PL236569B1

PL236569B1 - Staphylococcus aureus strain for the production of monoclonal phage preparations deprived of impurities by plasmid DNA

Info

Publication number: PL236569B1
Application number: PL434248A
Authority: PL
Inventors: Małgorzata ŁOBOCKA; Małgorzata Łobocka; Monika HEJNOWICZ; Monika Hejnowicz; Kamil DĄBROWSKI; Kamil Dąbrowski; Dariusz IZAK; Dariusz Izak; Agnieszka GOZDEK; Agnieszka Gozdek; Jan GAWOR; Jan Gawor; Jarosław KOSAKOWSKI; Jarosław Kosakowski; Robert GROMADKA; Robert Gromadka; Beata WEBER-DĄBROWSKA; Beata Weber-Dąbrowska; Andrzej Górski
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk; Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2014-08-31
Filing date: 2014-08-31
Publication date: 2021-01-25
Also published as: PL434248A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest szczep Staphylococcus aureus do otrzymywania monoklonalnych preparatów bakteriofagów litycznych o wysokim mianie, pozbawionych zanieczyszczeń niepożądanymi bakteriofagami oraz plazmidowym DNA. Będący efektem wynalazku szczep gwarantuje produkcję bezpiecznych w stosowaniu preparatów bakteriofagowych nie będących źródłem rozsiewu genów związanych z wirulencją bakterii.The subject of the invention is a Staphylococcus aureus strain for the production of monoclonal preparations of lytic bacteriophages with high titer, free from contamination with unwanted bacteriophages and plasmid DNA. The strain resulting from the invention guarantees the production of safe to use bacteriophage preparations that are not a source of spreading genes related to bacterial virulence.

W obliczu kryzysu skuteczności antybiotykoterapii zakażeń bakteryjnych obserwuje się w ostatnich latach powrót do badań nad fagoterapią jako alternatywną metodą leczenia zakażeń (Górski i in., 2009; Golka i in., 2014). Czynnikiem leczniczym w fagoterapii są bakteriofagi - wirusy selektywnie infekujące bakterie i nieszkodliwe dla organizmów eukariotycznych. Bakteriofagi jako bezwzględne pasożyty bakterii możliwe są do pozyskania jedynie przez namnażanie w komórkach bakteryjnych. Wydostanie się z zainfekowanych komórek namnożonych w nich bakteriofagów skorelowane jest z lizą komórek i wylaniem do środowiska ich treści. Otrzymane w ten sposób lizaty zawierają bakteriofagi zawieszone w mieszaninie zawartości komórek oraz pożywki, w której hodowano bakterie. Bezpieczeństwo terapii fagowej wymaga by były one wolne zarówno od czynników szkodliwych dla organizmów leczonych bakteriofagami jak i od czynników mogących zwiększać patogenność bakterii. Dotychczasowe metody produkcji preparatów fagów terapeutycznych, w tym m.in. fagów przeciwko Staphylococcus aureus, nie zapewniają w pełni takiego bezpieczeństwa, z uwagi na brak odpowiednich szczepów bakterii do namnażania fagów.In the face of the crisis in the effectiveness of antibiotic therapy of bacterial infections, in recent years there has been a return to research on phage therapy as an alternative method of treating infections (Górski et al., 2009; Golka et al., 2014). The therapeutic factor in phage therapy are bacteriophages - viruses that selectively infect bacteria and are harmless to eukaryotic organisms. Bacteriophages, as absolute bacterial parasites, can only be obtained by multiplication in bacterial cells. Leaving infected cells, the bacteriophages multiplied in them is correlated with the lysis of cells and the discharge of their contents into the environment. The lysates obtained in this way contain bacteriophages suspended in a mixture of the cell contents and the medium in which the bacteria were grown. The safety of phage therapy requires that they are free from both harmful factors for organisms treated with bacteriophages and from factors that may increase the pathogenicity of bacteria. The current methods of producing therapeutic phage preparations, including phages against Staphylococcus aureus do not fully ensure such safety, due to the lack of appropriate strains of bacteria for phage multiplication.

Bakteriofagi efektywne w zwalczaniu infekcji powodowanych przez bakteryjne patogeny typowo nie namnażają się w komórkach niepatogennych bakterii. Co więcej preparaty o wysokim mianie efektywne litycznie w stosunku do określonego patogena najczęściej można pozyskać t ylko przez namnażanie danego faga w bakteriach tego samego gatunku reprezentujących szczepy o cechach genetycznych podobnych do zwalczanego patogena (D'Herelle, 1938; Balogh i in., 2010). Zawierają więc one zanieczyszczenia pochodzące z komórek bakterii patogennych. Bakterie te kodują liczne czynniki wirulencji takie jak np. toksyny bakteryjne. Co więcej geny kodujące te czynniki są zwykle częścią obecnych w ich komórkach ruchomych elementów genetycznych zdolnych do przemieszczania się różnymi sposobami z jednych komórek bakterii do innych.Bacteriophages effective in combating infections caused by bacterial pathogens typically do not multiply in the cells of non-pathogenic bacteria. Moreover, preparations with a high titer, lithically effective in relation to a specific pathogen, can most often be obtained only by multiplication of a given phage in bacteria of the same species representing strains with genetic characteristics similar to the target pathogen (D'Herelle, 1938; Balogh et al., 2010) . Therefore, they contain impurities derived from the cells of pathogenic bacteria. These bacteria code for numerous virulence factors, such as, for example, bacterial toxins. Moreover, genes encoding these factors are usually part of mobile genetic elements present in their cells that are able to move from one bacterial cell to another in different ways.

Najtrudniejsze do usunięcia z preparatów fagowych są zanieczyszczenia bakteriofagami innymi niż namnażane. Bakteriofagi te należą do tzw. bakteriofagów łagodnych, będących szczególnym typem ruchomych elementów genetycznych (Guttman i in., 2005). W odróżnieniu od bakteriofagów obligatoryjnie litycznych zalecanych do zastosowań terapeutycznych i namnażających się jedynie drogą rozwoju litycznego, bakteriofagi łagodne mogą namnażać się drogą rozwoju litycznego lub pozostawać w komórce w postaci tzw. profaga - cząsteczki DNA najczęściej wbudowanej w chromosom bakteryjny. W tej formie mogą pozostawać latami, replikując jako integralna część chromosomu. W obronie przed ich utratą przez bakterie nabyły w procesach ewolucji geny pozwalające na lepsze przystosowanie zawierających je bakterii do zajmowanych środowisk. Dlatego większość bakteriofagów łagodnych bakteryjnych patogenów koduje czynniki wirulencji, takie jak m.in. toksyny bakteryjne, adhezyny czy czynniki chroniące bakterie przed odpowiedzią immunologiczną gospodarza (Cheetham i in., 1995). Spontaniczne wycinanie profagów z chromosomów w niektórych komórkach populacji w procesie tzw. indukcji prowadzi do zapoczątkowania ich rozwoju litycznego. Namnożone w rozwoju litycznym fagi łagodne infekując kolejne komórki bakterii mogą integrować jako profagi do ich DNA, stając się w ten sposób przenośnikami genów związanych z wirulencją bakterii. Szereg szczególnie trudnych do zwalczania epidemicznych szczepów bakterii powstało dzięki nabyciu przez nie nowych profagów (Canchaya i in., 2003). Z tego powodu konieczne jest wykorzystywanie w terapii fagowej tylko monoklonalnych preparatów fagowych, które zawierają wyłącznie wiriony faga terapeutycznego i nie są zanieczyszczone innymi fagami (Łobocka i in., 2014). Jednocześnie koktajle składające się z kilku rodzajów fagów powinny być otrzymywane tylko drogą mieszania monoklonalnych preparatów.The most difficult to remove from phage preparations are contamination with non-propagated bacteriophages. These bacteriophages belong to the so-called benign bacteriophages, which are a special type of mobile genetic elements (Guttman et al., 2005). Unlike obligatory lytic bacteriophages recommended for therapeutic applications and multiplying only by lytic development, benign bacteriophages can multiply through lytic development or remain in the cell in the form of the so-called profaga - DNA molecules most often built into the bacterial chromosome. In this form, they can remain for years, replicating as an integral part of the chromosome. In defense against their loss by bacteria, in the process of evolution, genes have been acquired that allow the bacteria containing them to better adapt to their environments. Therefore, most bacteriophages of benign bacterial pathogens code for virulence factors such as bacterial toxins, adhesins, or factors that protect bacteria from the host's immune response (Cheetham et al., 1995). Spontaneous cutting of prophages from chromosomes in some cells of the population in the process of the so-called induction leads to the initiation of their lytic development. The benign phages multiplied in lytic development, by infecting subsequent bacterial cells, can integrate as prophages into their DNA, thus becoming carriers of genes related to bacterial virulence. A number of epidemic strains of bacteria that are particularly difficult to combat have arisen thanks to the acquisition of new prophages by them (Canchaya et al., 2003). For this reason, it is necessary to use in phage therapy only monoclonal phage preparations that contain only therapeutic phage virions and are not contaminated with other phages (Łobocka et al., 2014). At the same time, cocktails consisting of several types of phages should be obtained only by mixing monoclonal preparations.

