PL235926B1 - Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures - Google Patents
Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures Download PDFInfo
- Publication number
- PL235926B1 PL235926B1 PL415008A PL41500815A PL235926B1 PL 235926 B1 PL235926 B1 PL 235926B1 PL 415008 A PL415008 A PL 415008A PL 41500815 A PL41500815 A PL 41500815A PL 235926 B1 PL235926 B1 PL 235926B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- axon
- layer
- layers
- damage
- chambers
- Prior art date
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest przepływowe, zamknięte, wielowarstwowe urządzenie mikrofluidalne (bioczip) ze zintegrowanym mechanizmem uszkadzania aksonów oraz rozłączną podstawą do prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych, w szczególności komórek nerwowych (neuronów) w warunkach przepływowych oraz prowadzenia badań neurologicznych. Mikrourządzenie znajduje zastosowanie w biologii, medycynie, farmacji, biotechnologii i inżynierii biomedycznej. Umożliwia prowadzenie badań w kontrolowanych warunkach, w szczególności kontrolowanego wzrostu komórek nerwowych oraz kontrolowanego uszkadzania i regeneracji uszkodzeń aksonów jak również badań wpływu czynników biologicznych, chemicznych i fizycznych na proces regeneracji połączeń nerwowych. W szczególności, urządzenie przeznaczone jest do badań i symulacji zjawisk zachodzących podczas mechanicznego uszkodzenia rdzenia kręgowego oraz procesu regeneracji połączeń nerwowych w rdzeniu kręgowym, w tym z wykorzystaniem kohodowli komórkowych.The subject of the invention is a flow, closed, multilayer microfluidic device (biochip) with an integrated axonal damage mechanism and a disjoint basis for the cultivation and co-culture of cells, in particular nerve cells (neurons) under flow conditions, and for conducting neurological research. The microdevice is used in biology, medicine, pharmacy, biotechnology and biomedical engineering. It enables conducting research in controlled conditions, in particular for the controlled growth of nerve cells and controlled damage and regeneration of axonal damage, as well as research on the influence of biological, chemical and physical factors on the regeneration process of nerve connections. In particular, the device is designed to study and simulate the phenomena occurring during mechanical damage to the spinal cord and the regeneration process of nerve connections in the spinal cord, including the use of cell cultures.
Neurony to komórki nerwowe zdolne do przetwarzania i przewodzenia informacji w postaci sygnału elektrycznego. Neurony są podstawowym elementem układu nerwowego ludzi i zwierząt, w szczególności ośrodkowego układu nerwowego, w skład którego wchodzi mózgowie oraz rdzeń kręgowy. Neuron zbudowany jest z ciała komórki (soma) oraz odchodzących od niego wypustek: aksonu i dendrytów. Neurony kontaktują się między sobą poprzez synapsy tworząc sieci neuronowe. Nieprawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego, będące wynikiem zaburzeń przewodzenia bodźców elektrycznych w sieciach neuronowych jest przyczyną nieuleczalnych chorób neurodegeneracyjnych takich jak: stwardnienie zanikowe boczne (choroba Charcota, choroba Lou Gehriga, ALS), choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, choroba Huntingtona, stwardnienie rozsiane, choroba Alexandra, choroba Alpersa, choroba Canavan, choroba Spielmeyera-Vogta-Sjogrena i wiele innych. Ponadto urazy mechaniczne rdzenia kręgowego, udary oraz wstrząśnienia mózgu mogą prowadzić do nieodwracalnych zaburzeń w funkcjonowaniu ośrodkowego układu nerwowego. Urazy mechaniczne rdzenia kręgowego prowadzą do utraty jego czynności poniżej miejsca urazu oraz innych objawów, jak: niedowłady, zaburzenia czucia, zaburzenia świadomości czy niewydolność oddechowa. Uraz rdzenia kręgowego możne polegać na jego stłuczeniu, ucisku, naciągnięciu, rozerwaniu, przecięciu, złamaniu i zmiażdżeniu.Neurons are nerve cells that can process and conduct information in the form of an electrical signal. Neurons are the basic element of the nervous system of humans and animals, in particular the central nervous system, which includes the brain and spinal cord. A neuron is made of the cell body (soma) and its projections: the axon and dendrites. Neurons contact each other through synapses to form neural networks. Malfunctioning of the central nervous system resulting from disturbances in the conduction of electrical stimuli in neural networks is the cause of incurable neurodegenerative diseases such as: amyotrophic lateral sclerosis (Charcot's disease, Lou Gehrig's disease, ALS), Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Huntington's disease, multiple sclerosis, Alexander's disease, Alpers disease, Canavan disease, Spielmeyer-Vogt-Sjogren disease and many others. Moreover, mechanical injuries of the spinal cord, strokes and concussions may lead to irreversible disturbances in the functioning of the central nervous system. Mechanical injuries of the spinal cord lead to the loss of its function below the site of the injury and to other symptoms, such as: paresis, sensory disturbances, impaired consciousness or respiratory failure. Injury to the spinal cord can involve contusion, pressure, stretching, tearing, cutting, breaking and crushing.
