PL237102B1 - Sposób wzmacniania skuteczności działania przeciwgrzybicznego flukonazolu i kompozycja farmaceutyczna o działaniu przeciwgrzybicznym - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wzmacniania skuteczności działania przeciwgrzybicznego flukonazolu i kompozycja farmaceutyczna o działaniu przeciwgrzybicznym.

Ze zgłoszenia patentowego P. 415060 znana jest kompozycja farmaceutyczna o działaniu przeciwgrzybiczym zawierająca jako składniki aktywne co najmniej jeden styrylochinolinowy inhibitor pomp wyrzutu, wybrany spośród: 2-[2-(3-hydroksyfenylo)winylo]-8-hydroksychinolina, 2-[2-(2-hydroksyfenylo)winylo]-8-hydroksychinolina, 2-[2-(3-acetoksyfenylo)winylo]-8-hydroksychinolina lub korzystnie, 2-[2-(2-acetoksyfenylo)winylo]-8-hydroksychinolina, oraz co najmniej jeden lek z grupy azoli wybrany spośród: itrakonazol, ketokonazol, worikonazol, klotrimazol lub korzystnie flukonazol, przy czym stosunek leku do inhibitora mieści się w przedziale od 1-100 do 1-1, korzystnie 1-4. Kompozycja jest skuteczna jako środek działający przeciwgrzybicznie, zwłaszcza wobec szczepu Candida albicans.

Znana jest też ze zgłoszenia patentowego P.333282 kombinacja do terapii przeciwgrzybiczej składająca się ze znanego środka przeciwgrzybiczego, takiego jak azole lub polieny oraz środka przeciwgrzybiczego pochodnej pneumokandyny. Wynalazek dotyczy terapii przeciwgrzybiczej, obejmującej stosowanie azoli, takich jak flukonazol, vorikonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol, ER30346, SCH56592; polienów takich jak amfoterycyna B, nystatyna lub ich formy liposomowe i lipidowe, takie jak Abelcet, AmBisome i Amphocil; purynowych lub pirymidynowych inhibitorów nukleotydowych takich jak flucytozyna lub polioksyn takich jak nikomycyny, zwłaszcza nikomycyna Z lub innych inhibitorów chityny, inhibitorów czynnika elongacji, takich jak sordarin i jego analogi, inhibitorów mannanu, takich jak predamycyna, produktów białkowych bakteriobójczych/indukujących przenikalność, takich jak XMP.97 lub ΧΜΡ.127 lub złożonych węglowodanowych środków przeciwgrzybiczych, takich jak CAN296, w kombinacji z pochodną pneumokandyny.

Najczęściej w leczeniu ostrej infekcji drożdżakowej stosuje się antybiotyki polienowe lub azole. Azole wykazują wysoką aktywność grzybobójczą, a flukonazol należy do trzeciej generacji leków tej grupy. Należy podkreślić, że flukonazol uważany jest za jeden z najbardziej skutecznych leków przeciwgrzybiczych, jednakże mimo tego pojawiają się doniesienia wskazujące na rosnącą częstotliwość izolowanych szczepów opornych. Jest to powód uzasadniający poszukiwanie substancji mogących wzmocnić jego działanie terapeutyczne. In vitro flukonazol wykazuje działanie przeciwgrzybicze na najbardziej powszechne klinicznie szczepy Candida (w tym C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis). Grupa pochodnych triazolowych, do których przynależy flukonazol, charakteryzuje się mniejszą hepatotoksycznością (uszkodzenia wątroby) niż pochodne imidazolu (np. klotrimazol, mikonazol). Po podaniu doustnym flukonazol dobrze się wchłania, a stężenia w osoczu (i ogólna biodostępność) osiągają ponad 90% wartości stężeń występujących po podaniu dożylnym (Martin M.V. The use of fluconazole and itraconazole in the treatment of Candida albicans infections: a review. J. Antimicrob. Chemother. 1999, 44: 429-37).

