PL235927B1 - Urządzenie mikrofluidalne do generowania uszkodzeń sieci neuronów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zamknięte, wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne do generowania uszkodzeń sieci neuronów (bioczip) ze zintegrowanym mechanizmem uszkadzania aksonów oraz rozłączną podstawą do prowadzenia hodowli komórek nerwowych (neuronów) w zorganizowany przestrzennie sposób, w warunkach przepływowych oraz prowadzenia badań neurologicznych. Mikrourządzenie znajduje zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii i inżynierii biomedycznej. Umożliwia prowadzenie badań w kontrolowanych warunkach, w szczególności kontrolowanego wzrostu komórek nerwowych oraz tworzenia sieci połączeń o kontrolowanej strukturze, kontrolowanego uszkadzania i regeneracji uszkodzeń aksonów, jak również badań wpływu czynników biologicznych, chemicznych i fizycznych na proces regeneracji połączeń nerwowych. W szczególności, urządzenie przeznaczone jest do badań i symulacji zjawisk towarzyszących chorobom neurodegeneracyjnym.

Neurony to komórki nerwowe zdolne do przetwarzania i przewodzenia informacji w postaci sygnału elektrycznego. Neurony są podstawowym elementem układu nerwowego ludzi i zwierząt, w szczególności ośrodkowego układu nerwowego, w skład którego wchodzi mózgowie oraz rdzeń kręgowy. Neuron zbudowany jest z ciała komórki (soma) oraz odchodzących od niego wypustek: aksonu i dendrytów. Neurony kontaktują się między sobą poprzez synapsy tworząc sieci neuronowe. Nieprawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego, będące wynikiem zaburzeń przewodzenia bodźców elektrycznych w sieciach neuronowych jest przyczyną nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych takich jak: stwardnienie zanikowe boczne (choroba Charcota, choroba Lou Gehriga, ALS), choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona, stwardnienie rozsiane, choroba Alexandra, choroba Alpersa, choroba Canavan, choroba Spielmeyera-Vogta-Sjogrena i wiele innych. Ponadto urazy mechaniczne rdzenia kręgowego, udary oraz wstrząśnienia mózgu mogą prowadzić do nieodwracalnych zaburzeń w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego.

Badania z wykorzystaniem hodowli komórek nerwowych są podstawową metodą poznawczą patogenezy oraz metod leczenia chorób neurologicznych. Klasycznie, hodowle komórkowe neuronów prowadzone są na szalkach Petriego lub w komorach Campenota. W tych hodowlach nie ma możliwości pozycjonowania neuronów oraz wymuszenia pożądanej struktury połączeń nerwowych występujących w różnych tkankach nerwowych. Nie jest możliwe prowadzenie hodowli w warunkach dynamicznych w układzie przepływowym. Występują problemy z zachowaniem warunków sterylnych z racji otwartej konfiguracji układów. Dodatkowo, żadne z klasycznych urządzeń wykorzystywanych do hodowli neuronów nie umożliwia uszkadzania aksonów w kontrolowany sposób.

Opracowano szereg konstrukcji mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych, w których częściowo zniwelowano wady układów klasycznych (Park, J. W., Kim, H.J., Kang, M. W., Jeon, N.L., 2013. Advances in microfluidics-based experimental methods for neuroscience research. Lab. Chip 13, 509-521). Znane są z literatury naukowej otwarte, stacjonarne i nieprzepływowe mikrosystemy do hodowli komórek nerwowych, w których zastosowano pneumatyczny system uszkadzania aksonów wykorzystujący bezpośredni strumień wody do ich przecięcia, podciśnienie lub nadciśnienie do rozciągnięcia aksonów (Yap, Y.C., Dickson, T.C., King, A.E., Breadmore, M.C., Guijt, R.M., 2014. Microfluidic culture platform for studying neuronal response to mild to very mild axonal stretch injurya). Biomicrofluidics 8, 044110.), wiązkę lasera impulsowego do termicznej destrukcji aksonu (Hellman, A.N., Vahidi, B., Kim, H.J., Mismar, W., Steward, O., Jeon, N.L., Venugopalan, V, 2010. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab. Chip 10, 2083-2092.) lub pneumatycznie ekspandowane wybrzuszenie do zgniatania aksonów (Hosmane, S, Fournier, A., Wright, R., Rajbhandari, L., Siddique, R., Yang, I.H., Ramesh, K.T., Venkatesan, A., Thakor, N, 2011. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab. Chip 11, 3888-3895.).

W międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO2004034016 oraz WO2006037033 opisano metodę wytwarzania oraz mikrosystem stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty z separacją hydrauliczną komór za pomocą różnicy ciśnienia hydrostatycznego płynów pomiędzy komorami somalną i dystalną połączonymi krótkimi równoległymi odcinkami mikrokanałów przez które penetrują aksony komórek nerwowych. Komórki nerwowe wewnątrz komór hodowlanych były pozycjonowane za pomocą siły odśrodkowej przy wlotach do mikrokanałów, co promowało penetrację aksonów do wnętrza mikrokanałów łącznikowych. Szerokość bariery pomiędzy komorami wynosiła 450 mikrometrów, co zapobiegało penetracji dendrytów do komory dystalnej, a niewielka średnica mikrokanałów łącznikowych uniemożliwiała migracje komórek nerwowych z komory somalnej do dystalnej.

PL 235 927 B1

W kolejnym zgłoszeniu międzynarodowym nr W02010040920 ujawniono stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty układ do hodowli komórkowych, w szczególności komórek nerwowych, złożony z co najmniej dwóch komór połączonych za pomocą sieci mikrokanałów różnych kształtów i zmiennej średnicy, łączących się wzajemnie. Aksony penetrowały z komory somalnej do dystalnej wewnątrz mikrokanałów, a ich złożona struktura wymuszała przestrzenny układ aksonów. Mikrosystem nie był jednak wyposażony w układ do uszkadzania aksonów.

Patent europejski nr EP2470640 oraz zgłoszenie WO2009121555 opisuje zamknięty mikrosystem do hodowli komórkowych oraz metodę funkcjonalizacji jego powierzchni, złożony z dwóch komór przedzielonych łącznikiem. Mikrosystem złożony jest z pokrywy, podłoża oraz ścian połączonych ze sobą w sposób trwały i hermetyczny umożliwiając zachowanie właściwości powierzchniowych oraz sterylnych warunków przez długi okres przechowywania. Powierzchnia kanałów jest miejscowo funkcjonalizowana umożliwiając pozycjonowanie komórek w ich wnętrzu. Mikrosystem wyposażony był dodatkowo w elektrody wymuszające perfuzję substancji czynnych pomiędzy kanałami, jednakże nie był wyposażony w układ do uszkadzania aksonów z kontrolą mikrośrodowiska w miejscu ich uszkadzania.

Z międzynarodowego zgłoszenia nr WO2012174445 znany jest przepływowy układ do hodowli komórkowych, w szczególności nefrocytów, naśladujący dynamiczne warunki przepływu w nerkach. Aparat wyposażony jest w szereg przepływowych komór hodowlanych, w których na podłoże i ściany były naniesione struktury o różnym kształcie w postaci kanałów i wypustek ułatwiające prowadzenie hodowli komórkowych.

Stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty mikrosystem do prowadzenia hodowli neuronów, metodę jego wytwarzania oraz metodykę prowadzenia badań z jego wykorzystaniem ujawniono w zgłoszeniu nr WO2015013804. Układ składał się z czterech cylindrycznych zasobników płynów połączonych z narożnikami równolegle przebiegających mikrokomór hodowlanych, które zostały połączone prostopadłymi odcinkami mikrokanałów.

Z amerykańskiego zgłoszenia nr US20100323434 znany jest również wieloprzedziałowy i wielokomorowy otwarty mikrosystem do hodowli komórek nerwowych zaopatrzony w szereg kanałów wiodących aksony do prowadzenia równoległych hodowli i kohodowli komórkowych. Szereg komór somalnych i dystalnych zostało rozmieszczonych po okręgu na jednej podstawie.

Natomiast w zgłoszeniu patentowym nr WO2013017770 opisano otwarte mikrourządzenie w postaci perforowanej płytki do hodowli komórek nerwowych, a w zgłoszeniu nr WO2015092141 platformę mikrofluidalną do hodowli i badań procesu mielinizacji włókien nerwowych.

