PL236415B1

PL236415B1 - System for passive splitting of droplets to emulsion and emulsion marks and the method for passive division of droplets to emulsion and emulsion marks

Info

Publication number: PL236415B1
Application number: PL420615A
Authority: PL
Inventors: Witold Postek; Tomasz KAMIŃSKI; Tomasz Kamiński; Piotr Garstecki
Original assignee: Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-02-22
Publication date: 2021-01-11
Also published as: PL420615A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest układ do pasywnego podziału kropli na emulsje, obejmujący: kanał główny (103), umożliwiający przepływ cieczy od wlotu do wylotu kanału głównego (103), to jest w kierunku przepływu, przy czym w kanale głównym (103) znajduje się przewężenie (104), to jest fragment kanału głównego (103), na którym pole przekroju poprzecznego tego kanału jest znacznie mniejsze niż w obydwu odcinkach kanału głównego (103) bezpośrednio sąsiadujących z tym fragmentem przed i za nim, patrząc w kierunku przepływu, szerokość i wysokość kanału głównego kwadratowego w przekroju poprzecznym wynosi od 1 µm do 5000 µm, korzystnie od 100 do 600 µm, szerokość przewężenia (104) jest równa szerokości kanału głównego (103), głębokość przewężenia (104) wynosi pomiędzy 0,1% a 25% szerokości kanału, korzystnie 5% do 10% szerokości kanału, trójdzielne złącze mikroprzepływowe umiejscowione za przewężeniem (104), patrząc w kierunku przepływu oraz przewód wyprowadzający, do odprowadzania cieczy z trójdzielnego złącza przepływowego. Przedmiotowy układ charakteryzuje się tym, że kanał główny (103) obejmuje pochylnię (101), to jest prowadzący do przewężenia (104), odcinek o stale zmniejszającym się co najmniej jednym wymiarze poprzecznym, to jest wymiarze mierzonym w kierunku prostopadłym do kierunku przepływu. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób pasywnego podziału kropli na emulsje, realizowany w przedmiotowym układzie.The subject of the application is a system for passively dividing drops into emulsions, including: the main channel (103), enabling the flow of liquid from the inlet to the outlet of the main channel (103), i.e. in the direction of flow, with a narrowing in the main channel (103) ( 104), i.e. a fragment of the main channel (103), in which the cross-sectional area of this channel is much smaller than in both sections of the main channel (103) directly adjacent to this fragment before and after it, looking in the direction of flow, the width and height of the channel main square in cross-section is from 1 µm to 5000 µm, preferably from 100 to 600 µm, the width of the constriction (104) is equal to the width of the main channel (103), the depth of the constriction (104) is between 0.1% and 25% of the channel width , preferably 5% to 10% of the channel width, a three-part microfluidic connector located behind the constriction (104), looking in the direction of flow, and an outlet conduit for draining liquid from the three-part flow connector. The present system is characterized in that the main channel (103) includes a ramp (101), i.e. leading to the narrowing (104), a section with constantly decreasing at least one transverse dimension, i.e. a dimension measured in the direction perpendicular to the direction of flow. The subject of the application is also a method of passively dividing drops into emulsions, implemented in the system in question.

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest układ do pasywnego podziału wielu kropli na emulsje monodyspersyjnych kropli zawieszonych w fazie ciągłej i znakowania każdej wygenerowanej emulsji przez kolejność w sekwencji emulsji oddzielonych od siebie wzajemnie trzecią, niemieszającą się z pozostałymi fazami, fazą, a także sposób pasywnego podziału kropli na emulsje i znakowania emulsji oraz sposób pasywnego podziału kropli na emulsje i znakowania emulsji z wykorzystaniem tego układu.The subject of the invention is a system for passively dividing multiple drops into emulsions of monodisperse drops suspended in a continuous phase and marking each generated emulsion by the sequence in the sequence of emulsions separated from each other by the third, immiscible with other phases, as well as a method of passively dividing the drops into emulsions and marking of emulsions and a method of passive division of drops into emulsions and marking of emulsions using this system.

Rozwiązania będące przedmiotem wynalazku, w połączeniu z modułami mikroprzepływowymi znanymi w stanie techniki - na przykład opisanymi w poprzednich zgłoszeniach wynalazków zespołu prof. Piotra Garsteckiego (opublikowane zgłoszenia polskie nr P-390250, P-390251, P-393619 oraz zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/PL2011/050002) mogą służyć do przeprowadzania wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeprowadzonych w kroplach o pikolitrowych (subnanolitrowych) objętościach, w których mogą znajdować się pojedyncze komórki lub pojedyncze molekuły. Reakcje na pojedynczych komórkach mają olbrzymi potencjał w diagnostyce i w badaniach nad heterogenicznymi populacjami jak np. tkanki nowotworowe czy środowiskowe próbki mikrobiologiczne. W ostatnich latach eksperymenty przeprowadzone na pojedynczych komórkach stają się podstawą badań w takich dziedzinach jak biologia systemowa, genomika czy metabolomika. Ponadto pikolitrowe krople uzyskane w naszych układach mogą służyć jako platforma do prowadzenia reakcji na pojedynczych cząsteczkach biologicznych takich jak enzymy czy sekwencje kwasów nukleinowych. Reakcje takie są podstawą prowadzenia ukierunkowanej ewolucji enzymów czy reakcji cyfrowego PCR (ang. Polymerase Chain Reaction) - np. US RE41.780E.The solutions that are the subject of the invention, in combination with microfluidic modules known in the art - for example described in previous inventions applications of the team of prof. Piotr Garstecki (published Polish applications no. P-390250, P-390251, P-393619 and international application no. PCT / PL2011 / 050002) can be used to conduct high-throughput screening tests carried out in drops with picolitre (subnanoliter) volumes in which there may be single cells or single molecules. Single cell reactions have enormous potential in diagnostics and in research on heterogeneous populations such as cancerous tissues or environmental microbiological samples. In recent years, single-cell experiments have become the basis of research in areas such as systems biology, genomics and metabolomics. In addition, the picoliter drops obtained in our systems can serve as a platform for carrying out reactions on single biological molecules such as enzymes or nucleic acid sequences. Such reactions are the basis for the directed evolution of enzymes or digital PCR (Polymerase Chain Reaction) - eg US RE41.780E.

Metoda „Microfluidic Step Emulsification (MSE) (np. T. Kawakatsu et al., J. Am. Oil Chem. Soc., 1997, 74, 317-321.; S. Sugiura et. al., Langmuir, 2002, 18, 3854-3859) pozwala na otrzymywanie w układach mikroprzepływowych emulsji, charakteryzujących się wysokim stopniem monodyspersyjności: podczas odrywania się kolejnych kropli do fazy rozproszonej emulsji w miejscu odrywania panują zbliżone warunki hydrodynamiczne, zatem otrzymane krople emulsji cechuje zbliżona do siebie nawzajem objętość. Jednym z potencjalnych zastosowań MSE jest możliwość wykorzystania opartych na MSE układów mikroprzepływowych w badaniach diagnostycznych, na przykład w badaniach opartych na cyfrowej reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych, droplet digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) (np. B. J. Hindson et al., Anal. Chem., 2011,83, 8604-8610). Metoda MSE może zostać wykorzystana do tworzenia bibliotek kropel, czyli emulsji złożonych z kilkuset, kilku tysięcy kropel o jednakowym składzie chemicznym. Wykorzystanie wielu bibliotek kropel o różniącym się stężeniu kwasów nukleinowych w badaniu opartym na ddPCR pozwala na zredukowanie całkowitej liczby kropel użytych do badania bez zmniejszenia zakresu dynamicznego badania w porównaniu do ddPCR opartego na jednej emulsji otrzymanej z pojedynczej próbki (o jednym stężeniu kwasów nukleinowych) (P. R. Dębski et al., Anal. Chem., 2015, 87, 8203-8209).Method "Microfluidic Step Emulsification (MSE) (e.g. T. Kawakatsu et al., J. Am. Oil Chem. Soc., 1997, 74, 317-321; S. Sugiura et. Al., Langmuir, 2002, 18) , 3854-3859) allows to obtain emulsions characterized by a high degree of monodispersity in microfluidic systems: during the detachment of successive drops into the dispersed phase of the emulsion, similar hydrodynamic conditions prevail at the point of detachment, so the obtained emulsion drops have a similar volume to each other. One potential application of MSE is the possibility of using MSE-based microfluidic systems in diagnostic research, for example, in research based on a digital nucleic acid amplification reaction, digital Polymerase Chain Reaction (ddPCR) droplet (eg, BJ Hindson et al., Anal. Chem. , 2011.83, 8604-8610). The MSE method can be used to create drop libraries, i.e. emulsions composed of several hundred or several thousand drops of the same chemical composition. The use of multiple drop libraries with differing nucleic acid concentrations in a ddPCR-based assay reduces the total number of drops used in the assay without reducing the dynamic range of the assay compared to ddPCR based on a single emulsion obtained from a single sample (with one nucleic acid concentration) (PR Dębski et al., Anal. Chem., 2015, 87, 8203-8209).

