadzie. Kobiety po trzech i więcej porodach odbytych w przeszłości stanowiły łącznie 41,2% badanej grupy (Ryc. 2)

Najwięcej: 34,4% porodów przedwczesnych w badanej grupie odbyło się pomiędzy 32-35 tygodniem ciąży (Ryc. 3).

Czynniki związane z cyklem płciowym

Tabela 4. Charakterystyka czynników związanych z cyklem płciowym w badanych grupach

Badany czynnik	Parametry statyst.	Poród przedwczesny	Poród fałszywy	Grupa Referen -cyjna	Pi	P2
Wiek	średnia	13,4	14,1	13,1	0,091	0,082
pierwszej	odch.	1,4	1,8	1,6
miesiączki	stand.
(lata)	min-max	12-16	13 - 16	12- 15
Długość	średnia	28,6	28,5	28,1	0,112	0,075
cykli (dni)	odch.	4,4	3,9	3,8
	stand.
	min-max	26 -32	27 - 30	26 - 30
Nieregularne	%	18,4	17,6	22,1	0,268	0,083
miesiączki (% kobiet w grupie)
Obfite miesiączki (% kobiet w grupie)	%	12,2	16,2	9,6	0,096	0,074

pl - (prawdopodobieństwo) porównanie grupy z porodem przedwczesnym (B-l) i grupy z porodem przedwczesnym fałszywym (B-ll).

p2 - (prawdopodobieństwo) porównanie grupy z porodem przedwczesnym (B-l) i grupy referencyjnej (R).

Nie zaobserwowano istotnych statystycznie różnic w wieku pierwszej miesiączki (menarche), długości cykli miesięcznych, regularności cyklu miesiączkowego oraz nasileniem krwawień między grupą badaną i grupą referencyjną.

Badanie markerów biochemicznych w surowicy

Analizy ROC

W celu miarodajnego porównania wyników i określenia progów odcięcia dla wartości stężeń markerów biochemicznych, oraz wyodrębnienia zbiorów wartości uznanych za mieszczące się „w przyjętej

PL 237 304 Β1 normie” oraz „poza normą”, wykonano ocenę zmiennych osobno dla każdego badanego markera za pomocą krzywych ROC. Wybór „najlepszej” wartości progowej wyniku testu jest często kompromisem pomiędzy największą czułością testu (zdolność testu do rozpoznania choroby z najmniejszym odsetkiem wyników fałszywie ujemnych) i największą swoistością (zdolność do wykluczenia choroby, tam, gdzie jej nie ma, z najmniejszym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich). Wybór takich wartości progowych dla badanych markerów biochemicznych ułatwiają wykresy krzywych ROC, w których na osi rzędnych podana jest czułość (czyli odsetek wyników prawdziwie dodatnich), a na osi odciętych dopełnienie swoistości do jedności (1-swoistość; czyli odsetek wyników fałszywie dodatnich). Zaletą krzywych ROC jest niezależność od jednostek oraz skal, pozwalają na miarodajne porównanie wyników z różnych klasyfikatorów.

Pole powierzchni pod tą krzywą (AUC - Area Under Curve) zawiera się w przedziale wartości od 0 do 1, odzwierciedla zdolność testu do prawidłowego rozgraniczenia wyników prawidłowych oraz nieprawidłowych i może służyć do porównania zdolności rozdzielczej badanych markerów.

Analiza przydatności IGFBP-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 14, 15 i w tabelach: 27, 28.

Tabela 27. Wynik analizy ROC dla stężeń IGFBP-1

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
TGFBP-l	0,74	0,62 to 0,86	0,061	<0.001	wyższe wartości

Pole pod krzywą ROC dla IGFBP-1 wyniosło 0,74; co jest wartością zadowalającą i wskazuje na przydatność tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Tabela 28. Wartość diagnostyczna oceny stężenia IGFBP-1 w różnicowaniu porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

IGFBP-1 Wartość progowa> (pg/ml)	czułość	95% CI	Swoistość	95% CI	LR (+)	LR (-)	WPP	WPN
158,83	0,608	0,461 do 0,742	0,609	0,385 do 0,803	1,55	0,64	0,775	0,412

W badanej grupie stwierdzono istotnie wyższe prawdopodobieństwo zakończenia ciąży porodem przedwczesnym u kobiet ze stężeniem IGFBP-1 powyżej wartości progowej 158,83 pg/ml (p<0,001).

Na Ryc. 16 przedstawiono odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem IGFBP-1, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny).

Analiza przydatności IGFBP-2 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 17, 18 i w tabeli: 29.

Tabela 29. Wyniki analizy krzywej ROC dla stężeń IGFBP-2

Test	Area	95% Cl	SE	P	B-l
IGFBP-2	0,52	0,39 to 0,65	0,067	0,392	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń IGFBP-2, różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,392). Pole

PL 237 304 Β1 pod krzywą ROC dla IGFBP-2 wyniosło 0,52; co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności L-Selektyny w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 19, 20 i w tabeli: 30.

Tabela 30. Wyniki analizy krzywej ROC dla stężeń L-Selektyny

Test	Arca	95% CI	SE	P	B-I
L-Selektyna	0,47	0,33 do 0,61	0,071	0,655	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń LSelektyny różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,392). Pole pod krzywą ROC dla L-Selektyny wyniosło 0,47; co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności ΜΙΡ-ld w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 21,22 i w tabelach: 31,32.

Tabela 31. Analiza krzywej ROC dla stężeń MIP-1d

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
MlP-ld	0,64	0,50 do 0,78	0,071	0,021	niższe wartości

Tabela 32. Wartość diagnostyczna oceny stężenia MIP-1d w różnicowaniu porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

MlP-ld Wartość progowa (pg/ml)	czułość	95% Cl	swoistość	95% Cl	LR (+)	LR (-)	WPP	WPN
27,66	0.627	0,481 do 0,759	0.627	0,385 do 0,803	1,60	0,61	0,780	0,424

Oceniając stężenie MIP-1d w badanej grupie stwierdzono istotnie wyższe prawdopodobieństwo zakończenia ciąży porodem przedwczesnym u kobiet ze stężeniem MIP-1d poniżej wartości progowej 27,66 pg/ml (p=0,021).

Na Ryc. 23 przedstawiono odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem MIP-1d, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny).

Analiza przydatności BDNF w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 24, 25 i w tabelach: 33, 34.

PL 237 304 Β1

Tabela 33. Analiza krzywej ROC dla stężeń BDNF

Test	Area	95% CI	SE	P	B-T
BDNF	0,69	0,56 To 0,82	0,066	0,002	wyższe wartości

Pole pod krzywą ROC dla BDNF wyniosło 0,69; co jest wartością wskazującą na przydatność tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Tabela 34. Wartość diagnostyczna oceny stężenia BDNF w różnicowaniu porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

BDNF Wartość progowa (pg/ml)	Czułość	95% CI	swoistość	95% CI	LR (+)	LR (-)	WPP	WPN
36,54	0,630	0,475 do 0.768	0,647	0,383 do 0,858	1,79	0,57	0,828	0,392

W badanej grupie stwierdzono istotnie wyższe prawdopodobieństwo zakończenia ciąży porodem przedwczesnym u kobiet ze stężeniem BDNF powyżej wartości progowej 36,54 pg/ml (p=0,002).

Na Ryc. 26 przedstawiono odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem BDNF, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny).

Analiza przydatności BLC w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 27, 28 i w tabelach: 35, 36.

Tabela 35. Analiza krzywej ROC dla stężeń BLC

Test	Arca	95% CI	SE	P	B-I
BLC	0,70	0,58 do 0,83	0,062	<0,001	wyższe wartości

Pole pod krzywą ROC dla BLC wyniosło 0,70, co jest wartością zadowalającą i wskazuje na przydatność tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Tabela 36. Wartość diagnostyczna oceny stężenia BLC w różnicowaniu porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

BLC Wartość progowa> (pg/ml)	czułość	95% CI	swoistość	95% CI	LR (+)	LR (-)	WPP	WPN
25,46	0,588	0,442 do 0,724	0,609	0,385 do 0,803	1,50	0,68	0,769	0,4

W badanej grupie stwierdzono istotnie wyższe prawdopodobieństwo zakończenia ciąży porodem przedwczesnym u kobiet ze stężeniem BLC powyżej wartości progowej 25,46 pg/ml (p<0,001).

Na Ryc. 29 przedstawiono odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem BLC, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny).

Analiza przydatności Eotaksyny-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 30, 31 i w tabelach: 37, 38.

PL 237 304 Β1

Tabela 37. Analiza krzywej ROC dla stężeń Eotaksyny-1

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
Eotaksyna-1	0,74	0,62 do 0,86	0,060	<0.001	Wyższe wartości

Pole pod krzywą ROC dla Eotaksyny-1 wyniosło 0,74, co jest wartością zadowalającą i wskazuje na przydatność tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Tabela 38. Wartość diagnostyczna oceny stężenia Eotaksyny-1 w różnicowaniu porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

Eotaksyna1 wartość progowa>	czułość	95% CI	swoistość	95% CI	LR (+)	LR (-)	WPP	WPN
(pg/ml)	0,633	0,483 do 0,766	0,652	0,427 do 0,836	1,82	0,56	0,795	0,454

W badanej grupie stwierdzono istotnie wyższe prawdopodobieństwo zakończenia ciąży porodem przedwczesnym u kobiet ze stężeniem Eotasyny-1 powyżej wartości progowej 1,16 pg/ml (p<0,001).