Żadne ze znanych urządzeń mikrofluidalnych nie wykorzystuje rozłącznej podstawy zbudowanej z dwóch warstw materiału o odmiennych właściwościach: spodniej sprężystej i wierzchniej elastycznej, która to podstawa wraz z systemem nieruchowych listew tworzy mechanizm kontrolowanego, precyzyjnego uszkadzania aksonów poprzez kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego, a tym samym zaburzania mikrośrodowiska hodowli. Znane rozwiązania z literatury patentowej oraz naukowej w postaci otwartych, stacjonarnych i nieprzepływowych mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych nie umożliwiają prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych w stabilnych, sterylnych warunkach w długim okresie czasu, a w szczególności nie umożliwiają formowania dwuwymiarowych sieci neuronowych o złożonej strukturze połączeń i uszkodzeń. W wyniku procesów metabolicznych przebiegających w żywych komórkach następuje ciągły i sukcesywny ubytek substancji odżywczych i tlenu z medium hodowlanego oraz wzrost stężenia metabolitów w komorach hodowlanych układów stacjonarnych, nieprzepływowych. Pociąga to za sobą konieczności częstej wymiany medium hodowlanego w komorach mikrosystemu. Wahania składu medium hodowlanego zaburzają mikrośrodowisko hodowli komórkowych.

Znane z literatury pneumatyczne systemy uszkadzania aksonów stosowane w otwartych urządzeniach mikrofluidalnych są złożone, przez co trudne w wykonaniu, kontroli oraz zawodne i kłopotliwe w stosowaniu. Wymagają stosowania zewnętrznych układów generowania i kontroli ciśnienia. Podwyższone ciśnienie w kanałach roboczych mikrourządzenia często prowadzi do nieodwracalnego odkształcenia ścian mikrosystemu, jego rozwarstwienia i utraty szczelności. Z kolei zastosowanie wiązki laserowej nie pozwala na oddanie efektu kompresji aksonu w miejscu jego uszkodzenia, jak również prowadzi do wystąpienia niekorzystnych efektów termicznych. Ponadto zastosowanie bezpośrednich metod uszkadzania aksonów nie jest możliwe w zamkniętych układach przepływowych.

W rezultacie wynikła potrzeba opracowania nowego rozwiązania konstrukcyjnego rozwiązującego powyższe problemy.

PL 235 927 B1

Urządzenie mikrofluidalne do generowania uszkodzeń sieci neuronów, według wynalazku składa się z rozłącznej, dwuwarstwowej sprężysto-elastycznej podstawy utworzonej z dwóch warstw: spodniej wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) oraz wierzchniej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS), warstwy funkcjonalnej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS) lub niestechiometrycznej mieszaniny tioli i związków enowych w postaci tetratiolu i triallilu (OSTE), warstwy szklanej, warstwy klejowej wykonanej z błony klejowej oraz wieka wykonanego z tworzywa sztucznego w postaci polimetakrylanu metylu (PMMA), przy czym w warstwie funkcjonalnej wykonana została komora hodowlana, w której usytuowane zostały nieruchome listwy do uszkadzania aksonów wykonane z polidimetylo siloksanu (PDMS), które wraz z warstwą podstawy, w której wykonane zostały nisze i mikrokanały, tworzą mechanizm uszkadzania aksonów.

Korzystnie grubość wierzchniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 1 mikrometr i nie większa niż 100 mikrometrów.

Korzystnie grubość spodniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.

Korzystnie nisze do hodowli neuronów i mikrokanały wiodące aksony są ze sobą połączone i tworzą dwuwymiarową przestrzenną sieć połączeń umożliwiającą pozycjonowanie neuronów i ukierunkowany wzrost aksonów.

Korzystnie nieruchome listwy do uszkadzania aksonów umieszczone są nad każdym mikrokanałem wiodącym aksony łączącym dwie nisze do hodowli neuronów.

Korzystnie wysokość listwy do uszkadzania aksonów jest nie większa niż wysokość warstwy funkcjonalnej i nie mniejsza niż jedna dziesiąta jej wysokości.

Korzystnie szerokość listwy do uszkadzania aksonów odpowiada planowanej długości odcinka uszkodzenia aksonu.

Korzystnie w warstwie funkcjonalnej znajdują się podzielniki strumienia wyrównujące prędkości płynu w kanałach.