Badania z wykorzystaniem hodowli komórek nerwowych są podstawową metodą poznawczą patogenezy oraz metod leczenia chorób neurologicznych. Klasycznie, hodowle komórkowe neuronów prowadzone są na szalkach Petriego lub w komorach Campenota. W tych hodowlach bardzo trudne jest rozróżnienie aksonów od dendrytów i zastosowanie odmiennego mikrośrodowiska hodowli dla aksonów, dendrytów i synaps. Nie ma możliwości pozycjonowania neuronów oraz wymuszenia pożądanej struktury połączeń nerwowych występujących w różnych tkankach nerwowych. Nie jest możliwe prowadzenie hodowli w warunkach dynamicznych w układzie przepływowym. Występują problemy z zachowaniem warunków sterylnych z racji otwartej konfiguracji układów. Dodatkowo, żadne z klasycznych urządzeń wykorzystywanych do hodowli neuronów nie umożliwia uszkadzania aksonów w kontrolowany sposób i zastosowania odmiennego mikrośrodowiska w miejscach ich uszkodzeń, co jest istotne w przypadku prowadzenia badań mechanizmu regeneracji uszkodzeń połączeń nerwowych w obecności czynników stymulujących: fizycznych, chemicznych i biologicznych oraz kohodowli komórkowych. Opracowano szereg konstrukcji mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych, w których częściowo zniwelowano wady układów klasycznych (Park, J. W., Kim, H.J., Kang, M.W., Jeon, N.L., 2013. Advances in microfluidics-based experimental methods for neuroscience research. Lab. Chip 13, 509-521). Znane są z literatury naukowej otwarte, stacjonarne i nieprzepływowe mikrosystemy do hodowli komórek nerwowych, w których zastosowano pneumatyczny system uszkadzania aksonów wykorzystujący bezpośredni strumień wody do ich przecięcia, podciśnienie lub nadciśnienie do rozciągnięcia aksonów (Yap, Y.C., Dickson, T.C., King, A.E., Breadmore, M.C., Guijt, R.M., 2014. Microfluidic culture platform for studying neuronal response to mild to very mild axonal stretch injury. Biomicrofluidics 8, 044110), wiązkę lasera impulsowego do termicznej destrukcji aksonu (Heilman, A.N., Vahidi, B., Kim, H.J., Mismar, W., Steward, O., Jeon, N.L., Venugopalan, V, 2010. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab. Chip 10, 2083-2092) lub pneumatycznie ekspandowane wybrzuszenie do zgniatania aksonów (Hosmane, S., Fournier, A., Wright, R., Rajbhandari, L., Siddique, R., Yang, I.H., Ramesh, K.T., Venkatesan, A., Thakor, N, 2011. Valve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab. Chip 11, 3888-3895).Research with the use of nerve cell cultures is the basic method of cognitive pathogenesis and treatment of neurological diseases. Classically, cell cultures of neurons are carried out in Petri dishes or in Campenot chambers. In these cultures it is very difficult to distinguish axons from dendrites and use a different culture microenvironment for axons, dendrites and synapses. It is not possible to position neurons and enforce the desired structure of nerve connections present in various nerve tissues. It is not possible to cultivate under dynamic conditions in a flow system. There are problems with maintaining sterile conditions due to the open configuration of the systems. In addition, none of the classic devices used for the cultivation of neurons allows damaging axons in a controlled manner and using a different microenvironment in the places of their damage, which is important in the case of research on the mechanism of regeneration of nerve junctions in the presence of stimulating factors: physical, chemical and biological, and co-culture phones. A number of structures of microsystems for the cultivation of nerve cells have been developed, in which the disadvantages of classical systems have been partially eliminated (Park, JW, Kim, HJ, Kang, MW, Jeon, NL, 2013. Advances in microfluidics-based experimental methods for neuroscience research. Lab. Chip 13 , 509-521). There are known from the scientific literature open, stationary and non-flow microsystems for the cultivation of nerve cells, which use a pneumatic system of axon damage using direct water jets to cut them, negative pressure or hypertension to stretch axons (Yap, YC, Dickson, TC, King, AE, Breadmore, MC, Guijt, RM, 2014. Microfluidic culture platform for studying neuronal response to mild to very mild axonal stretch injury. Biomicrofluidics 8, 044110), pulsed laser beam for thermal axon destruction (Heilman, AN, Vahidi, B., Kim , HJ, Mismar, W., Steward, O., Jeon, NL, Venugopalan, V, 2010. Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection. Lab. Chip 10, 2083-2092) or pneumatically expanded bulge for axon crushing (Hosmane, S., Fournier, A., Wright, R., Rajbhandari, L., Siddique, R., Yang, IH, Ramesh, KT, Venkatesan, A., Thakor, N, 2011. Val ve-based microfluidic compression platform: single axon injury and regrowth. Lab. Chip 11, 3888-3895).