Innym rodzajem ruchomych elementów genetycznych mogących zanieczyszczać preparaty fagowe są plazmidy - pozachromosomalne cząsteczki DNA zdolne do autonomicznej replikacji. Plazmidy bakterii patogennych, podobnie jak fagi łagodne, nabyły w ewolucji geny związane z wirulencją ich bakteryjnych gospodarzy. Ponadto, podczas namnażania bakteriofagów w komórkach bakteryjnych, plazmidy mogą wbudowywać się do DNA fagowego i jako część tego DNA być pakowane do wirionów (Masters, 1996). Zastępując w ten sposób fragmenty fagowego DNA powodują powstawanie fagówAnother type of mobile genetic elements that can contaminate phage preparations are plasmids - extrachromosomal DNA molecules capable of autonomous replication. Plasmids of pathogenic bacteria, like benign phages, have acquired genes related to the virulence of their bacterial hosts in the course of evolution. Moreover, during the propagation of bacteriophages in bacterial cells, the plasmids can integrate into the phage DNA and, as part of this DNA, be packaged into virions (Masters, 1996). By replacing the fragments of phage DNA in this way, they create phages

PL 236 569 B1 defektywnych, niezdolnych do namnażania. Fagi te wprowadzają jednak do infekowanych komórek zawierające plazmid DNA i w ten sposób mogą rozsiewać geny wirulencji bakterii. Dlatego bakterie do namnażania fagów terapeutycznych nie powinny zawierać plazmidów.PL 236 569 B1 defective, unable to multiply. However, these phages introduce into infected cells DNA plasmid containing the plasmid and thus can disseminate bacterial virulence genes. Therefore, bacteria for the propagation of therapeutic phages should not contain plasmids.

Celem wynalazku jest dostarczenie szczepów Staphylococcus aureus do produkcji preparatów bakteriofagów terapeutycznych o wysokim mianie pozbawionych zanieczyszczeń fagami łagodnymi oraz plazmidowym DNA. Nieoczekiwanie tak określony cel został osiągnięty dzięki rozwiązaniu zaproponowanemu w niniejszym wynalazku.The aim of the invention is to provide Staphylococcus aureus strains for the production of high-titer therapeutic bacteriophage preparations devoid of contamination with benign phages and plasmid DNA. Surprisingly, the aim defined in this way was achieved thanks to the solution proposed in the present invention.

Przedmiotem wynalazku jest szczep Staphylococcus aureus pozbawiony profagów oraz plazmidów, przy czym jest on szczepem Staphylococcus aureus 6409wphpl zdeponowanym w PCM jako B/00073.The invention relates to a strain of Staphylococcus aureus devoid of prophages and plasmids, the strain of Staphylococcus aureus 6409wphpl deposited in PCM as B / 00073.

Przedmiotem wynalazku jest także szczep Staphylococcus aureus, który posiada chromosom bakteryjny zawierający DNA o sekwencji Sekw. Nr. 2.The subject of the invention is also a Staphylococcus aureus strain which has a bacterial chromosome containing DNA with the sequence Seq. No. 2.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania preparatu bakteriofagowego, zwłaszcza terapeutycznego charakteryzujący się tym, że szczep bakteriofaga specyficznego wobec Staphylococcus aureus namnaża się w hodowli szczepu Staphylococcus aureus pozbawionego profagów oraz plazmidów według wynalazku określonego powyżej, a następnie izoluje się namnożone fagi z uzyskanego lizatu, przy czym otrzymywane preparaty bakteriofagowe są pozbawione zanieczyszczeń fagami łagodnymi oraz plazmidowym DNA.The subject of the invention is also a method of obtaining a bacteriophage preparation, especially a therapeutic one, characterized in that a bacteriophage strain specific for Staphylococcus aureus is propagated in a culture of a Staphylococcus aureus strain devoid of prophages and plasmids according to the invention defined above, and then isolating the multiplied phages from the obtained lysate, whereby the obtained bacteriophage preparations are devoid of contamination with benign phages and plasmid DNA.

Efektem wynalazku jest otrzymanie szczepu 6409wphwpl S. aureus o sekwencji genomowego DNA określonych odpowiednio jako SEQ ID NO. 2 charakteryzujących się brakiem sekwencji odpowiadających sekwencjom genomowym aktywnych profagów.The object of the invention is to obtain the S. aureus strain 6409wphwpl with the genomic DNA sequence identified as SEQ ID NO, respectively. 2 characterized by the lack of sequences corresponding to the genomic sequences of active prophages.

Dodatkowym efektem wynalazku jest brak w komórkach szczepu 6409wphwpl plazmidów.An additional effect of the invention is the lack of plasmids in the cells of strain 6409wphwpl.

Korzystnym efektem wynalazku jest zachowanie przez szczep 6409wphwpl tych właściwości szczepu rodzicielskiego, które pozwalają na efektywne namnażanie w jego komórkach bakteriofagów Staphylococcus aureus, w tym w szczególności bakteriofagów P4W, Staph1 N, A5W lub Fi200W należących do gatunku Twort-like.An advantageous effect of the invention is that the 6409wphwpl strain maintains those properties of the parent strain which allow for the effective multiplication of Staphylococcus aureus bacteriophages in its cells, including in particular P4W, Staph1 N, A5W or Fi200W bacteriophages belonging to the Twort-like species.

Dodatkowym korzystnym efektem wynalazku jest możliwość otrzymywania w wyniku namnażania w komórkach szczepu 6409wphwpl bakteriofagów P4W, Staph1 N, A5W lub Fi200W, lizatów zawierających w/w bakteriofagi o mianie przynajmniej 10⁹ pfu/ml.An additional advantageous effect of the invention is the possibility to obtain lysates containing the above-mentioned bacteriophages with a titer of at least 10 ⁹ pfu / ml by the cultivation of bacteriophages P4W, Staph1 N, A5W or Fi200W in the cells of strain 6409wphwpl.

Dotychczasowym standardem uznawanym za wystarczający dla wykluczenie obecności niepożądanych bakteriofagów w preparatach bakteriofagów terapeutycznych były obserwacje w mikroskopie elektronowym (Merabishvili i in., 2009). Można tą drogą przejrzeć około kilkudziesięciu do kilkuset wirionów w polu widzenia weryfikując ich jednorodność morfologiczną. Na obecność plazmidów w komórkach do namnażania fagów terapeutycznych nie zwracano uwagi, mimo doniesień literaturowych o licznych przypadkach przenoszenia plazmidów pomiędzy komórkami przez bakteriofagi (podsumowane w Łobocka i in., 2014).The current standard considered sufficient to exclude the presence of undesirable bacteriophages in therapeutic bacteriophage preparations were observations under the electron microscope (Merabishvili et al., 2009). This way, it is possible to see about several dozen to several hundred virions in the field of view, verifying their morphological homogeneity. The presence of plasmids in cells for the multiplication of therapeutic phages was not paid attention to, despite literature reports on numerous cases of transfer of plasmids between cells by bacteriophages (summarized in Łobocka et al., 2014).