Korzystnie nisze do hodowli neuronów i mikrokanały wiodące aksony znajdują się w zagłębieniach pomiędzy cylindrycznymi wypustkami wierzchniej warstwy podstawy.

Korzystnie obie warstwy podstawy zostały połączone z warstwą funkcjonalną w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny.

Korzystnie warstwa szklana połączona jest z warstwą funkcjonalną w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.

Korzystnie warstwa klejowa łączy warstwę szklaną z wiekiem w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.

Korzystnie komora hodowlana posiada wlot i wylot.

Korzystnie wysokość komory hodowlanej jest nie mniejsza niż 30 mikrometrów i nie większa niż 1 mm.

Korzystnie warstwa szklana posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.

Korzystnie warstwa klejowa ma grubość nie mniejszą niż 50 mikrometrów i nie większą niż 200 mikrometrów.

Korzystnie warstwa klejowa posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.

Korzystnie warstwa klejowa posiada wolną przestrzeń w obszarze detekcji odsłaniającą powierzchnię mikrosystemu przeznaczoną do prowadzenia obserwacji mikroskopowych.

Korzystnie wieko zaopatrzone jest w porty przyłączeniowe doprowadzające i odprowadzające płyny do/z urządzenia.

Korzystnie pory przyłączeniowe rozlokowane są na bocznych ścianach wieka.

Korzystnie wszystkie warstwy urządzenia posiadają rozlokowane w jednakowych miejscach pozycjonujące otwory przelotowe.

Korzystnie wszystkie warstwy urządzenia wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.

Korzystnie wszystkie warstwy urządzenia wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.

Korzystnie wszystkie warstwy urządzenia wykonane są z materiałów biokompatybilnych.

Urządzenie mikrofluidalne do generowania uszkodzeń sieci neuronów, według wynalazku umożliwia prowadzenie długookresowych hodowli komórek nerwowych (neuronów) w warunkach przepływo

PL 235 927 B1 wych, w stabilnych i kontrolowanych warunkach, samodzielnie lub wraz z innymi kom órkami (tzw. kohodowli) w przestrzennie ukierunkowany sposób, tak by połączenia między komórkami nerwowymi utworzyły dwuwymiarową sieć o zadanej topologii i rozlokowaniu uszkodzeń, umożliwia prowadzenie hodowli w układzie zamkniętym, przepływowym z możliwością dynamicznej zmiany warunków prowadzenia badań: natężeń przepływu, składu oraz właściwości fizycznych medium hodowlanego, ponadto umożliwia prowadzenia hodowli na rozłącznym podłożu, co ułatwia czyszczenie i sterylizację mikrosystemu, jak również utrwalenie, konserwację oraz obserwację komórek po hodowli poza urządzeniem mikrofluidalnym, oraz umożliwia precyzyjne i kontrolowane punktowe uszkadzanie wybranych aksonów podczas obserwacji mikroskopowych z wykorzystaniem mikromanipulatora poprzez punktowy nacisk na podstawę urządzenia mikrofluidalnego, a dzięki jej sprężystemu odkształceniu, kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego.

Przedmiot wynalazku przedstawiony je st bliżej w przykładzie wykonania oraz na rysunku na którym:

Fig. 1 przedstawia urządzenie mikrofluidalne wraz z portami przyłączeniowymi,

Fig. 2 przedstawia układ warstw w urządzeniu mikrofluidalnym,

Fig. 3 przedstawia fragment komory hodowlanej wraz z układem nisz i mikrokanałów wiodących aksony oraz układem listew do uszkadzania aksonów,

Fig. 4 przedstawia mechanizm uszkadzania aksonów w przekroju wzdłuż listwy uszkadzającej aksony:

Fig. 4A - w stanie spoczynku,

Fig. 4B - w stanie pracy,

Fig. 5 przedstawia komorę hodowlaną mikrourządzenia.

