PL236893B1 - Kompozycja ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców wybranych roślin leczniczych i jej zastosowanie - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców wybranych roślin z rodzaju Prunus sp., Crataegus sp., Sorbus sp., Euonymus sp. oraz jej zastosowanie.

Jedną z głównych przyczyn przedwczesnych zgonów u ludzi są choroby nowotworowe. Według danych epidemiologicznych Polskiej Unii Onkologii do roku 2020 dojdzie do podwojenia liczby nowych zachorowań na nowotwory w Polsce oraz 70% wzrostu liczby zgonów z powodu nowotworów i ich powikłań, a zgodnie z prognozami brytyjskich naukowców, nowotwór zostanie zdiagnozowany u co drugiej osoby urodzonej po 1960 roku. Mimo rozwoju biologii molekularnej i biotechnologii farmaceutycznej wciąż nie udaje się stworzyć skutecznych uniwersalnych terapii przeciwnowotworowych. Oprócz prób wpłynięcia na typowe cechy komórki nowotworowej, takie jak adhezja (odziaływanie z komórkami i substancją zewnątrzkomórkową), metastaza (migracja, przerzutowanie), czy intensywna proliferacja (częste podziały), niezbędne staje się zlikwidowanie kolejnej z istotnych przeszkód, zdolności tych komórek do nabywania lekooporności. Jest to obecnie ważny problem terapeutyczny, ponieważ mimo, że medycyna dysponuje wieloma skutecznymi chemioterapeutykami, które są w stanie zabić komórkę, to wysoka aktywność białek lekooporności lekowej uniemożliwia skuteczne dostarczenie takiego leku do wnętrza komórki i jego zadziałanie. Za zjawisko lekooporności odpowiedzialne są białka należące do rodziny ABC, a głównym białkiem jest błonowe białko oporności wielolekowej o symbolu MDR1 (glik oproteina P). Ekspresja genu ABCB1 kodującego białko MDR1 jest silnie aktywowana po wprowadzeniu leku do komórki, co skutkuje zwiększeniem ilości MDR1 i pozwala na szybkie usunięcie terapeutyku z wnętrza komórki. Niestety, znane syntetyczne modulatory aktywności MDR1 cechują się dużą cytotoksycznością i nie mogą być skutecznie stosowane u pacjentów.

Dlatego tak ważne jest poszukiwanie odpowiednich kompozycji opartych o naturalne produkty lecznicze, które jednocześnie:

(i) nie są toksyczne (tzn. są bezpieczne dla prawidłowych komórek, zdrowych);

(ii) są zdolne do uwrażliwienia komórki nowotworowej na stosowane chemioterapeutyki (takie jak doksorubicyna);

(iii) istotnie wpływają na biologię komórek guza, w tym cechy, które są typowe tylko dla komórek nowotworowych, tj. obniżają zdolność tych komórek do proliferacji, adhezji czy migracji.

Dotąd nie opisano produktu leczniczego, który jednocześnie spełniałby powyższe kryteria.

Znane rozwiązania dotyczą jedynie wybranych pojedynczo gatunków roślin leczniczych i dodatkowo dotyczą różnych części roślin a nie mieszanin gatunków roślin leczniczych, jednak nie dotyczą modulowania lekooporności komórek oraz hamowania migracji, adhezji i proliferacji jednocześnie.

W zgłoszeniu międzynarodowym WO9959605A1 ujawniono zastosowanie kompozycji zawierającej ekstrakt alkoholowy z owoców rośliny Crataegus w trakcie leczenia lub profilaktyki chorób nowotworowych.

Dodatkowo, w stanie techniki ze zgłoszenia US20020132021A1 wskazane są właściwości przeciwdrobnoustrojowe i przeciwnowotworowe związków zawartych w roślinach (ale nie w ich owocach), w tym z gatunków Prunus sp, Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus. Zgłoszenie US20020132021A1 ujawnia też sposób wyboru związków mających efekt terapeutyczny, i te związki wymienia się jako zawarte m.in. w Prunus sp., Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus.

Ponadto, w zgłoszeniu US2012225141A1 ujawniono sposób stymulacji ekspresji białek LOX i/lub NRAGE dla modulacji równowagi proliferacji i apoptozy za pomocą kompozycji zawierającej ekstrakt m.in. z owoców Prunus spinosa.