Na Ryc. 32 przedstawiono odsetek kobiet z wysokim i niskim stężeniem Eotaksyny-1, w grupie rodzących przedwcześnie oraz z porodem przedwczesnym fałszywym (rozkład binarny).

Analiza przydatności Eotaksyny-2 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 33, 34 i w tabeli: 39.

Tabela 39. Analiza krzywej ROC dla stężeń Eotaksyny-2

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
Eotaksyna-2	0,54	0,39 do 0,69	0,077	0,311	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń Eotaksyny-2 różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,311). Pole pod krzywą ROC dla Eotaksyny-2 wyniosło 0,54, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności E-Selektyny w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 35, 36 i w tabeli: 40.

Tabela 40. Analiza krzywej ROC dla Stężeń E-Selektyny

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
E-Selekty na	0,50	0,36 do 065	0,074	0,475	wartości niższe

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń ESelektyny różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,475). Pole

PL 237 304 Β1 pod krzywą ROC dla E-Selektyny wyniosło 0,50, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności ICAM-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 37, 38 i w tabeli: 41.

Tabela 41. Analiza krzywej ROC dla stężeń ICAM-1

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
ICAM-t	0,53	0,39 do 0,66	0,069	0,338	Wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń ICAM1 różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,338). Pole pod krzywą ROC dla ICAM-1 wyniosło 0,53, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności MIP-3b w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 39, 40 i w tabeli: 42.

Tabela 42. Analiza krzywej ROC dla stężeń MIP-3b

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
MIP-3b	0,62	0,48 do 0,77	0,074	0,047	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń MIP-3b różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym. Pole pod krzywą ROC dla MIP-3b wyniosło 0,62, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności PECAM-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 41,42 i w tabeli: 43.

Tabela 43. Analiza krzywej ROC dla stężeń PECAM-1

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
PECAM-1	0,58	0,43 do 0,74	0,077	0,136	niższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń PECAM-1 różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,136). Pole pod krzywą ROC dla PECAM-1 wyniosło 0,58, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności VCAM-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 43, 44 i w tabeli: 44.

PL 237 304 Β1

Tabela 44. Analiza krzywej ROC dla stężeń VCAM-1

Test	Area	95% CI	SE	P	B-I
YCAM-l	0,60	0,47 do 0,74	0,067	0,062	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń VCAM-1 różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,062). Pole pod krzywą ROC dla VCAM-1 wyniosło 0,60, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Analiza przydatności VCAM-1 w prognozowaniu zagrożenia porodem przedwczesnym

Wykresy rozkładu czułości i swoistości oraz wyniki analizy krzywej ROC przedstawiono na rycinach: 45, 46 i w tabeli: 45.

Tabela 45. Analiza krzywej ROC dla stężeń CRP

Test	Area	95% CI	SE	Z	P	Grupa 1 = PP
CRP	0,64	0,41 do 0,87	0,118	1,16	0,122	wyższe wartości

W przeprowadzonym badaniu nie uzyskano wyznaczenia istotnego progu odcięcia dla stężeń CRP różnicujących poród przedwczesny z porodem przedwczesnym fałszywym (p=0,122). Pole pod krzywą ROC dla CRP wyniosło 0,64, co jest wartością niezadowalającą i wskazuje na niską wartość dyskryminacyjną tego markera biochemicznego jako narzędzia do przewidywania ryzyka porodu przedwczesnego.

Ocena predykcji stężenia markerów biochemicznych w surowicy krwi kobiet ciężarnych, w diagnostyce różnicowej porodu przedwczesnego i porodu przedwczesnego fałszywego

Uzyskany metodą analizy ROC, zadawalający poziom skuteczności diagnostycznej stężeń wybranych markerów biochemicznych, był powodem podjęcia próby uproszczenia procedury diagnostycznej przez zredukowanie liczby analizowanych czynników.

W tym celu badane markery biochemiczne zostały włączone do modelu wielowymiarowego, aby ocenić ich łączną wartość predykcyjną porodu przedwczesnego i wyselekcjonować te, których predykcja pozostałaby nadal istotna.

Ocena wartości predykcji markerów biochemicznych metodą Sztucznych Sieci Neuronowych

Po wprowadzeniu 14 czynników z modelu wielozmiennowego i zastosowaniu metody krokowej redukcji zmiennych uzyskano model, z prawdopodobieństwem porodu przedwczesnego (Tab. 46).

PL 237 304 Β1

Tabela 46. Dobór predykatorów (wejść sieci neuronowej) przy użyciu metody algorytmów genetycznych

Marker	Krokowa	Krokowa	Ocena
Biochemiczny:	postępująca	wsteczna	wyczerpująca
BDNF	T	T	T
Eotaksyna-1	T	T	T
VCAM-1	T	T	T
BLC	-	T	T
ICAM-1	-	T	T
PECAM-1	-	T	T
MlP-ld	T	-	T
IGFBP-2	-	-	T
L-Selektyna	-	-	T
IGFBP-1	T	T	-
Eotaksyna-2	-	T	-
E-Selektyna	T	-	-
MIP-3b	-	-	-
Błąd	0,448	0,436	0,475

Stosując metodę algorytmów genetycznych wyłoniono 3 markery biochemiczne, które w istotny sposób modyfikowały ryzyko porodu przedwczesnego:

1. - BDNF;

2. - Eotaksyna-1;

3. -VCAM-1.

Ocena predykcji markerów biochemicznych metodą Analizy Funkcji Dyskryminacyjnej

Każda wartość podana w pierwszej kolumnie oznacza Lambdę Wilksa po wprowadzeniu tej zmiennej do modelu. Cząstkowa Lamba Wilksa (druga kolumna) opisuje swoisty wkład danej zmiennej do dyskryminacji grup: im ta wartość jest bliższa zeru, tym większy wkład tej zmiennej do dyskryminacji. Wartość tolerancji - opisuje nadmiarowość danej zmiennej. Jeśli tolerancja jest równa 0 (lub bardzo bliska), oznacza to, że wkład danej zmiennej do dyskryminacji jest minimalny w świetle wkładu pozostałych.

PL 237 304 Β1

Tabela 47. Wartość predykcyjna markerów biochemicznych oznaczona

Marker biochemiczny	Lambda Wilksa	Cząstk. Wilksa	F usuń. -1,47	poziom p	Toler.	1-Toler. (R-kwad)
BDNF	0,636	0,891	5,733	0,021	0,851	0,148
BLC	0,601	0,943	2,840	0,099	0,796	0,204
Eotaksyna	0,589	0,963	1,818	0,184	0,582	0,418
Eotaksyna-2	0,581	0,976	1,143	0,290	0,678	0,322
E-Selektyna	0,571	0,993	0,332	0,567	0,393	0,607
ICAM-1	0,577	0,983	0,815	0,371	0,661	0,339
IGFBP-1	0,623	0,911	4,603	0,037	0,724	0,276
IGFBP-2	0,567	0,100	0,001	0,995	0,512	0,487
L-Selektyna	0,603	0,941	2,961	0,092	0,397	0,602
MlP-ld	0,567	0,100	0,004	0,951	0,691	0,309
MIP-3b	0,567	0,100	0,002	0,966	0,836	0,164
PECAM-1	0,657	0,863	7,453	0,009	0,779	0,221
VCAM-1	0,571	0,993	0,336	0,565	0,634	0,366

Zastosowanie Analizy Funkcji Dyskryminacyjnej Metodą Standardową pozwoliło na wyodrębnienie 3 potencjalnych biomarkerów, które w istotny sposób modyfikowały ryzyko porodu przedwczesnego: BDNF, IGFBP-1, PECAM-1.

Tabela 48. Wartość predykcyjna markerów biochemicznych oznaczona Metodą Krokową Postępującą

Marker biochemiczny	Lambda Wilksa	Cząstk. Wilksa	F usuń. -1,53	poziom P	Toler.	1-Toler. (R-kwad)
IGFBP-1	0,668	0,891	6,447	0,014	0,813	0,187
PECAM-1	0,687	0,867	8,103	0,006	0,864	0,136
Eotaksyna-1	0,617	0,965	1,917	0,172	0,846	0,154
BDNF	0,657	0,907	5,460	0,023	0,938	0,062
BLC	0,641	0,930	3,987	0,050	0,887	0,113
L-Selektyna	0,627	0,950	2,784	0,101	0,767	0,233
VCAM-1	0,611	0,976	1,327	0,254	0,867	0,133
Eotaksyna-2	0,586	0,983	0,904	0,346	0,737	0,263
E-Selektyna	0,590	0,990	0,501	0,482	0,437	0,563
ICAM-1	0,586	0,984	0,844	0,362	0,859	0,141
IGFBP-2	0,596	0,100	0,008	0,931	0,773	0,227
MlP-ld	0,594	0,997	0,136	0,713	0,830	0,170
MIP-3b	0,596	0,100	0,003	0,959	0,908	0,092

PL 237 304 Β1

Zastosowanie Metody Krokowej Postępującej, pozwoliło w modelu diagnostycznym na dodanie do trzech, wyodrębnionych Metodą Standardową markerów biochemicznych, kolejnego badanego markera: BLC.