Działanie przeciwgrzybicze flukonazolu jest ściśle związane z budową ściany komórkowej grzyba. Pod kilkuwarstwową ścianą komórkową, składającą się z mannoprotein i β-glukanu przeplatanego chityną, znajduje się błona komórkowa zbudowana z ergosterolu, lipidowego składnika analogicznego do cholesterolu komórek zwierzęcych (Garbusińska A., Mertas A., Król W. The antifungal activity of fluconazole against clinical Candida albicans strains and other Candida spp. - the review of the research in vitro carried out in various medical centres Ann. Acad. Med. Siles., 2011,65: 29-37). Rodzaj Candida wykształcił szereg mechanizmów odporności na azole przeciwgrzybicze. Szczepy grzybów, które wykształciły jeden lub więcej z tych mechanizmów oporności, charakteryzują się dużym MIC (Minimal Inhibitory Concentration) flukonazolu, co ma wpływ na skuteczność in vitro, in vivo oraz skuteczność kliniczną (Pfaller M.A., Diekema D.J., Sheehan D.J. Interpretive breakpoints for fluconazole and Candida revisited: a blueprint for the future of antifungal susceptibility testing. Clin. Microbiol. Rev., 2006, 19: 435-47. Z literatury wynika, że przy zwalczaniu zakażeń grzybiczych, w szczególności kandydoz skuteczną alternatywą dla antybiotyków mogą być lawendowe olejki eteryczne (Behmanesh F., Pasha H., Sefidgar A. A., et al. Comparison of the effect of Lavender and Clotrimazole on the growth of the standard strains of Candida albicans, an in vitro study. Journal of Babol University of Medical Sciences. 2010, 32, 2: 26-31).

W czasie badań nad oddziaływaniem olejków lawendowych z Lavandula angustifolia a flukonazolem, nieoczekiwanie okazało się, że charakteryzują się one oddziaływaniem synergistycznym z antybiotykiem wobec szczepów Candida albicans, w przeciwieństwie do innych olejków takich jak np. olejek eteryczny z oregano, eukaliptusa czy szałwii lekarskiej.

PL 237 102 B1

Sposób wzmacniania skuteczności działania przeciwgrzybicznego flukonazolu, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że flukonazol stosuje się z olejkiem eterycznym z lawendy lekarskiej (Lavandula angustifolia), przy czym ilość olejku eterycznego wynosi od 0,125 do 0,625% objętościowy na 2000 μο/ml flukonazolu.

Kompozycja farmaceutyczna o działaniu przeciwgrzybicznym, według wynalazku, zawierająca flukonazol, charakteryzuje się tym, że zawiera olejek eteryczny z lawendy lekarskiej (Lavandula angustifolia ) w ilości od 0,125 do 0,625% objętościowy na 2000 μο/ml flukonazolu.

Przeprowadzone badania potwierdzają, że olejki eteryczne z lawendy mogą znacznie wzmocnić działanie flukonazolu przeciw grzybom Candida albicans, a zatem stosowanie kompozycji olejków eterycznych z lawendy razem z flukonazolem może stanowić skuteczną terapię zakażeń Candida albicans.

Dla celów niniejszego wynalazku określono aktywność przeciwgrzybiczą flukonazolu i olejków eterycznych z kwiatów i ulistnionych łodyg różnych odmian lawendy lekarskiej (Lavandula angustifolia). Zastosowano metodę wyznaczenia minimalnego stężenia hamującego (MIC - Minimal Inhibitory Concentration), którą definiuje się jako najmniejsze stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego całkowicie hamującego wzrost drobnoustrojów. Badanie oddziaływania flukonazolu z olejkami lawendowymi przeprowadzono metodą szachownicy (ang. checkerboard'). W celu oceny charakteru oddziaływania kombinacji flukonazol/ olejek eteryczny z lawendy (Lavandula angustifolia) na szczep Candida albicans, na bazie ostatecznej wersji szachownicy (MIC z uwzględnieniem MFC - Minimal Fungicidal Concentration) dla każdej kombinacji wyliczono współczynnik FIC (ang. Fractional Inhibitory Concentration), a następnie ich sumę - ZFIC zgodnie z procedurą opisaną przez Van Vuuren i Viljoen (van Vuuren S., Viljoen A. Plant-based antimicrobial studies. Methods and approaches to study the interaction between natural products. Planta Med. 2011,77: 1168-1182).

W kontekście niniejszego wynalazku określenie „aktywność przeciwgrzybicza” oznaczało, że występuje działanie grzybobójcze i/lub grzybostatyczne.

Sposób wzmacniania działania flukonazolu opisano szczegółowo w przykładach wykonania, przy czym przykład pierwszy potwierdza występowanie synergizmu działania w połączeniu olejków eterycznych z lawendy oraz flukonazolu dla Candida albicans, zaś przykład 2 potwierdza brak synergizmu działania w połączeniu innych olejków eterycznych oraz flukonazolu dla Candida albicans.

Badania prowadzono z wykorzystaniem szczepu wzorcowego Candida albicans.

