PL235848B1

PL235848B1 - New derivatives of coumarin, method for producing them and application in the method of detection and/or determination of catalytic activity and stereoselectivity of the hydrolase reactions

Info

Publication number: PL235848B1
Application number: PL407948A
Authority: PL
Inventors: Ryszard Ostaszewski; Anna Żądło; Szymon KŁOSSOWSKI; Szymon Kłossowski; Małgorzata Zysk; Anna Brodzka
Original assignee: Inst Chemii Organicznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2020-11-02
Also published as: PL407948A1

Description

Przedmiotem wynalazku są pochodne kumaryny, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie tych związków jako substratów barwnych do fluorescencyjnego i spektrofotometrycznego wykrywania aktywności katalitycznej oraz oznaczania stereoselektywności reakcji katalizowanych przez hydrolazy.The subject of the invention is coumarin derivatives, the method of their preparation and the use of these compounds as color substrates for the fluorescent and spectrophotometric detection of catalytic activity and determination of the stereoselectivity of reactions catalyzed by hydrolases.

Enzymy jako katalizatory reakcji chemicznych i biochemicznych znalazły szerokie zastosowanie w procesach technologicznych i biotechnologicznych, szczególnie w syntezie związków nieracemicznych, o wysokiej wartości dodanej, takich jak aktywne składniki farmaceutyków (API; Active Pharmaceutical Ingredients). Zastosowania enzymów wymagają opracowania prostych i wiarygodnych metod oznaczania ich aktywności katalitycznej oraz określania stereoselektywności reakcji gdy substraty są związkami racemicznymi. Dlatego też, zastosowanie enzymów do syntezy związków enancjomerycznie wzbogaconych wymaga wykonania szeregu dodatkowych badań, w ramach których należy wyznaczyć, poza określeniem aktywności poszczególnych enzymów względem achiralnych substratów, także skład enancjomeryczny mieszanin reakcyjnych uzyskanych w wyniku procesów bioakatalitycznych dla substratów racemicznych. Umożliwia to określenie stereoselektywności reakcji katalizowanych przez enzymy co ma kluczowe znaczenie szczególnie dla ich zastosowań szczególnie przemysłowych. Metody oznaczania aktywności enzymatycznej oparte na oznaczeniach optycznych (fotometria, spektrofotometria, fluorescencja, luminescencja) zapewniają wysoki standard odpowiednich oznaczeń. Można je zastosować wtedy, gdy substrat do reakcji enzymatycznej lub uzyskiwany z niego w wyniku reakcji katalizowanej przez poszukiwany enzym produkt są substancjami barwnymi. Nie jest to jednak możliwe w przypadku, gdy oba związki nie różnią się właściwościami spektroskopowymi (J. P. Goddard, J. L. Reymond, Trends in Biotechnology 2004, 22, 363-370).Enzymes as catalysts for chemical and biochemical reactions are widely used in technological and biotechnological processes, especially in the synthesis of non-racemic compounds with high added value, such as active pharmaceutical ingredients (APIs). The use of enzymes requires the development of simple and reliable methods for determining their catalytic activity and determining the stereoselectivity of reactions when the substrates are racemic compounds. Therefore, the use of enzymes for the synthesis of enantiomerically enriched compounds requires a number of additional tests, within which, apart from determining the activity of individual enzymes on achiral substrates, also the enantiomeric composition of reaction mixtures obtained as a result of bioacatalytic processes for racemic substrates should be determined. This makes it possible to determine the stereoselectivity of reactions catalyzed by enzymes, which is of key importance, especially for their industrial applications. Methods for determining enzymatic activity based on optical determinations (photometry, spectrophotometry, fluorescence, luminescence) ensure a high standard of appropriate determinations. They can be used when the substrate for the enzymatic reaction or the product obtained from it as a result of the reaction catalyzed by the desired enzyme are colored substances. However, this is not possible when the two compounds do not differ in their spectroscopic properties (J. P. Goddard, J. L. Reymond, Trends in Biotechnology 2004, 22, 363-370).