Jednak nierozwiązanym problemem pozostaje brak skutecznych metod modelowania lekooporności komórek - w tym głównie nowotworowych. Dostępne dotąd syntetyczne modulatory MDR1 są po prostu toksyczne i w warunkach in vivo nie spełniają swojej funkcji. Ale problemem są również migracje komórek - ich przerzutowanie - które jest typowe dla guzów złośliwych i mimo usunięcia guza pierwotnego, to właśnie zdolność komórek do migracji i zasiedlania nowych tkanek (do czego potrzebna jest też wysoka adhezja i proliferacja) przez komórkę nowotworową stanowi również istotny problem do rozwiązania.

Wielolekooporność, podwyższona adhezja i proliferacja oraz metastaza są cechami typowymi dla guzów złośliwych, ale nie dla komórek prawidłowych. Komórka zdrowa nie ma takiej charakterystyki.

Żadna publikacja nie opisuje jednak wpływu badanych roślin, osobno ani łącznie, na aktywność genu i białka MDR1 modulującego lekooporność komórek nowotworowych oraz równoczesnego hamowania migracji, adhezji i proliferacji.

PL 236 893 B1

Celem wynalazku jest kompozycja zgodna z powyższą charakterystyką i jej praktyczne zastosowanie w modulowaniu, obniżaniu, poziomu lekooporności w komórkach oraz w hamowaniu: potencjału migracyjnego, adhezji i proliferacji komórek nowotworowych. Kompozycja według wynalazku ma uwrażliwiać komórki nowotworowe na chemioterapeutyki i jednocześnie obniżać zdolność komórek nowotworowych do migracji (przerzutowania), adhezji i podziałów, przy braku cytotoksyczności.

Jedynie połączenie ekstraktów z owoców odpowiednio dobranych roślin zielarskich pozwala uzyskać oczekiwane działanie kompozycji na komórki.

Termin ‘adhezja’ należy tu rozumieć jako cechę komórek nowotworowych, która umożliwia im komunikację pomiędzy sobą (adhezja typu komórka-komórka) oraz odziaływaniem komórek z podłożem/macierzą zewnątrzkomórkową.

Termin ‘proliferacja’ dotyczy szybkości/tempa z jaką komórka nowotworowa jest w stanie się dzielić w zadanym przedziale czasowym i w danych warunkach.

Termin ‘migracja’, ‘metastaza’ czy ‘przerzutowanie’ rozumie się jako zdolność komórek do przemieszczania się i zasiedlania innych tkanek/organów.

Podwyższona adhezja i proliferacja oraz metastaza są typowe dla komórek nowotworów złośliwych.

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców wybranych roślin leczniczych z rodzaju Prunus sp., Crataegus sp., Sorbus sp., Euonymus sp. charakteryzująca się tym, że składa się z ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców roślin wybranych z gatunków Prunus spinosa, Crataegus monogyna, Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus.

Korzystnie stosunek objętościowy ekstraktów alkoholowych w kompozycji odpowiednio wynosi 1:1:1:1. Korzystnie owoce w całości poddaje się procesowi ekstrakcji wybranym alkoholem alifatycznym, przy czym korzystnie alkohol alifatyczny wybrany jest spośród 100% metanolu lub 95% etanolu. Korzystnie 10 g owoców roślin wybranych z gatunków Prunus spinosa, Crataegus monogyna, Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus poddaje się ekstrakcji alkoholem. Korzystnie w ekstrakcji jest stosowany alkohol w ilości 10 ml.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie kompozycji według wynalazku w sposobie wspomagania leczenia chorób nowotworowych.

Przedmiotem wynalazku jest dodatkowo zastosowanie kompozycji w połączeniu z chemioterapeutykami jako bezpiecznego nietoksycznego środka leczniczego.

Przedmiotem wynalazku jest dodatkowo zastosowanie kompozycji do wspomagania terapii guzów lekoopornych. Korzystnie kompozycja jest podawana na 24h przed podaniem chemioterapeutyku. Korzystnie tym chemioterapeutykiem jest doksorubicyna lub inny podawany razem chemioterapeutyk.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładach wykonania na załączonych figurach.

Figura 1 - przedstawia wyniki tzw. testu rany wykonany dla komórek traktowanych kompozycją produktu leczniczego MIX2 oraz komórek traktowanych kontrolą, który pozwala monitorować potencjał migracyjny komórek.

Figura 2 - przedstawia porównanie przeżywalności komórek traktowanych kompozycją produktu leczniczego MIX2 oraz komórek traktowanych kontrolą.