Do wygenerowania emulsji w układzie mikroprzepływowym przy użyciu MSE niezbędne są źródła ciśnienia, które wymuszą przepływ płynów w układzie. Powszechne jest wykorzystywanie do tego dwóch źródeł przepływu np. pomp strzykawkowych. Jedna pompa w takim systemie doprowadza fazę rozproszoną do elementu geometrii przewężenia (zwanego dalej „emulsyfikatorem”) układu, który to element wymusza odrywanie się kropli dostarczanej fazy rozproszonej do emulsji. Druga pompa doprowadza fazę ciągłą do miejsca w układzie położonego bezpośrednio w dół strumienia przepływu od emulsyfikatora. Doprowadzana faza ciągła powoduje odepchnięcie powstających kropli emulsji od emulsyfikatora i gwarantuje zbliżone warunki fizyczne odrywania się każdej kropli, a przez to wysoki stopień monodyspersyjności emulsji (np. N. Mittal et al., Phys. Fluids, 2014, 26, 082109; K. van Dijke et al., Lab Chip, 2009, 9, 2824-2830; E. Amstad et al., Lab Chip, 2016, 16, 4163-4172).To generate an emulsion in a microfluidic system using MSE, pressure sources are needed to force the system fluids to flow. It is common to use two flow sources for this, e.g. syringe pumps. One pump in such a system supplies the dispersed phase to an element of the throat geometry (hereinafter referred to as the "emulsifier") of the system, which element forces the droplets of the supplied dispersed phase to detach into the emulsion. A second pump brings the continuous phase to a location in the system immediately downstream of the emulsifier. The infused continuous phase causes the resulting emulsion drops to be pushed away from the emulsifier and guarantees similar physical conditions for the detachment of each drop, and thus a high degree of monodispersity of the emulsion (e.g. N. Mittal et al., Phys. Fluids, 2014, 26, 082109; K. van Dijke et al., Lab Chip, 2009, 9, 2824-2830; E. Amstad et al., Lab Chip, 2016, 16, 4163-4172).

Jeżeli faza ciągła nie jest dostarczana, krople emulsji odrywane przez emulsyfikator nie oddalają się od niego. Kolejne krople, które przechodzą przez emulsyfikator, stykają się podczas procesu odrywania do emulsji z uprzednio wygenerowanymi kroplami. Stykanie się generowanej w emulsyfikatorze kropli z poprzednio wygenerowanymi kroplami prowadzi do wysokiej polidyspersyjności emulsji, a zatem do pogorszenia jakości emulsji.If the continuous phase is not supplied, the droplets of emulsion detached by the emulsifier do not move away from it. The successive droplets which pass through the emulsifier contact the previously generated droplets during the detachment process into the emulsion. Contact of the droplets generated in the emulsifier with the previously generated droplets leads to a high polydispersity of the emulsion and thus to a deterioration of the quality of the emulsion.

Alternatywnie wobec pompy strzykawkowej jako źródła fazy ciągłej do odpychania generowanych kropli od emulsyfikatora stosuje się: grawitacyjne odpychanie kropli od emulsyfikatora oparte na różnicy gęstości między kroplami a fazą ciągłą (F. Dutka et al., Lab Chip, 2016, 16, 2044-2049), odpychanie kropli oparte na różnicy gęstości w sztucznym polu grawitacyjnym wytworzonym w wirówce (F. SchulerAs an alternative to a syringe pump, the following is used as a source of continuous phase to repel the generated droplets from the emulsifier: gravitational repulsion of the droplets from the emulsifier based on the difference in density between the droplets and the continuous phase (F. Dutka et al., Lab Chip, 2016, 16, 2044-2049) droplet repulsion based on the difference in density in the artificial gravitational field generated in the centrifuge (F. Schuler

PL 236 415 B1 et al., Lab Chip, 2015, 15, 2759-2766), odciąganie przez magnes kropli emulsji tworzonej przez ferrofluid (ciecz magnetyczną) (S. Kahkeshani i D. Di Carlo, Lab Chip, 2016, 16, 2474-2480), samoczynną ucieczkę kropli opartą na preferencji kropli do pozostania w sferycznym kształcie w układach o zróżnicowanej wysokości kanałów (R. Dangla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110, 853-858). Jeżeli układ mikroprzepływowy ma pozostać zorientowany w jednej płaszczyźnie, co jest pożądane ze względu na łatwość wytworzenia, obserwacji i użytkowania takiego układu lub w przypadku małych różnic gęstości pomiędzy fazą kroplową a fazą ciągłą metody grawitacyjne są wykluczone. Ponadto, grawitacyjne usuwania kropel z progu przebiega stosunkowo wolno, co z kolei ogranicza częstotliwość tworzenia kropel w emulsyfikatorze. Metody oparte na ferrofluidach mają zastosowanie ograniczone tylko do cieczy o własnościach magnetycznych, zaś metoda oparta na samoczynnej ucieczce kropli z emulsyfikatora cechuje się niską częstotliwością generacji kropel w odniesieniu do pozostałych metod odpychania kropli z emulsyfikatora. Zatem głównym sposobem odpychania kropli od emulsyfikatora w układzie zorientowanym w jednej płaszczyźnie jest wykorzystanie dwóch źródeł ciśnienia, co podnosi koszty metody oraz komplikuje projekt i zastosowanie układów mikroprzepływowych.PL 236 415 B1 et al., Lab Chip, 2015, 15, 2759-2766), pumping through the magnet a drop of an emulsion formed by ferrofluid (magnetic liquid) (S. Kahkeshani and D. Di Carlo, Lab Chip, 2016, 16, 2474 -2480), spontaneous droplet escape based on the drop preference to stay spherical in shape in systems with varying channel heights (R. Dangla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013, 110, 853-858). If the microfluidic system is to remain oriented in one plane, which is desirable for ease of manufacture, observation and use of such a system, or in the case of small differences in density between the drip phase and the continuous phase, gravity methods are excluded. Moreover, gravity droplet removal from the sill is relatively slow, which in turn limits the frequency of droplet formation in the emulsifier. The methods based on ferrofluids are only applicable to liquids with magnetic properties, while the method based on the spontaneous escape of droplets from the emulsifier is characterized by a low frequency of droplet generation compared to other methods of repelling droplets from the emulsifier. Thus, the main way to push the droplets away from the emulsifier in a one-plane oriented system is to use two pressure sources, which adds cost to the method and complicates the design and application of microfluidic systems.