Powszechnie do oznaczania aktywności lipaz i esteraz stosuje się estry p-nitrofenolu i kwasów karboksylowych o wzorze 1 posiadające grupy R¹ będące łańcuchami alifatycznymi C1-C20. Krótkołańcuchowe estry, takie jak octan czy maślan, są rozpuszczalne w wodzie i zwykle wykorzystywane do oznaczania aktywności esteraz, natomiast estry długołańcuchowe, jak laurynian, palmitynian czy oleinian, nie są rozpuszczalne w środowisku wodnym oraz wymagają stosowania dodatku środków powierzchniowo czynnych i są wykorzystywane do oznaczania aktywności lipaz. Reakcje takie przebiegają zgodnie z mechanizmem przedstawionym na Schemacie I, powodując uwalnianie p-nitrofenolu, którego stężenie oznacza się spektofotometrycznie przy długości fali 410 nm.Commonly used to determine the activity of lipases and esterases are used esters of p-nitrophenol and carboxylic acids of formula 1 having R ¹ groups which are aliphatic chains of C1-C20. Short-chain esters such as acetate and butyrate are soluble in water and usually used to determine the activity of esterases, while long-chain esters such as laurate, palmitate and oleate are not soluble in water and require the addition of surfactants and are used for the determination of lipase activity. Such reactions proceed according to the mechanism presented in Scheme I, causing the release of p-nitrophenol, the concentration of which is determined spectrophotometrically at 410 nm.

Wzór 1Formula 1

Schemat IScheme I

Metoda pomimo wielu zalet, jak prostota oznaczania i niski koszt substratów, posiada jednak również szereg wad (C. Huggins, J. Lapides, J. Biol. Chem. 1947, 170, 467-482). Jedną z ważniejszych jest jej ograniczenie tylko do oznaczania jednego achiralnego fenolu i to, że nie pozwala ona na oznaczenie aktywności reakcji dla estrów alkoholi racemicznych.The method, despite many advantages, such as simplicity of determination and low cost of substrates, also has a number of disadvantages (C. Huggins, J. Lapides, J. Biol. Chem. 1947, 170, 467-482). One of the more important is its limitation to the determination of only one achiral phenol and the fact that it does not allow the determination of the reaction activity for racemic alcohol esters.

Aktywność enzymów hydrolitycznych może być oznaczana z dużą czułością i dokładnością za pomocą metod fluorymetrycznych z zastosowaniem substratów fluorogennych, które nie posiadają właściwości fluorescencyjnych a dopiero uwolniony w wyniku hydrolizy enzymatycznej związek wykazuje silną fluorescencję. Szeroko stosowane do tego celu są estry kumaryny o wzorze 2 posiadające jako grupę R² wodór, metyl lubtrifluorometyl oraz grupę R¹ będącą łańcuchem alifatycznymi C1-C20. Najczęściej stosowane są octan i maślan 7-hydroksy-4-metylokumaryny do oznaczania aktywności esteraz oraz palmitynian i laurynian do oznaczania aktywności lipaz (T. De Laborde de Monpezat, B. De Jeso, J.L. Butour, L. Chavant, M. Sancholle, Lipids 1990, 25, 661-664). Metody te jednak nie pozwalają na wyznaczenie stereoselektywności reakcji a także dotyczą tylko pochodnych kwasów karboksylowych.The activity of hydrolytic enzymes can be determined with high sensitivity and accuracy by means of fluorimetric methods using fluorogenic substrates that do not have fluorescent properties, and the compound released as a result of enzymatic hydrolysis shows a strong fluorescence. The coumarin esters of the formula II having as the R ² group hydrogen, methyl or trifluoromethyl and the R ¹ group being a C 1 -C 20 aliphatic chain are widely used for this purpose. The most commonly used are 7-hydroxy-4-methylcoumarin acetate and butyrate to determine the activity of esterases and palmitate and laurate for the determination of lipase activity (T. De Laborde de Monpezat, B. De Jeso, JL Butour, L. Chavant, M. Sancholle, Lipids 1990, 25, 661-664). These methods, however, do not allow for the determination of the stereoselectivity of the reaction and also apply only to carboxylic acid derivatives.

Zaproponowano pośrednie metody oznaczania aktywności hydrolaz z zastosowaniem procedury składającej się z sekwencji trzech następujących po sobie reakcji (Patent US 2003/0199017 A1 : J.-L. Reymond, D. Wahler, F. Badalassi, H.-K. Nguyen). W pierwszym etapie, z fluorogennych substratów w wyniku hydrolizy enzymatycznej uwalniany był kwas karboksylowy i drugorzędowy alkohol połączonyIndirect methods for determining the activity of hydrolases have been proposed using a procedure consisting of a sequence of three consecutive reactions (US Patent US 2003/0199017 A1: J.-L. Reymond, D. Wahler, F. Badalassi, H.-K. Nguyen). In the first stage, the carboxylic acid and the combined secondary alcohol were released from the fluorogenic substrates as a result of enzymatic hydrolysis.