Autorzy obecnego wynalazku niespodziewanie stwierdzili, że wszystkie badane przez nich preparaty bakteriofagów obligatoryjnie litycznych typu Twort-like Staphylococcus aureus namnażanych w komórkach izolatów S. aureus pozwalających na otrzymanie lizatów tych bakteriofagów o wysokim mianie są zanieczyszczone niepożądanymi bakteriofagami, i że źródłem tych bakteriofagów są profagi wbudowane w chromosomy szczepów wykorzystywanych do namnażania fagów (Fig. 1). Mimo, że wyniki ostatnich badań wskazywały na obecność profagów w genomach niemal wszystkich klinicznych lub środowiskowych izolatów S. aureus, badania pozwalające na oszacowanie częstości spontanicznej indukcji różnych profagów S. aureus i na ocenę ryzyka zanieczyszczenia hodowli S. aureus fagami powstającymi w wyniku indukcji profagów nie były prowadzone (Kahankova i in., 2013). Co więcej nie opisano pozbawionych profagów szczepów S. aureus do namnażania bakteriofagów typu Twort-like najcenniejszych z punktu widzenia terapeutycznego.The authors of the present invention have unexpectedly found that all the preparations of obligatory lytic bacteriophages of the Twort-like Staphylococcus aureus type, grown in the cells of S. aureus isolates, allowing the production of high-titer lysates of these phage, are contaminated with unwanted bacteriophages, and that the source of these bacteriophages are in the chromosomes of the strains used for phage multiplication (Fig. 1). Although the results of recent studies have indicated the presence of prophages in the genomes of almost all clinical or environmental S. aureus isolates, studies allowing to estimate the frequency of spontaneous induction of various S. aureus prophages and to assess the risk of contamination of S. aureus cultures with phages resulting from prophage induction are not were conducted (Kahankova et al., 2013). Moreover, the most valuable therapeutically valuable strains of S. aureus for the multiplication of Twort-like bacteriophages have not been described.

Z zamiarem pozbawienia profagów dwóch szczepów Staphylococcus aureus do wydajnego namnażania fagów terapeutycznych, autorzy określili sekwencję ich genomowego DNA. W ten sposób zidentyfikowali miejsca integracji profagów w genomach tych szczepów oraz geny, których ciągłość została przerwana przez integrację profagów. Dzięki powiązaniu fenotypu z utratą funkcji tych genów autorzy po zaidukowaniu wycięcia profagów z genomów badanych szczepów zidentyfikowali kolonie komórek, które utraciły profagi (Fig. 2). Utratę profagów potwierdzili poprzez analizę sekwencji DNA genomowego wyleczonych szczepów (wyspecyfikowanych na potrzeby prezentowanego wynalazku jako SEQ ID NO. 1 i SEQ ID NO. 2). Dodatkowo analizując sekwencję totalnego DNA badanych szczepów, autorzy niespodziewanie stwierdzili, że komórki tych szczepów zawierają plazmidy mogące kodowaćWith the intention of depriving the propages of two Staphylococcus aureus strains for the efficient propagation of therapeutic phages, the authors determined the sequence of their genomic DNA. In this way, they identified the sites of prophage integration in the genomes of these strains and the genes that were broken by prophage integration. By linking the phenotype to the loss of function of these genes, the authors, after visualizing excision of the prophages from the genomes of the studied strains, identified the colonies of cells that lost the prophages (Fig. 2). The loss of prophages was confirmed by analyzing the genomic DNA sequence of the cured strains (specified for the purposes of the present invention as SEQ ID NO. 1 and SEQ ID NO. 2). Additionally, analyzing the total DNA sequence of the tested strains, the authors unexpectedly found that the cells of these strains contain plasmids that can encode

PL 236 569 B1PL 236 569 B1

m.in. oporność na sole kadmu. Szukając komórek badanych szczepów, które nabyły wrażliwość na kadm w warunkach mogących stymulować utratę plazmidu, wyizolowali bezplazmidowe pochodne obu szczepów i potwierdzili brak plazmidów w ich komórkach poprzez analizę totalnego DNA wyizolowanego z tych komórek.incl. resistance to cadmium salts. Searching for cells of the test strains that acquired sensitivity to cadmium under conditions that could stimulate plasmid loss, they isolated plasmid-free derivatives of both strains and confirmed the absence of plasmids in their cells by analyzing the total DNA isolated from these cells.

W opisanych w literaturze przykładach wynika, że zawarte w komórkach bakteryjnych profagi, mogą kodować funkcje niezbędne dla rozwoju określonych fagów obligatoryjnie litycznych, uniemożliwiając namnażanie tych bakteriofagów w wyleczonych z profagów szczepach (Nirmal Kumar i in., 2012). Dlatego niespodzianką było wykazanie, że będące efektem prezentowanego wynalazku szczepy 80wphwpl i 6409wphwpl Staphylococcus aureus, mimo pozbawienia ich profagów i plazmidów, nadal mogą służyć jako bakteryjni gospodarze do namnażania bakteriofagów litycznych. Co więcej, miano bakteriofagów w lizatach otrzymanych po infekcji tych szczepów fagami terapeutycznymi nie odbiega od miana w lizatach otrzymanych po infekcji fagami szczepów rodzicielskich.The examples described in the literature show that the prophages contained in bacterial cells can encode functions necessary for the development of certain obligatorily lytic phages, preventing the multiplication of these bacteriophages in the strains cured of the prophages (Nirmal Kumar et al., 2012). Therefore, it was surprising to show that the Staphylococcus aureus strains 80wphwpl and 6409wphwpl, resulting from the present invention, despite depriving them of prophages and plasmids, can still serve as bacterial hosts for the multiplication of lytic bacteriophages. Moreover, the titer of bacteriophages in lysates obtained after infection of these strains with the therapeutic phages does not differ from the titer in lysates obtained after infection with the phages of the parental strains.

Jest więc oczywiste, że otrzymane szczepy 80wphwpl i 6409wphwpl S. aureus są szczepami z wyboru do namnażania bakteriofagów stosowanych w celach profilaktycznych, terapeutycznych lub dezynfekcyjnych w zwalczaniu S. aureus, poprzez gwarancję, że preparaty fagowe otrzymane przez namnażanie bakteriofagów obligatoryjnie litycznych w komórkach tych szczepów są wolne od zanieczyszczeń niepożądanym materiałem biologicznym stwarzającym zagrożenie rozsiewania genów związanych z wirulencją bakterii. Wyklucza to możliwość pogorszenia stanu pacjentów lub zwierząt leczonych takimi preparatami w wyniku nieplanowanego nabycia przez infekujące szczepy S. aureus dodatkowych genów związanych z wirulencją, czego nie można wykluczyć w przypadku dotychczas stosowanych preparatów.It is therefore obvious that the obtained strains 80wphwpl and 6409wphwpl S. aureus are the strains of choice for the propagation of bacteriophages used for prophylactic, therapeutic or disinfecting purposes in the control of S. aureus, by guaranteeing that phage preparations obtained by propagating obligatorily lytic bacteriophages in the cells of these strains are free from contamination with undesirable biological material that poses a risk of spreading genes related to bacterial virulence. This excludes the possibility of deterioration of the condition of patients or animals treated with such preparations as a result of unplanned acquisition of additional virulence-related genes by the infecting S. aureus strains, which cannot be excluded in the case of the preparations used so far.