PL 235 926 B1PL 235 926 B1
W międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO2004034016 oraz WO2006037033 opisano metodę wytwarzania oraz mikrosystem stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty z separacją hydrauliczną komór za pomocą różnicy ciśnienia hydrostatycznego płynów pomiędzy komorami somalną i dystalną połączonymi krótkimi równoległymi odcinkami mikrokanałów przez które penetrują aksony komórek nerwowych. Komórki nerwowe wewnątrz komór hodowlanych były pozycjonowane za pomocą siły odśrodkowej przy wlotach do mikrokanałów, co promowało penetrację aksonów do wnętrza mikrokanałów łącznikowych. Szerokość bariery pomiędzy komorami wynosiła 450 mikrometrów, co zapobiegało penetracji dendrytów do komory dystalnej, a niewielka średnica mikrokanałów łącznikowych uniemożliwiała migracje komórek nerwowych z komory somalnej do dystalnej.International patent applications WO2004034016 and WO2006037033 describe a method of production and a stationary, non-flow, open microsystem with hydraulic separation of the chambers by means of the difference of hydrostatic pressure of fluids between the somal and distal chambers connected by short parallel sections of microchannels through which the axons of nerve cells penetrate. Nerve cells inside the culture chambers were positioned by centrifugal force at the microchannel inlets, which promoted axonal penetration into the connecting microchannels. The barrier width between the chambers was 450 micrometers, which prevented the penetration of dendrites into the distal ventricle, and the small diameter of the connecting microchannels prevented the migration of nerve cells from the somal to the distal ventricle.
W kolejnym zgłoszeniu międzynarodowym nr W02010040920 ujawniono stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty układ do hodowli komórkowych, w szczególności komórek nerwowych, złożony z co najmniej dwóch komór połączonych za pomocą sieci mikrokanałów różnych kształtów i zmiennej średnicy, łączących się wzajemnie. Aksony penetrowały z komory somalnej do dystalnej wewnątrz mikrokanałów, a ich złożona struktura wymuszała przestrzenny układ aksonów. Mikrosystem nie był jednak wyposażony w układ do uszkadzania aksonów.Another international application No. WO2010040920 discloses a stationary, non-flow open system for cell culture, in particular of nerve cells, composed of at least two chambers connected by a network of microchannels of different shapes and variable diameter interconnecting. Axons penetrated from the somal chamber to the distal inside the microchannels, and their complex structure enforced the spatial arrangement of the axons. The microsystem, however, was not equipped with an axon damage system.
Patent europejski nr EP2470640 oraz zgłoszenie WO2009121555 opisuje zamknięty mikrosystem do hodowli komórkowych oraz metodę funkcjonalizacji jego powierzchni, złożony z dwóch komór przedzielonych łącznikiem. Mikrosystem złożony jest z pokrywy, podłoża oraz ścian połączonych ze sobą w sposób trwały i hermetyczny umożliwiając zachowanie właściwości powierzchniowych oraz sterylnych warunków przez długi okres przechowywania. Powierzchnia kanałów jest miejscowo funkcjonalizowana umożliwiając pozycjonowanie komórek w ich wnętrzu. Mikrosystem wyposażony był dodatkowo w elektrody wymuszające perfuzję substancji czynnych pomiędzy kanałami, jednakże nie był wyposażony w układ do uszkadzania aksonów z kontrolą mikrośrodowiska w miejscu ich uszkadzania.European patent no. EP2470640 and application WO2009121555 describe a closed microsystem for cell culture and a method of functionalisation of its surface, consisting of two chambers separated by a connector. The microsystem consists of a cover, a base and walls connected to each other in a durable and hermetic manner, allowing for the preservation of surface properties and sterile conditions for a long period of storage. The surface of the channels is functionalized locally, enabling the positioning of cells inside them. The microsystem was additionally equipped with electrodes forcing the perfusion of active substances between the channels, however, it was not equipped with a system for axon damage with the control of the microenvironment at the site of their damage.
Z międzynarodowego zgłoszenia nr WO2012174445 znany jest przepływowy układ do hodowli komórkowych, w szczególności nefrocytów, naśladujący dynamiczne warunki przepływu w nerkach. Aparat wyposażony jest w szereg przepływowych komór hodowlanych, w których na podłoże i ściany były naniesione struktury o różnym kształcie w postaci kanałów i wypustek ułatwiające prowadzenie hodowli komórkowych.From the international application No. WO2012174445 there is known a flow system for cell cultures, in particular of nephrocytes, which mimics the dynamic flow conditions in the kidneys. The apparatus is equipped with a series of flow-through culture chambers in which structures of various shapes in the form of channels and protrusions were applied to the substrate and walls, facilitating the conduct of cell cultures.
Stacjonarny, nieprzepływowy, otwarty mikrosystem do prowadzenia hodowli neuronów, metodę jego wytwarzania oraz metodykę prowadzenia badań z jego wykorzystaniem ujawniono w zgłoszeniu nr WO2015013804. Układ składał się z czterech cylindrycznych zasobników płynów połączonych z narożnikami równolegle przebiegających mikrokomór hodowlanych, które zostały połączone prostopadłymi odcinkami mikrokanałów.A stationary, non-flow, open microsystem for cultivating neurons, the method of its production and the methodology of conducting research using it are disclosed in the application No. WO2015013804. The system consisted of four cylindrical reservoirs of fluids connected to the corners of parallel running microcells, which were connected by perpendicular sections of microchannels.