PL 235 848 Β1 wiązaniem eterowym z 7-hydroksy-4-metylokumaryną. Następnie, w wyniku działania najdodanu sodu alkohol był utleniany do odpowiedniego ketonu, który pod działaniem albuminy z surowicy bydlęcej ulegał procesowi β-eliminacji, prowadząc do uwolnienia fluorescencyjnej 7-hydroksy-4-metylokumaryny. W kolejnych latach metoda ta została zaadaptowana do badań przesiewowych nad lipazami i esterazami (E. Nyfeler, J. Grognux, D. Wahler, J.L. Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2919-2926), aldolazami (R. P. Carlón, N. Jourdain, J.-L. Reymond, Chem. Eur. J. 2000, 6, 4154-4162), amidazami (E. Henke, U. T. Bornscheuer, Anal. Chem. 2003, 75, 255-260), fosfatazami (E. M. Gonzalez-Garcia, J. Grognux, D. Wahler, J.-L. Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2458-2467), hydrolazami epoksydowymi (P. D. Jones, N. M. Wolf, C. Morisseau, P. Wheatstone, B. Hock, B. D. Hammock, Anal. Blochem. 2005, 343, 66-75), monooksygenazami Bayera-Villigera (R. Sicard, L. S. Chen, A. J. Marsaioli, J.-L. Reymond, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1041-1050). Zaproponowane substraty w wyniki reakcji z hydrolazami dają produkty uboczne takie jak aldehydy lub ketony, które są często inhibitorami badanych hydrolaz.PL 235 848 Β1 ether bond with 7-hydroxy-4-methyl coumarin. Then, as a result of the action of the most added sodium, the alcohol was oxidized to the appropriate ketone, which under the action of bovine serum albumin underwent the process of β-elimination, leading to the release of the fluorescent 7-hydroxy-4-methyl coumarin. In the following years, this method was adapted to screening lipases and esterases (E. Nyfeler, J. Grognux, D. Wahler, JL Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2919-2926), aldolases (RP Carlón, N. Jourdain , J.-L. Reymond, Chem. Eur. J. 2000, 6, 4154-4162), amidases (E. Henke, UT Bornscheuer, Anal. Chem. 2003, 75, 255-260), phosphatases (EM Gonzalez- Garcia, J. Grognux, D. Wahler, J.-L. Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2458-2467), epoxy hydrolases (PD Jones, NM Wolf, C. Morisseau, P. Wheatstone, B. Hock, BD Hammock, Anal. Blochem. 2005, 343, 66-75), Bayer-Villiger monooxygenases (R. Sicard, LS Chen, AJ Marsaioli, J.-L. Reymond, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1041- 1050). The proposed substrates, as a result of reactions with hydrolases, give by-products such as aldehydes or ketones, which are often inhibitors of the tested hydrolases.

Przedstawione metody można zastosować, gdy produkty reakcji hydrolizy katalizowanej przez enzym posiadają silną fluorescencję w środowisku reakcji, natomiast substraty nie wykazują fluorescencji i można je użyć do jakościowego oraz ilościowego oznaczania nawet bardzo małych ilości enzymu. Tego typu oznaczenia znakomicie upraszczają procesy wydzielania enzymów. Takie substraty znajdują zastosowanie w technikach „high-throughput screening” (HTS). Niestety, można je zastosować tylko do wybranych grup substratów, w których funkcję grupy alkoksylowej pełni cząsteczka chromoforu lub fluoroforu. Oznaczenie aktywności dla nieracemicznych estrów alkoholi drugorzędowych, tioli czy amidów nieracemicznych amin nie jest bezpośrednio możliwe jak też oznaczenie stereoselektywności tych reakcji.The presented methods can be used when the products of the enzyme catalyzed hydrolysis reaction have a strong fluorescence in the reaction medium, while the substrates do not show fluorescence and can be used for qualitative and quantitative determination of even very small amounts of enzyme. This type of assay greatly simplifies the processes of enzyme secretion. Such substrates are used in "high-throughput screening" (HTS) techniques. Unfortunately, they can only be applied to selected groups of substrates in which the function of the alkoxy group is performed by a chromophore or fluorophore molecule. The determination of activity for non-racemic esters of secondary alcohols, thiols or amides of non-racemic amines is not directly possible, nor is it possible to determine the stereoselectivity of these reactions.