Ocena predykcji markerów biochemicznych metodą Budowy Modelu Skoringowego

Tabela 49. Wartość predykcyjna markerów biochemicznych oznaczona metodą Budowy Modelu Skoringowego

Marker biochemiczny	Współczynnik IV (Information Valiue)	Współczynnik V Cramera
ICAM-1	1,03	0,59
BDNF	0,89	0,61
IGFBP-1	0,74	0,53
L-Selektyna	0,59	0,53
MlP-ld	0,52	0,51
Eotaksyna	0,41	0,57
PECAM-1	0,37	0,52
MIP-3b	0,36	0,45
E-Selektyna	0,31	0,52
BLC	0,27	0,51
VCAM-1	0,21	0,51
IGFBP-2	0,2	0,48
Eotaksyna-2	0,19	0,55

Budowa Modelu Skoringowego wykazała wartość predykcyjną oznaczeń stężeń ICAM-1 oraz BDNF w przewidywaniu wystąpienia porodu przedwczesnego.

Model diagnostyczny Drzewa Regresyjnego i Klasyfikacyjnego

Na Ryc. 47 przedstawiono model diagnostyczny różnicowania porodu przedwczesnego od porodu przedwczesnego fałszywego w oparciu o stężenia markerów biochemicznych według wynalazku.

Dyskusja i Konkluzje

Badając stężenia markerów biochemicznych w surowicy krwi, w dwóch grupach kobiet z rozpoczynającą się czynnością skurczową: kobiet u których poród przedwczesny dokona się, z kobietami z porodem przedwczesnym fałszywym, niezwykle rzadko udaje się zaobserwować pełną rozdzielczość wyników ocenianego testu. Rozkłady wyników testu w obu grupach zwykle zachodzą na siebie, dając przedział wyników, które nie pozwalają z całkowitą pewnością zaliczyć badanej kobiety do grupy, w której poród przedwczesny dokona się, lub grupy z fałszywym porodem przedwczesnym. Jest to zależność obserwowana we wszystkich badaniach kohortowych, gdzie w praktyce nie spotyka się idealnych badań

PL 237 304 B1 diagnostycznych, pozwalających w 100% przewidzieć efekt końcowy. O ile wyniki skrajne nie nastręczają trudności interpretacyjnych, warunkiem przydatności diagnostycznej każdego badanych białek markerowych było ustalenie granicy (progu - ang. treshold, cut-off, criterion value) pomiędzy wynikami prawidłowymi i nieprawidłowymi. Wykresy rozkładów wyników w grupie z porodem przedwczesnym oraz grupie z porodem fałszywym częściowo zachodzą na siebie i w tym zakresie wyznaczono granicę (próg odcięcia) rozdzielającą wyniki stężeń markerów na pozytywne (przemawiające za rozwijającym się porodem przedwczesnym) i negatywne (pozwalające rozpoznać poród przedwczesny fałszywy).

Czułość i swoistość danego badania znamionują test diagnostyczny per se, stanowiąc przesłankę w podejmowaniu decyzji o zastosowaniu go u konkretnej pacjentki. Parametry WPP i WPN uściślają natomiast interpretację wyniku tego badania. Obliczenie wszystkich wymienionych wskaźników skuteczności badania wymagało prawidłowego przypisania wyniku badania do zbioru wyników pozytywnych (przemawiających za wystąpieniem porodu przedwczesnego) lub negatywnych (sugerujących poród przedwczesny fałszywy). Jednak podobnie jak w większości testów diagnostycznych, stwierdzono zakres wyników, które mogły występować zarówno u pacjentek z porodem przedwczesnym jak i porodem przedwczesnym fałszywym. W analizach statystycznych taki przedział określa się jako zakres decyzyjny. Wyznaczając w tym zakresie granicę między wynikami uznanymi za pozytywne i negatywne ustalono wartość progową dzielącą dychotomicznie zbiór wszystkich wyników. Dla każdej wartości progowej z zakresu decyzyjnego otrzymywano różne odsetki wyników: Prawdziwie Pozytywnych, Fałszywie Pozytywnych, Fałszywie Negatywnych oraz Prawdziwie Negatywnych, a przez to różne wartości wszystkich wskaźników skuteczności badania.

Istniały przy tym następujące zależności:

1. Zwiększenie czułości (wymagane np. w badaniach przesiewowych) można było uzyskać przesuwając wartość progową stężeń markerów w kierunku wartości „prawidłowych”. Wiązało się to ze zmniejszeniem odsetka wyników fałszywie ujemnych, ale i też ze zmniejszeniem swoistości i zwiększeniem odsetka wyników fałszywie dodatnich;

2. Zwiększenie swoistości było możliwe poprzez przesunięcie wartości progowej stężeń badanych markerów w kierunku wyników „nieprawidłowych”. Takie rozwiązanie stosuje się zwykle w sytuacjach, w których celem jest zminimalizowanie odsetka wyników fałszywie dodatnich. Zawsze wiąże się to jednak ze zmniejszeniem czułości i zwiększeniem odsetka wyników fałszywie ujemnych.

W związku z przedstawionymi powyżej zależnościami, w praktyce klinicznej często stosuje się kolejno dwa różne testy: pierwszy o dużej czułości (wykrycie potencjalnych przypadków patologii) i drugi o dużej swoistości (potwierdzenie choroby). W przeprowadzonym badaniu wybór „najlepszej” wartości progowej wyników badania stężeń markerów biochemicznych był kompromisem pomiędzy największą czułością testu (najmniejszym odsetkiem wyników fałszywie ujemnych) i największą swoistością (najmniejszym odsetkiem wyników fałszywie dodatnich). Wybór takiej wartości progowej ułatwił wykres, w którym na osi rzędnych podawano czułość (czyli odsetek wyników prawdziwie dodatnich), a na osi odciętych dopełnienie swoistości do jedności (1 - swoistość). Krzywa ROC opisująca zależność między odsetkami wyników prawdziwie i fałszywie dodatnich, czyli pomiędzy czułością i dopełnieniem swoistości do 1 (zakładając różne wartości progowe testu) była w przeprowadzonym badaniu narzędziem umożliwiającym takie wybory. Największe zbliżenie do 100% czułości i swoistości uzyskano przy wartości progów odcięcia krzywych powyżej 0,7 - co zadecydowało o przyjęciu właśnie takiej wartości.

Warunkiem koniecznym do uzyskania wysokiej jakości wyników oznaczeń stężeń markerów biochemicznych w surowicy krwi, jest odpowiedni wybór metody oznaczeń. Tradycyjna metoda oznaczania i kwantyfikacji markerów opiera się o metodę enzymatyczną ELISA.

Interpretując otrzymane wyniki należy uwzględnić fizjologiczne zmiany stężeń niektórych białek w przebiegu ciąży. Dla przykładu stężenie IGFBP-1 ulega fizjologicznemu wzrostowi w drugim i trzecim trymestrze [150], dlatego w metodologii oprócz profilowania stężeń poszczególnych markerów, wykonano porównanie wyników w grupie kobiet rodzących przedwcześnie zarówno z grupą z porodem przedwczesnym fałszywym (w tożsamym wieku ciążowym), jak również z rodzącymi w ciąży donoszonej.

Niezależnie od wieku ciąży istnieją inne mechanizmy wpływające na stężenia poszczególnych markerów biochemicznych w surowicy krwi. Gravett i wsp. [151] wykazali zmianę stężeń Calgranuliny B (białka którego ekspresja pojawia się na powierzchni makrofagów i komórek nabłonkowych tkanek

PL 237 304 B1 w ostrej fazie zapalnej) oraz IGFBP-1, syntetyzowanych w błonach płodowych oraz doczesnej w przebiegu zakażeń wewnątrzmacicznych. Zmiany te zachodzą przed wystąpieniem objawów klinicznych zakażenia, co daje podstawy do poszukiwania wśród cytokin markerów biochemicznych porodu przedwczesnego. Dla kontrastu, stężenia nie wszystkich cytokin ulegają modulacji w przebiegu wewnątrzmacicznych procesów zapalnych. Jednak rola ekspresji niektórych cytokin w diagnostyce wczesnych stadiów stanów zapalnych toczących się wewnątrzmacicznie jest bezsporna [154]. W badaniach Urbana i wsp. [155] wykazano u kobiet z zagrażającym porodem przedwczesnym istotne zmiany ekspresji ICAM-1, które pozwoliły autorom przewidywać przydatność kliniczną oznaczeń ICAM-1 w predykcji porodu przedwczesnego.

W prezentowanym badaniu, będącym podstawą wynalazku, przydatność oznaczeń ICAM-1 potwierdzono metodą budowy modelu skoringowego, w którym uzyskano dla ICAM-1 wartości współczynników IV (Information Valiue), oraz V Cramer'a odpowiednio: 1,03 i 0,59 - co pozwala na wykorzystanie oznaczeń stężenia ICAM-1 w surowicy krwi w predykcji porodu przedwczesnego. Podobnie jak w badaniach Urbana i wsp. [155], ze względu na zbyt duże odchylenia standardowe nie udowodniono u kobiet z porodem przedwczesnym statystycznie istotnych zmian stężeń w surowicy krwi VCAM-1. Jednak poszerzając analizę statystyczną o budowę sieci neuronowej przy użyciu metody algorytmów genetycznych uzyskano wyniki które pozwalają przewidywać wartość predykcyjną także dla oznaczeń VCAM-1.