Z amerykańskiego zgłoszenia nr US20100323434 znany jest również wieloprzedziałowy i wielokomorowy otwarty mikrosystem do hodowli komórek nerwowych zaopatrzony w szereg kanałów wiodących aksony do prowadzenia równoległych hodowli i kohodowli komórkowych. Szereg komór somalnych i dystalnych zostało rozmieszczonych po okręgu na jednej podstawie.From US application No. US20100323434 there is also known a multi-compartment and multi-chamber open microsystem for the cultivation of nerve cells provided with a number of axon-guiding channels for carrying out parallel cell cultures and co-cultures. The series of somal and distal chambers are arranged in a circle on a single base.
Natomiast w zgłoszeniu patentowym nr WO2013017770 opisano otwarte mikrourządzenie w postaci perforowanej płytki do hodowli komórek nerwowych, a w zgłoszeniu nr WO2015092141 platformę mikrofluidalną do hodowli i badań procesu mielinizacji włókien nerwowych.On the other hand, the patent application no. WO2013017770 describes an open microdevice in the form of a perforated plate for the cultivation of nerve cells, and the application no. WO2015092141 describes a microfluidic platform for the cultivation and research of the nerve myelination process.
Żadne z przytoczonych oraz ze znanych urządzeń mikrofluidalnych nie wykorzystuje rozłącznej podstawy zbudowanej z dwóch warstw materiału o odmiennych właściwościach: spodniej sprężystej i wierzchniej elastycznej, która to podstawa wraz z nieruchomą listwą tworzy mechanizm kontrolowanego, precyzyjnego uszkadzania aksonów poprzez kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego, a tym samym zaburzania mikrośrodowiska hodowli. Znane rozwiązania z literatury patentowej oraz naukowej w postaci otwartych, stacjonarnych i nieprzepływowych mikrosystemów do hodowli komórek nerwowych nie umożliwiają prowadzenia hodowli i kohodowli komórkowych w stabilnych, sterylnych warunkach w długim okresie czasu. W wyniku procesów metabolicznych przebiegających w żywych komórkach następuje ciągły i sukcesywny ubytek substancji odżywczych i tlenu z medium hodowlanego oraz wzrost stężenia metabo litów w komorach hodowlanych w mikrosystemach stacjonarnych, nie przepływowych. Pociąga to za sobą konieczności częstej wymiany medium hodowlanego w komorach mikrosystemu. Wahania składu medium hodowlanego zaburzają mikrośrodowisko hodowli komórkowych.None of the mentioned and known microfluidic devices uses a detachable base made of two layers of material with different properties: elastic bottom and elastic top, which together with the fixed blade creates a mechanism for controlled, precise damage to axons by compressing and crushing selected fragments of axons without the need for opening the system and stopping the flow of the culture medium, thus disturbing the microenvironment of the culture. Known solutions from patent and scientific literature in the form of open, stationary and non-flow microsystems for the cultivation of nerve cells do not allow for cell culture and co-cultures in stable, sterile conditions for a long time. As a result of metabolic processes taking place in living cells, there is a continuous and successive loss of nutrients and oxygen from the culture medium and an increase in the concentration of metabolites in the culture chambers in stationary, non-flow microsystems. This entails frequent replacement of the culture medium in the microsystem chambers. Fluctuations in the composition of the culture medium disturb the microenvironment of cell cultures.
PL 235 926 B1PL 235 926 B1
W otwartych, stacjonarnych i nieprzepływowych urządzeniach mikrofluidalnych separację hydrauliczną komór hodowlanych uzyskuje się dzięki precyzyjnie kontrolowanej wysokości cieczy w jej zasobnikach, co jest trudne i kłopotliwe w długim okresie czasu z racji jej ubytków spowodowanych parowaniem. Układy przepływowe z racji ciągłej wymiany płynu w komorach nie wymagają precyzyjnej kontroli ciśnień hydrostatycznych w ich wnętrzu, a efekty niewielkich przepływów cieczy pomiędzy komorami są niwelowane ciągła wymianą płynów w komorach. Nie występuje też efekt parowania cieczy z układu.In open, stationary and non-flow microfluidic devices, hydraulic separation of breeding chambers is achieved thanks to a precisely controlled height of the liquid in its reservoirs, which is difficult and troublesome in the long term due to evaporation losses. Due to the continuous fluid exchange in the chambers, the flow systems do not require precise control of hydrostatic pressures inside them, and the effects of small liquid flows between the chambers are eliminated by the continuous exchange of fluids in the chambers. There is also no evaporation of the liquid from the system.
Znane z literatury pneumatyczne systemy uszkadzania aksonów stosowane w otwartych urządzeniach mikrofluidalnych są złożone, przez co trudne w wykonaniu, kontroli oraz zawodne i kłopotliwe w stosowaniu. Wymagają stosowania zewnętrznych układów generowania i kontroli ciśnienia. Podwyższone ciśnienie w kanałach roboczych mikrourządzenia często prowadzi do nieodwracalnego odkształcenia ścian mikrosystemu, jego rozwarstwienia i utraty szczelności. Z kolei zastosowanie wiązki laserowej nie pozwala na oddanie efektu kompresji aksonu w miejscu jego uszkodzenia, jak również prowadzi do wystąpienia niekorzystnych efektów termicznych. Ponadto zastosowanie bezpośrednich metod uszkadzania aksonów nie jest możliwe w zamkniętych układach przepływowych.Pneumatic axon damage systems known from the literature used in open microfluidic devices are complex, making them difficult to manufacture, control, unreliable and difficult to use. They require the use of external pressure generation and control systems. Increased pressure in the working channels of the microdevice often leads to irreversible deformation of the walls of the microsystem, its delamination and loss of tightness. On the other hand, the use of a laser beam does not allow to reproduce the axon compression effect in the place of its damage, and also leads to the occurrence of unfavorable thermal effects. Moreover, the use of direct methods of axon damage is not possible in closed flow systems.