Nieoczekiwanie, stwierdzono, że pochodne kumaryny według wynalazku przedstawione poniższym wzorem 5, które są mieszanymi węglanami alkoholi, tioli, amin oraz pochodnych kumaryny są o wiele lepszymi substratami od znanych obecnie związków stosowanych do wykrywania obecności oraz oznaczania aktywności hydrolaz oraz wyznaczania stereoselektywności biokatalizowanych reakcji.Surprisingly, it has been found that the coumarin derivatives according to the invention represented by the formula 5 below, which are mixed carbonates of alcohols, thiols, amines and coumarin derivatives, are much better substrates than the currently known compounds used for detecting the presence and determination of the activity of hydrolases and determining the stereoselectivity of biocatalised reactions.

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne kumaryny przedstawione wzorem 5,The subject of the invention is new coumarin derivatives represented by the formula 5,

R7 R6R7 R6

R9R9

Wzór 5 gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl, a X oznacza atom tlenu, siarki lub azotu.Formula 5 where R ³ and R ⁴ are each independently hydrogen, C1-C25 alkyl, optionally substituted at the α, β, γ position with -OH, C1-C5 alkoxy, NH2, COOH; C2-C25 alkene, C2-C25 alkyne or C6-C10 aryl; R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ are each independently hydrogen, C1-C5 alkyl, C1-C5 alkoxy, phenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, trifloromethyl, trichloromethyl, and X is oxygen, sulfur or nitrogen atom.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych kumaryny o wzorze 5. Synteza według wynalazku polega na reakcji odpowiedniego alkoholu, tiolu lub aminy o wzorze 3, gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; z fosgenem co daje odpowiednią pochodną o wzorze 6, która następnie poddawana jest reakcji z kumaryną o wzorze 4 gdzie R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl.Another object of the invention is a process for the preparation of new coumarin derivatives of formula 5. The synthesis according to the invention consists in the reaction of a suitable alcohol, thiol or amine of formula 3, where R ³ and R ⁴ are, independently of each other, hydrogen, C1-C25 alkyl, optionally substituted in the α, β, γ with -OH, C1-C5 alkoxy, NH2, COOH; C2-C25 alkene, C2-C25 alkyne or C6-C10 aryl; with phosgene to give the corresponding derivative of formula 6, which is then reacted with the coumarin of formula 4 where R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ are each independently hydrogen, C1-C5 alkyl, C1-C5 alkoxy , phenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, trifloromethyl, trichloromethyl.

W sposobie według wynalazku substrat barwny o wzorze 5 otrzymuje się jak przedstawiono na Schemacie II (dane eksperymentalne patrz Przykład I) w reakcji pomiędzy podstawioną grupami R³ i R⁴alkoholem, aminą lub tiolem z fosgenem co prowadzi do powstania nietrwałego związku o wzorze 6, który natychmiast i bez wydzielania podawany jest reakcji z podstawioną grupami R⁵, R⁶, R⁷i R⁸, R⁹kumaryną o wzorze 4.In the process according to the invention, the color substrate of formula 5 is prepared as described in Scheme II (for experimental data see Example I) by reaction between the substituted groups R ³ and R ⁴ with an alcohol, amine or thiol with phosgene to form the unstable compound of formula 6. which is immediately and without isolation reacted with the substituted groups R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ and R ⁸ , R ⁹ coumarin of formula 4.