Zastosowanie w prezentowanym badaniu kilku odmiennych metod analizy statystycznej pozwala zwrócić uwagę na potencjalne znaczenie różnych markerów biochemicznych w predykcji porodu przedwczesnego. Budowa Sieci Neuronowej sugeruje wartość predykcyjną oznaczeń BDNF, Eotaksyny-1 oraz VCAM-1 w prognozowaniu porodu przedwczesnego. Czynnikiem obniżającym wartość analizy tą metodą w prezentowanym badaniu jest mała liczebność badanej grupy. Wyniki analizy metodą budowy sieci neuronowych są tym bardziej wiarygodne, im większa jest liczebność badanych grup.

Zastosowanie metody Analizy Funkcji Dyskryminacyjnej pozwoliło na wyodrębnienie 4 potencjalnych biomarkerów, które w istotny sposób modyfikowały ryzyko porodu przedwczesnego: IGFBP-1, PECAM-1, BDNF, BLC. Niestety w metodzie tej, wartość Lambdy Wilksa, która jest stosowana do wyznaczenia istotności statystycznej mocy dyskryminacyjnej aktualnego modelu jest relatywnie wysoka co sugeruje umiarkowaną wartość diagnostyczną tego modelu w prezentowanym wynalazku.

Ocena predykcji markerów biochemicznych metodą Budowy Modelu Skoringowego wykazała wartość oznaczeń ICAM-1 oraz BDNF, a więc również nieco inną kombinację badanych markerów. Brak pełnej zgodności uzyskanych wyników analiz statystycznych badanych markerów biochemicznych, wykonanych różnymi metodami nie pozwala na jednoznaczne wnioski odnośnie przydatności klinicznej prezentowanych modeli diagnostycznych i wymaga potwierdzenia na większych grupach, jednak wszystkie modele wykazały istotność BDNF jako markera porodu przedwczesnego. W tej sytuacji najwyższą wartość predykcyjną oznaczeń stężeń badanych markerów biochemicznych w przewidywaniu porodu przedwczesnego wydają się mieć analizy krzywych ROC, które dla IGFBP-1, BDNF, BLC, Eotaksyny-1 oraz MIP-1d pozwoliły na określenie wartości progowych, pozwalających z określoną czułością i swoistością przewidywać u danej ciężarnej prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego. Stworzony całościowo model diagnostyczny Drzewa Regresyjnego i Klasyfikacyjnego (Rycina 47), będąc prezentowanym wynalazkiem, łączy wyniki zastosowanych i opisanych powyżej metod badawczych.

Główną siłą przeprowadzonego przez zgłaszającego badania była metoda badania analizowanych markerów biochemicznych. Tylko nieliczne systemy posiadają zdolność wielokierunkowych oznaczeń [161,162]. Taką możliwość wprowadził Moody i wsp. [163], którzy opracowali metodologię opartą o wykorzystanie połączeń enzymów z immunosorbentem w celu jest odpowiedzią na mechanizmy pośredniczące w porodzie przedwczesnym.

Jak wspomniano wcześniej, infekcja wewnątrzmaciczna prowadząc do porodu przedwczesnego, zazwyczaj przebiega bezobjawowo do czasu wystąpienia skurczów mięśnia macicy. Dlatego u ciężarnych bezpośrednio narażonych na poród przedwczesny, kluczowa jest identyfikacja czynników ryzyka we wczesnym stadium, kiedy możliwe jest wprowadzenie odpowiedniej strategii leczenia. Medycyna kliniczna opiera się głównie na podejściu redukcjonistycznym, ogniskującym się na jednym czynniku sprawczym [169]. Powszechnie zaakceptowano podejście, że każda choroba posiada główną przyczynę, która staje się celem postępowania leczniczego. Odkąd dla zakażeń wewnątrzmacicznych najbardziej oczywistą przyczyną choroby stał się patogen, metody wykrywania subklinicznych infekcji prowadzących do porodu przedwczesnego koncentrują się na wykrywaniu drobnoustrojów lub związków uwalnianych przez źródła zakażeń w płynie owodniowym, wydzielinie pochwowej oraz surowicy krwi.

PL 237 304 B1

Istnieją liczne dowody skuteczności klinicznej takiego redukcjonistycznego postępowania. Dla przykładu: przewlekłe zakażenia wewnątrzmaciczne prowadzą do degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej błon płodowych, co skutkuje uwalnianiem fibronektyny do wydzieliny pochwowej, co jest najlepszym wskaźnikiem Chorioamnionitis i zagrażającego porodu przedwczesnego [170]. Jednak większość współczesnych badań sugeruje bardziej kompleksową odpowiedź immunologiczną, warunkowaną przez wiele czynników. Dla przykładu przewlekła odpowiedź immunologiczna może prowadzić do obniżenia reaktywności, przejawiającej się obniżeniem stężeń niektórych cytokin [110]. Takie zjawisko stwierdzono w przeprowadzonym badaniu w przypadku MIP-1d, cytokiny działającej chemotaktycznie na neutrofile, monocyty i limfocyty, warunkującej poprzez receptory CCR1 i CCR3 ich wiązanie z komórkami docelowymi. U kobiet z porodem przedwczesnym stężenia MIP-1d były istotnie niższe w porównaniu z wartościami w grupie porodów przedwczesnych fałszywych. Taka interpretacja obniżonego poziomu MIP-1d u kobiet rodzących przedwcześnie nie jest jedyna. Simhan i wsp. [166] stwierdzili, że obniżony poziom niektórych cytokin może być zjawiskiem pierwotnym, wynikającym z uwarunkowań genetycznych, co powoduje zmniejszoną odporność osobniczą na zakażenia wewnątrzmaciczne i promuje wystąpienie porodu przedwczesnego. Jest to zgodne z badaniami Dizon-Townson i wsp. [171] według których poród przedwczesny, przynajmniej w części jest uwarunkowany genetycznie.

Rola wymienionych cytokin w przebiegu ciąży jest nieznana. Ogólnie cytokiny wpływają na liczne tkanki i organy nie tylko lokalnie, na drodze auto i parakrynnej, lecz również na drodze endokrynnej - czego przykładem może być współistnienie (mediowane przez cytokiny) zapalenia wewnątrzowodniowego i uszkodzenia centralnego układu nerwowego płodu [172]. W prezentowanym badaniu stwierdzono u kobiet z porodem przedwczesnym wzrost stężenia BDNF, markera należącego do białek z grupy neurotropin, biorącego udział w procesie neurogenezy. Wywiera on wpływ na mechanizmy regulujące apoptozę, dzięki wiązaniu z receptorem p75NTR [173]. Wykazany wzrost potwierdza spostrzeżenia Gilmore i wsp. [122], którzy dowodzą istnienia mechanizmów uszkadzających tkanki ośrodkowego układu nerwowego w przebiegu infekcji wewnątrzmacicznej.

Oceniane jako markery biochemiczne cytokiny MIP-1d, BLC oraz Eotaksyna-1, pełnią rolę chemotaktantu dla różnego rodzaju komórek, między innymi dla komórek Natural Killer (NK) [174-176] a także limfocytowi oraz B [177]. Sendag i wsp. [165] wykazali zmiany w krążącej we krwi subpopulacji limfocytów T, komórek B oraz NK, u kobiet z zagrażającym porodem przedwczesnym. Dowiedli, że odsetek krążących limfocytów T CD3+ u tych kobiet jest znacząco niższy, z równoczesnym wzrostem odsetka komórek B CD19+ w porównaniu z grupą kontrolną. Według autorów zmiany te mogą być związane z mechanizmami pośredniczącymi w rozwoju porodu przedwczesnego. Ekspresję IGFBP-1 oraz Eotaksyny-1 [178, 179] stwierdzono także w endometrium, jednak rola Eotaksyny-1, będącej chemoatraktantem dla komórek NK, jaką odgrywa w ciąży jest niejasna [179].

Badania przeprowadzone w populacji polskiej przez Kalinkę i wsp. [180] wykazały, że nosicielstwo alleli IL1RN*2 może sprzyjać zwiększonym odsetkom porodów przedwczesnych wśród Polek, szczególnie w przypadku współistnienia IL1RN*2 z przynajmniej jedną kopią alleli G Interleukiny-6. Takie wyniki są szczególnie cenne ponieważ dostarczają wiedzy ściśle dotyczącej naszej populacji i mogą być podstawą prób tworzenia modeli diagnostycznych.

Z chwilą wykazania wzrostu stężenia IGFBP-1, BDNF, BLC, Eotaksyny-1, oraz obniżenia MIP1d u kobiet rodzących przedwcześnie, pojawia się kwestia, czy białka te mogą indukować poród przedwczesny poprzez mobilizację limfocytów i wpływ na ich sub-populacje krążące, a tym samym promocję procesów zapalnych.

Niezależnie od tego jakie metody badawcze były stosowane wnioski są podobne - wskazują na ogromny potencjał tych metod w zakresie badania biomarkerów oraz profili diagnostycznych porodu przedwczesnego. Jednak techniki molekularne wymagają zaawansowanych narzędzi obliczeniowych i matematycznych, które są zaledwie wstępem do rozwinięcia pełni możliwości. Systemy złożone, jakim jest poród przedwczesny nie mogą być rozwikłane metodami analiz pojedynczych czynników (każdy z osobna). Tylko wykorzystanie ogromu potencjału ekspresji ludzkiego genomu, poprzez tworzenie sieci współpracy w oparciu o interdyscyplinarne zespoły, może zwiększyć nasze rozumienie etiologii porodu przedwczesnego, jednego z najpoważniejszych wyzwań współczesnego położnictwa.