Sposób wykonania wynalazku zilustrowano następującymi figurami:The embodiment of the invention is illustrated by the following figures:

Figura 1. przedstawia wykrycie zanieczyszczeń preparatów bakteriofagów obligatoryjnie litycznych bakteriofagami powstałymi na skutek spontanicznej indukcji profagów w szczepach bakterii wykorzystywanych do namnażania fagów. (A) Górny żel przedstawia produkty amplifikacji otrzymane w reakcjach multiplex PCR z wykorzystaniem jako matrycy DNA wyizolowanego z wirionów zawartych w preparatach fagów obligatoryjnie litycznych (Fagi) lub DNA chromosomalnego szczepów S. aureus użytych do namnażania fagów (S. aureus), oraz starterami specyficznymi dla DNA bakteriofagów łagodnych następujących serogrup: A (oczekiwana długość produktu PCR - 744 p.z.), B (oczekiwana długość produktu PCR - 405 p.z.), Fa (oczekiwana długość produktu PCR - 548 p.z.), Fb (oczekiwana długość produktu PCR - 147 pz., p.z.). Dolny żel przedstawia produkty amplifikacji z w/w matrycami i starterami specyficznymi dla bakteriofagów łagodnych serogrupy L (oczekiwana długość produktu 648 p.z.) i dla namnażanych bakteriofagów litycznych serogrupy D (oczekiwana długość produktu 331 p. z.). Sekwencje starterów wykorzystanych do detekcji bakteriofagów poszczególnych serogrup, oraz warunki reakcji multiplex PCR odpowiadały opisanym poprzednio (Pantucek i in., 2004). Fragmenty DNA otrzymane w reakcjach PCR rozdzielano elektroforetycznie w 1% żelu agarozowym. Ścieżka oznaczona jako M zawiera rozdzielone fragmenty markera wielkości DNA (GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas), o wielkości odpowiednio (w parach zasad): 75, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 7000, 10000 i 20000. W ścieżkach oznaczonych jako K(-) rozdzielano mieszaniny kontrolne nie zawierające matrycowego DNA. (B) Produkty amplifikacji otrzymane z wykorzystaniem jako matrycy DNA wyizolowanego z wirionów zawartych w preparatach fagów obligatoryjnie litycznych (Fagi) lub DNA chromosomalnego szczepu S. aureus 6409 (użytych w części A) oraz starterami specyficznymi dla chromosomalnego genu koagulazy S. aureus.Figure 1 shows the detection of contamination of obligate lytic bacteriophage preparations with bacteriophages resulting from spontaneous induction of prophages in bacterial strains used for phage propagation. (A) The upper gel shows the amplification products obtained in multiplex PCR reactions using as a template DNA isolated from virions contained in obligate lytic phage preparations (Phages) or chromosomal DNA of S. aureus strains used for phage propagation (S. aureus), and with specific primers for benign bacteriophage DNA of the following serogroups: A (expected PCR product length - 744 bp), B (expected PCR product length - 405 bp), Fa (expected PCR product length - 548 bp), Fb (expected PCR product length - 147 bp. , pz). The bottom gel shows the amplification products with the above-mentioned templates and primers specific for benign serogroup L bacteriophages (expected product length 648 bp) and for grown lytic serogroup D bacteriophages (expected product length 331 bp). The sequences of the primers used for the detection of bacteriophages of the individual serogroups, and the multiplex PCR reaction conditions corresponded to those previously described (Pantucek et al., 2004). DNA fragments obtained by PCR reactions were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. The lane marked M contains separated fragments of the DNA size marker (GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas), with the following sizes (in base pairs): 75, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, respectively, 4,000, 5,000, 7,000, 10,000, and 20,000. In lanes labeled K (-), control mixtures containing no template DNA were separated. (B) Amplification products obtained using DNA isolated from virions contained in obligate lytic phage preparations (Phages) or DNA of the chromosomal strain S. aureus 6409 (used in Part A) as a template and with primers specific for the chromosomal coagulase gene S. aureus.

Figura 2 przedstawia selekcję pochodnych szczepu 6409, które uzyskały zdolność do hemolizy po traktowaniu mitomycyną C. Komórki traktowane mitomycyną C wysiewano na podłoże Columbia agar z krwią baranią. Strefy hemolizy widać jako przejaśnienia wokół kolonii.Figure 2 shows the selection of derivatives of strain 6409 that acquired hemolytic capacity after mitomycin C treatment. Mitomycin C treated cells were plated on Columbia Sheep Blood Agar. Hemolytic zones are visible as bright spots around the colony.

Figura 3 przedstawia negatywny wynik reakcji PCR z wykorzystanie jako matrycy DNA wybranych pochodnych szczepów 80 i 6409, które po traktowaniu mitomycyną C odzyskały zdolność do hemolizy erytrocytów krwi baraniej (ścieżki oznaczone jako MitC) oraz ze starterami specyficznymi dla profagów serogrupy Fa, obecnych w genomach szczepów rodzicielskich (ścieżki oznaczone jako wt). Zastosowane warunki rozdziału amplikonów, startery specyficzne dla profagów serogrupy Fa oraz rodzaj markera wielkości DNA, są takie same jak podano w opisie Fig. 1.Figure 3 shows a negative result of the PCR reaction using selected derivatives of strains 80 and 6409 as a DNA template, which, after treatment with mitomycin C, regained the ability to hemolyze sheep blood erythrocytes (lanes marked as MitC) and with primers specific for the Fa serogroup prophages present in the genomes of the strains. parental (paths marked as wt). The amplicon separation conditions used, the Fa serogroup propage specific primers and the type of DNA size marker used are the same as described in the description of Fig. 1.

Figura 4 przedstawia wyniki potwierdzające brak plazmidu w pochodnej szczepu 80wph oznaczonej jako 80wphwpl. (A) Rozdziału w żelu agarozowym metodą PFGE DNA szczepu 80wph oraz jego pozbawionej plazmidu pochodnej 80wphwpl. Strzałkami oznaczono nietrawione i trawione nukleazą S1 DNA plazmidowe obecne w komórkach szczepu 80wphwpl. Zastosowane warunki trawienia preparatówFigure 4 shows the results confirming the absence of plasmid in the derivative of strain 80wph designated as 80wphwpl. (A) Separation in agarose gel by PFGE method of DNA of strain 80wph and its plasmid-free derivative 80wphwpl. The arrows indicate the undigested and S1 nuclease digested plasmid DNA present in the cells of the 80wphwpl strain. The conditions of digesting preparations used