Wygenerowane przy użyciu MSE emulsje mogą być przechowywane w tym samym układzie mikroprzepływowym, w którym zostały wygenerowane, lub poza nim. Wygenerowanie wielu bibliotek kropel (tj. szeregu emulsji różniących się składem chemicznym) w jednym układzie mikroprzepływowym przy zastosowaniu MSE nie zostało dotąd zaprezentowane. Geometrie emulsyfikatorów do MSE zakładają, że stosunkowo płytki i szeroki kanał dostarczający fazę rozproszoną znajduje ujście do głębszego kanału lub zbiornika zawierającego fazę ciągłą. Aby wiele kropli wygenerowanych w danym układzie mikroprzepływowym mogło zostać zamienionych w wiele emulsji w tym samym układzie zawierającym emulsyfikator oparty na MSE, płytki kanał doprowadzający musiałby być długi. Długi i płytki kanał generowałby znaczne opory przepływu oraz zwiększałby ryzyko zwilżania fazy rozproszonej (R. Dreyfus et al., Phys. Rev. Lett., 2003, 90, 144-505) do ścianek kanału oraz samoistnego i przedwczesnego podziału kropel na mniejsze podobjętości. Te niekorzystne zjawiska w dużej mierze utrudniałaby kontrolę nad kroplami.The emulsions generated using MSE can be stored in the same microfluidic system in which they were generated or outside of it. The generation of multiple drop libraries (i.e. a series of emulsions differing in chemical composition) in a single microfluidic system using MSE has not yet been demonstrated. The geometries of MSE emulsifiers assume that the relatively shallow and wide channel supplying the dispersed phase opens into a deeper channel or vessel containing the continuous phase. In order for many droplets generated in a given microfluidic system to be converted into multiple emulsions in the same system containing an MSE based emulsifier, the shallow delivery channel would need to be long. A long and shallow channel would generate considerable flow resistance and increase the risk of wetting the dispersed phase (R. Dreyfus et al., Phys. Rev. Lett., 2003, 90, 144-505) to the channel walls and spontaneous and premature division of the droplets into smaller volumes. These unfavorable phenomena would largely hamper the control of the drops.

Biblioteki kropel (emulsje powstałe z kolejnych kropel) zazwyczaj ulegają wymieszaniu ze sobą w szerokim kanale umiejscowionym za emulsyfikatorem. Aby odróżnić od siebie biblioteki kropel o odmiennym składzie chemicznym wygenerowane przy użyciu MSE, należy każdą z tych bibliotek/emulsji oznakować. Możliwe jest wykorzystanie znaczników chemicznych, na przykład barwników fluorescencyjnych: jednego barwnika w różnych stężeniach w kolejnych bibliotekach kropel lub kombinacji wielu barwników w kolejnych bibliotekach kropel. Poza tym możliwe jest zastosowanie na przykład cząsteczek kwasów nukleinowych o zróżnicowanej sekwencji zasad azotowych jako znaczników kolejnych bibliotek kropel. Biblioteki kropel można także indeksować przestrzennie, to jest odizolować je od siebie na przykład w probówkach lub płytkach wielodołkowych zanim wymieszają się ze sobą. Ponadto izolacja przestrzenna bibliotek pozwala na zahamowanie niepożądanej dyfuzji reagentów (zwłaszcza substancji hydrofobowych) między poszczególnymi kroplami emulsji. Izolowanie od siebie bibliotek kropel w probówkach czy płytkach wielodołkowych wymaga nakierowania każdej kolejnej emulsji do swojego desygnowanego naczynia. Operacja ta może być przeprowadzana za pomocą przewodu przemieszczanego manualnie lub za pomocą sterowanego komputerowo robota - podajnika, co związane jest z niekorzystnym wydłużeniem czasu trwania eksperymentu oraz z dodatkowym kosztem zakupu systemu zautomatyzowanego.Drop libraries (emulsions made up of successive droplets) are usually mixed together in a wide channel located behind the emulsifier. In order to distinguish from each other drop libraries of different chemical composition generated using MSE, each of these libraries / emulsions should be labeled. Chemical markers such as fluorescent dyes may be used: one dye at different concentrations in successive drop libraries or a combination of multiple dyes in successive drop libraries. In addition, it is possible to use, for example, nucleic acid molecules with a different sequence of nitrogen bases as markers for successive drop libraries. Drop libraries can also be spatially indexed, that is, isolate them from each other, for example, in test tubes or multi-well plates, before mixing them together. Moreover, spatial isolation of libraries allows to inhibit undesirable diffusion of reagents (especially hydrophobic substances) between individual drops of emulsion. Isolating drop libraries in test tubes or multi-well plates from each other requires targeting each successive emulsion to its designated vessel. This operation can be carried out by means of a manually moved cable or by a computer-controlled robot - a feeder, which is associated with the unfavorable extension of the duration of the experiment and the additional cost of purchasing an automated system.

Celem wynalazku jest zaproponowanie sposobu, który pozwoliłby na wygenerowanie wielu emulsji monodyspersyjnych kropel w układzie zorientowanym w jednej płaszczyźnie (może ona być dowolna), co ułatwia produkcję układu. Ponadto bez użycia dodatkowego źródła ciśnienia możliwe jest odpychanie kropli emulsji od emulsyfikatora, a następnie izolacja przestrzenna poszczególnych emulsji bez konieczności użycia probówek lub płytek wielodołkowych. Celem wynalazku jest także zaproponowanie układu skonfigurowanego i przeznaczonego do realizacji takiego sposobu.The object of the invention is to propose a method that would allow the generation of multiple monodisperse droplet emulsions in a system oriented in one plane (it can be any), which facilitates the production of the system. Moreover, without the use of an additional pressure source, it is possible to push the emulsion drops away from the emulsifier and then spatially isolate the individual emulsions without the need for test tubes or multi-well plates. It is also an object of the invention to propose a system configured and dedicated to carrying out such a method.

Zgodnie z wynalazkiem układ do pasywnego podziału kropli na emulsje obejmuje:According to the invention, the system for passively splitting the droplets into emulsions comprises:

• kanał główny, umożliwiający przepływ cieczy od wlotu do wylotu kanału głównego, to jest w kierunku przepływu, przy czym w kanale głównym znajduje się przewężenie, to jest fragment kanału głównego, na którym pole przekroju poprzecznego tego kanału jest znacznie mniejsze niż w obydwu odcinkach kanału głównego bezpośrednio sąsiadujących z tym fragmentem przed i za nim, patrząc w kierunku przepływu, szerokość i wysokość kanału głównego kwadratowego w przekroju poprzecznym wynosi od 1 μm do 5000 μm, korzystnie od 100 do 600 μm, szerokość przewężenia jest równa szerokości• main channel allowing liquid to flow from the inlet to the outlet of the main channel, i.e. in the flow direction, the main channel having a narrowing, i.e. a fragment of the main channel, on which the cross-sectional area of this channel is much smaller than in both sections of the channel of the main square immediately adjacent to this part before and after it, viewed in the direction of flow, the width and height of the main square channel in the cross-section is from 1 μm to 5000 μm, preferably from 100 to 600 μm, the width of the narrowing is equal to the width

PL 236 415 B1 kanału głównego, głębokość przewężenia wynosi pomiędzy 0,1% a 25% szerokości kanału, korzystnie 5% do 10% szerokości kanału, • trójdzielne złącze mikroprzepływowe umiejscowione za przewężeniem, patrząc w kierunku przepływu oraz • przewód wyprowadzający, do odprowadzania cieczy z trójdzielnego złącza przepływowego, i charakteryzuje się tym, że kanał główny obejmuje pochylnię, to jest prowadzący do przewężenia odcinek o stale zmniejszającym się co najmniej jednym wymiarze poprzecznym, to jest wymiarze mierzonym w kierunku prostopadłym do kierunku przepływu, przy czym układ mikroprzepływowy zawiera co najmniej jeden kanał przetokowy, biegnący wzdłuż pochylni, z wlotem z kanału głównego do kanału przetokowego umiejscowionym tuż przed pochylnią i wylotem z kanału przetokowego do kanału głównego znajdującym się tuż za przewężeniem, patrząc w kierunku przepływu, przy czym wlot z kanału głównego do kanału przetokowego ma pole przekroju poprzecznego mniejsze niż pole przekroju poprzecznego kanału głównego, a korzystnie posiada dwa lub więcej takich kanałów przetokowych.In the main channel, the throat depth is between 0.1% and 25% of the width of the channel, preferably 5% to 10% of the width of the channel, • a tripartite microfluidic junction located downstream of the restriction, viewed in the flow direction, and • a discharge conduit for draining liquid from a three-way flow connector, and is characterized in that the main channel comprises a ramp, i.e. a section leading to a constriction with a continuously decreasing at least one lateral dimension, i.e. a dimension measured in a direction perpendicular to the flow direction, the microfluidic system comprising at least one fistula canal running along the incline, with an inlet from the main canal to the fistula canal located just in front of the incline and an outlet from the fistula canal to the main canal just after the stricture, viewed in the direction of flow, with the main canal to the fistula inlet having an area cross-sectional area smaller than the cross-sectional area of pop main river channel, and preferably has two or more such fistula channels.