Figura 3 - przedstawia porównanie zdolności do adhezji i proliferacji komórek traktowanych kompozycją produktu leczniczego MIX2 i komórek traktowanych kontrolą.

Figura 4 - przedstawia porównanie zdolności do ekspresji mRNA (transkryptu) i białka MDR1 w komórkach traktowanych kompozycją produktu leczniczego MIX2 oraz w komórkach traktowanych kontrolą.

Figura 5 - przedstawia porównanie przeżywalności komórek traktowanych kontrolą; kompozycją produktu leczniczego MIX2; doksorubicyną (chemioterapeutykiem) oraz kombinacją produktu leczniczego MIX2 i doksorubicyną.

Figura 6 - przedstawia zdjęcia komórek traktowanych kontrolą; kompozycją produktu leczniczego MIX2; doksorubicyną oraz kombinacją produktu leczniczego MIX2 i doksorubicyną.

Figura 7 - przedstawia analizę ekspresji białka MDR1 w komórkach traktowanych doksorubicyną oraz kompozycją produktu leczniczego MIX2 i doksorubicyną.

P r z y k ł a d y

Wszystkie poniżej opisane doświadczenia przeprowadzono w warunkach in vitro na komórkach modelowych linii komórkowych wyprowadzonych z: glejaka (linie: T98G, U118); raka wątroby (linia HepG2); raka tarczycy (linie: TPC1, CGTH-w-1) oraz na komórkach HeLa (linia pierwotnie wyizolowana z raka szyjki macicy). Komórki były hodowane w medium hodowlanym RPMI uzupełnionym 10% FBS, w 37°C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

PL 236 893 B1

We wszystkich przykładach „komórki traktowane MIX2” były traktowane produktem lecznic zym MIX2 w stężeniu 10 pl/ml. W doświadczeniach z chemioterapeutykiem, doksorubicyna była stosowana w stężeniu 8 pg/ml.

We wszystkich przykładach komórki nietraktowane MIX2 a traktowane tylko alkoholem w stężeniu 10 pl/ml, oznaczone są jako „kontrola”.

P r z y k ł a d 1 Przygotowanie kompozycji.

Sporządzono produkt zawierający samodzielnie pozyskane w otulinie Kampinoskiego Parku Narodowego, zgodnie z rekomendacją WHO dojrzałe owoce: jarzębu pospolitego (Sorbus aucuparia), głogu (Crataegus laevigata), śliwy tarniny (Prunus spinosa) oraz trzmieliny pospolitej (Euonymus europaeus). 10 g świeżych całych owoców każdego gatunku rozdrobniono i zalano 10 ml 100% metanolu i trzymano przez 1 miesiąc w temperaturze 4°C. Następnie ekstrakty przefiltrowano i połączono w jedną mieszaninę nazwaną MIX2 przez zmieszanie otrzymanych ekstraktów w stosunku objętościowym 1:1:1:1. Mieszanina ta jest termostabilna i może być przechowywana w zakresie temperatur od -20°C do +25°C, bez utraty właściwości biochemicznych. Podgrzanie mieszaniny MIX2 do 100°C przez 10 minut również nie wpływa na jej stabilność i właściwości. Czas przechowywania nie ma wpływu na aktywność mieszaniny (kompozycja jest aktywna nawet po 12 miesiącach przechowywania).

P r z y k ł a d 1a Przygotowanie kompozycji.

Powtórzono Przykład 1, stosując 96% etanol zamiast 100% metanolu. Otrzymano analogiczne wyniki.

P r z y k ł a d 2 Test rany.

Został wykonany tzw. test rany, którego wyniki są przedstawione na Figurze 1.

Test polega na pomiarze tempa zarastania wolnej od komórek powierzchni w czasie i pozwala monitorować potencjał migracyjny komórek.

Na płytce hodowlanej (6-dołkowej), wysiano 4x105 komórek na dołek, i hodowano w 2 ml pożywki do uzyskania pełnej konfluencji. Następnie, centralnie rozerwano komórki przy pomocy końcówki pipety, wykonując tzw. „ranę” przez środek dołka, uzyskując w ten sposób przestrzeń wolną od komórek. Do wybranych dołków dodano 20 pl MIX2, a do komórek kontrolnych dodano 20 pl czystego alkoholu. Moment wykonania rany oznaczono jako czas t0. Po upływie 24h (t1) zaobserwowano, że komórki potraktowane MIX2, migrują znacznie wolniej w porównaniu do kontroli (co widać w postaci nie zajętego przez komórki pola na zdjęciu MIX2/t1). Białe linie na zdjęciach oznaczają czoło poruszających się komórek, a dystans pomiędzy nimi jest odwrotnie proporcjonalny do potencjału migracyjnego (tzn. im większy dystans, tym mniejszy potencjał migracyjny).