PL 236 569 B1PL 236 569 B1

DNA nukleazą S1 oraz rozdziału metodą PFGE były analogiczne do opisanych poprzednio (Barton i in., 1995). W ścieżkach żelu oznaczonych jako S1 - i S1+ rozdzielano DNA nietrawione i trawione nukleazą S1, w ścieżkach oznaczonych jako K+ i M rozdzielano odpowiednio oczyszczone DNA plazmidu kontrolnego wyizolowanego z innego szczepu oraz fragmenty wzorca wielkości DNA (Lambda Ladder PFGE Marker, New England Biolabs). (B) Rozdział produktów amplifikacji otrzymanych z wykorzystaniem jako matrycy totalnego DNA szczepu 80wph lub 80wphwpl oraz starterów: 5'-TTCAGTAATAAACATTTGTGCGA i 5'-CATGTTTTTACGGCGCATAT, specyficznych dla plazmidów obecnych w komórkach szczepu 80wph oraz 6409wph. Ścieżki oznaczone jako - nie zawierały DNA matrycy. W ścieżkach oznaczonych jako L rozdzielano fragmenty wzorca wielkości DNA (GeneRulerTM 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas). Amplifikację prowadzono stosując gradient temperatur hybrydyzacji startera z matrycą w zakresie 49-59°C. Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami, które przedstawiają sposób detekcji zanieczyszczeń preparatów fagowych niepożądanymi bakteriofagami łagodnymi, sposób usunięcia profagów i plazmidów ze szczepów do namnażania fagów terapeutycznych oraz wydajne namnażanie bakteriofagów terapeutycznych w pozyskanych szczepach pozbawionych plazmidów i profagów. Poprzez ujawnienie sekwencji DNA genomowego otrzymanych szczepów oraz wykazanie braku w ich komórkach plazmidów dokumentują też, że szczepy te nie mogą być źródłem zanieczyszczeń namnażanych w ich komórkach bakteriofagów litycznych, bakteriofagami łagodnymi i plazmidami. We wszystkich przykładach, o ile nie napisano inaczej, zastosowano standardowe metody biologii molekularnej opisane przez Sambrook i in. (1989).S1 nuclease DNA and PFGE separations were analogous to those previously described (Barton et al., 1995). In the gel lanes labeled S1 - and S1 + DNA undigested and digested with S1 nuclease were separated, in the lanes labeled K + and M respectively purified DNA of a control plasmid isolated from another strain and fragments of standard size DNA (Lambda Ladder PFGE Marker, New England Biolabs) were separated. (B) Separation of amplification products obtained with the use of the total DNA of the 80wph or 80wphwpl strain as a template and the primers: 5'-TTCAGTAATAAACATTTGTGCGA and 5'-CATGTTTTTACGGCGCATAT, specific for the plasmids present in the cells of the strain 80wph and 6409wph. Lanes marked - did not contain template DNA. Fragments of DNA size standard (GeneRuler ™ 1 kb Plus DNA Ladder, Fermentas) were separated in lanes labeled L. Amplification was performed using a gradient of primer annealing temperatures to the template over a range of 49-59 ° C. For a better understanding of the essence of the invention, it is illustrated by the following examples, which show a method of detecting contamination of phage preparations with undesirable benign bacteriophages, a method of removing prophages and plasmids from therapeutic phage strains, and efficient multiplication of therapeutic bacteriophages in the obtained strains devoid of plasmids and prophages. By revealing the genomic DNA sequence of the obtained strains and demonstrating the absence of plasmids in their cells, they also document that these strains cannot be a source of contamination of lytic bacteriophages, benign bacteriophages and plasmids grown in their cells. All examples, unless otherwise noted, use standard molecular biology methods described by Sambrook et al. (1989).

P r z y k ł a d 1. Obecność zanieczyszczeń niepożądanymi bakteriofagami w preparatach bakteriofagów obligatoryjnie litycznych namnażanych w komórkach Staphylococcus aureus.Example 1. Presence of undesirable bacteriophage contamination in obligate lytic bacteriophage preparations grown in Staphylococcus aureus cells.

Sprawdzono, czy preparaty fagów obligatoryjnie litycznych wykorzystywanych w fagoterapii i namnożonych w komórkach szczepów Staphylococcus aureus używanych standardowo do namnażania tych fagów (Łobocka i in., 2012) są zanieczyszczone innymi fagami. Lizaty otrzymane po infekcji komórek szczepów 6409, 80, R19930, Ż11788, i PS80 fagami A3R (szczep R19930), Fi200W lub P4W (szczep 6409), Staph1N (szczep 80), 676Ż (szczep Ż11788) i A5W (szczep PS80) oczyszczono z bakteryjnego DNA i RNA przez trawienie DNazą i RNazą, a następnie wyizolowano z nich wiriony i ich DNA wg opisanej poprzednio procedury (Łobocka i in., 2004). Równolegle, z komórek niezainfekowanych szczepów używanych do namnażania fagów wyizolowano chromosomalne DNA. Oczyszczone DNA wirionów oraz oczyszczone DNA chromosomalne szczepów do namnażania fagów wykorzystano jako matryce do amplifikacji fragmentów reprezentatywnych dla bakteriofagów łagodnych S. aureus reprezentujących różne serotypy (Fig. 1A), stosując opisane sekwencje starterów (Pantucek i in., 2004). Niespodziewanie okazało się, że wszystkie badane preparaty bakteriofagów obligatoryjnie litycznych są zanieczyszczone DNA reprezentującym genomy fagów łagodnych, których profagi były wintegrowane do chromosomów szczepów do namnażania fagów. Ponieważ preparaty fagowe przed izolacją wirionowego DNA, oczyszczono z wolnego DNA resztek chromosomów bakteryjnych w lizatach, tak, że w reakcjach kontrolnych PCR ze starterami dla chromosomalnego genu koagulazy S. aureus nie otrzymywano produktów reakcji PCR (Fig. 1B), jedynym źródłem wykrytego w tych preparatach DNA bakteriofagów łagodnych mogły być wiriony tych bakteriofagów powstałe w wyniku spontanicznej indukcji profagów wbudowanych w chromosomy szczepów do namnażania fagów litycznych.It was checked whether preparations of obligatory lytic phages used in phage therapy and Staphylococcus aureus strains propagated in cells, which are used as standard for the propagation of these phages (Łobocka et al., 2012), were contaminated with other phages. Lysates obtained after infection of cells of strains 6409, 80, R19930, Ż11788, and PS80 with phages A3R (strain R19930), Fi200W or P4W (strain 6409), Staph1N (strain 80), 676Ż (strain Ż11788) and A5W (strain PS80) were purified from bacterial DNA and RNA by digestion with DNase and RNase, and then virions and their DNA were isolated from them according to the previously described procedure (Łobocka et al., 2004). In parallel, chromosomal DNA was isolated from the cells of uninfected strains used for phage propagation. Purified DNA of virions and purified chromosomal DNA of the phage propagation strains were used as templates to amplify fragments representative of mild S. aureus bacteriophages representing different serotypes (Fig. 1A) using the described primer sequences (Pantucek et al., 2004). Surprisingly, it turned out that all tested preparations of obligatorily lytic bacteriophages are contaminated with DNA representing the genomes of benign phages, the prophages of which were integrated into the chromosomes of the phage multiplication strains. As the phage preparations prior to virion DNA isolation, they were purified from free DNA of bacterial chromosome residues in lysates, so that in control PCR reactions with primers for the chromosomal coagulase gene S. aureus, no PCR products were obtained (Fig. 1B), the only source detected in these DNA preparations of benign bacteriophages could be virions of these bacteriophages resulting from the spontaneous induction of prophages embedded in the chromosomes of strains for lytic phage propagation.

P r z y k ł a d 2. Identyfikacja rejonów integracji profagów w szczepach S. aureus 80 i 6409.Example 2. Identification of the regions of prophage integration in S. aureus 80 and 6409 strains.

Do leczenia z profagów wybrano szczepy 80 i 6409. Lizaty fagów obligatoryjnie litycznych namnażanych w komórkach tych szczepów zanieczyszczone były fagami reprezentującymi typ serologiczny Fa (Fig. 1). W celu identyfikacji rejonów integracji profagów w genomach szczepów 80 i 6409 z komórek tych szczepów wyizolowano DNA chromosomalne i przygotowano z niego biblioteki fragmentów, które następnie zostały zsekwencjonowane (z wykorzystaniem Roche 454 Genome Sequencer GS FLX), a ich sekwencje złożone w większe fragmenty. Analiza bioinformatyczna otrzymanych fragmentów pod kątem rejonów homologicznych do rejonów DNA profagów ujawniła obecność profagów reprezentujących grupę serologiczną Fa w genie hlb zarówno w szczepie 80 jak i 6409. Zidentyfikowane profagi przerywały ciągłość genu hlb, w który były wbudowane. Rejony integracji profagów zweryfikowano poprzez analizę fenotypową badanych szczepów. Szczepy 80 i 6409 okazały się niezdolne do hemolizy erytrocytów krwi baraniej w podłożu Columbia agar, co potwierdziło niefunkcjonalność genu hlb w genomach tych szczepów.Strains 80 and 6409 were selected for treatment of the prophages. Lysates of obligatory lytic phages grown in the cells of these strains were contaminated with phages representing the Fa serological type (Fig. 1). In order to identify the regions of prophage integration in the genomes of strains 80 and 6409, chromosomal DNA was isolated from the cells of these strains, and libraries of fragments were prepared from it, which were then sequenced (using Roche 454 Genome Sequencer GS FLX) and their sequences assembled into larger fragments. Bioinformatic analysis of the obtained fragments in terms of regions homologous to the DNA regions of the prophages revealed the presence of prophages representing the Fa serological group in the hlb gene in both strain 80 and 6409. The identified prophages interrupted the continuity of the hlb gene in which they were embedded. The regions of prophage integration were verified by phenotypic analysis of the tested strains. Strains 80 and 6409 proved incapable of haemolysis of sheep blood erythrocytes in Columbia agar, which confirmed the non-functionality of the hlb gene in the genomes of these strains.