W rezultacie wynikła potrzeba opracowania nowego rozwiązania konstrukcyjnego rozwiązującego powyższe problemy.As a result, there was a need to develop a new design solution solving the above problems.
Przepływowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych, według wynalazku, składa się z rozłącznej, dwuwarstwowej sprężystej i elastycznej podstawy utworzonej z dwóch warstw: spodniej wykonanej z politereftalanu etylenu (PET) oraz wierzchniej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS), warstwy funkcjonalnej wykonanej z polidimetylo siloksanu (PDMS) lub niestechiometrycznej mieszaniny tioli i związków enowych w postaci tetratiolu i triallilu (OSTE), warstwy szklanej, warstwy klejowej wykonanej z błony klejowej oraz wieka wykonanego z polimetakrylanu metylu (PMMA) , przy czym w warstwie funkcjonalnej wykonane są komory hodowlane: somalna, uszkodzeń aksonów oraz dystalna, przy czym w komorze uszkadzania aksonów usytuowana jest nieruchoma listwa wykonana z polidimetylo siloksanu (PDMS), która wraz z wierzchnią warstwą podstawy, w której wykonane są kanały wiodące aksony, tworzy mechanizm uszkadzania aksonów.The flow microfluidic device for the cultivation of nerve cells, according to the invention, consists of a detachable, two-layer elastic and flexible base made of two layers: a bottom made of polyethylene terephthalate (PET) and a top made of polydimethyl siloxane (PDMS), a functional layer made of polydimethyl siloxane (PDMS) or a non-stoichiometric mixture of thiols and ene compounds in the form of tetrathiol and triallyl (OSTE), a glass layer, an adhesive layer made of an adhesive film and a lid made of polymethyl methacrylate (PMMA), with the following culture chambers in the functional layer: somal , axon damage and distal, where in the axon damage chamber there is a fixed polydimethyl siloxane (PDMS) blade, which together with the top layer of the base, in which the axon-leading channels are made, forms the axon damage mechanism.
Korzystnie grubość wierzchniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 1 mikrometr i nie większa niż 20 mikrometrów.Preferably, the thickness of the surface layer of the base is not less than 1 micrometer and not more than 20 microns.
Korzystnie grubość spodniej warstwy podstawy jest nie mniejsza niż 50 mikrometrów i nie większa niż 200 mikrometrów.Preferably, the thickness of the backsheet of the base is not less than 50 microns and not more than 200 microns.
Korzystnie wykonane w wierzchniej warstwie podstawy mikrokanały wiodące aksony są wzajemnie równoległe.Preferably, the leading axons of the microchannels in the outermost base layer are mutually parallel.
Korzystnie długość kanałów wiodących jest nie mniejsza niż szerokość komory uszkadzania aksonów wraz ze ścianami okalającymi po dłuższych bokach tą komorę, najkorzystniej długość kanałów wiodących jest równa sumie szerokości komór hodowlanych: somalnej, uszkadzania aksonów i dystalnej wraz z oddzielającymi je ścianami.Preferably, the length of the leading channels is not less than the width of the axon damage chamber along with the walls surrounding the chamber on its longer sides, most preferably the length of the leading channels is equal to the sum of the widths of the somal, axon damage and distal breeding chambers together with the walls separating them.
Korzystnie wysokość listwy do uszkadzania aksonów jest nie większa niż wysokość warstwy funkcjonalnej i nie mniejsza niż jedna dziesiąta jej wysokości.Preferably, the height of the axon damage blade is not greater than the height of the functional layer and not less than one-tenth of its height.
Korzystnie szerokość listwy do uszkadzania aksonów odpowiada planowanej długości odcinka uszkodzenia aksonu.Preferably, the width of the axon damage blade corresponds to the intended length of the axon damage segment.
Korzystnie obie warstwy podstawy zostały połączone z warstwą funkcjonalną w sposób rozłączny, hydraulicznie szczelny.Preferably, both base layers have been connected to the functional layer in a releasable, hydraulically tight manner.
Korzystnie warstwa szklana połączona jest z warstwą funkcjonalną w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.Preferably, the glass layer is connected to the functional layer in a non-separable, permanent and hydraulically tight manner.
Korzystnie warstwa klejowa łączy warstwę szklaną z wiekiem w sposób nierozłączny, trwały i hydraulicznie szczelny.Preferably, the adhesive layer connects the glass layer to the lid in a non-separable, permanent and hydraulically tight manner.
Korzystnie komory hodowlane mają wydłużony kształt i w swej części roboczej przebiegają równolegle do siebie.Preferably, the rearing chambers have an elongated shape and extend parallel to each other in their operative part.
Korzystnie każda z komór hodowlanych posiada wlot i wylot.Preferably, each of the rearing chambers has an inlet and an outlet.
Korzystnie wysokość komór hodowlanych jest nie mniejsza niż 30 mikrometrów i nie większa niż 1 mm.Preferably, the height of the growth chambers is not less than 30 micrometers and not more than 1 mm.