Korzystnie, układ posiada dwa kanały przetokowe, przebiegające symetrycznie po przeciwnych stronach kanału głównego, korzystnie równolegle do kanału głównego.Preferably, the system has two shunt channels, running symmetrically on opposite sides of the main canal, preferably parallel to the main canal.

Korzystnie, długość kanałów przetokowych wynosi od 100% do 4000% szerokości kanału głównego, a korzystniej 2000% szerokości kanału głównego, szerokość kanałów przetokowych wynosi od 1 gm do 3000 gm, a korzystnie 200 gm do 300 gm, głębokość kanałów przetokowych wynosi od 10% do 100% szerokości kanałów przetokowych, a korzystnie ok. 30% szerokości kanałów przetokowych, głębokość wlotów do kanałów przetokowych wynosi 50% do 150% głębokości kanałów przetokowych, korzystnie ok. 75% głębokości kanałów przetokowych.Preferably, the length of the fistula canals is from 100% to 4000% of the width of the main canal, and more preferably 2000% of the width of the main canal, the width of the fistula canals is from 1gm to 3000gm, and preferably 200gm to 300gm, the depth of the fistula canals is from 10% up to 100% of the width of the fistula channels, and preferably approx. 30% of the width of the fistula channels, the depth of the inlets to the fistula channels is 50% to 150% of the depth of the fistula channels, preferably about 75% of the depth of the fistula channels.

Korzystnie, przekrój poprzeczny kanałów przetokowych jest prostokątny.Preferably, the cross section of the fistula channels is rectangular.

Korzystnie, kanał główny posiada prostokątny przekrój poprzeczny, płaskie ściany boczne, płaskie dno i płaską powierzchnię ograniczającą kanał główny od góry, a pochylnia stanowi odcinek kanału głównego o stale zmniejszającej się wysokości, to jest wymiarze mierzonym w kierunku prostopadłym do płaszczyzny, w której zorientowane są kanały.Preferably, the main channel has a rectangular cross-section, flat side walls, a flat bottom and a flat surface delimiting the main channel from above, and the ramp is a section of the main channel of continuously decreasing height, i.e. a dimension measured in a direction perpendicular to the plane in which the ramps are oriented. channels.

Korzystnie, kąt nachylenia powierzchni ograniczającej kanał główny od góry względem płaskiego dna, wynosi od 0,25 do 45 stopni, korzystnie od 1 do 10 stopni, najkorzystniej około 2,5 stopnia.Preferably, the inclination angle of the surface delimiting the main channel from above relative to the flat bottom is from 0.25 to 45 degrees, preferably from 1 to 10 degrees, most preferably about 2.5 degrees.

Korzystnie, kanał główny i ewentualnie kanały przetokowe są zorientowane w jednej płaszczyźnie.Preferably, the main channel and possibly the fistula channels are oriented in one plane.

Korzystnie, układ posiada wlot dla fazy ciągłej do kanału głównego oraz wlot dla fazy rozproszonej do kanału głównego oraz że obydwa te wloty skierowane są prostopadle do płaszczyzny, w której zorientowany jest kanał główny i ewentualnie kanały przetokowe.Preferably, the system has a continuous phase inlet to the main channel and a dispersed phase inlet to the main channel, and both of these inlets are directed perpendicular to the plane in which the main channel and possibly the fistula channels are oriented.

Korzystnie, układ jest wykonany z materiału wybranego z grupy obejmującej: elastomer poli(dimetylosiloksan), poliwęglan, polimetakrylan metylu), teflon, cykliczny kopolimer olefinowy (COC cyclic olefin copolymer), szkło, krzem.Preferably, the system is made of a material selected from the group consisting of: poly (dimethylsiloxane) elastomer, polycarbonate, polymethyl methacrylate, Teflon, cyclic olefin copolymer (COC cyclic olefin copolymer), glass, silicon.

Wynalazek obejmuje także sposób pasywnego podziału kropli na emulsje, realizowany w układzie według wynalazku, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące kroki:The invention also encompasses a passive splitting of the droplets into emulsions, implemented in the system according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:

a) doprowadzenie kanałem głównym kropli-matki, korzystnie z wody, zawieszonej w fazie ciągłej, korzystnie w oleju fluorowanym, do przewężenia;a) leading through the main channel the mother drop, preferably from water, suspended in a continuous phase, preferably in fluorinated oil, to the constriction;

b) przejście kropli-matki przez przewężenie z podziałem kropli-matki na emulsję;b) passage of the mother-drop through the constriction dividing the mother-drop into an emulsion;

c) odprowadzenie emulsji od przewężenia i doprowadzenie jej do jednej gałęzi trójdzielnego złącza mikroprzepływowego;c) leading the emulsion from the throat and feeding it to one branch of the tripartite microfluidic junction;

d) doprowadzenie trzeciej fazy, niemieszającej się z faza ciągłą, korzystnie oleju mineralnego lub skwalanu, do drugiej gałęzi tego trójdzielnego złącza mikroprzepływowego, przy czym trzecia faza zwilża ścianki kanału;d) feeding a third phase, which is immiscible with the continuous phase, preferably mineral oil or squalane, to the second branch of the tripartite microfluidic junction, the third phase wetting the channel walls;

e) skierowanie emulsji w trójdzielnym złączu mikroprzepływowym do przewodu wyprowadzającego i wtłoczenie do tego kanału poprzez trójdzielne złącze mikroprzepływowe trzeciej fazy, bezpośrednio za emulsją.e) forcing the emulsion in the tripartite microfluidic junction into a discharge conduit and forcing it into the conduit through the tripartite microfluidic junction of the third phase immediately downstream of the emulsion.

Korzystnie, sposób jest realizowany w układzie zorientowanym w jednej płaszczyźnie.Preferably, the method is performed in a mono-oriented configuration.

Korzystnie, jako trzecią fazę stosuje się odmienne ciecze dla różnych emulsji.Preferably, different liquids are used for the different emulsions as the third phase.

Poniżej zwięźle wyjaśniono mechanizm działania układu według wynalazku. Zgodnie z wynalazkiem, sposób prowadzi się korzystnie w układzie mikroprzepływowym, który posiada:The operating mechanism of the system of the invention is briefly explained below. According to the invention, the method is preferably carried out in a microfluidic system which has:

- przewężenie w kanale mikroprzepływowym, do którego to przewężenia prowadzi fragment kanału o stale zmniejszającej się wysokości (pochylnia), która pozwala na zastosowanie przed- narrowing in the microfluidic channel, to which narrowing leads a fragment of the channel with a constantly decreasing height (ramp), which allows for use before

PL 236 415 B1 emulsyfikatorem kanału o przekroju znacznie większym niż przekrój przewężenia. Co za tym idzie, przy zastosowaniu przewężenia w głębokim i szerokim kanale, można w nim umieścić wiele kropel, z których w emulsyfikatorze wygenerowane zostaną emulsje. Ze względu na znaczny w stosunku do przewężenia rozmiar kanału, kanał przed przewężeniem nie będzie stawiał znaczących oporów przepływu. W głębokim i szerokim kanale operacje na kroplach, z których mają zostać wygenerowane emulsje (dalej „kroplach-matkach), takie jak mieszanie oraz transport wzdłuż kanału, będą efektywniejsze niż w płytkim i długim kanale. Pochylnia ułatwia kropli-matce przejście w całej objętości przez przewężenie (emulsyfikator) i zapobiega pozostawaniu kropli przed przewężeniem.A channel emulsifier with a cross section much larger than that of the throat. Consequently, by using a constriction in a deep and wide channel, many drops can be placed in it, from which emulsions will be generated in the emulsifier. Due to the significant size of the channel in relation to the constriction, the channel before the constriction will not create significant flow resistance. In the deep and wide channel, operations on the droplets from which emulsions are to be generated (hereinafter "motherdrops"), such as mixing and transport along the channel, will be more effective than in the shallow and long channel. The ramp makes it easier for the mother-dropper to pass through the constriction (emulsifier) in its entire volume and prevents the drops from remaining in the constriction.