P r z y k ł a d 3. Pozbawienie szczepów S. aureus 80 i 6409 aktywnych profagów zawartych w ich chromosomach.Example 3. Deprivation of S. aureus 80 and 6409 strains of active prophages contained in their chromosomes.

PL 236 569 Β1PL 236 569 Β1

Profagi zawarte w chromosomach szczepów 80 i 6409 indukowano mitomycyną C wg standardowej procedury. Komórki po indukcji wysiewano na podłoże stałe Columbia agar z krwią baranią (Fig. 2). Otrzymane pochodne szczepów 80 i 6409 (oznaczone jako 80wph i 6409wph), z zaznaczoną wokół strefą hemolizy przeczyszczano kilkakrotnie przez posiew redukcyjny na takim samym podłożu. Niespodziewanie tylko kilka zachowało fenotyp świadczący o trwałym odzyskaniu funkcji genu hlb. Po jednej kolonii każdego szczepu wykorzystywano do izolacji genomowego DNA. Reakcje multiplex PCR z wyizolowanym DNA każdego ze szczepów oraz starterami specyficznymi dla bakteriofagów łagodnych serogrupy Fa wykazały brak produktów amplifikacji fragmentów DNA profagów, które w przypadku szczepów wyjściowych zanieczyszczały przygotowane w ich komórkach preparaty fagów obligatoryjnie litycznych (Fig. 3.). W celu potwierdzenia usunięcia profagów z genomów w/w szczepów ich totalne DNA zsekwencjonowano zgodnie z opisaną wcześniej procedurą dla genomów fagowych (Łobocka i in., 2012). Otrzymane sekwencje genomowe szczepów 80wph i 6409wph (oznaczone na potrzeby tego wynalazku kolejno jako SEQ ID NO 1 i SEQ ID NO 2) przeanalizowano pod kątem obecności w nich fragmentów DNA reprezentujących aktywne profagi. Analiza potwierdziła brak takich rejonów.The chromosomal propages of strains 80 and 6409 were induced with mitomycin C according to standard procedure. After induction, cells were plated on solid Columbia Sheep Blood Agar (Fig. 2). The obtained derivatives of strains 80 and 6409 (designated as 80wph and 6409wph) with the hemolysis zone marked around were purged several times by reduction inoculation on the same medium. Surprisingly, only a few retained the phenotype indicating a permanent recovery of hlb gene function. One colony of each strain was used to isolate genomic DNA. Multiplex PCR reactions with the isolated DNA of each strain and primers specific for benign bacteriophages of the Fa serogroup showed the lack of amplification products of DNA fragments of the prophages, which in the case of starting strains contaminated the obligatory lytic phage preparations prepared in their cells (Fig. 3). In order to confirm the removal of the prophages from the genomes of the above-mentioned strains, their total DNA was sequenced in accordance with the previously described procedure for phage genomes (Łobocka et al., 2012). The obtained genomic sequences of the strains 80wph and 6409wph (designated for the purposes of this invention sequentially as SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2) were analyzed for the presence of DNA fragments representing active prophages therein. The analysis confirmed the lack of such regions.

Przykład 4. Usunięcie plazmidów z komórek szczepów 80wph i 6409 wph.Example 4. Removal of plasmids from cells of 80wph and 6409 wph strains.

Analiza totalnego DNA wyizolowanego z komórek szczepów 80wph i 6409wph pozwoliła na wyróżnienie w obu tych szczepach oprócz DNA chromosomalnego dodatkowych homologicznych w stosunku do siebie, kolistych, cząsteczek DNA o wielkości 20 tys. p. z., reprezentujących plazmidy mogące kodować oporność na sole kadmu. Oporność szczepów 80wph i 6409wph na sole kadmu potwierdzono w testach fenotypowych i wykorzystano do selekcji komórek, które utraciły plazmid. Częstość spontanicznej utraty plazmidu zwiększano przez hodowlę komórek w podwyższonej temperaturze. Hodowle nocne szczepów 80wph i 6409wph rozcieńczano czterokrotnie w pożywce LB, inkubowano przez 1,5 godziny z wytrząsaniem w 37°C, po czym hodowlę rozcieńczano ponownie około 100 razy w świeżej pożywce LB i inkubowano przez 5,5 godz. z wytrząsaniem w 43°C. Bakterie z hodowli rozcieńczano 10⁴ i wysiewano na podłoże stałe LB, tak by otrzymać pojedyncze kolonie. Płytki inkubowano przez noc w 37°C. Wyrosłe kolonie przemazywano na podłoże LB z octanem kadmu (67 μg/ml) oraz bez octanu kadmu i inkubowano przez noc w 37°C. Kolonie niezdolne do wzrostu na podłożu z octanem kadmu czyszczono kilkakrotnie przez posiew redukcyjny. Brak plazmidu w otrzymanych izolatach, nazwanych odpowiednio 80wphpl i 6409wphpl weryfikowano po izolacji z nich totalnego DNA, po rozdziale otrzymanego DNA w żelu agarozowym metodą elektroforezy pulsacyjnej (PFGE) lub poprzez weryfikację obecności w otrzymanym DNA sekwencji charakterystycznych dla plazmidów metodą amplifikacji ze starterami specyficznymi dla plazmidowego DNA (Fig. 4). Uzyskane szczepy Staphylococcus aureus pozbawione profagów oraz plazmidów zdeponowane zostały w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM), Wrocław, Polska, działającej zgodnie z traktatem budapesztańskim.The analysis of total DNA isolated from the cells of the 80wph and 6409wph strains allowed for the distinction in both of these strains, apart from chromosomal DNA, additional homologous to each other, circular, DNA molecules with a size of 20 thousand. pz, representing plasmids that can code for resistance to cadmium salts. Resistance of the 80wph and 6409wph strains to cadmium salts was confirmed in phenotypic tests and used to select cells that lost the plasmid. The frequency of spontaneous plasmid loss was increased by culturing the cells at elevated temperature. The overnight cultures of the 80wph and 6409wph strains were diluted four-fold in LB medium, incubated for 1.5 hours with shaking at 37 ° C, then the culture was re-diluted approximately 100 times in fresh LB medium and incubated for 5.5 hours. with shaking at 43 ° C. The bacteria from the culture were diluted 10 ⁴ and plated on LB solid medium so as to obtain single colonies. The plates were incubated overnight at 37 ° C. Grown colonies were washed on LB medium with cadmium acetate (67 µg / ml) and without cadmium acetate and incubated overnight at 37 ° C. Colonies unable to grow on cadmium acetate medium were cleaned several times by reduction plating. The lack of plasmid in the obtained isolates, named 80wphpl and 6409wphpl, respectively, was verified after isolating total DNA from them, after separating the obtained DNA on an agarose gel by pulsed electrophoresis (PFGE) or by verifying the presence of sequences characteristic for plasmids in the obtained DNA by amplification with primers specific for plasmid DNA (Fig. 4). The obtained Staphylococcus aureus strains devoid of prophages and plasmids were deposited at the Polish Microbial Collection (PCM), Wrocław, Poland, operating in accordance with the Budapest Treaty.