PL 237 304 B1

Literatura:

1. Pasquier JC, Picaud JC, Rabilloud M, at al. Neonatal outcomes after elective delivery management of preterm premature rupture of the membranes before 34 weeks' gestation (dominos study). Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;143:18-23;

2. Bohnhorst B. Skin to skin care in the neonatal intensive care unit: More data regarding seriously ill infants are badly needed. Commentary on heimann et al.: Impact of skin to skin care, prone and supine positioning on cardiorespiratory parameters and thermoregulation in premature infants. Neonatology 2009;97:318-320;

3. Kiss H, Pichler E. Cost effectiveness of a screen-and-treat program for asymptomatic vaginal infections in pregnancy: towards a significant reduction in the costs of prematurity. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006;127:198-203.

4. Wiswell G B. The problem of prematurity. N S Med Bull 1948;27:33-43;

5. Lelong M. Definition, criteria and frequency of prematurity. Sem Hop 1951;27:2937-2940;

6. Candau M G. Program of the World Health Organization and plans for the future. Fed Proc 1961;20:403-406;

7. Dennison B. Definition of preterm delivery. Br Med J 1976;2:1449-1453;

8. Dunn P M. The Van Deventer Lecture. Prematurity: the changing scene. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1989;33:1-6;

9. Lumley J. Preventing and managing prematurity. Int J Technol Assess Health Care 1991 ;7:460477;

10. Carbonne B. Is it possible to improve diagnostic and prognostic criteria of preterm labour? Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004;117:6-9;

11. Burwick R, Zork MN. Cervilenz assessment of cervical length compared to fetal fibronectin in the prediction of preterm delivery in women with threatened preterm labor. J Matern Fetal Neonatal Med 2010;24:127-31;

12. Maul H, Saade G, Garfield RE. Prediction of term and preterm parturition and treatment monitoring by measurement of cervical cross-linked collagen using light-induced fluorescence. Acta Obstet Gynecol Scand 2005;84:534-536;

13. Czajka R, Torbe A, Rzepka R, et al. Kliniczna analiza porodów przedwczesnych. Ginekol Pol 2000;8:724-727;

14. Czajka R. Wartość prognostyczna oceny stanu szyjki w skali Bishopa i skurczów macicy w rozpoznawaniu i leczeniu porodu przedwczesnego. Ginekol Pol 1991;62:153-156;

15. Lockwood CJ. Stress - associated preterm delivery: the role of corticotropin - releasing hormone. Am J Obstet Ginecol 1997;177:947-952;

16. Marianowski L. Diagnostyka i postępowanie w porodzie przedwczesnym. Klin Perinatol Ginekol 1998;25:119-126;

17. Papiernik E. Prediction of the Preterm Baby. Clin Obstet Gynecol 1984;11:315-336;

18. Czajka R. Delivery by natural birth or caesarean section in preterm Labour. Med Wieku Rozwoj 2003;7:97-103;

19. Nesin M. Genetic basis of preterm birth. Front Biosci 2007;12:115-124;

20. Ananth CV, Vintzileos AM. Epidemiology of preterm birth and its clinical subtypes. J Matern Fetal Neonatal Med 2006;19:773-782;

21. Al-Dabbagh SA, Al-Taee WY. Risk factors for pre-term birth In Iraq: a case-control study. BMC Pregnancy Childbirth 2006;6:13;

22. MacDorman M, Declercq E, Zhang J. Obstetrical intervention and the singleton preterm birth rate in the United States from 1991-2006. Am J Public Health 2010;100:2241-7;

23. Berkovitz GS, Papiernik E. Epidemiology of preterm birth. Epidemiolopy Review 1993;15:414-443;

24. Szamatowicz M. Bezpieczeństwo Zdrowotne Kobiet Ciężarnych i Rodzących. Biuletyn GUS, Warszawa,2008,53:102;

25. Seremak-Mrozikiewicz A, Drews K. The significance of genetic factors in aetiology of preterm delivery. Ginekol Pol 2007;78:317-323;

26. Chamberlain G V. High risk factors in labour. Br J Hosp Med 1977;17:249-25;

27. Koval'chuk L S. Chronic pyelonephritis in pregnant women as a reason for premature labor and perinatal Heath. Vopr Okhr Materin Det 1971;16:51-4;

28. O'Neill M, Hertz-Picciotto I, Pastore L, et al. Have studies of urinary tract infection and preterm delivery used the most appropriate methods? Paediatr Perinat Epidemiol 2003;17:226-33;

PL 237 304 B1

29. Moutquin JM. Socioeconomic and Psychosocial Factors In the Management and Prevention of Preterm Labour. Br J Obstet Gynaecol 2003;110: 56-60;

30. Hossain R, Harris T, Lohsoonthorn,V, et al. Risk of preterm delivery in relation to vaginal bleeding in early pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2007;135:158-63;

31. Hackney D N, Glantz JC. Vaginal bleeding in early pregnancy and preterm birth: systemic review and analysis of heterogeneity. J Matern Fetal Neonatal Med 2010, DOI 10.3109/ 14767058.2010.530707;

32. Goffinet F, Maillard F, Mihoubi N, et al. Bacterial vaginosis: prevalence and predictive value for premature delivery and neonatal infection in women with preterm labour and intact membran es. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2003;108:146-51;

33. Kamiński K, Wnęk M. Vagina ecosystem with taking into consideration bacterial vaginosis in particular at pregnant women to be in miscarriage and premature delivery danger. Ginekol Pol 2001;72:1005-9;

34. Kurata A, Matsuda Y, Tanabe K, et al. Risk factors of preterm delivery at less than 35 weeks in patients with renal transplant. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006;128:64-8;

35. Rajaeefard A, Mohammadi M, Choobineh A, et al. Preterm delivery risk factors: a prevention strategy in Shiraz, Islamic Republic of Iran. East Mediterr Health J 2007;13:551-9;

36. Lo CC, Hsu JJ, Hsieh CC, et al. Risk factors for spontaneous preterm delivery before 34 weeks of gestation among Taiwanese women. Taiwan J Obstet Gynecol 2007;46:389-94;

37. Hubner F, Schonlau H, Stumpf C, et al. Effect of risk factors on premature labor and neonatal condition following delivery. Z Geburtshilfe Perinatol 1988;192:91-5;

38. Raghupathy R, Al-Mutawa E, Al-Azemi M, et al. Progesterone-induced blocking factor (PIBF) modulates cytokine production by lymphocytes from women with recurrent miscarriage or preterm delivery. J Reprod Immunol 2009;80:91-9;

39. Matsushita E, Matsuda Y, Makino Y, et al. Risk factors associated with preterm delivery in women with pregestational diabetes. J Obstet Gynaecol Res 2008;34:851-7;

40. Ye RW, Li HT, Ma R, et al. Prospective cohort study of pregnancy-induced hypertension and risk of preterm delivery and low birth weight. Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi 2010;44:70-4;

41. Liro M, Gasowski J, Wydra D, et al. Twenty-four-hour and conventional blood pressure components and risk of preterm delivery or neonatal complications in gestational hypertension. Blood Press 2009;18:36-43;

42. Mayer A, Erez O, Novack L, et al. Chronic hypertension is an independent risk factor for preeclampsia and preterm delivery in women with rheumatologic diseases: a population-based study. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2007;133:157-63;

43. Easterling TR, Carr DB, Brateng D, et al. Treatment of hypertension in pregnancy: effect of atenolol on maternal disease, preterm delivery, and fetal growth. Obstet Gynecol 2001;98:427-33;

44. Nordentoft M, Lou HC, Hansen D, et al. Intrauterine growth retardation and premature delivery. The effect of smoking and psychosocial factors. Ugeskr Laeger 1997;159:3393-400;

45. Suska P, Jakubovsky J, Polak S, et al. Premature delivery and placenta. A morphological study. Czech Med 1990;13:193-212;

46. Melamed N, Chen R, Soiberman U, et al. Spontaneous and indicated preterm delivery in pregestational diabetes mellitus: etiology and risk factors. Arch Gynecol Obstet 2008; 278:129-34;

47. Ogunyemi D. Risk factors for acute pulmonary edema in preterm delivery. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2007;133:143-7;

48. Stepanova RN, Abdurakhimova MK, Rasulova Kh A, et al. Risk factors and prognosis in premature labor. Akush Ginekol 1990;12:30-2;

49. Shumway J, O'Campo P, Gielen A, et al. Preterm labor, placental abruption, and premature rupture of membranes in relation to maternal violence or verbal abuse. J Matern Fetal Med 1999;8:76-80;

50. Ip M, Peyman E, Lohsoonthorn V, et al. A case-control study of preterm delivery risk factors according to clinical subtypes and severity. J Obstet Gynaecol Res 2010;36:34-44;

51. Mazza A, Diversi F. Premature labor in the grand multipara. Clin Ostet Ginecol 1962;17:319-27;

52. Michalkiewicz W, Pisarski T, Woźnica A, et al. Medico-social aspects of prematurity. I. Socioeconomic position of the parents versus the incidence of premature labor. Ginekol Pol 1980;51: 605-12;