- dwa kanały przetokowe, biegnące wzdłuż pochylni, z wlotami umiejscowionymi tuż przed (w odniesieniu do kierunku przepływu) pochylnią i wylotami znajdującymi się tuż za emulsyfikatorem. Kropla-matka nie wpływa do kanałów przetokowych ze względu duży opór przepływu kropli w wąskich kanałach przetokowych - przepływ kropli przez taki kanał wiązałby cię ze znaczącym i energetycznie niekorzystnym rozciągnięciem powierzchni międzyfazowej woda/olej. Natomiast faza ciągła wpływa do wąskich kanałów przetokowych w czasie, kiedy główny kanał (pochylnia) emulsyfikatora jest zablokowany przez dzielącą się kroplę-matkę. Gdy kropla matka przechodzi przez emulsyfikator, odrywane są od niej krople emulsji. Faza ciągła, która przepływa przez kanały przetokowe, odpycha każdą nowopowstającą kroplę emulsji od emulsyfikatora. Powoduje to, że nie jest potrzebne dodatkowe źródło ciśnienia (na przykład pompa strzykawkowa) dedykowana do odpychania kropel emulsji od emulsyfikatora. Dzięki odpychaniu kropel, proces emulsyfikacji jest niezaburzony przez niekorzystne kolizje między kroplami i możliwe jest uzyskanie wysoce monodyspersyjnych emulsji.- two fistula channels, running along the ramp, with inlets located just in front of (in relation to the direction of flow) of the ramp and outlets just behind the emulsifier. The mother drop does not flow into the fistula channels due to the high resistance of the droplet flow in narrow fistula channels - the flow of the drop through such a channel would bind you with a significant and energetically unfavorable stretching of the water / oil interface. On the other hand, the continuous phase flows into the narrow fistula channels at a time when the main channel (ramp) of the emulsifier is blocked by the dividing mother droplet. As the mother drop passes through the emulsifier, the emulsion drops are torn off. The continuous phase, which flows through the fistula channels, pushes every newly formed drop of emulsion away from the emulsifier. As a result, no additional pressure source is needed (e.g. a syringe pump) dedicated to pushing away the emulsion droplets from the emulsifier. Due to the droplet repulsion, the emulsification process is unaffected by unfavorable collisions between the droplets and it is possible to obtain highly monodisperse emulsions.

- trójdzielne złącze mikroprzepływowe umiejscowione za emulsyfikatorem. Z drugiej gałęzi złącza doprowadzana jest trzecia faza (np. olej mineralny), który nie miesza się z fazą ciągłą (np. olej perfluorowany), w którym zawieszona jest emulsja (np. roztwór wodny). Po tym, jak emulsja przejdzie przez złącze, do złącza wprowadza się porcję trzeciej fazy z drugiej gałęzi złącza, co powoduje odizolowanie danej biblioteki kropel od pozostałych bibliotek kropel generowanych w emulsyfikatorze.- three-way microfluidic junction located behind the emulsifier. From the second branch of the junction, a third phase (e.g. mineral oil) is supplied which is immiscible with the continuous phase (e.g. perfluorinated oil) in which the emulsion (e.g. aqueous solution) is suspended. After the emulsion has passed the junction, an aliquot of the third phase from the second branch of the junction is introduced into the junction, which isolates the given drop library from the rest of the drop libraries generated in the emulsifier.

- przewód, którego ścianki zwilża trzecia faza (np. olej mineralny), która oddziela od siebie poszczególne biblioteki kropel, zapewniając w ten sposób szczelność izolacji. Do przewodu kierowane są wygenerowane i odizolowane od siebie monodyspersyjne biblioteki.- a wire, the walls of which are wetted by the third phase (e.g. mineral oil), which separates the individual drop libraries from each other, thus ensuring insulation tightness. The generated and isolated monodisperse libraries are directed to the conduit.

Korzystny przykład wykonania wynalazkuA preferred embodiment of the invention

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:The invention will now be illustrated in more detail in a preferred embodiment with reference to the attached drawings, in which:

fig. 1 przedstawia schemat emulsyfikatora z pochylnią w przekroju podłużnym widzianym z boku wraz z ilustracją emulsyfikacji kropli-matki i zaznaczeniem kierunku przepływu. Na schemacie na pochylnię 101 wpływa z kanału 103 zgodnie z kierunkiem wskazywanym przez strzałkę kropla-matka 102, która podlega emulsyfikacji w przewężeniu emulsyfikatora 104 i zostaje podzielona na mniejsze krople 105, tworzące bibliotekę kropel w dalszej części kanału 106;Fig. 1 is a schematic longitudinal section view of a ramp emulsifier as seen from the side with an illustration of the mother-drop emulsification and the flow direction indicated. In the diagram, ramp 101 flows from channel 103 in the direction of the mother-drop arrow 102, which is emulsified in the constriction of the emulsifier 104 and is broken down into smaller droplets 105, forming a drop library downstream of channel 106;

fig. 2 przedstawia wykonaną z góry fotografię emulsyfikatora 201 z pochylnią 202 i kanałami przetokowymi 203, 204;Figure 2 is a photograph of a top photograph of an emulsifier 201 with a ramp 202 and fistula channels 203, 204;

fig. 3 przedstawia schemat widzianego z góry układu mikroprzepływowego stosowanego w sposobie według wynalazku, na schemacie zaznaczono krople-matki 301, generowane biblioteki kropel 302, i biblioteki kropel odizolowane od siebie nawzajem 303 w przewodzie wyprowadzającym 304;Fig. 3 is a schematic diagram of a top-viewed microfluidic system used in the method of the invention, the diagram shows the mother drops 301, the generated drop libraries 302, and the drop libraries isolated from each other 303 in the lead-out 304;

fig. 4 przedstawia powstającą emulsję kropli 401 odpychanych od emulsyfikatora 402 przez fazę ciągłą doprowadzaną przez wyloty (403, 404) kanałów przetokowych (203, 204, 312, 313);Figure 4 shows the resulting droplet emulsion 401 being repelled from the emulsifier 402 by the continuous phase supplied through the outlets (403, 404) of the fistula channels (203, 204, 312, 313);

fig. 5 przedstawia średnice kolejnych kropli w powstającej emulsji w zależności od zadanej prędkości przepływu fazy ciągłej doprowadzającej kroplę-matkę do emulsyfikatora dla wysokości przewężenia w emulsyfikatorze równej 70 μm;Fig. 5 shows the diameters of successive drops in the formed emulsion as a function of the set flow rate of the continuous phase supplying the droplet to the emulsifier for a throat height in the emulsifier equal to 70 µm;

fig. 6 przedstawia monodyspersyjność biblioteki kropel (mierzoną jako współczynnik zmienności średnicy kropel w wygenerowanej emulsji) w zależności od prędkości przepływu fazy ciągłej doprowadzającej kroplę-matkę do emulsyfikatora dla wysokości przewężenia w emulsyfikatorze równej 70 μm i w zależności od stężenia fluorosurfaktantu PFPE-PEG-PFPE w fazie ciągłej;Fig. 6 shows the monodispersity of the drop library (measured as the coefficient of drop diameter variation in the generated emulsion) depending on the flow velocity of the continuous phase supplying the droplet to the emulsifier for a throat height in the emulsifier equal to 70 μm and depending on the concentration of the PFPE-PEG-PFPE fluorosurfactant in continuous phase;

PL 236 415 B1 fig. 7 przedstawia histogram częstości występowania danych objętości kropli w ośmiu emulsjach wygenerowanych kolejno przy użyciu emulsyfikatora wyposażonego w pochylnię i kanały przetokowe dla wysokości przewężenia w emulsyfikatorze równej 30 μπ;Figure 7 is a frequency histogram for given droplet volumes in eight emulsions successively generated using an emulsifier equipped with a ramp and shunt channels for an emulsifier throat height of 30 Pπ;

fig. 8 przedstawia fotografię przewodu polimerowego 801, wewnątrz którego widoczne są dwie emulsje kropli wodnych w oleju perfluorowanym 802, 803, które to emulsje oddzielone są od siebie trzecią fazą 804 (tu: olejem mineralnym), która nie miesza się z fazą ciągłą (tu: olejem perfluorowanym), w której zawieszone są emulsje i która (olej mineralny) zwilża ścianki przewodu polimerowego.Fig. 8 is a photograph of a polymer conduit 801 inside which two emulsions of water droplets in perfluorinated oil 802, 803 are visible, which emulsions are separated from each other by a third phase 804 (here: mineral oil) which does not mix with the continuous phase (here : perfluorinated oil) in which the emulsions are suspended and which (mineral oil) wets the walls of the polymer conduit.