Zdjęcia wykonano obiektywem 10x na mikroskopie Zeiss wyposażonym w kamerę.

Zaobserwowano, że komórki potraktowane MIX2 mają znacząco obniżony potencjał migracyjny. Wszystkie badane linie komórkowe potraktowane MIX2 przedstawiały powyżej opisany fenotyp.

P r z y k ł a d 3 Test przeżywalności komórek.

Na płytce hodowlanej (6-dołkowej), wysiano 4x105 komórek na dołek i hodowano w 2 ml pożywki do uzyskania pełnej konfluencji. Dodano 20 pl MIX2 do wybranych dołków i po upływie 24h komórki analizowano zestawem Annexin V firmy Abcam. Komórki traktowano i barwiono Annexin-FITC i jodkiem propidyny, zgodnie z zaleceniami producenta i analizowano na cytometrze przepływowym BD FACSCanto II firmy BD Bioscences.

Wyniki przedstawiono na Figurze 2 i wykazano, że MIX2 nie powoduje spadku liczby żywych komórek, czyli jest dla nich bezpieczny oraz ogranicza liczbę komórek w stadium apoptozy (proces prowadzący do kontrolowanej śmierci komórki).

Wszystkie badane linie komórkowe potraktowane MIX2 przedstawiały powyżej opisany fenotyp.

Jedną z przyczyn spowolnienia migracji komórek pod wpływem MIX2, może być zmieniona zdolność do adhezji i/lub proliferacji.

Na Figurze 3 przedstawiono wyniki testu. Wykonany test wskazuje, że komórki potraktowane MIX2, istotnie redukują zarówno proliferację i adhezję komórek (Figura 3).

P r z y k ł a d 4 Zdolność do adhezji.

Na płytce hodowlanej (96-dołkowej), wysiano 1x104 komórek na dołek w 200 pl pożywki. Dodano 2 pl MIX2 do wybranych dołków i po upływie 2h wszystkie komórki intensywnie przemyto solą fizjologiczną. Komórki związane z podłożem utrwalono metanolem i wybarwiono fioletem krystalicznym. Po przepłukaniu, komórki analizowano kolorymetrycznie. Adhezja, wyrażona liczbą wybarwionych komórek, była wprost proporcjonalna do intensywności wybarwienia, i w rezultacie wartości odczytu na kolorymetrze. Komórki traktowane MIX2 charakteryzuje istotnie obniżona zdolność do adhezji.

PL 236 893 B1

Wszystkie badane linie komórkowe potraktowane MIX2 przedstawiały powyżej opisany fenotyp. Wyniki przedstawiono na Figurze 3.

P r z y k ł a d 5 Zdolność do proliferacji.

Na płytce hodowlanej (96-dołkowej), wysiano 1x104 komórek na dołek w 200 ąl pożywki. Dodano 2 ąl MIX2 do wybranych dołków. Tempo proliferacji analizowano zestawem BrdU Assay Kit firmy Millipore, zgodnie z zaleceniami producenta. Czynnik BrdU wkomponowuje się do DNA po każdym cyklu replikacji. Komórki dzielące się intensywnie kumulują w genomie więcej BrdU, w porównaniu do komórek o niskim tempie podziałów. Ilość inkorporowanego do DNA komórek BrdU jest wykrywana za pomocą specyficznego przeciwciała i analizowana kolorymetrycznie. Wynik wskazuje, że komórki traktowane MIX2 charakteryzuje istotnie obniżona zdolność do proliferacji.

Wszystkie badane linie komórkowe potraktowane MIX2 przedstawiały powyżej opisany fenotyp.

Na Figurze 3 przedstawiono wyniki powyższego testu. Wykonany test wskazuje, że komórki potraktowane MIX2, istotnie redukują proliferację i adhezję komórek.

P r z y k ł a d 6 Charakterystyka poziomu ekspresji mRNA genu ABCD1 kodującego białko MDR1 w komórkach po potraktowaniu ich MIX2.