53. Kasznia-Kocot J. Cigarette smoking as a risk factor of premature labor. Wiad Lek 1992;45:490-3;

PL 237 304 B1

54. Kayemba-Kay's S, Ribrault A. Maternal smoking during pregnancy and fetal growth. Effects in preterm infants of gestational age less than 33 weeks. Swiss Med Wkly 2010;140:13139;

55. Dunn PM. Smoking and premature delivery. Lancet 1986;1:1494;

56. Nordentoft M, Lou HC, Hansen D, et al. Intrauterine growth retardation and premature delivery. The effect of smoking and psychosocial factors. Ugeskr Laeger 1997;159:3393-400;

57. Wisborg K, Henriksen TB. Is smoking during pregnancy a cause of premature delivery? Ugeskr Laeger 1995;157:6707-12;

58. Becker-Christensen FG. Alcohol and risk of preterm labor. Ugeskr Laeger 2001;163: 5692;

59. Żak L, Kornacka M, Szpakowska-Rzymska I et al. Evaluation of children with bronchopulmonary dysplasia. Czwarte Francusko-Polskie Spotkania Pediatryczne. Zbiór referatów i doniesień. Warszawa, 1995:201-204;

60. Makowiec-Dabrowska T, Radwan-Wlodarczyk Z, Kozada-Wlodarczyk W, et al. Relationship between chemical exposure in the workplace and the risk of premature delivery, low birth weight and intrauterine growth retardation. Int Arch Occup Environ Health 1998;71:64-9;

61. Biernacka JB, Hanke W, Makowiec-Dabrowska T, et al. Occupation-related psychosocial factors in pregnancy and risk of preterm delivery. Med Pr 2007;58:205-14;

62. Lettieri L, Vintzileos A, Albini M, et al. Does 'idiopatic' pre- term labor exist? 12th Annual SPO Meeting. No. 313. AM J Obstet Gynecol 1992;166:363-368;

63. McLean M, Bisits A, Davies J, et al. A placental clock con-trolling the length of human pregnancy. Nat Med 1995;1:460-463;

64. Ellis M, Livesey J, Inder W, et al. Plasma corticotropin-releas-ing hormone and unconjugated estriol in human pregnancy: gestational patterns and ability to predict preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 2002;186:,94-99;

65. Smith R. Parturition. N Engl J Med 2007;356:271-283;

66. Houben M L, Nikkeis PG, van Bleek G M, et al. The association between intrauterine inflammation and spontaneous vaginal delivery at term: a cross-sectional study. PLoS One 2009;4: 6572-573;

67. Laudanski P, Pierzynski P, Laudanski T. Reductionist and system approaches to study the role of infection in preterm labor and delivery. BMC Pregnancy Childbirth 2007;7:9-10;

68. Raba G, Kotarski J. Evaluation of selected morphological markers of inflammation in afterbirth from idiopathic premature labors. Ginekol Pol 2010;81:435-440;

69. Goldenberg RL, Hauth JC, Andrews WW. Intrauterine infection and preterm delivery. N Engl J Med 2000; 342:1500-1507;

70. Romero R, Gonzalez R, Sepulveda W et al, Infection and labor: Microbial invasion of the amniotic cavity in patients with suspected cervical incompetence: Prevbalence and clinical significance. Am J Obstet Gynecol 1992;167:1086-1091;

71. Li L, Kang J, Lei W. Role of Toll-like receptor 4 in inflammation-induced preterm delivery. Mol Hum Reprod 2010;16:267-272;

72. Siegel JD, Mc Eracken H. Sepsis neonatorum. N Engl J Med. 1981;304:642-648;

73. Chmielnicka-Kopaczyk M, Gabryel P, Jasiński P. Analiza Umieralności Płodów i Noworodków. Kliniczna Perinatologia i Ginekologia. Słomko, Gadzinowski red. Poznań 1993,4:417-427;

74. Keelan JA, Coleman M, Mitchell MD. The molecular mechanisms of term and preterm labor: recent progress and clinical implications. Clin Obstet Gynecol 1997;40:460-478;

75. Hirsch E, Wang H. The molecular pathophysiology of bacterially induced preterm labor: insights from the murine model. J Soc Gynecol Investig 2005;12:145-155;

76. Arai K, Lee F, Miyajima A, et al. Ctykinesxoordinators of inflammatory responses. Ann Rev Inc 1990;59:783-836;

77. Bonnet D, Cesaire R, Lemoine F, et al. The tetrapeptide AcSDKP, an inhibitor of the cell-cycle status for normal human hematopoietic progenitors, has no effect on leukemic cells. Exp Hematol 1992;20:251-255;

78. Robak T. Biologia i farmakologia cytokin. Wydawnictwo Naukowe PWN 1995:13-22;

79. Bertolini D R, Nedwin GE, Bringman TS, et al. Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumour necrosis factors. Nature 1986;319:516-518;

80. Flier JS, Underhill LH. Cytokine receptors In congenital hematopoetic disease. N Engl J Med 1994;330:839-846;

PL 237 304 B1

81. Enkin M, Keirse MJ, Renfrew M, et al. A guide to effective care in pregnancy and childbirtch. Oxford University Press. 1995: 22-27;

82. Lamom RF, Fisk N. The role of infection in the pathogenesis of preterm labour. In: Studd J (ed). Progress in obstetrics and gynaecology. Rdinburgh, Churchill Livingstone 1995;10:135-158;

83. Creasy RK. Preterm labour and delivery. In: Creasy KC. Resnik R (eds). Maternal-fetal medicine, principles and practice. 3rd edn. WB Saunders. 1994:494-520;

84. Donders GG, Van Calsteren K. Predictive value for preterm birth of abnormal vaginal flora, bacterial vaginosis and aerobic vaginitis during the first trimester of pregnancy. BJOG 2009;116:1315-24;

85. Vigeh M, Yokoyama K, Seyedaghamiri Z, et al. Blood lead at currently acceptable levels may cause preterm labour. Occup Environ Med 2010; DOI oem.2009.050419 [pii]

10.1136/oem.2009.050419;

86. Edovitsky E, Lerner I, Zcharia E, et al. Role of endothelial heparanase in delayed-type hypersensitivity. Blood 2006;107:3609-3616;

87. Nan N, Elkin M, Vlodavsky I. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. Int J Biochem Cell Biol 2006;38:2018-2039;

88. Vestweber D. VE-cadherin: the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formation. Arterioscler Thromb Vase Biol 2008;28:223-232;

89. Muller WA. Mechanisms of transendothelial migration of leukocytes. Circ Res 2009;105:223-230;

90. Nicholson IC. CD62L (L-selectin). J Biol Regul Homeost Agents 2003;16:144-6;

91. Kittipatarin C, Li W, Durum SK, et al. Cdc25A-driven proliferation regulates CD62L levels and lymphocyte movement in response to interleukin-7.Exp Hematol 2010;38:1143-56;

92. Juelke K, Killig M, Luetke-Eversloh M, et al. CD62L expression identifies a unique subset of polyfunctional CD56dim NK cells. Blood 2010;116:1299-307;

93. Dixon GL, Heyderman RS, van der Ley P, et al. High-level endothelial E-selectin (CD62E) cell adhesion molecule expression by a lipopolysaccharide-deficient strain of Neisseria meningitidis despite poor activation of NF-kappaB transcription factor. Clin Exp Immunol 2004;135:85-93;

94. Collins T, Williams A, Johnston Gl, et al. Structure and chromosomal location of the gene for endothelial-leukocyte adhesion molecule 1. J Biol Chem 1991;266:2466-2473;

95. Wu TC. The role of vascular cell adhesion molecule-1 in tumor immune evasion. Cancer Res 2007;67:6003-6006;

96. Newman PJ, Newman DK. Signal transduction pathways mediated by PECAM-1: new roles for an old molecule in platelet and vascular cell biology. Arterioscler Thromb Vase Biol 2004; 23: 953-964;

97. Lyall F, Bulmer JN, Duffie E, et al. Human trophoblast invasion and spiral artery transformation: the role of PECAM-1 in normal pregnancy, preeclampsia, and fetal growth restriction. Am J Pathol 2001;158:1713-21;

98. Bańkowska E, Leibschang M. Usefulness of determination of granulocyte elastase plasma level, c-reactive protein and white blood cell count in prediction in intrauterine infection in pregnant women after PROM. Ginekol Pol 2003;74:1037-43;

99. Sisi T, Li F, Gee H, et al. Cervical ripering mediated by vascular endothell November 1995 Meeting of the Growth Factor Group. London, 1995:25;

100. Lamont RF, Taylor-Robinson D, Wigglesworth JS, et al. The role of mycoplasmas, ure- plasmas and chlamydiae in the genital tract of women presenting in spontaneous early preterm labour. J Med Microbiol 1987; 24:253-257;

101. Bearfield C, Davenport ES, Sivapathasundaram V, et al. Possible association between amniotic fluid micro-organism infection and microflora in the mouth. BJOG: Int J Obstet Gynaecol 2002; 109:527-533;

102. Wenstrom KD, Andrews WW, Hauth JC, et al. Elevated second-trimester amniotic fluid interleukin-6 levels predict preterm delivery. Am J Obstet Gynecol 1998;178:546-550;