Schemat układuLayout diagram

Przeprowadzono testowanie wielu wersji geometrii układu, różniące się m. in. kątem nachylenia pochylni do płaszczyzny kanału, przekrojem kanałów przetokowych, długością kanałów przetokowych. Wybrano najbardziej optymalną geometrię układu. Na fig. 3 przedstawiono schemat układu mikroprzepływowego, na którym zaznaczone są:Testing of many versions of the geometry of the system was carried out, which differed, among others, in the inclination angle of the inclination to the plane of the canal, the cross-section of the fistula canals, the length of the fistula canals. The most optimal geometry of the system was selected. Fig. 3 shows a diagram of the microfluidic system, which shows:

305 - złącze trójdzielne typu T, w którym formowane są krople-matki 301 objętości ok. 400 nl w następujący sposób: z jednej gałęzi 306 złącza dostarczana jest faza ciągłą, natomiast z drugiej gałęzi 307 złącza dostarczana jest faza rozproszona. Płyny dostarczane są przez wloty 308, 309 skierowane prostopadle do płaszczyzny, w której zorientowane są pozostałe kanały układu. Płyny dostarczane są ze stałymi prędkościami przepływu przy użyciu pomp strzykawkowych. Na złączu następuje oderwanie kropli-matki od całości fazy rozproszonej;305 - a T-type tripartite junction, in which the mother drops 301 of approximately 400 nl are formed as follows: one branch 306 of the junction is supplied with a continuous phase, and a stray phase is supplied from the other branch 307 of the junction. Fluids are delivered through inlets 308, 309 oriented perpendicular to the plane in which the other channels of the system are oriented. Fluids are delivered at constant flow rates using syringe pumps. At the junction, the mother-drop is detached from the whole of the dispersed phase;

310 - pochylnia prowadząca krople-matki do emulsyfikatora 311. Pochylnia przedstawiona w korzystnym przykładzie wykonania była nachylona względem płaszczyzny układu pod kątem 2,5 stopnia, co niwelowało opory przepływu kropli-matki przez przewężenie emulsyfikatora;310 - a ramp leading the mother droplets to the emulsifier 311. The ramp presented in the preferred embodiment was inclined with respect to the plane of the system at an angle of 2.5 degrees, which eliminated the flow resistance of the mother droplet by the narrowing of the emulsifier;

312, 313 - kanały przetokowe doprowadzające fazę ciągłą do emulsyfikatora i odpychające od niego krople powstającej emulsji;312, 313 - fistula channels supplying the continuous phase to the emulsifier and the droplets of the formed emulsion repelling from it;

314, 315 - wloty do kanałów przetokowych;314, 315 - inlets to fistula canals;

311 - przewężenie emulsyfikatora i powstająca w nim biblioteka kropel (302) ok. 400 kropli o objętości ok. 1 nl każda;311 - constriction of the emulsifier and the drop library formed in it (302) of approx. 400 drops with a volume of approx. 1 nl each;

316 - złącze trójdzielne typu T, z którego gałęzi 317 dostarczana jest faza trzecia niemieszająca się z fazą ciągłą, w której to fazie ciągłej zawieszone są emulsje, i oddzielająca od siebie nawzajem jako separator (318) kolejne formowane emulsje (303). Wylot z układu, oznaczony jako 319, prowadzący do przewodu wyprowadzającego (304, pogrubienie), którego ścianki zwilżane są przez fazę trzecią dostarczaną z gałęzi 317, skierowany jest prostopadle do płaszczyzny, w której zorientowane są pozostałe kanały układu.316 - T-junction, from the branches of which 317 is supplied a third phase that is immiscible with the continuous phase, in which the continuous phase is suspended the emulsions, and separates from each other as a separator (318) successive emulsions (303). The outlet from the system, indicated at 319, leading to the lead-out (304, thick), whose walls are wetted by the third phase supplied from branch 317, is directed perpendicular to the plane in which the other channels of the system are oriented.

W korzystnym przykładzie szerokość i wysokość głównego kanału wynosi 400 μπ (w przekroju poprzecznym mają kształt kwadratowy). Kanały przetokowe oznaczone jako 312 i 313 mają wysokość 40 μπ i szerokość 220 μm. Wloty do kanałów przetokowych oznaczone jako 314 i 315 mają szerokość 170 μm i wysokość 50 μm. Płytkie w stosunku do głównego kanału wloty do kanałów przetokowych uniemożliwiają kropli-matce wpłynięcie do kanału przetokowego i zmuszają ją do wpłynięcia na pochylnię prowadzącą do przewężenia emulsyfikatora.In a preferred example, the width and height of the main channel are 400 µπ (square in cross section). The fistula channels labeled 312 and 313 are 40 µπ high and 220 µm wide. The fistula inlets labeled 314 and 315 are 170 µm wide and 50 µm high. The inlets to the fistula canals, shallow in relation to the main canal, prevent the mother drop from flowing into the fistula canal and force it to flow down the ramp leading to the narrowing of the emulsifier.

Tworzenie emulsji i pomiar średnicy i objętości kropel generowanych emulsjiCreation of an emulsion and measurement of the diameter and volume of droplets of the generated emulsions

Krople generowanej emulsji odrywane są od kropli-matki przy zbliżonych warunkach hydrodynamicznych dzięki wykorzystaniu kanałów przetokowych. Emulsja z tylnej części kropli-matki powstaje przy nieco innych warunkach fizycznych, między innymi ponieważ tylna część kropli matki jest na tyle mała, że zmienia się proporcja fazy ciągłej do fazy rozproszonej w przewężeniu emulsyfikatora. Zatem krople emulsji otrzymanej z tylnej części kropli matki są wyraźnie większe lub mniejsze od pozostałych kropel emulsji. Zwiększenie prędkości przepływu o 300% od 3 ml/h do 12 ml/h spowodowało średni wzrost średnicy kropli w emulsji o ok. 5%.The droplets of the generated emulsion are torn from the mother droplet under similar hydrodynamic conditions thanks to the use of fistula channels. The emulsion from the posterior part of the mother drop is formed under slightly different physical conditions, inter alia, because the rear part of the mother drop is so small that the ratio of the continuous phase to the dispersed phase in the throat of the emulsifier changes. Thus, the drops of the emulsion obtained from the back of the mother drop are clearly larger or smaller than the remaining emulsion droplets. Increasing the flow rate by 300% from 3 ml / h to 12 ml / h resulted in an average increase in the diameter of the droplets in the emulsion by about 5%.