P r z y k ł a d realizacji

Zamknięte, przepływowe urządzenie mikrofluidalne o wymiarach 24/60/6 mm (szerokość/długość/wysokość) do generowania uszkodzeń sieci neuronów zostało przedstawione na fig. 1,2, 3, 4 i 5. Na fig. 1 zostało uwidocznione urządzenie mikrofluidalne w widoku ogólnym wraz z portami przyłączeniowymi 1 rozlokowanymi w bocznych ścianach urządzenia, obszarem detekcji 2, komorą hodowlaną 3, otworami pozycjonującymi 4 oraz podzielnikami strumienia 5. Urządzenie mikrofluidalne składa się z pięciu warstw: podstawy z dwóch warstw: sprężystej 6A wykonanej z PET o grubości 120 mikrometrów oraz elastycznej 6B wykonanej z PDMS o grubości 20 mikrometrów, warstwy funkcjonalnej 7 wykonanej z PDMS o grubości 100 mikrometrów, warstwy szklanej 8 wykonanej ze szkła borokrzemowego trzeciej klasy hydrolitycznej o grubości 150 mikrometrów, warstwy klejowej 9 o grubości 120 mikrometrów oraz wieka 10 wykonanego z PMMA o grubości 5 mm.

Urządzenie posiada dwa boczne porty przyłączeniowe w postaci otworów średnicy 1 mm, dopasowanej do zewnętrznej średnicy mikrowęży doprowadzających i odprowadzających płyny do/z urządzenia.

Urządzenie posiada jeden centralnie rozmieszczony obszar detekcji 2 obejmujący obszar roboczy komory hodowlanej o wymiarach 18/9 mm (długość/szerokość), umożliwiający obserwację i detekcję procesów pod mikroskopem w sposób niezakłócony, bez zniekształceń optycznych, w świetle widzialnym oraz UV.

Urządzenie posiada jedną przepływową komorę hodowlaną o szerokości 6 mm i długości przestrzeni roboczej 16 mm zaopatrzoną we wlot i wylot, które podłączone są do odpowiednich portów przyłączeniowych mikrourządzenia. W komorze hodowlanej znajduje się dziewięćdziesiąt siedem listew 11 do uszkadzania aksonów, rozmieszczonych koncentrycznie wokół dwudziestu sześciu środków symetrii. Każda z listew jest o wymiarach 0,9/0,1/0,1 mm (długość/szerokość/wysokość). Elastyczna listwa uszkadzająca aksony 11 wraz ze sprężysto-elastyczną podstawą tworzą mechanizm uszkadzania aksonów przedstawiony na fig. 4, który działa w ten sposób, że po zastosowaniu punktowym niewielkiej siły zgodnie z kierunkiem przedstawionym na rysunku 4B za pomocą strzałki, następuje odwracalne odkształcenie podstawy i zgniecenie aksonu 12. Po ustaniu działania siły, mechanizm uszkadzania aksonów samoczynnie powraca do pozycji wyjściowej przedstawionej na fig. 4A.

W dnie komory hodowlanej, w obszarze roboczym urządzenia mikrofluidalnego wykonanych zostało sześćdziesiąt osiem nisz 13 połączonych mikrokanałami wiodącymi aksony 14. Kanały wiodące mają szerokość 30 mikrometrów w najwęższym miejscu i wysokość 20 mikrometrów. Komory i kanały wiodące powstały w zagłębieniach pomiędzy cylindrycznymi występami 15.

PL 235 927 B1

Urządzenie posiada dwa podzielniki strumienia 5 w kształcie rombów o wymiarach 7/2,3/0,1 mm (długość/szerokość/wysokość) pozwalające na wyrównanie prędkości płynu na całej szerokości wlotu i wylotu do/z komory hodowlanej.

Urządzenie posiada cztery otwory pozycjonujące rozmieszczone w narożach urządzenia, umożliwiające precyzyjne wzajemne pozycjonowanie warstw mikrourządzenia.

Warstwy podstawy 6A i 6B połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Podstawa połączona jest z warstwą 7 w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny. Warstwy 7-10 połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Warstwy 6A-8 połączone są ze sobą bez użycia kleju, a jedynie w wyniku modyfikacji właściwości powierzchniowych. Warstwa klejowa 9 200MP o kodzie producenta 468MP określającego grubość błony klejowej łączy ze sobą warstwy 8 i 10. W warstwach 8 i 9 wykonane zostały otwory przelotowe 16 umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi warstwami.