103. Correia CT, Coutinho AM. Increased BDNF levels and NTRK2 gene association su- ggest a disruption of BDNF/TrkB signaling in autism. Genes Brain Behav 2008;9:841-8;

104. Van der Horst EH, Frank BT, Chinn L, et al. The growth factor Midkine antagonizmes

VEGF signaling in vitro and in vivo. Neoplasia 2008;10:340-347;

105. Masferrer JL, Leahy KM, Koki AT, et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyc- looxygenase-2 inhibitors. Cancer Res 2000; 60:1306-1311;

PL 237 304 B1

106. Keeley EC, Mehrad B, Strieter RM. Chemokines as mediators of neovascularization,

Arterioscler Thromb Vase Biol 2008; 28:1928-1936;

107. Shin YH, Son KN, Lee GW, et al. Transcriptional regulation of human CC chemokine

CCL15 gene by NF-kappaB and AP-1 elements in PMA-stimulated U937 monocytoid cells. Biochim Biophys Acta 2005; 1732: 38-42;

108. Hwang J, Kim CW, Son KN, et al. Angiogenic activity of human CC chemokine CCL15 in vitro and in vivo. FEBS Lett 2004; 570: 47-51;

109. Irving SG, Zipfel, PF, Balke J. et al. Two inflammatory mediator cytokine genes are closely linked and variably amplified on chromosome 17q. Nucleic Acids Res 1990;18:3261-270;

110. Laudanski P, Lemancewicz A, Pierzynski P, et al. Decreased serum level of ma- crophage inflammatory chemokine-3beta/CCL19 in preterm labor and delivery. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006;124:23-6;

111. Baggiolini M, Dewald B, Moser B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol

1997;15:675-705;

112. Jayaprakasam B, Doddaga S, Wang R, et al. Licorice flavonoids inhibit eotaxin-1 se- cretion by human fetal lung fibroblasts in vitro. J Agric Food Chem 2009;57:820-5;

113. Legier DF, Loetscher M, Roos RS, et al. B cell-attracting chemokine 1, a human CXC chemokine expressed in lymphoid tissues, selectively attracts B lymphocytes via BLR1/CXCR5. J Exp Med 1998;187:655-660;

114. Nhan-Chang CL, Romero R, Kusanovic JP, et al. A role for CXCL13 (BCA-1) in pregnancy and intra- amniotic infection/inflammation. J Matern Fetal Neonatal Med 2008; 21:763-75;

115. Kohidai L, Torok K, lllyes E, et al. Characterization of chemotactic ability of peptides containing N-formyl-methionyl residues in Tetrahymena fMLP as a targeting ligand. Cell Biol Int 2003;27:695-700;

116. Novosyadlyy R, Lelbach A, Sheikh N, et al. Temporal and spatial expression of IGF-I and IGFBP-1 during acute-phase response induced by localized inflammation in rats. Growth Horm IGF Res 2009;19:51-60;

117. Tagore S, Kwek K. Comparative analysis of insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP- 1), placental alpha-microglobulin-1 (PAMG-1) and nitrazine test to diagnose premature rupture of membranes in pregnancy. J Perinat Med 2010;38:609-12;

118. Diehl D, Hessel E, Oesterle D, et al. IGFBP-2 overexpression reduces the appearance of dysplastic aberrant crypt foci and inhibits growth of adenomas in chemically induced colorectal carcinogenesis. Int J Cancer 2009;124:2220-225;

119. Monget P, Mazerbourg S, Delpuech T, et al. Pregnancy-associated plasma protein-A is involved in insulin-like growth factor binding protein-2 (IGFBP-2) proteolytic degradation in bovine and porcine preovulatory follicles: identification of cleavage site and characterization of IGFBP-2 degradation. Biol Reprod 2003;68:77-86;

120. Consuegra-Sanchez L, Fredericks S, Kaski JC, et al. Pregnancy-associated plasma protein A: Has this biomarker crossed the boundary from research to clinical practice? Drug News Perspect 2009;22:341-8;

121. Binder DK, Scharfman HE. Brain-derived neurotrophic factor. Growth Factors 2004;

22:123-31;

122. Gilmore JH, Jarskog LF, Vadlamudi S, et al. Maternal poly l:C exposure during pre- gnancy regulates TNF alpha, BDNF, and NGF expression in neonatal brain and the maternalfetal unit of the rat. J Neuroimmunol 2005;159:106-12;

123. Ahn AA, Muneesh T, Poon CS, et al. The Limits of Reductionism in Medicine: Could

Systems Biology Offer an Alternative? PLOS Medicine 2006;3:208-209;

124. Pierzynski P, Oczeretko E, Laudanski P, et al. New research models and novel signal ana- lysis in studies on preterm labor: A key to progress? BMC Pregnancy Childbirth 2007;7:6-7;

125. Meis PJ, Goldenberg RL, Mercer B. The preterm prediction study: significace of vaginal infections. Am J Obstet Gynecol 1995;173:1231-235;

126. Arntzen KJ, Kjollesdal AM, Halgunset J, et al. IL-1, IL-6, IL-8 and soluble TNF receptors in relation to chrorioamnionitis and premature labor. J Perinat Med 1998; 26:17-26;

127. Goldenberg RL, Goepfert AR, Ramsey PS. Biochemical markers for the prediction of preterm birth. Am J Obstet Gynecol 2005;192:36-46;

PL 237 304 B1

128. Keelan JA, Blumenstein M, Helliwell RJ, et al. Cytokines, prostaglandins and parturition- a review. Placenta 2003;24:33-46;

129. Gene MR, Witkin SS, Delaney ML. A disproportionate increase IL-1beta over IL-1ra in the cervicovaginal secretions of pregnant women with altered vaginal microflora correlates with preterm birth. Am J Obstet Gynecol 2004;190:1191-197;

130. Papatsonis D N, Van Geijn HP. Nifedipine as a safe and effective tocolytic agent in the treatment of preterm labor. Am J Obstet Gynecol 200;183:513-4;

131. Wollmann HA. Intrauterine growth restriction: definition and etiology. Horm Res

1998;49:16;

132. Tekesin I, Eberhart LH, Schaefer V, et al. Evaluation and validation of a new risk score (CLEOPATRA score) to predict the probability of premature delivery for patients with threatened preterm labor. Ultrasound Obstet Gynecol 2005;26:699-706;

133. Frigole Reixach J. A model of procreation, gender, and marriage: a proposed methodo- logy based on European and Mediterranean ethnography. Rev Int Sociol 1993;6:127-53;

134. Gjerdingen DK. Premature labor, Part I: Risk assessment, etiologie factors, and diagno- sis. J Am Board Fam Pract 1992;5:495-509;

135. Uszynski M, Grabczewski Z. Excessive uterine contractility as a risk factor of premature labor. Ginekol Pol 1982;53:215-9;

136. Uszynski M, Grabczewski Z. Usefulness of the Saling's list for the prediction of risk of premature labor. Ginekol Pol 1982;53:343-7;

137. Wender-Ozegowska E, Zawiejska A, Brązert J. Pregnancy in diabetic women - past and today. Ginekol Pol 2006;77:962-72;

138. Czajka R, Torbę A, Zebielowicz D, et al. Clinical analysis of pregnancy complicated by hypertension in the material of the Department of Obstetrics and Perinatology of the Pomeranian Academy of Medicine. Ginekol Pol 2004;75:361-6;

139. Rogoszewski M, Szuscik P, Grudzień J, et al. Epidemiology of the pregnant women risk groups according to Troszynski's criterion with special regard to risk factors of potentially environmental charakter. Ginekol Pol 2001;72:940-4;

140. Omanwa K, Zimmer M, Tlolka J, et al. Is low pre-pregnancy body mass index a risk factor for preterm birth and low neonatal birth weight? Ginekol Pol 2006;77:618-23;

141. Andersen HF, Freda MC, Damus K, et al. Effectiveness of patient education to reduce preterm delivery among ordinary risk patients. Am J Perinatol 1989;6:214-7;

142. Blumenshine PM, Egerter SA, ubet ML, et al. Father's Education: An Independent Mar- ker of Risk for Preterm Birth. Matern Child Health J. 2010; DOI 10.1007/sl0995-009-0559-x;

143. Chalermchockcharoenkit A, Rattanachaiyanont M, Kongjeera A, et al. Two different tre- atment regimens in women with preterm contractions who were admitted to a hospital due to a presumptive diagnosis of preterm labor: an observational study. J Obstet Gynaecol Res 2008; 34:343-9;

144. Hanke W, Sobala W, Kalinka J. The effect of environmental tobacco smoke on birthwe- ight: a prospective study employing biomarkers of exposure. Ginekol Pol 2000;71:833-6;

145. Gopichandran V, Luke DM, Vinodhini, R, et al. Psycho-socio-economic stress as a risk factor for preterm labour: a community-based, case-control study from rural South India. Natl Med J India 2010;23:184-185;

146. Gleicher N, Weghofer A. Why depression is associated with increased risk towards pre- mature labor. Hum Reprod 2009;24:760-1;

147. Swingle HM, Colaizy TT, Zimmerman MB, et al. Abortion and the risk of subsequent preterm birth: a systematic review with meta-analyses. J Reprod Med 2009;54:95-108;

148. Jerzak M. Immunological aspects of recurrent spontaneous abortion. Ginekol Pol

2000;71:427-34;