PL 235 848 Β1PL 235 848 Β1

R4R4

Wzór 3Formula 3

COCI₂ COCI ₂

Wzór 6Formula 6

Schemat IIScheme II

Korzystnie, reakcje prowadzi się w rozpuszczalnikach polarnych aprotycznych, np. tetrahydrofuranie, chlorku metylenu, chloroformie lub w węglowodorach aromatycznych, lub w ich mieszaninach, przez 1-24 godziny, w temperaturze od 0 do 100°C i w obecności zasady organicznej, korzystnie EtsN, pirydyny, lutydyny, dimetyloaminopirydyny lub zasady nieorganicznej, korzystnie węglan sodu lub węglan potasu.Preferably, the reactions are carried out in polar aprotic solvents, e.g. tetrahydrofuran, methylene chloride, chloroform or aromatic hydrocarbons, or mixtures thereof, for 1-24 hours at a temperature of 0 to 100 ° C and in the presence of an organic base, preferably EtsN. pyridine, lutidine, dimethylaminopyridine or an inorganic base, preferably sodium carbonate or potassium carbonate.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania aktywności hydrolaz, charakteryzujący tym, że testowaną próbkę kontaktuje się z substratem, a następnie bada się obecność produktu hydrolizy substratu, przy czym jako substrat stosuje się związek według wynalazku o wzorze 5 a jego hydrolizę bada się dokonując pomiaru spektrofotometrycznego lub pomiaru fluorescencji.Another subject of the invention is a method for determining the activity of hydrolases, characterized in that the test sample is contacted with a substrate, and then the presence of the substrate hydrolysis product is tested, whereby a compound of the invention of formula 5 is used as the substrate and its hydrolysis is tested by spectrophotometric or fluorescence measurement.

Korzystnie, aktywność hydrolaz oznacza się w surowych lub oczyszczonych preparatach organicznych i/lub preparatach biologicznych.Preferably, the activity of the hydrolases is determined in crude or purified organic preparations and / or biological preparations.

Korzystnie, sposobem według wynalazku oznacza się stereoselektywność reakcji katalizowanych przez hydrolazy, przy czym do oznaczeń stosuje się enancjomerycznie czyste lub wzbogacone pochodne kumaryny o wzorze 5.Preferably, the process of the invention determines the stereoselectivity of the hydrolase-catalyzed reactions, the determination using enantiomerically pure or enriched coumarin derivatives of formula 5.

Uzyskany substrat barwny o wzorze 5, według wynalazku jest stosowany do wykrywania, oznaczania aktywności enzymatycznej oraz wyznaczania stereoselektywności reakcji katalizowanych przez hydrolazy takie jak lipazy, esterazy, proteazy obecne w surowych i oczyszczonych preparatach organicznych i/lub preparatach biologicznych zawierających te enzymy natywne lub genetycznie modyfikowane, zgodnie ze Schematem III.The obtained color substrate of formula 5, according to the invention, is used for detection, determination of enzymatic activity and determination of stereoselectivity of reactions catalyzed by hydrolases such as lipases, esterases, proteases present in crude and purified organic preparations and / or biological preparations containing these native or genetically modified enzymes. according to Scheme III.

Schemat IIIScheme III

Uzyskiwane w tej reakcji produkty, którymi są pochodne kumaryny o wzorze 4 silnie pochłaniają światło w zakresie UV oraz silnie fluoryzują co umożliwia ich szybkie jakościowe i ilościowe oznaczenie, a także wyznaczenie prędkości poszczególnych reakcji jednostkowych z enzymami. Zastosowanie obu enancjomerów substratu barwnego do reakcji oddzielnie umożliwia bezpośrednie wyznaczenie prędkości reakcji obu enancjomerów a tym samym oznaczenie stereoselektywności procesu i określenia który z enancjomerów substratu reaguje szybciej w obecności danego enzymu.The products obtained in this reaction, which are coumarin derivatives of formula 4, strongly absorb light in the UV range and strongly fluoresce, which enables their quick qualitative and quantitative determination, as well as the determination of the speed of individual unit reactions with enzymes. The use of both enantiomers of a colored substrate for the reaction separately makes it possible to directly determine the rate of reaction of both enantiomers and thus to determine the stereoselectivity of the process and determine which of the enantiomers of the substrate reacts faster in the presence of a given enzyme.