Oznaczenie szczepu Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus strain determination Polska Kolekcja Mikroorganizmów (PCM) Numer Dostępu Depozytu Polish Collection of Microorganisms (PCM) Deposit Access Number 80wphwpl 80wphwpl B/00072 B / 00072 6409wphpl 6409wphpl B/00073 B / 00073

Przykład 5. Weryfikacja przydatności szczepów 80wphwpl i 6409wphwpl do wydajnego namnażania fagów obligatoryjnie litycznych.Example 5. Verification of the suitability of the 80wphwpl and 6409wphwpl strains for efficient multiplication of obligatorily lytic phages.

W celu weryfikacji, czy pozbawione profagów i plazmidów szczepy 80wphwpl i 6409wphwpl mogą służyć jako szczepy gospodarzy do namnażania obligatoryjnie litycznych bakteriofagów gronkowcowych, i czy bakteriofagi namnażają się w komórkach tych szczepów z wydajnością wystarczającą do stosowania ich dla celów profilaktyki, terapii i dezynfekcji, komórki otrzymanych szczepów zainfekowano takimi samymi bakteriofagami, które wydajnie namnażały się w komórkach szczepów rodzicielskich, zawierających plazmidy i profagi. W celu przygotowania lizatów hodowlę nocną każdego szczepu rozcieńczano w stosunku 1:100 w 50 ml świeżej pożywki LB i inkubowano w temperaturze 37°C z wytrząsaniem do osiągnięcia gęstości optycznej ODeoonm =~0,3. Następnie do hodowli dodawano jonów MgSO₄ i CaCl2 (do stężenia końcowego 10 mM) oraz lizat zawierający fagi, tak by współczynnik infekcji (M.O.I.) wynosił 0,1. Mieszaniny pozostawiano na 5 minut w temperaturze pokojowej w celu adsorpcji fagów na powierzchni komórek bakterii, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C z wytrząsaniem do momentu zaobserwowania wyraźnych oznak lizy. Lizat wirowano (20 min., 4°C, 9000 g), a uzyskany supernatant filtrowano przez filtry 0,22 PVDF (firmy MILLEX® GS). W celu zmianowania fagów w oczyszczonym lizacie do 0,1 ml nocnej hodowli bakterii prowadzonej na pożywce LB dodawanoIn order to verify whether the strains 80wphwpl and 6409wphwpl devoid of prophages and plasmids can serve as host strains for the propagation of obligatory lytic staphylococcal bacteriophages, and whether the bacteriophages multiply in the cells of these strains with the efficiency sufficient to use them for prophylaxis, cell therapy and disinfection, of the strains were infected with the same bacteriophages that efficiently multiplied in the cells of the parent strains containing plasmids and prophages. To prepare lysates, the overnight culture of each strain was diluted 1: 100 in 50 ml of fresh LB medium and incubated at 37 ° C with shaking until the optical density was ODeoonm = ~ 0.3. Subsequently, MgSO ₄ and CaCl 2 ions (to a final concentration of 10 mM) and the phage containing lysate were added to the culture so that the infection index (MOI) was 0.1. The mixtures were left for 5 minutes at room temperature to adsorb the phages to the surface of the bacterial cells and then incubated at 37 ° C with shaking until clear signs of lysis were observed. The lysate was centrifuged (20 min, 4 ° C, 9000 g) and the resulting supernatant was filtered through 0.22 PVDF filters (from MILLEX® GS). In order to change phages in the purified lysate to 0.1 ml of the overnight culture of bacteria grown on LB medium was added

PL 236 569 Β1PL 236 569 Β1

0,1 ml 25 mM roztworu CaCb i MgSO₄ oraz 0,1 ml rozcieńczonego lizatu fagowego (10 ², 10 ⁴, 10 ⁶, 10'⁸). Mieszaninę pozostawiano na 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodawano 1 ml pożywki LB oraz 4 ml rozpuszczonego i schłodzonego do 55°C podłoża LCA (LB, 5 mM CaCb, 0,7% agar) i wylewano na powierzchnię płytek z podłożem LB. Po nocnej inkubacji w temperaturze 37°C zliczano łysinki na warstwie komórek bakterii i na tej podstawie określano liczbę infekcyjnych cząstek faga w 1 ml lizatu. We wszystkich przypadkach miana otrzymanych fagów w lizatach szczepów pozbawionych plazmidów i profagów były porównywalne z ich mianami w lizatach szczepów rodzicielskich (Tabela 1). Jednocześnie były one zgodne z zakresem mian bakteriofagów gronkowcowych w lizatach stosowanych terapeutycznie (Merabishvili i in., 2009), co jednoznacznie wskazuje na przydatność szczepów otrzymanych w ramach prezentowanego wynalazku do przygotowywania preparatów fagowych dla celów terapeutycznych.0.1 ml of a 25 mM solution of CaCb and MgSO ₄ and 0.1 ml of diluted phage lysate (10 ² , 10 ⁴ , 10 ⁶ , ^10-8 ). The mixture was left for 5 minutes at room temperature, and then 1 ml of LB medium and 4 ml of LCA medium dissolved and cooled to 55 ° C (LB, 5 mM CaCb, 0.7% agar) were added and poured onto the surface of the LB medium plates. After overnight incubation at 37 ° C, the plaques on the layer of bacterial cells were counted and the number of infectious phage particles in 1 ml of lysate was determined on this basis. In all cases, the titers of the obtained phages in the lysates of the strains lacking plasmids and prophages were comparable with their titers in the lysates of the parent strains (Table 1). At the same time, they were consistent with the range of titers of staphylococcal bacteriophages in therapeutically used lysates (Merabishvili et al., 2009), which clearly indicates the usefulness of the strains obtained in the framework of the present invention for the preparation of phage preparations for therapeutic purposes.

Tabela 1. Miana fagów w lizatach zainfekowanych komórek szczepów pozbawionych profagów i plazmidów oraz szczepów rodzicielskich.Table 1. Phage titers in lysates of infected cells of prophage and plasmid deficient strains and parental strains.

Bakteriofag Bacteriophage Szczep do namnażania The strain to multiply Miano faga w lizacie Phage titer in the lysate A5W A5W 80wphwpl 80wphwpl 5,5 x 10⁹ 5.5 x 10 ⁹ 80 80 3,4x10⁹ 3.4x10 ⁹ StaphIN StaphIN 80wphwpl 80wphwpl 3,0 x 10⁹ 3.0 x 10 ⁹ 80 80 1,5 x 10¹⁰ 1.5 x 10 ¹⁰ Fi200W Fi200W 6409wphwpl 6409wphwpl 1,8 x 10⁹ 1.8 x 10 ⁹ 6409 6409 1,1-5,0 x 10⁹ 1.1-5.0 x 10 ⁹ P4W P4W 6409wphwpl 6409wphwpl 3,3X10⁹ 3.3X10 ⁹ 6409 6409 1,5 x10¹°1.5 x10 ¹ °

Literatura:Literature:

Balogh, B.; Jones, J. B.; Iriarte, F. B.; Momol, Μ. T. Phage therapy for plant disease control. Curr. Pharm. Biotechnol., 2010, 11: 48-57.Balogh, B .; Jones, J. B .; Iriarte, F. B .; Momol, Μ. T. Phage therapy for plant disease control. Curr. Pharm. Biotechnol., 2010, 11: 48-57.

Barton BM, Harding GP, Zuccarelli AJ. 1995. A generał method for detecting and sizing large plasmids. Anal. Biochem. 226: 235-240.Barton BM, Harding GP, Zuccarelli AJ. 1995. A general method for detecting and sizing large plasmids. Anal. Biochem. 226: 235-240.