P r z y k ł a d 1

Do testowania wrażliwości na flukonazol i olejki eteryczne wybrano szczep pochodzący z uznanej kolekcji American Type Culture Collection (ATCC). Grzyby drożdżopodobne Candida albicans posiano powierzchniowo na pożywkę Sabouraud z chloramfenikolem. Po 72 h oceniano czystość posiewu i cechy charakterystyczne wzrostu kolonii. Dla każdego mikroorganizmu, kolonię o najlepszych cechach przeniesiono jednorazową jałową elą plastikową do fiolki z zestawu do archiwizacji szczepów składającej się z nośnika - koralików i płynu konserwującego. Mikroorganizm osadzony zostaje wewnątrz mikrozagłębień koralika, a skład płynu zapewnia żywotność szczepu do 2 lat w temperaturze < -20°C. Fiolka taka stanowiła bazę do kolejnych rozsiewów danego szczepu na przestrzeni czasu, stanowiąc szczep macierzysty (tj. jednakowe klony) z którego rozsiewano kolejno świeże szczepy robocze na potrzeby analiz. Z 24 godzinnej hodowli szczepu roboczego (inkubacja w monitorowanej temperaturze 37±1°C) pobierano jednorazową jałową ezą plastikową (oczko 1 μl) 2:5 typowych kolonii i zawieszano w izotonicznym sterylnym 0,9% roztworze NaCl i mierzono gęstość optyczną na densytometrze (odchylenie pomiaru ± 0,1 w przedziale 0,00 : 3,00 w skali McFarland’a) doprowadzając do zmętnienia równego 0,5 MF, co odpowiada przeciętnej ilości 1,5 x 10⁸ JTK/ml. Następnie przenoszono 1 ml tej zawiesiny do 9 ml soli fizjologicznej, uzyskując kolejne rozcieńczenie o ilości komórek 10⁷ JTK/ml. Powtarzając tę czynność otrzymano końcowe rozcieńczenie, które zawierało około 106 JTK/ml. Stanowiło ono wyjściowe rozcieńczenie dla wszystkich badań.

W doświadczeniu wykonano indywidualny MIC dla antybiotyku i olejków eterycznych z lawendy przy użyciu metody mikrorozcieńczeń w pożywce płynnej (bulionie). Postępowano zgodnie z zaleceniami CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). Całość oznaczeń wykonano na indywidualnie pakowanych dzielonych sterylnych 96-studzienkowych polistyrenowych płytkach titracyjnych o płaskim dnie. Dzielenie horyzontalne płytki (4 x 24 studzienek) pozwoliło na wykonanie do czterech niezależnych powtórzeń (tj. odrębne rozcieńczenia), co umożliwiło wyznaczenie właściwego indywidualnego MIC. Dla flukonazolu wykonano serię rozcieńczeń dwukrotnych w zakresie od 0,002:2 mg/ml w DMSO. Dla badanych próbek wykonano gradient stężenia olejków eterycznych rozpuszczonych w DMSO w zakresie 0,008:5% v/v. Następnie do każdej studzienki dodano 0,005 μl zawiesiny bakteryjnej na każde 100 μl