Monodyspersyjność generowanych emulsjiMonodispersity of generated emulsions

Kropla-matka, wpływając na pochylnię, prowadzącą do przewężenia, napotyka coraz większy opór. Opór ten jest związany z panującym wewnątrz kropli-matki ciśnieniem Laplace'a, którego wartość zależy między innymi od promienia krzywizny kropli i napięcia powierzchniowego. Zwiększenie stężeniaDrop-mother, influencing the ramp leading to the narrowing, meets more and more resistance. This resistance is related to the Laplace pressure inside the mother-droplet, the value of which depends, inter alia, on the radius of curvature of the droplet and the surface tension. Increasing the concentration

PL 236 415 B1 surfaktantu w fazie olejowej doprowadza do zmniejszenia napięcia powierzchniowego, a zatem do zmniejszenia ciśnienia Laplace'a w kropli-matce. Niższe ciśnienie Laplace'a oznacza mniejszy opór, który napotyka kropla-matka na pochylni, a zatem większą prędkość kropli-matki w przewężeniu emulsyfikatora. Wyższe stężenie surfaktantu powoduje pogorszenie monodyspersyjności kropel w emulsji, co jest przedstawione na fig. 6.The preparation of the surfactant in the oil phase leads to a reduction in surface tension and thus to a reduction of the Laplace pressure in the mother-drop. Lower Laplace pressure means less resistance that the mother drop encounters on the ramp and therefore a greater velocity of the mother drop in the throat of the emulsifier. Higher surfactant concentration causes deterioration of monodispersity of the droplets in the emulsion, which is shown in Fig. 6.

Monodyspersyjność generowanych kolejno po sobie emulsjiMonodispersity of sequentially generated emulsions

Kolejno generowane w trójdzielnym złączu T krople-matki są oddzielone od siebie nawzajem na tyle, by kropla-matka wpłynęła na pochylnię dopiero po tym, jak poprzednia kropla-matka zostanie całkowicie podzielona na emulsję. Dzięki temu każda emulsja powstaje w zbliżonych warunkach hydrodynamicznych, co zapewnia zbliżoną objętość kropel w każdej kolejno generowanej emulsji. Wysoka monodyspersyjność kropel kolejnych emulsji jest przedstawiona na fig. 7, do którego w korzystnym przykładzie wykonania wynalazku wykorzystano przepływ z kanału 306 równy 0,9 ml/h, z kanału 307 równy 0,03 ml/h, stężenie surfaktantu w fazie ciągłej wynosiło 0,1 % wagowych, a wysokość przewężenia emulsyfikatora to 30 μm. Otrzymano emulsje składające się z 392 ± 9 kropli o przeciętnej średnicy 120 μm (około 900 pl). Całkowity współczynnik zmienności średnic kropel dla ośmiu wygenerowanych emulsji składających się łącznie z 3134 kropel wynosił około 4%. Około 5% kropli miało średnicę poniżej 115 μm (około 800 pl), te krople zawsze powstawały z tylnej części kropli-matki, czyli w innych warunkach hydrodynamicznych niż reszta emulsji. Nie wliczając tych kropli powstałych z tylnej części kropel-matek, współczynnik zmienności średnic kropel generowanych emulsji wynosił mniej niż 1%.The mother-drops sequentially generated in the tripartite T-junction are sufficiently separated from each other for the mother-drop to enter the ramp only after the previous mother-drop has completely broken down into an emulsion. As a result, each emulsion is formed under similar hydrodynamic conditions, which ensures a similar volume of droplets in each successively generated emulsion. The high monodispersity of the droplets of successive emulsions is shown in Fig. 7, where in a preferred embodiment of the invention the flow from channel 306 was 0.9 ml / h, from channel 307 was 0.03 ml / h, the concentration of surfactant in the continuous phase was 0 , 1% by weight, and the height of the throat of the emulsifier is 30 μm. The obtained emulsions consisted of 392 ± 9 drops with an average diameter of 120 µm (about 900 µl). The total coefficient of variation in droplet diameters for the eight generated emulsions consisting of a total of 3134 drops was about 4%. About 5% of the droplets were less than 115 µm in diameter (about 800 µl), these droplets always originated from the back of the mother drop, i.e. under different hydrodynamic conditions than the rest of the emulsion. Not including these droplets formed from the back of the mother droplets, the coefficient of variation in the droplet diameters of the generated emulsions was less than 1%.

Izolacja poszczególnych bibliotek kropelIsolation of individual drop libraries

Emulsje generowane w emulsyfikatorze są kierowane do trójdzielnego złącza, z którego jednej gałęzi dostarczana jest trzecia faza niemieszająca się z fazą ciągłą, w której to fazie ciągłej zawieszone są emulsje, aby służyła jako separator emulsji, zgodnie ze schematem widocznym na fig. 8. Trzecia faza tworząca separator jest wtłaczana do złącza za każdym razem, gdy zemulsyfikowana zostanie kropla-matka.The emulsions generated in the emulsifier are directed to a tripartite junction, from which one branch supplies a third phase immiscible with the continuous phase, in which continuous phase the emulsions are suspended to serve as an emulsion separator according to the scheme shown in Fig. 8. Third phase the separator forming the separator is forced into the connector each time the mother drop is emulsified.

Na fig. 8 widoczne są dwie emulsje kropel zawieszonych w oleju perfluorowanym, oddzielonych od siebie nawzajem olejem mineralnym. Olej mineralny tworzący separator zwilża ścianki przewodu, w którym umieszczone są widoczne na fig. 8 emulsje.Fig. 8 shows two emulsions of droplets suspended in perfluorinated oil, separated from each other by mineral oil. The mineral oil forming the separator wets the walls of the conduit in which the emulsions shown in Fig. 8 are placed.

DyskusjaDiscussion

Dzięki sposobowi według wynalazku można było zastosować układ mikroprzepływowy do produkcji wielu emulsji - bibliotek kropel o wysokim stopniu monodyspersji, zarówno w odniesieniu do pojedynczej emulsji, jak i pomiędzy bibliotekami. Możliwe również jest odizolowanie od siebie i oznaczenie poszczególnych emulsji-bibliotek kropel przez ich kolejność w sekwencji w przewodzie emulsji. Do tej pory generowanie emulsji z wielu postępujących po sobie kropel w układach mikroprzepływowych opartych na MSE było utrudnione ze względu na konieczność użycia długich i płytkich kanałów, które generowały duże opory przepływu i utrudniały mieszanie wewnątrz kropel. Zastosowanie pochylni miejscowo spłycającej kanał mikroprzepływowy rozwiązuje ten problem. Do tej pory wykorzystanie MSE do produkcji emulsji w układach horyzontalnych wiązało się z koniecznością użycia dodatkowego źródł a ciśnienia lub wykorzystania ferrofluidów i magnesu do odpychania lub odciągania kropli powstających emulsji od emulsyfikatora. Zastosowanie kanałów przetokowych biegnących wzdłuż pochylni pozwoliło na otrzymywanie wysoce monodyspersyjnych emulsji bez konieczności użycia dedykowanych do usuwania kropel z emulsyfikatora źródeł ciśnienia lub wykorzystania ferrofluidów i magnesu. Do tej pory przestrzenna izolacja emulsji wymagała manualnego umiejscowienia każdej emulsji w osobnej probówce lub dołku w płytce wielodołkowej. Wykorzystanie trzeciej fazy niemieszającej się z fazą ciągłą, w której zawieszone są emulsje i doprowadzenie tej trzeciej fazy pomiędzy kolejne biblioteki kropel po ich wygenerowaniu umożliwia oznakowanie kolejnych bibliotek kropel przez znajomość ich sekwencji w przewodzie opuszczającym układ mikroprzepływowy.Due to the method of the invention, it was possible to use a microfluidic system to produce multiple emulsions - drop libraries with a high degree of monodispersion, both in relation to a single emulsion and between libraries. It is also possible to isolate and identify individual emulsion drop libraries by their sequence in the sequence in the emulsion duct. Until now, the generation of emulsions from multiple successive droplets in MSE-based microfluidic systems was difficult due to the need to use long and shallow channels, which generated high flow resistance and hindered mixing inside the droplets. This problem is solved by the use of a slope locally shallowing the microfluidic channel. Until now, the use of MSE for the production of emulsions in horizontal systems required the use of an additional source of pressure or the use of ferrofluids and a magnet to repel or pull off the emulsion drops from the emulsifier. The use of fistula channels running along the ramp made it possible to obtain highly monodisperse emulsions without the need to use pressure sources dedicated to removing drops from the emulsifier or the use of ferrofluids and a magnet. Until now, spatial isolation of emulsions required manual placement of each emulsion in a separate test tube or well in a multi-well plate. Using the third phase immiscible with the continuous phase in which the emulsions are suspended and bringing this third phase between successive drop libraries after they have been generated enables subsequent drop libraries to be labeled by knowing their sequence in the conduit exiting the microfluidic system.