Oznaczenia takie można prowadzić dla różnych preparatów biologicznych zawierających hydrolazy, niezależnie od ich pochodzenia w roztworach wodnych, w procesie oczyszczania enzymów, w procesie ich immobilizacji, w badaniu aktywności próbek otrzymywanych w procesie oczyszczania tego enzymu po rozdziale metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej, hodowlach inokulum, fermentacji w skali laboratoryjnej i przemysłowej. Ponadto, używając te związki jako substraty barwne można wykrywać obecność oraz określać stereoselektywność hydrolaz na żelach po procesie rozdziału próbek metodą elektroforezy. Identyfikacja taka polega na oświetleniu powierzchni żelu światłem UV o długości fali 360 nm i obserwacji fluoryzującego prążka produktu reakcji katalizowanej przez hydrolazę na jego powierzchni.Such determinations can be carried out for various biological preparations containing hydrolases, regardless of their origin in aqueous solutions, in the process of enzyme purification, in the process of their immobilization, in the study of the activity of samples obtained in the process of purification of this enzyme after separation by medium pressure liquid chromatography and high performance liquid chromatography, inoculum cultures, laboratory and industrial scale fermentation. Moreover, by using these compounds as color substrates, the presence and stereoselectivity of the hydrolases on the gels can be detected after the separation of samples by electrophoresis. Such identification consists in illuminating the surface of the gel with UV light with a wavelength of 360 nm and observing the fluorescent band of the reaction product catalyzed by hydrolase on its surface.

PL 235 848 B1PL 235 848 B1

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunku, na którym na fig. 1 przedstawiono widma absorpcji i fluorescencji 7-hydroksy-4-metylokumaryny, 7-hydroksy-4-trifluorometylokumaryny, związku 5a.FIG. 1 shows the absorption and fluorescence spectra of 7-hydroxy-4-methyl coumarin, 7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin, compound 5a.

W podanych przykładach pokazano zastosowanie tych związków do fluorescencyjnego oznaczania aktywności enzymatycznej hydrolaz (przykład II, IV) do spektrofotometrycznego oznaczania aktywności enzymatycznej hydrolaz (przykład III).The examples given show the use of these compounds for the fluorescent determination of the enzymatic activity of hydrolases (example 2, 4) for the spectrophotometric determination of the enzymatic activity of hydrolases (example 3).

P r z y k ł a d IP r z k ł a d I

Wytwarzanie substratu barwnego o wzorze 5a (ogólnie Schemat II, szczegółowo)Preparation of a color substrate of formula 5a (generally, Scheme II, in detail)

Ogólna metoda syntezy związków o wzorze 5General method for the synthesis of compounds of formula 5

Roztwór odpowiedniego alkoholu, aminy lub tiolu (1 mmol) w bezwodnym tetrahydrofuranie THF (2 ml) schłodzono do temperatury 0°C, w atmosferze argonu, i dodano roztwór fosgenu w toluenie (20%, 1.25 ml, 2.5 mmol). Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przepuszczono przez 15 minut argon, aby usunąć nieprzereagowany fosgen. Ponownie schłodzono do 0°C i powoli dodano roztwór dimetyloaminopirydyny (25 mg, 0.2 mmol), trietyloaminy (0.42 ml, 3 mmol) i odpowiedniej kumaryny o wzorze 4 (1 mmol) w bezwodnym THF (2 ml). Następnie mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dodano chlorek metylenu (10 ml) i ekstrahowano roztworem kwasu solnego (1 M, 5 ml). Fazy rozdzielono i fazę organiczną suszono za pomocą siarczanu magnezu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę chlorku metylenu i metanolu (99:1, obj./obj.).A solution of the appropriate alcohol, amine or thiol (1 mmol) in anhydrous THF tetrahydrofuran (2 ml) was cooled to 0 ° C under argon and a solution of phosgene in toluene (20%, 1.25 ml, 2.5 mmol) was added. The reaction mixture was then stirred for 2 hours at room temperature. Argon was flushed for 15 minutes to remove unreacted phosgene. Re-cooled to 0 ° C and a solution of dimethylaminopyridine (25 mg, 0.2 mmol), triethylamine (0.42 ml, 3 mmol) and the appropriate coumarin of formula 4 (1 mmol) in anhydrous THF (2 ml) was slowly added. After stirring for 2 hours at room temperature, methylene chloride (10 ml) was added and extraction was carried out with hydrochloric acid solution (1 M, 5 ml). The phases were separated and the organic phase was dried with magnesium sulfate. After evaporating the solvent, the residue was subjected to column chromatography on silica gel using a mixture of methylene chloride and methanol (99: 1, v / v) as eluent.

Produkt 5a węglan etylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3= Et, R4, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (161.4 mg, wydajność 65%, tt = 98-99°C).Product 5a ethyl- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) (X = O, R3 = Et, R4, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) was obtained as white powder (161.4 mg, 65% yield, mp = 98-99 ° C).