Korzystnie warstwa szklana posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.Preferably, the glass layer has through-holes enabling fluid to flow vertically between adjacent layers.
Korzystnie warstwa klejowa ma grubość o nie mniejszą niż 50 mikrometrów i nie większą niż 200 mikrometrów.Preferably, the adhesive layer has a thickness of not less than 50 microns and not more than 200 microns.
PL 235 926 B1PL 235 926 B1
Korzystnie warstwa klejowa posiada otwory przelotowe umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi z nią warstwami.Preferably, the adhesive layer has through-holes allowing fluid to flow vertically between adjacent layers.
Korzystnie warstwa klejowa posiada wolną przestrzeń w obszarze detekcji odsłaniającą powierzchnię mikrosystemu przeznaczoną do prowadzenia obserwacji mikroskopowych.Preferably, the adhesive layer has a free space in the detection area exposing the surface of the microsystem intended for microscopic observations.
Korzystnie wieko zaopatrzone jest w porty przyłączeniowe doprowadzające i odprowadzające płyny do/z urządzenia.Preferably, the lid is provided with connection ports for supplying and draining fluids to / from the device.
Korzystnie porty przyłączeniowe rozlokowane są na bocznych ścianach wieka.Preferably, the connection ports are located on the side walls of the lid.
Korzystnie wszystkie warstwy posiadają rozlokowane w jednakowych miejscach otwory pozycjonujące.Preferably, all layers have positioning holes distributed in the same places.
Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów o niskiej autoluminescencji.Preferably, all layers are made of low autoluminescent materials.
Korzystnie wszystkie warstwy wykonane są z materiałów transparentnych dla promieniowania świetlnego w zakresie widzialnym oraz ultrafiolecie.Preferably, all layers are made of materials transparent to light radiation in the visible and ultraviolet range.
Korzystnie warstwy wykonane są z materiałów biokompatybilnych.Preferably, the layers are made of biocompatible materials.
Przepływowe urządzenie mikrofluidalne do prowadzenia hodowli komórek nerwowych, według wynalazku umożliwia prowadzenie długookresowych hodowli komórek nerwowych (neuronów) w stabilnych i kontrolowanych warunkach, samodzielnie lub wraz z innymi komórkami (tzw. kohodowli) przy zastosowaniu odmiennego mikrośrodowiska hodowli dla ciała komórki i dendrytów, aksonów w miejscach ich uszkodzenia oraz końcowych odcinków aksonów zakończonych synapsami, umożliwia prowadzenie hodowli w układzie zamkniętym, przepływowym z możliwością dynamicznej zmiany warunków prowadzenia badań w każdej ze stref niezależnie: natężeń przepływu, składu oraz właściwości fizycznych medium hodowlanego bez konieczności precyzyjnej kontroli ciśnień hydrostatycznych, ponadto umożliwia prowadzenia hodowli na rozłącznym podłożu, co ułatwia czyszczenie i sterylizację mikrosystemu, jak również utrwalenie, konserwację oraz obserwację komórek po hodowli poza urządzeniem mikrofluidalnym, oraz umożliwia precyzyjne i kontrolowane punktowe uszkadzanie wybranych aksonów podczas obserwacji mikroskopowych z wykorzystaniem mikromanipulatora poprzez punktowy nacisk na podstawę urządzenia mikrofluidalnego, a dzięki jej sprężystemu odkształceniu, kompresję i zgniecenie wybranych fragmentów aksonów bez konieczności otwierania układu oraz zatrzymania przepływu medium hodowlanego.The flow microfluidic device for the cultivation of nerve cells, according to the invention, enables long-term cultures of nerve cells (neurons) under stable and controlled conditions, alone or together with other cells (so-called co-cultures) using a different culture microenvironment for the cell body and dendrites, axons in damage sites and the end sections of axons ending with synapses, enables cultivation in a closed, flow system with the possibility of dynamically changing the test conditions in each of the zones independently: flow rates, composition and physical properties of the culture medium without the need for precise control of hydrostatic pressures, culture on a detachable medium, which facilitates cleaning and sterilization of the microsystem, as well as fixation, maintenance and observation of cells after cultivation outside the microfluidic device, and enables precise and controlled point damage to selected axons during microscopic observations with the use of a micromanipulator by point pressure on the base of the microfluidic device, and thanks to its elastic deformation, compression and crushing of selected fragments of axons without the need to open the system and stop the flow of the culture medium.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładzie wykonania oraz na rysunku na którym:The subject of the invention is presented in more detail in the embodiment and in the drawing where:
fig. 1 przedstawia urządzenie mikrofluidalne wraz z portami przyłączeniowymi, fig. 2 przedstawia układ warstw w urządzeniu mikrofluidalnym, fig. 3 przedstawia układ komór hodowlanych w urządzeniu mikrofluidalnym, fig 4 przedstawia mechanizm uszkadzania aksonów w przekroju wzdłuż listwy uszkadzającej aksony:Fig. 1 shows the microfluidic device with connection ports, Fig. 2 shows the arrangement of layers in the microfluidic device, Fig. 3 shows the arrangement of rearing chambers in the microfluidic device, Fig. 4 shows the axon damage mechanism in a section along the axon damage strip:
fig. 4A - w stanie spoczynku, fig. 4B - w stanie pracy, fig. 5 przedstawia układ kanałów wiodących aksony.Fig. 4A - at rest, Fig. 4B - in operation, Fig. 5 shows the axon-leading channel arrangement.