Claims (24)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Urządzenie mikrofluidalne do generowania uszkodzeń sieci neuronów znamienne tym, że składa się z dwuwarstwowej rozłącznej, sprężysto-elastycznej podstawy utworzonej z dwóch warstw: spodniej (6A) wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) oraz wierzchniej (6B) wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS), warstwy funkcjonalnej (7) wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS) lub niestechiometrycznej mieszaniny tioli i związków enowych w postaci tetratiolu i triallilu (OSTE), warstwy szklanej (8), warstwy klejowej (9) wykonanej z błony klejowej oraz wieka (10) wykonanego z tworzywa sztucznego w postaci polimetakrylanu metylu (PMMA), przy czym w warstwie funkcjonalnej (7) wykonana jest komora hodowlana (3), w której usytuowane są nieruchome listwy (11) wykonane z polidimetylo siloksanu (PDMS), które wraz z wierzchnią warstwą podstawy (6B), w której wykonane są nisze (13) i mikrokanały wiodące aksony (14), tworzą mechanizm uszkadzania aksonów.
2. 2. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że grubość wierzchniej warstwy podstawy (6B) jest nie mniejsza niż 1 mikrometr i nie większa niż 100 mikrometrów.
3. 3. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że grubość spodniej warstwy podstawy (6A) jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.
4. 4. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że nisze do hodowli neuronów (13) i mikrokanały wiodące aksony (14) są ze sobą połączone i tworzą dwuwymiarową przestrzenną sieć połączeń umożliwiającą pozycjonowanie neuronów i ukierunkowany wzrost aksonów.
5. 5. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że nieruchome listwy do uszkadzania aksonów (11) umieszczone są nad każdym mikrokanałem wiodącym aksony (14) łączącym dwie nisze do hodowli neuronów (13).
6. 6. Urządzenie według zastrz. 5 znamienne tym, że wysokość listwy do uszkadzania aksonów (11) jest nie większa niż wysokość warstwy funkcjonalnej i nie mniejsza niż jedna dziesiąta jej wysokości.
7. 7. Urządzenie według zastrz. 5 znamienne tym, że szerokość listwy do uszkadzania aksonów (11) odpowiada planowanej długości odcinka uszkodzenia aksonu.
8. 8. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że w warstwie funkcjonalnej (7) znajdują się podzielniki strumienia (5) wyrównujące prędkości płynu w kanałach.
9. 9. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że nisze do hodowli neuronów (13) i mikrokanały wiodące aksony (14) znajdują się w zagłębieniach pomiędzy cylindrycznymi wypustkami (15) wierzchniej warstwy podstawy.
10. 10. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że dwuwarstwowa podstawa (6A, 6B) została połączona z warstwą funkcjonalną (7) w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny.
11. 11. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że warstwa szklana (8) połączona jest z warstwą funkcjonalną (7) w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.
12. 12. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że warstwa klejowa (9) łączy warstwę szklaną (8) z wiekiem (10) w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.
13. 13. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że komora hodowlana (3) posiada wlot i wylot.
14. 14. Urządzenie według zastrz. 13 znamienne tym, że wysokość komory hodowlanej (3) jest nie mniejsza niż 30 mikrometrów i nie większa niż 1 mm.

    PL 235 927 B1
15. 15. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że warstwa szklana (8) posiada otwory przelotowe (16) umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.
16. 16. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że grubość warstwy klejowej (9) jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.
17. 17. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że warstwa klejowa (9) posiada otwory przelotowe (16) umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.
18. 18. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że warstwa klejowa (9) posiada wolną przestrzeń w obszarze detekcji (2) odsłaniającą powierzchnię mikrosystemu przeznaczoną do prowadzenia obserwacji mikroskopowych.
19. 19. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że wieko (10) zaopatrzone jest w porty przyłączeniowe (1) doprowadzające i odprowadzające płyny do/z urządzenia.
20. 20. Urządzenie według zastrz. 19 znamienne tym, że pory przyłączeniowe (1) rozlokowane są na bocznych ścianach wieka.
21. 21. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że wszystkie warstwy urządzenia (6A, 6B, 7, 8, 9, 10) posiadają rozlokowane w jednakowych miejscach pozycjonujące otwory przelotowe (4).
22. 22. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że wszystkie warstwy urządzenia (6A, 6B, 7, 8, 9, 10) wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.
23. 23. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że wszystkie warstwy urządzenia (6A, 6B, 7, 8, 9, 10) wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.
24. 24. Urządzenie według zastrz. 1 znamienne tym, że wszystkie warstwy urządzenia (6A, 6B, 7, 8, 9, 10) wykonane są z materiałów biokompatybilnych.