PL 236 415 B1PL 236 415 B1

Właściwości układuLayout properties

Układ został wykonany z elastomeru poli(dimetylosiloksanu) Sylgard 184 (Dow Corning, USA) połączonego z płytką szklaną o grubości 1 mm przy użyciu plazmy (Harrick Plasma, USA). Powierzchnia kanałów została zmodyfikowana przy użyciu płynu Novec 1720 (3M, USA). Płyny do układu wtłaczano przy użyciu pomp strzykawkowych Nemesys (Cetoni, Niemcy). Do generacji emulsji użyto kropli wody jako fazy rozproszonej i oleju Novec HFE 7500 (3M, USA) jako fazy ciągłej. W fazie ciągłej rozpuszczony był surfaktant otrzymany według metody opisanej przez Holze et al. (Lab Chip, 2008, 8, 1632-1639). Jako separatora emulsji użyto oleju mineralnego (Sigma, Niemcy) lub w innym korzystnym przykładzie skwalanu (Sigma, Niemcy). Do przechowania izolowanych od siebie emulsji użyto przewodu z polietylenu (Becton Dickinson, USA).The system was made of Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) elastomer (Dow Corning, USA) bonded to a 1 mm thick glass plate using plasma (Harrick Plasma, USA). The surface of the channels was modified using Novec 1720 fluid (3M, USA). Fluids were pumped into the system using Nemesys syringe pumps (Cetoni, Germany). Water drops were used as dispersed phase and Novec HFE 7500 oil (3M, USA) as continuous phase for emulsion generation. The surfactant obtained according to the method described by Holze et al. Was dissolved in the continuous phase. (Lab Chip, 2008, 8, 1632-1639). Mineral oil (Sigma, Germany) or another preferred example of squalane (Sigma, Germany) was used as the emulsion separator. A polyethylene tubing (Becton Dickinson, USA) was used to store the isolated emulsions.

Pomiar rozmiaru kropli generowanych emulsjiMeasurement of the droplet size of the generated emulsions

Proces tworzenia kropli był nagrywany przy użyciu szybkiej kamery (Photron, Japonia). Następnie, przy pomocy oprogramowania do analizy obrazu mierzona była powierzchnia przekroju kropli przechodząca przez środek kropli. Z tej powierzchni obliczano następnie średnicę kropli i jej objętość.The drop formation process was recorded using a high-speed camera (Photron, Japan). Then, the cross-sectional area of the drop passing through the center of the drop was measured with the image analysis software. The droplet diameter and volume were then calculated from this area.

Claims

Patent claims

A microfluidic system for passively splitting the droplets into emulsions, comprising • a main channel (103) allowing liquid to flow from the inlet to the outlet of the main channel (103), i.e. in the direction of flow, the main channel (103) having a constriction ( 104, 311), i.e. the part of the main channel (103) in which the cross-sectional area of this channel is significantly smaller than in the two sections of the main channel (103) immediately adjacent to this part upstream and downstream from it, viewed in the flow direction, the width and the height of the square main channel in cross-section is from 1 μm to 5000 μm, preferably from 100 to 600 μm, the width of the throat (104, 311) is equal to the width of the main channel (103), the depth of the throat (104, 311) is between 0.1 % a 25% of the width of the channel, preferably 5% to 10% of the width of the channel, • a tripartite microfluidic connector (316) located downstream of the constriction (104, 31) as viewed in the flow direction and • a discharge conduit (304), d o draining liquid from the three-way flow connector (316), characterized in that the main channel (103) comprises a ramp (101, 202, 310), i.e. a section leading to a narrowing (104, 311) with at least one transverse dimension continuously decreasing, to is a dimension measured perpendicular to the flow direction, the microfluidic system including at least one fistula channel (203, 204, 312, 313), running along the ramp (101, 202, 310), with an inlet (314, 315) from the channel the main (103) to the fistula (203, 204, 312, 313) located just in front of the incline (101, 202, 310) and the outlet (403, 404) from the fistula (203, 204, 312, 313) to the main canal ( 103) immediately downstream of the constriction (104, 311) as seen in the flow direction, the inlet (314, 315) from the main channel (103) to the fistula channel (203, 204, 312, 313) having a cross-sectional area less than cross-sectional area of the main channel (103), and preferably has two or w more of such fistulas (203, 204, 312, 313).

2. The system according to claim The method of claim 1, characterized in that it has two fistula channels (203, 204, 312, 313) running symmetrically on opposite sides of the main channel (103), preferably parallel to the main channel (103).

The system according to p. 2. The method of claim 2, characterized in that the length of the fistula channels (203, 204, 312, 313) is from 100% to 4000% of the width of the main channel (103), preferably 2000% of the width of the main channel (103), the width of the fistula channels (203, 204). , 312, 313) is from 1 μm to 3000 μm, and preferably 200 μm to 300 μm, the depth of the fistula canals (203, 204, 312, 313) is 10% to 100% of the width of the fistula canals (203, 204, 312,

PL 236 415 B1

313), preferably approx. 30% of the width of the fistula channels (203, 204, 312, 313), the depth of the inlets (314, 315) to the fistula channels (203, 204, 312, 313) is 50% to 150% of the depth of the fistula channels (203, 204, 312, 313), preferably about 75% of the depth of the fistula canals (203, 204, 312, 313).

4. The system according to p. The method of claim 2 or 3, characterized in that the cross-section of the fistula channels (203, 204, 312, 313) is rectangular.

5. System according to any of the preceding claims. from 1 to 4, characterized in that the main channel (103) has a rectangular cross-section, flat side walls, a flat bottom and a flat surface delimiting the main channel (103) from above, and the ramp (101, 202, 310) is a section of the main channel (103) of continuously decreasing height, that is, a dimension measured in a direction perpendicular to the plane in which the channels are oriented.

6. The system according to p. 5. A method as claimed in claim 5, characterized in that the slope angle of the surface delimiting the main channel (103) from above relative to the flat bottom is from 0.25 to 45 degrees, preferably from 1 to 10 degrees, most preferably about 2.5 degrees.

System according to any of the preceding claims. characterized in that the main channel (103) and possibly the fistula channels (203, 204, 312, 313) are oriented in one plane.

8. The system according to p. A continuous phase inlet (308) to the main channel (103) and a dispersed phase inlet (309) to the main channel (103), and both of these inlets are directed perpendicular to the plane in which the channel is oriented. main (103) and possibly fistula canals (203, 204, 312, 313).

The system according to p. A method according to any of the claims 1 to 8, characterized in that it is made of a material selected from the group consisting of: poly (dimethylsiloxane) elastomer, polycarbonate, poly (methyl methacrylate), teflon, cyclic olefin copolymer (COC cyclic olefin copolymer), glass, silicon.

10. A method for passively breaking the droplets into emulsions, implemented in the system according to any of claims 1 to 9, comprising the following steps:

a) feeding through the main channel (103) the mother drop (102, 301), preferably of water, suspended in a continuous phase, preferably in a fluorinated oil, to the constriction (104, 311);

b) passing the mother droplet (102, 301) through the constriction (104, 311) with the division of the mother droplet (102, 301) into an emulsion (401,802, 803);

c) leading the emulsion (401, 802, 803) from the throat (104, 311) and feeding it to one branch of the triple microfluidic junction (316);

d) feeding a third phase (804), non-miscible with the continuous phase, preferably mineral oil or squalane, to a second branch (317) of the tripartite microfluidic connector (316), the third phase wetting the walls of the channel (319);

e) directing the emulsion (401, 802, 803) in the triple microfluidic junction (316) into the discharge conduit (304) and forcing it into this conduit through the triple microfluidic junction (316) of the third phase (804), immediately after the emulsion (401,802, 803) .

11. The method according to p. 10. The process of claim 10, characterized in that it is implemented in an orientation in a single plane.

12. The method according to p. Process according to claim 10 or 11, characterized in that different liquids for the different emulsions (401, 802, 803) are used as the third phase (804).