Canchaya C, Proux C, Fournous G, Bruttin A, Briissow H. 2003. Prophage genomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 238-276,Canchaya C, Proux C, Fournous G, Bruttin A, Briissow H. 2003. Prophage genomics. Microbiol. Moth. Biol. Rev. 67: 238-276,

Cheetham BF, Katz ME. 1995. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants. Mol Microbiol. 18: 201-208.Cheetham BF, Katz ME. 1995. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants. Mol Microbiol. 18: 201-208.

D’Herelle. Preparation of Therapeutic Bacteriophages, Appendix 1 from: Le Phenomene de la Guerison dans les maladies infectieuses. 1938. Masson et Cie, 1938, Paris-OCLC 5784382. (translation from Bacteriophages 2011; 1,55-65).D'Herelle. Preparation of Therapeutic Bacteriophages, Appendix 1 from: Le Phenomene de la Guerison dans les maladies infectieuses. 1938. Masson et Cie, 1938, Paris-OCLC 5784382. (translation from Bacteriophages 2011; 1.55-65).

Gili, J.J., and Hyman, P. 2010. Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy. Curr Pharm Biotechnol. 11: 2-14.Gili, J.J., and Hyman, P. 2010. Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy. Curr Pharm Biotechnol. 11: 2-14.

GolkarZ, Bagasra O, Pace DG. 2014. Bacteriophage therapy: a potential solution forthe antibiotic resistance crisis. J Infect DevCtries. 2014 Feb 13; 8(2): 129-36.GolkarZ, Bagasra O, Pace DG. 2014. Bacteriophage therapy: a potential solution forthe antibiotic resistance crisis. J Infect DevCtries. 2014 Feb 13; 8 (2): 129-36.

Guttman, B., Raya, P., and Kutter, E. 2005. Basic phage biology. In Bacteriophages: biology and application, E.B., Kutter, and A., Sulakvelidze, eds. (Boca Raton (FL): CRC Press), pp. 29-66.Guttman, B., Raya, P., and Kutter, E. 2005. Basic phage biology. In Bacteriophages: biology and application, E.B., Kutter, and A., Sulakvelidze, eds. (Boca Raton (FL): CRC Press), pp. 29-66.

Kahankova, J., Pantucek, R., Goerke, C., Ruzickova, V., Holochova, P., Doskar, J. 2010. Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modulargenome structure. Environ. Microbiol. 12: 2527-2538.Kahankova, J., Pantucek, R., Goerke, C., Ruzickova, V., Holochova, P., Doskar, J. 2010. Multilocus PCR typing strategy for differentiation of Staphylococcus aureus siphoviruses reflecting their modulargenome structure. Environ. Microbiol. 12: 2527-2538.

Łobocka, M.B., Rosę, D.J., Plunkett, G. 3rd, Rusin, M., Samojedny, A., Lehnherr, H., Yarmolinsky, M.B., and Blattner, F.R. 2004. Genome of bacteriophage P1. J. Bacteriol 186, 7032-7068.Łobocka, M.B., Rosa, D.J., Plunkett, G. 3rd, Rusin, M., Samojedny, A., Lehnherr, H., Yarmolinsky, M.B., and Blattner, F.R. 2004. Genome of bacteriophage P1. J. Bacteriol 186, 7032-7068.

PL 236 569 B1PL 236 569 B1

Łobocka, M., Hejnowicz, M.S., Dąbrowski, K., Gozdek, A., Kosakowski, J., Witkowska, M., Ulatowska, M.I., Weber-Dąbrowska, B., Kwiatek, M., Parasion, S., Gawor, J., Kosowska, H., Głowacka, A. 2012. Genomics of staphylococcal Twort-like phages-potential therapeutics of the post-antibiotic era. Adv Virus Res. 83, 143-216.Łobocka, M., Hejnowicz, MS, Dąbrowski, K., Gozdek, A., Kosakowski, J., Witkowska, M., Ulatowska, MI, Weber-Dąbrowska, B., Kwiatek, M., Parasion, S., Gawor, J., Kosowska, H., Głowacka, A. 2012. Genomics of staphylococcal Twort-like phages-potential therapeutics of the post-antibiotic era. Adv Virus Res. 83, 143-216.

Łobocka M., Hejnowicz M. S., Gągała U., Weber-Dąbrowska B., Węgrzyn G., Dadlez M. 2014. The first step to bacteriophage therapy - how to choose the correct phage. In.: Phage Therapy. Current Research and Applications. Borysowski J., Międzybrodzki R., Górski, A. (ed.). Caister Academic Press, pp. 23-69.Łobocka M., Hejnowicz M. S., Gągała U., Weber-Dąbrowska B., Węgrzyn G., Dadlez M. 2014. The first step to bacteriophage therapy - how to choose the correct phage. In .: Phage Therapy. Current Research and Applications. Borysowski J., Międzybrodzki R., Górski, A. (ed.). Caister Academic Press, pp. 23-69.

Masters, M. 2004. Transduction: host DNA transfer by bacteriophages. In The Desk Encyclopedia of Microbiology, M. Schaechter, eds. (London, UK: Elsevier Academic Press), pp. 1000-1012.Masters, M. 2004. Transduction: host DNA transfer by bacteriophages. In The Desk Encyclopedia of Microbiology, M. Schaechter, eds. (London, UK: Elsevier Academic Press), pp. 1000-1012.

Merabishvili, M., Pirnay, J.P., Verbeken, G., Chanishvili, N., Tediashvili, M., Lashkhi, N., Glonti, T., Krylov, V., Mast, J., Van Parys, L., Lavigne, R., Volckaert, G., Mattheus, W., Verween, G., De Corte, P., Rose, T., Jennes, S., Zizi, M., De Vos, D., and Vaneechoutte, M. 2009. Quality-controlled smallscale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One. 4, e4944.Merabishvili, M., Pirnay, JP, Verbeken, G., Chanishvili, N., Tediashvili, M., Lashkhi, N., Glonti, T., Krylov, V., Mast, J., Van Parys, L., Lavigne, R., Volckaert, G., Mattheus, W., Verween, G., De Corte, P., Rose, T., Jennes, S., Zizi, M., De Vos, D., and Vaneechoutte, M. 2009. Quality-controlled smallscale production of a well-defined bacteriophage cocktail for use in human clinical trials. PLoS One. 4, e4944.

Nirmal Kumar GP, Sundarrajan S, Paul VD, Nandini S, Saravanan RS, Hariharan S, Sriram B, Padmanabhan S. 2012. Use of prophage free host for achieving homogenous population of bacteriophages: new findings. Virus Res. 169: 182-187.Nirmal Kumar GP, Sundarrajan S, Paul VD, Nandini S, Saravanan RS, Hariharan S, Sriram B, Padmanabhan S. 2012. Use of prophage free host for achieving homogenous population of bacteriophages: new findings. Virus Res. 169: 182-187.

Pantucek R, Doskar J, Ruzickova V, Kasparek P, Oracova E, Kvardova V, Rosypal S. 2004. Identification of bacteriophage types and their carriage in Staphylococcus aureus. Arch Virol. 149: 1689-1703.Pantucek R, Doskar J, Ruzickova V, Kasparek P, Oracova E, Kvardova V, Rosypal S. 2004. Identification of bacteriophage types and their carriage in Staphylococcus aureus. Arch Virol. 149: 1689-1703.

Claims

Patent claims

1. Staphylococcus aureus strain devoid of prophages and plasmids, the strain of Staphylococcus aureus 6409wphpl deposited in PCM as B / 00073.

2. A Staphylococcus aureus strain characterized by having a bacterial chromosome containing DNA with the sequence Seq. No. 2.

A method of obtaining a bacteriophage preparation, especially a therapeutic one, characterized in that the bacteriophage strain specific for Staphylococcus aureus is propagated in the culture of the Staphylococcus aureus strain devoid of prophages and plasmids according to claim 1. 1 or 2, and then the amplified phages are isolated from the obtained lysate, the obtained bacteriophage preparations are devoid of contamination with benign phages and plasmid DNA.