Przykład realizacjiImplementation example
Zamknięte, przepływowe urządzenie mikrofluidalne o wymiarach 24/60/6 mm (szerokość/długość/wysokość) do prowadzenia hodowli komórek nerwowych zostało przedstawione na fig. 1, 2, 3, 4 i 5. Na fig. 1 zostało uwidocznione urządzenie mikrofluidalne w widoku ogólnym wraz z portami przyłączeniowymi 1 rozlokowanymi w bocznych ścianach urządzenia, obszarem detekcji 2, układem komór hodowlanych 3 oraz otworami pozycjonującymi 4. Urządzenie mikrofluidalne składa się z pięciu warstw: podstawy - złożonej z dwóch warstw: sprężystej 5A wykonanej z PET o grubości 100 mikrometrów oraz elastycznej 5B wykonanej z PDMS o grubości 8 mikrometrów, warstwy funkcjonalnej 6 wykonanej z PDMS o grubości 120 mikrometrów, warstwy szklanej 7 wykonanej ze szkła borokrzemowego trzeciej klasy hydrolitycznej o grubości 150 mikrometrów, warstwy klejowej 8 o grubości 100 mikrometrów oraz wieka 9 wykonanego z PMMA o grubości 5 mm.A closed flow microfluidic device with dimensions 24/60/6 mm (width / length / height) for culturing nerve cells is shown in Figures 1, 2, 3, 4 and 5. Figure 1 shows a microfluidic device in view. general with connection ports 1 located in the side walls of the device, the detection area 2, the arrangement of breeding chambers 3 and positioning holes 4. The microfluidic device consists of five layers: the base - composed of two layers: elastic 5A made of PET with a thickness of 100 micrometers and flexible 5B made of PDMS with a thickness of 8 micrometers, functional layer 6 made of PDMS with a thickness of 120 micrometers, glass layer 7 made of borosilicate glass of the third hydrolytic class with a thickness of 150 micrometers, an adhesive layer 8 with a thickness of 100 micrometers and a lid 9 made of PMMA with 5 mm thick.
Urządzenie posiada sześć bocznych portów przyłączeniowych w postaci otworów o średnicy 1 mm, dopasowanej do zewnętrznej średnicy mikrowęży doprowadzających i odprowadzających płyny do/z urządzenia.The device has six side connection ports in the form of holes with a diameter of 1 mm, matched to the outer diameter of the micro-hoses supplying and discharging liquids to / from the device.
Urządzenie posiada jedno centralnie rozmieszczone pole detekcji obejmujące obszar roboczy komór hodowlanych o wymiarach 14/9 mm (długość/szerokość), umożliwiające obserwację i detekcję procesów pod mikroskopem w sposób niezakłócony, bez zniekształceń optycznych, w świetle widzialnym oraz UV.The device has one centrally placed detection field covering the working area of the 14/9 mm (length / width) culture chambers, enabling the observation and detection of processes under the microscope in an undisturbed manner, without optical distortion, in visible and UV light.
PL 235 926 B1PL 235 926 B1
Urządzenie posiada trzy komory hodowlane: komorę somalną 3A, komorę uszkodzeń aksonów 3B oraz komorę dystalną 3C o przebiegu wzajemnie równoległym w obrębie obszaru roboczego urządzenia mikrofluidalnego, każda o szerokości 2 mm i długości przestrzeni roboczej 14 mm. Każda z komór hodowlanych jest komorą przepływową oraz posiada wlot i wylot podłączone do odpowiednich portów przyłączeniowych mikrourządzenia. W osi symetrii komory uszkodzeń aksonów, położona równolegle do ścian komory, znajduje się listwa 10 uszkadzająca aksony o wymiarach 12000/50/120 mikronów (długość/szerokość/wysokość). Elastyczna listwa 10 uszkadzająca aksony wraz z sprężysto-elastyczną podstawą tworzą mechanizm uszkadzania aksonów przedstawiony na fig. 4, który działa w ten sposób, że po zastosowaniu punktowym niewielkiej siły zgodnie z kierunkiem przedstawionym na rysunku 4B za pomocą strzałki, następuje odwracalne odkształcenie podstawy i zgniecenie aksonu 11. Po ustaniu działania siły, mechanizm uszkadzania aksonów samoczynnie powraca do pozycji wyjściowej przedstawionej na fig. 4A.The device has three rearing chambers: the somal chamber 3A, the axon damage chamber 3B and the distal chamber 3C with a mutually parallel course within the working area of the microfluidic device, each 2 mm wide and 14 mm long. Each of the breeding chambers is a flow chamber and has an inlet and an outlet connected to the respective microdevice connection ports. In the axis of symmetry of the axon damage chamber, located parallel to the walls of the chamber, there is an axon damage strip 10 with dimensions of 12000/50/120 microns (length / width / height). The elastic axon damaging blade 10 together with the elastic-elastic base form the axonal damage mechanism shown in Fig. 4 which operates in such a way that when a slight point force is applied in the direction shown by an arrow in Fig. 4B, reversible deformation of the base and crushing occurs. axon 11. Upon the termination of the force, the axon damage mechanism automatically returns to the starting position shown in Figure 4A.