149. Cammu H, Goossens A, Derde M P, et al. C-reactive protein in preterm labour: association with outcome of tocolysis and placental histology. Br J Obstet Gynaecol 1989; 96: 314-319;

150. Skjaerbaek C, Frystyk J, Orskov H, et al. Free IGF-I, IGFBP-1, and the binary complex of IGFBP-1 and IGF-I are increased during human pregnancy. Horm Res 2004;62:215-220;

151. Gravett MG, Novy MJ, Rosenfeld RG, et al. Diagnosis of intra-amniotic infection by pro- teomic profiling and identification of novel biomarkers. JAMA 2004;292:462-469;

PL 237 304 B1

152. Ruetschi U, Rosen A, Karlsson G, et al. Proteomic analysis using protein chips to detect biomarkers in cervical and amniotic fluid in women with intra-amniotic inflammation. J Proteome Res 2005;4:2236-242;

153. Buhimschi IA, Buhimschi CS, Weiner CP, et al. Proteomic but not enzyme-linked immu- nosorbent assay technology detects amniotic fluid monomeric calgranulins from their complexed calprotectin form. Clin Diagn Lab Immunol 2005;12:837-844;

154. Buhimschi CS, Weiner CP, Buhimschi IA. Proteomics, Part II: The emerging role of proteo- mics over genomics in spontaneous preterm labor/birth. Obstet Gynecol Surv 2006; 61:543-553;

155. Urban R, Lemancewicz A, Urban J, et al. Evaluation of serum slCAM-1 and sVCAM-1 concentration in patient at risk of preterm delivery. Ginekol Pol 2003;74:1325-8;

156. Garcia-Velasco JA, Arici A. Chemokines and human reproduction. Fertil Steril

1999;71:983-993;

157. Keelan JA, Blumenstein M, Helliwell RJ, et al. Cytokines, prostaglandins and parturi- tion - a review. Placenta 2003;24:33-46;

158. Marvin KW, Keelan JA, Eykholt RL, et al. Use of cDNA arrays to generate differential expression profiles for inflammatory genes in human gestational membranes delivered at term and preterm. Mol Hum Reprod 2002;8:399-408;

159. Tromp G, Kuivaniemi H, Romero R, et al. Genome-wide expression profiling of fetal membranes reveals a deficient expression of proteinase inhibitor 3 in premature rupture of membranes. Am J Obstet Gynecol 2004;191:1331-338;

160. Bolt LA, Chandiramani M, De Greeff A, et al. Does fetal fibronectin testing change pa- tient management in women at risk of preterm labour? Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;146:180-183;

161. Mendoza LG, McQuary P, Mongan A, et al. High-throughput microarray - based en- zyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Biotechniques 1999;27:778-88;

162. Schweitzer B, Wiltshire S, Lambert J, et al. Inaugural article: immunoassays with rolling circle DNA amplification-a versatile platform for ultrasensitive antigen detection. PNAS USA 2000; 97:10113-119;

163. Moody MD, Van-Arsdell SW, Murphy KP, et al. Array-based ELISAs for high-throughput analysis of human cytokines. Biotechniques 2001;31:186-90;

164. Jarjoura K, Devine PC, Perez-Delboy A, et al. Markers of periodontal infection and pre- term birth. Am J Obstet Gynecol 2005;192: 513-519;

165. Sendag F, Itil IM, Terek MC, et al. The changes of circulating lymphocyte sub-popula- tions in women with preterm labour: a casecontrolled study. Aust NZ J Obstet Gynaecol 2002;42:359-362;

166. Simhan HN, Caritis SN, Krohn MA, et al. Decreased cervical proinflammatory cytokines permit subsequent upper genital tract infection during pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2003;189:560-567;

167. Romero R, Oyarzum E, Mazor M. et al. Meta-analysis of the relationship between asymp- tomatic bacteriuria and preterm delivery/low birth weight. Obstet Gynecol 1989;169:576-582;

168. Morales R, Schorr S, Albritton J. Effect of metronidazole in patients with pretenn birth in preceding pregnancy and bacterial vaginosis: a placebo-controlled double-blind study. Am JU Obstet Gynecol 1994;171:345-349;

169. Ahn AC, Tewari M, Poon CS, et al. The limits of reductionism in medicine: could systems biology offer an alternative? PLoS Med 2006;3:208-213;

170. Gene MR, Witkin SS, Delaney ML. A disproportionate increase In IL-1beta over IL-1ra in the cervicovaginal secretions of pregnant women with altered vaginal microflora correlates with preterm birth. Am J Obstet Gynecol 2004;190:1191-197;

171. Dizon-Townson D S. Preterm labour and delivery: a genetic predisposition. Paediatr

Perinat Epidemiol 2001;15:57-62;

172. Hagberg H, Mallard C, Jacobsson B. Role of cytokines in Praterm labour and brain injury. Br J Obstet Gynecol 2005;112:16-8;

173. Griesmaier E, Schlager G, Wegleiter K, et al. Role of p75(NTR) in NMDAR-mediated excitotoxic brain injury in neonatal mice. Brain Res 2010;1355:31-40;

PL 237 304 B1

174. Kim CH, Peius LM, Appelbaum E, et al. CCR7 ligands, SLC/6Ckine/ Exodus 2/TCA4 and CKb-11/MIP-3b/ELC, are chemoattractants for CD56+CD16, NK cells and late stage lymphoid progenitors. Cell Immunol 1999;193:226-235;

175. Ishikawa S. Aberrant high expression of B lymphocyte chemoattractant (BLC/CXCL13) in a murine model for SLE. Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002;47:2369-374;

176. Winsor G L, Waterhouse CC, MacLellan RL, et al. Interleukin-4 and IFN-gamma diffe- rentially stimulate macrophage chemoattractant protein-1 (MCP-1) and eotaxin production by intestinal epithelial cells. J Interferon Cytokine Res 2000;20:299-308;

177. Kim CH, Pelus LM, White JR, et al. CK b-11/macrophage inflammatory protein-3b/EBI1- ligand chemokine is an efficacious chemoattractant for T and B cells. J Immunol 1998;160: 2418-424;

178. Waksmanski B, Dudkiewicz J, Dąbrowski S. Function of insulin-like growth factor (IGF-

I) and its binding protein (IGFBP-1) in pathological proliferation of endometrium. Wiad Lek 2001; 54:656-661;

179. Zhang J, Lathbury LJ, Salamonsen LA. Expression of the chemokine eotaxin and its receptor, CCR3, in human endometrium. Biol Reprod 2000;62:404-411;

180. Kalinka J, Bitner A. Selected cytokine gene polymorphisms and the risk of preterm de- livery in the population of Polish women. Ginekol Pol 2009;80:111-7;

181. Bręborowicz GH, Czajkowski K, Dębski R i wsp. Rekomendacje dotyczące profilaktyki, diagnostyki i postępowania w zagrażającym porodzie przedwczesnym. Ginekol Dypl; 2008,2:101-103.

Claims (9)

1. Zastosowanie in vitro markerów biochemicznych BLC, IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP3b oraz VCAM-1 do diagnozowania porodu przedwczesnego u kobiety ciężarnej z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego obejmujące określenie kolejno stężenia w surowicy krwi kobiety ciężarnej z objawami zagrażającego porodu przedwczesnego biomarkeru BLC, a następnie stężeń jednego lub więcej z biomarkerów IGFBP-1, BDNF, MIP-1d, ICAM-1, MIP3b oraz VCAM-1.

2. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że rozpoczyna się od oznaczenia stężenia w surowicy krwi markera BLC, gdzie uzyskany wynik BLC > 42,27 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni, a stężenie w surowicy krwi BLC < 42,27 pg/ml wymaga dalszego oznaczenia stężenia markera IGFBP-1.

3. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml wynik stężenia IGFBP-1 > 18,37 pg/ml wymaga następowego oznaczenia stężenia markera MIP-1d, gdzie otrzymana wartość MIP-1d < 31,25 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni.

4. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 > 18,37 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia MIP1d > 31,25 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.

5. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27, stężeniu IGFBP -1 < 18,37 pg/ml, należy oznaczyć stężenie markera BDNF, uzyskany wynik stężenia BDNF > 46,70 pg/ml wymaga dalszego oznaczenia stężenia markera MIP-3b, uzyskany w takim wariancie wynik stężenia MIP-3b < 68,19 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

6. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF > 46,70 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia MIP-3b > 68,19 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.

7. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, należy oznaczyć stężenie markera ICAM-1, a uzyskany w takim wariancie wynik stężenia ICAM-

PL 237 304 B1

1 < 27,97 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

8. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, stężeniu ICAM-1 > 27,97 pg/ml, należy oznaczyć marker VCAM-1, a uzyskany w takim wariancie wynik stężenia VCAM-1 > 53,53 pg/ml wskazuje na realne zagrożenie wystąpienia porodu przedwczesnnego w czasie do 14 dni.

9. Zastosowanie markerów biochemicznych według zastrz. 1, znamienne tym, że przy stężeniu BLC < 42,27 pg/ml, stężeniu IGFBP-1 < 18,37 pg/ml, stężeniu BDNF < 46,70 pg/ml, stężeniu ICAM-1 > 27,97 pg/ml, wartość oznaczonego stężenia VCAM-1 < 53,53 pg/ml wskazuje na niskie prawdopodobieństwo wystąpienia porodu przedwczesnego w czasie do 14 dni - poród przedwczesny fałszywy.