PL 237 102 B1 zawartości studzienki. Dodatkowo na końcu każdej serii wykonano po jednej kontroli negatywnej (czysty bulion hodowlany) i pozytywnej (bulion z dodatkiem 0,005 μΙ zawiesiny bakteryjnej/100 μl zawartości studzienki). Płytkę titracyjną nakrywano pokrywką, całość zabezpieczano w workach foliowych strunowych z niewielkim stałym dostępem tlenu i inkubowano w cieplarce w temperaturze +37,0±1 °C przez 72 h. Po zakończeniu inkubacji każdą płytkę titracyjną (indywidualne MIC lub w układzie szachownicy) delikatnie potrząsano w celu równomiernego rozłożenia się zmętnienia w tych studzienkach, gdzie nastąpił wzrost mikroorganizmów. Płytkę odczytywano w czytniku mikropłytek (zakres absorbancji 0:4,000) z użyciem oprogramowania xChekPlus firmy IDEXX. Wynikiem był odczyt i zapis absorbancji poszczególnych studzienek płytki przy zastosowanym filtrze, o długości fali 650 nm. Poziom absorbancji był wprost proporcjonalny do stopnia zmętnienia bulionu w studzience przy braku reakcji barwnych. Im wyższy stopień zmętnienia, tym większa była końcowa ilość drobnoustrojów po namnożeniu. W celu potwierdzenia, że testowany antybiotyk i/lub olejki eteryczne efektywnie zabijały komórki Candida albicans wyznaczono wskaźnik minimalnego stężenia grzybobójczego (MFC, ang. Minimal Fungicidal Concentration). Wskaźnik wyznaczono na podstawie najniższego stężenia antybiotyku i/lub olejków lawendowych, przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów. W tym celu cała zawartość studzienek z obszarów granicznych (tj. określony wizualnie punkt MIC ± 3 rozcieńczenia) została indywidualnie posiana powierzchniowo na pożywkę o dobrych właściwościach wzrostowych i odzysku kolonii: TSA. Materiał delikatnie rozprowadzano jednorazową sterylną głaszczką po powierzchni agarowej, pozostawiono na 20 minut w celu wyschnięcia, po czym płytki odwracano i inkubowano w cieplarce w monitorowanej temperaturze 37±1°C przez 72 h. Przy założeniu, że zawiesiną roboczą 106 JTK/ml drobnoustrojów inokulowano studzienkę w ilości 1/20 całkowitej objętości mieszaniny w studzience (tj. 5 lub 10 μl), w momencie rozpoczęcia inkubacji w każdej studzience znajdowało się około 5,0 ± 0,3 x 104 JTK komórek drobnoustrojów. Przy efektywnym działaniu antybiotyku i/lub olejków eterycznych po zakończonej inkubacji w punkcie MFC notowano nie więcej niż 5,0 x 10² JTK/studzienkę płytki titracyjnej. Wynik posiewu spełniający to kryterium dawał podstawy do potwierdzenia punktu MIC w zgodzie z MFC.

W celu oceny charakteru oddziaływania kombinacji flukonazol / olejek eteryczny z lawendy (Lavandula angustifolia) wobec Candida albicans, na bazie ostatecznej wersji szachownicy (MIC z uwzględnieniem MFC) dla każdej kombinacji wyliczono współczynnik FIC (ang. Fractional Inhibitory Concentration), a następnie ich sumę - ZFIC zgodnie z procedurą opisaną przez van Vuuren i Viljoen (van Vuuren S., Viljoen A. Plant-based antimicrobial studies. Methods and approaches to study the interaction between natural products. Planta Med. 2011, 77: 1168-182). Przyjęto następujące kryteria oceny wyników (ESCMID Eucast Definitive Document 1.2, 2000):

ZFIC < 0,5 oznacza wystąpienie silnego pozytywnego oddziaływania synergistycznego;

0,5 < ZFIC < 1,0 oznacza słabsze ale również pozytywne oddziaływanie addytywne;

1,0 < ZFIC < 2,0 to brak oddziaływania (neutralne);

ZFIC > 2,0 to niekorzystne oddziaływanie antagonistyczne.

W tabeli 1 przedstawiono wartości ZFIC w zestawieniach olejków eterycznych z lawendy i flukonazolu względem Candida albicans.

PL237 102 Β1

Stwierdzono występowanie synergizmu w każdej możliwej kombinacji dla Candida albicansw połączeniu olejków eterycznych z lawendy oraz flukonazolu.

Wartość ZFIC mieści się w przedziale od 0,129 do 0,403.

Przykład 2

Oznaczenie aktywności i oddziaływanie flukonazolu z olejkami eterycznymi przygotowano jak w przykładzie 1. Pozostałe warunki bez zmian. Zamiast olejków eterycznych z lawendy zastosowano olejki eteryczne z innych roślin.

W tabeli 2 przedstawiono wartości ZFIC w zestawieniach olejków eterycznych z różnych roślin i flukonazolu względem Candida albicans.

PL237 102 Β1

Nie stwierdzono występowania synergizmu działania antybiotyku z olejkami eterycznymi (wzmacniania działania flukonazolu). Wartość ZFIC mieściła się w przedziale od 1,083 (efekt neutralny) do 2,200 (efekt antagonistyczny).

Claims (2)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wzmacniania skuteczności działania przeciwgrzybicznego flukonazolu, znamienny tym, że flukonazol stosuje się z olejkiem eterycznym z lawendy lekarskiej (Lavandula angustifolia), przy czym ilość olejku eterycznego wynosi od 0,125 do 0,625% objętościowy na 2000 μg/ml flukonazolu.
2. 2. Kompozycja farmaceutyczna o działaniu przeciwgrzybieżnym zawierająca flukonazol, znamienna tym, że zawiera olejek eteryczny z lawendy lekarskiej (Lavandula angustifolia) w ilości od 0,125 do 0,625% objętościowy na 2000 μg/ml flukonazolu.