W dnie komór hodowlanych, w obszarze roboczym urządzenia mikrofluidalnego, przebiega prostopadle do ścian, w poprzek komór hodowlanych, sześćdziesiąt osiem prostoliniowych kanałów wiodących aksony 12. Kanały wiodące mają szerokość 30 mikrometrów i wysokość 8 mikrometrów.At the bottom of the rearing chambers, in the working area of the microfluidic device, sixty-eight straight leading channels, axons 12, run perpendicular to the walls, across the rearing chambers. The leading channels are 30 micrometers wide and 8 micrometers high.
Urządzenie posiada cztery otwory pozycjonujące rozmieszczone w narożach urządzenia, umożliwiające precyzyjne wzajemne pozycjonowanie warstw mikrourządzenia.The device has four positioning holes located in the corners of the device, enabling precise mutual positioning of the microdevice layers.
Warstwy podstawy 5A i 5B połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Podstawa połączoną jest z warstwą 6 w sposób rozłączny i hydraulicznie szczelny. Warstwy 6-9 połączone są ze sobą w sposób nierozłączny, hydraulicznie szczelny i trwały. Warstwy 5A-7 połączone są ze sobą bez użycia kleju, a jedynie w wyniku modyfikacji właściwości powierzchniowych. Warstwa klejowa 8 łączy ze sobą warstwy 7 i 9. W warstwach 7 i 8 wykonane zostały otwory przelotowe 13 umożliwiające wertykalny przepływ płynu pomiędzy sąsiadującymi warstwami.The base layers 5A and 5B are connected in a non-separable, hydraulically tight and durable manner. The base is connected to the layer 6 in a releasable and hydraulically tight manner. Layers 6-9 are connected with each other in an inseparable, hydraulically tight and durable manner. Layers 5A-7 are joined together without the use of glue, but only as a result of modification of the surface properties. The adhesive layer 8 connects the layers 7 and 9. The layers 7 and 8 are provided with through-holes 13 to allow vertical fluid flow between adjacent layers.
Claims (23)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415008A PL235926B1 (en) | 2015-11-30 | 2015-11-30 | Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415008A PL235926B1 (en) | 2015-11-30 | 2015-11-30 | Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415008A1 PL415008A1 (en) | 2016-12-19 |
| PL235926B1 true PL235926B1 (en) | 2020-11-16 |
Family
ID=57542569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415008A PL235926B1 (en) | 2015-11-30 | 2015-11-30 | Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL235926B1 (en) |
-
2015
- 2015-11-30 PL PL415008A patent/PL235926B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415008A1 (en) | 2016-12-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blake et al. | Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment | |
| Wang et al. | A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues | |
| DE102008018170B4 (en) | Microfluidic system and method for the construction and subsequent cultivation and subsequent investigation of complex cell arrays | |
| EP1319062B1 (en) | Method and device for growing and/or treating cells | |
| Taylor et al. | Microfluidic multicompartment device for neuroscience research | |
| US11596945B2 (en) | Microfluidic device, system, and method for the study of organisms | |
| CN107980057B (en) | Microfluidic device for in-vitro 3D cell culture experiment | |
| JP7257565B2 (en) | Microfluidic device, method of manufacture, and use thereof | |
| WO2004020341A2 (en) | Bioreactors with substance injection capacity | |
| WO2017175236A1 (en) | Microfluidic platform for developing in-vitro co-cultures of mammalian tissues. | |
| EP3140390B1 (en) | Semi-finished product and device for the in vitro production and culturing of cell layers | |
| DE102013011768B4 (en) | Circulation system and method for the vital supply of cell cultures in a microfluidic network | |
| TW201343916A (en) | A passive microfluidic device and a method of forming the same | |
| CN111621420B (en) | Cell co-culture micro-fluidic chip for enhancing neuron function | |
| WO2018106132A1 (en) | Microfluidic device for cell culture in gradient of bioactive substance | |
| PL235926B1 (en) | Microfluidic flow device for growing neuronal cell cultures | |
| PL235927B1 (en) | Microfluidal device for generation of neural network damages | |
| US11236300B2 (en) | Microfluidic device for controlling the geometry of living bodies | |
| CN103599722B (en) | Bionics microfluidic mixer | |
| Cabello Valverde | MEMS-based Lab-on-chip platform with integrated 3D and planar microelectrodes for organotypic and cell cultures | |
| DE102022123877A1 (en) | Basic body of a multi-chamber biochip, production of the multi-chamber biochip and its use for the establishment of organ and disease models and substance testing | |
| US20210238524A1 (en) | Elastically deformable components and assemblies for use in cellular assays | |
| Caicedo et al. | Microfluidic culture chamber for the long term perfusion and precise chemical stimulation of organotypic brain tissue slices | |
| CN115960717A (en) | Cell and tissue culture organ chip | |
| Chennuri | DEVELOPMENT OF INNOVATIVE MULTICOMPARTMENT MICROFLUIDIC PLATFORMS TO INVESTIGATE TRAUMATIC AXONAL INJURY |