Z komórek potraktowanych MIX2 oraz kontrolą wyizolowano RNA zestawem firmy Eurx zgodnie z zaleceniami producenta. RNA przepisano na cDNA zestawem firmy Takara (zgodnie z zaleceniami producenta) a następnie przeprowadzono reakcję pomiaru ilości transkryptu w czasie rzeczywistym (RT-qPCR) na urządzeniu IQ5 oraz odczynnikami firmy Biorad. Analizę wyników przeprowadzono używając oprogramowania firmy BioRad. Komórki traktowane MIX2 charakteryzuje istotnie obniżony poziom ekspresji transkryptu dla białka MDR1, porównując do komórek nietraktowanych MIX2 - kontrola.

Zastosowana kompozycja produktu leczniczego MIX2 istotnie redukuje poziom ekspresji genu ABCB1 kodującego białko MDR1 we wszystkich badanych liniach komórkowych.

Na Figurze 4 przedstawiono wyniki powyższego testu.

P r z y k ł a d 7 Test przeżywalności po potraktowaniu komórek produktem leczniczym MIX2 i chemioterapeutykiem (doksorubicyną).

Komórki HeLa charakteryzujące się naturalnie wysokim poziomem ekspresji MDR1 zostały potraktowane: (i) tylko doksorubicyną (+DOX); (ii) MIX2 (+MIX2); (iii) zarówno MIX2 i doksorubicyną (+MIX2+DOX). Komórki kontrolne (iv) traktowane były tylko alkoholem.

Po 4h, licząc od dodania związków, komórki barwiono błękitem trypanu i analizowano ilość żywych i martwych komórek na automatycznym liczniku EVE firmy NanoEntek. Tylko komórki traktowane zarówno MIX2 i doksorubicyną (+MIX2+DOX) charakteryzowały się istotnie obniżonym poziomem przeżywalności. Wskazuje to na fakt, że MIX2 uwrażliwia komórki na suplementowany chemioterapeutyk, ponieważ sam lek (+DOX) nie wpływa na przeżywalność komórek w zadanym czasie.

Na Figurze 5 przedstawiono wyniki powyższego testu wyrażone w zależności od procentu żywych komórek.

Wyniki pokazują, że jedynie komórki traktowane zarówno MIX2 i doksorubicyną ulegają nekrozie. MIX2, jak i doksorubicyna, stosowane osobno, nie wykazują właściwości cytotoksycznych w zadanym czasie i stężeniu badanych związków.

Jednocześnie proces toksycznego działania połączonych MIX2 i doksorubicyny został zwizualizowany z użyciem mikroskopii konfokalnej i barwników znakujących jądro komórkowe (DAPI) i cytoszkielet komórkowy (falloidyny). Doksorubicyna naturalnie wybarwia się na czerwono (Rhod) i po podaniu do komórki lokalizuje w jądrze komórkowym. Jak pokazano na zdjęciach, na Figurze 6, tylko komórki potraktowane jednocześnie MIX2 i doksorubicyną są nadwrażliwe na chemioterapeutyk i ulegają autolizie.

Figura 6 przedstawia obraz komórek kontrolnych (nietraktowanych) oraz traktowanych odpowiednio MIX2, doksorubicyną oraz kombinacją MIX2 i doksorubicyną. MIX2 choć nie wykazuje właściwości cytotoksycznych, to indukuje zmiany w obrębie cytoszkieletu komórki, co skutkuje jej uwrażliwieniem na podawany chemioterapeutyk. Komórki traktowane zarówno MIX2 i doksorubicyną ulegają rozpadowi/autolizie.

Kolejne zdjęcia przedstawiają: 1 - komórki nietraktowane - kontrola; 2- komórki traktowane doksorubicyną; 3 - komórki traktowane MIX2; 4 - komórki traktowane zarówno MIX2 i doksorubicyną.

Oznaczenia: DAPI - związek barwiący tylko jądro komórkowe. Rhod - sygnał świadczy o obecności leku w komórce (tylko widoczny na zdjęciach 2 i 4).

P r z y k ł a d 8 Analiza ilości białka MDR1 w komórkach potraktowanych doksorubicyną oraz produktem leczniczym MIX2 i doksorubicyną.

PL 236 893 B1

Z komórek traktowanych tylko doksorubicyną oraz zarówno MIX2 jak i doksorubicyną przygotowano lizaty białkowe i analizowano ilość całkowitego białka MDR1 metodą Western biot. Użyto przeciwciała skierowanego przeciwko białku MDR1 (firmy Abcam).

Komórki traktowane MIX2 i doksorubicyną charakteryzuje znacząco obniżony poziom ekspresji białka MDR1 w porównaniu do komórek traktowanych tylko samym chemioterapeutykiem. Poziom B-aktyny służył jako tzw. kontrola stężenia całkowitego lizatu. Wyniki pokazano na Figurze 7. Lewa strona figury, linia lewa - nałożono lizat z komórek traktowanych tylko doksorubicyną. Obecność doksorubicyny indukuje białko MDR1 - widoczne w postaci intensywnych prążków.

Linia prawa - nałożono lizat z komórek traktowanych jednocześnie doksorubicyną i MIX2. Ilość białka MDR1 znacząco spada pod wpływem działania MIX2 (słabe prążki w prawej górnej części zdjęcia). Podobny poziom B-aktyny świadczy, że analizowano takie samo stężenie lizatu w obu próbach (analizowano 20 gg lizatu dla każdej z prób).

Powyższe dane wskazują, że do komórki potraktowanej MIX2, chemioterapeutyk można dostarczyć do komórki nowotworowej znacznie szybciej i ostatecznie ją zabić. Dodatkowo, z powyższych doświadczeń wynika, że komórki traktowane doksorubicyną nie są nadwrażliwe na lek i nie wykazują istotnych zmian w organizacji cytoszkieletu. Tylko komórki traktowane zarówno MIX2 i doksorubicyną są nadwrażliwe na lek i ulegają autolizie.

Oczekiwana korzyść z zastosowania kompozycji według wynalazku MIX2 oznacza docelowo możliwość leczenia guzów lekoopornych, obniżenia dawki chemioterapeutyku i ochronę komórek prawidłowych u chorego.

Z przedstawionych danych wynika, że mechanizm działania i obserwowane fenotypy mogą być spowodowane efektem addytywnym lub synergistycznym związków czynnych zawartych w tych roślinach lub w wyniku połączenia tych ekstraktów dochodzi do powstania nowych związków modulujących procesy biologiczne. Wyraźny jest efekt synergistyczny działania substancji czynnych zawartych w ekstraktach.

Wynalazek nie ogranicza się do pokazanych przykładów realizacji i możliwe są różne jego modyfikacje w ramach załączonych zastrzeżeń patentowych bez odchodzenia od istoty wynalazku.

Claims (11)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców wybranych roślin leczniczych z rodzaju Prunus sp., Crataegus sp., Sorbus sp., Euonymus sp. znamienna tym, że składa się z ekstraktów alkoholowych otrzymanych z owoców roślin wybranych z gatunków Prunus spinosa, Crataegus monogyna, Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że stosunek objętościowy ekstraktów alkoholowych w kompozycji odpowiednio wynosi 1:1:1:1.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1-2, znamienna tym, że owoce w całości poddaje się procesowi ekstrakcji wybranym alkoholem alifatycznym.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1-3, znamienna tym, że alkohol alifatyczny wybrany jest spośród 100% metanolu lub 95% etanolu.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 1-4, znamienna tym, że 10 g owoców roślin wybranych z gatunków Prunus spinosa, Crataegus monogyna, Sorbus aucuparia, Euonymus europaeus poddaje się ekstrakcji alkoholem.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 1-5, znamienna tym, że w ekstrakcji jest stosowany alkohol w ilości 10 ml.
7. 7. Kompozycja jak określono w zastrz. 1-6 do zastosowania w sposobie wspomagania leczenia chorób nowotworowych.
8. 8. Kompozycja jak określono w zastrz. 1-7, znamienna tym, że w połączeniu z chemioterapeutykami jest stosowana jako bezpieczny nietoksyczny środek leczniczy.
9. 9. Kompozycja jak określono w zastrz. 1-8, znamienna tym, że stosowana jest do wspomagania terapii nowotworowej guzów lekoopornych.
10. 10. Kompozycja jak określono w zastrz. 1-6 do zastosowania według zastrz. 7, znamienna tym, że jest podawana na 24h przed podaniem chemioterapeutyku.
11. 11. Kompozycja jak określono w zastrz. 1-6 do zastosowania według zastrz. 7-10, znamienna tym, że chemioterapeutykiem jest doksorubicyna lub inny podawany razem chemioterapeutyk.