¹H NMR (COCI3, 400 MHz) δ 7.61-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.21-7.14 (m, 2H), 6.26 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.37-4.31 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.43-2.42 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.42-1.38 (t, 3H, J = 7.2 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 100 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 152.7, 151.8, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 65.3, 18.7, 14.1; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.25), 270 (4.12), 310 (4.03); Analiza obliczona dla C13H12O5: C 62.90, H 4.87; znaleziona C 62.76, H 4.79. ¹ H NMR (COCl 3, 400 MHz) δ 7.61-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.21-7.14 (m, 2H), 6.26 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.37-4.31 (q , 2H, J = 7.2 Hz), 2.43-2.42 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.42-1.38 (t, 3H, J = 7.2 Hz); ¹³ C NMR (COCl 3, 100 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 152.7, 151.8, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 65.3, 18.7, 14.1; UV / Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.25), 270 (4.12), 310 (4.03); Analysis calculated for C13H12O5: C 62.90, H 4.87; found C 62.76, H 4.79.

Produkt 5b węglan izopropylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=i-Pr, R4, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (91.8 mg, wydajność 35%, tt = 94-95°C) ¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.64-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.14 (m, 2H), 6.28-6.27 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.08-4.95 (m, 1H, J = 6.2 Hz), 2.44-2.43 (d, 3H, J = 1.4 Hz), 1.42-1.39 (d, 6H, J = 6.2 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.3, 152.7, 151.8, 125.4, 117.8, 117.4, 114.5, 109.9, 73.8, 21.7, 18.7; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (4.04), 310 (3.96); Analiza obliczona dla C14H14O5: C 64.12, H 5.38; znaleziona: C 64.02, H 5.33.Product 5b isopropyl- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = O, R3 = i-Pr, R4, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) obtained as a white powder (91.8 mg, 35% yield, mp = 94-95 ° C) ¹ H NMR (COCl 3, 200 MHz) δ 7.64-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.14 (m, 2H), 6.28-6.27 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.08-4.95 (m, 1H, J = 6.2 Hz), 2.44-2.43 (d, 3H, J = 1.4 Hz), 1.42-1.39 (d , 6H, J = 6.2Hz); ¹³ C NMR (COCl3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.3, 152.7, 151.8, 125.4, 117.8, 117.4, 114.5, 109.9, 73.8, 21.7, 18.7; UV / Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (4.04), 310 (3.96); Analysis calculated for C14H14O5: C 64.12, H 5.38; found: C 64.02, H 5.33.

Produkt 5c węglan tri(etylenowego glikolumonoetylowego)-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7- ylo) (X=O, R3= Et(OCH2CH2)3, R4, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju z wydajnością 35%.Product 5c Tri (ethylene glycolum monoethyl) - (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7- yl) carbonate (X = O, R3 = Et (OCH2CH2) 3, R4, R5, R7, R8, R9 = H , R6 = Me) obtained in the form of a colorless oil with a yield of 35%.

¹H NMR (COCI3, 400 MHz) δ 7.63-7.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.16 (m, 2H), 6.28 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.45-4.43 (m, 2H, J = 2.8 Hz), 3.83-3.81 (m, 2H, J = 2.8 Hz), 3.73-3.66 (m, 6H), 3.62-3.60 (m, 2H), 3.56-3.51 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.44 (d, 3H, J = 1.6Hz), 1.23-1.20 (t, 3H, J = 7.2 Hz); ¹ H NMR (COCl 3, 400 MHz) δ 7.63-7.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.16 (m, 2H), 6.28 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.45-4.43 (m , 2H, J = 2.8 Hz), 3.83-3.81 (m, 2H, J = 2.8 Hz), 3.73-3.66 (m, 6H), 3.62-3.60 (m, 2H), 3.56-3.51 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.44 (d, 3H, J = 1.6Hz), 1.23-1.20 (t, 3H, J = 7.2 Hz);

¹³C NMR (COCI3, 100 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 152.8, 151.8, 125.5, 117.9, 117.3, 114.6, 109.9, 70.7, 70.6, 70.5, 69.7, 68.6, 68.1,66.6, 18.7, 15.1; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.19), 270 (4.04), 310 (3.98); Analiza obliczona dla C19H24O8: C 59.99, H 6.36; znaleziona: C 59.75, H 6.25 ¹³ C NMR (COCl3, 100 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 152.8, 151.8, 125.5, 117.9, 117.3, 114.6, 109.9, 70.7, 70.6, 70.5, 69.7, 68.6, 68.1, 66.6, 18.7, 15.1; UV / Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.19), 270 (4.04), 310 (3.98); Analysis calculated for C19H24O8: C 59.99, H 6.36; found: C 59.75, H 6.25

Produkt 5d węglan (R)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (115.8, 71%, t1 = 65-66°C).Product 5d (R) -1-Phenylethyl- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = O, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H , R6 = Me) obtained as a white powder (115.8, 71%, t1 = 65-66 ° C).

¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.79-7.83 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.65-7.59 (m, 5H), 7.43-7.35 (td, 2H, Ji = 8.8 Hz, J2 = 6.4 Hz), 6.49 (s, 1 H), 6.09-6.06 (q, 1 H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H, J = 6.6 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 151.9, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1,22.1, 18.7 UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (4.02), 310 (3.93); Analiza obliczona dla C19H16O5: C 70.36, H 4.97; znaleziona: C 70.51, H 4.99; [a]o = 124 (c 1.0,CHCh). ¹ H NMR (COCl 3, 200 MHz) δ 7.79-7.83 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.65-7.59 (m, 5H), 7.43-7.35 (td, 2H, J = 8.8 Hz, J2 = 6.4 Hz), 6.49 (s, 1H), 6.09-6.06 (q, 1H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H, J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (COCl3, 50 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 151.9, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1, 22.1, 18.7 UV / Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (4.02), 310 (3.93); Analysis calculated for C19H16O5: C 70.36, H 4.97; found: C 70.51, H 4.99; [a] O = 124 (c 1.0, CHCl3).

Produkt 5e węglan (S)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (113.5, 70%, t1 = 65-66°C).Product 5e (S) -1-Phenylethyl- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = O, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H , R6 = Me) obtained as a white powder (113.5, 70%, t1 = 65-66 ° C).

¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.84-7.79 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.67-7.59 (m, 4H), 7.43-7.35 (m, 2H), 6.49 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.09-6.06 (q, 1H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H, ¹ H NMR (COCl 3, 200 MHz) δ 7.84-7.79 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.67-7.59 (m, 4H), 7.43-7.35 (m, 2H), 6.49 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.09-6.06 (q, 1H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H,

PL 235 848 B1PL 235 848 B1

J = 6.6 Hz); ¹³C NMR (CDCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 151.8, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1,22.1, 18.7; UV/Vis 7max(MeCN, nm, logs): 215 (4.22), 270 (4.03), 310 (3.95); Analiza obliczona dla C19H16O5: C 70.36, H 4.97; znaleziona: C 70.49, H 4.86; [a]D = -122 (c1.0, CHCI3)J = 6.6 Hz); ¹³ C NMR (CDCl3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 151.8, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1,22.1, 18.7; UV / Vis 7max (MeCN, nm, logs): 215 (4.22), 270 (4.03), 310 (3.95); Analysis calculated for C19H16O5: C 70.36, H 4.97; found: C 70.49, H 4.86; [a] D = -122 (c1.0, CHCl3)

Produkt 5f węglan (R)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = CF3) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju (131.8 mg, 70%) ¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.66-7.64 (dd, 1H, Ji = 8.8 Hz, J₂ = 1.6 Hz), 7.36-7.12 (m, 7H), 6.70 (s, 1H), 5.81-5.76 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.63 (d, 3H, J = 6.4 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 158.4, 155.0, 154.2, 151.8, 139.9, 128.7, 128.7, 126.5, 126.3, 126.2, 119.6, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.14), 280 (3.97), 315 (3.86), Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; znaleziona: C 60.89, H 3.85 [a]D = 109 (c 1.0, CHCI3)Product 5f (R) -1-Phenylethyl- (2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = O, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H R6 = CF3) was obtained as a colorless oil (131.8 mg, 70%) ¹ H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.66-7.64 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, J ₂ = 1.6 Hz), 7.36-7.12 (m, 7H), 6.70 (s, 1H), 5.81-5.76 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.63 (d, 3H, J = 6.4 Hz), ¹³ C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 158.4, 155.0, 154.2, 151.8, 139.9, 128.7, 128.7, 126.5, 126.3, 126.2, 119.6, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1, UV / Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.14 ), 280 (3.97), 315 (3.86). Analysis calculated for C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; found: C 60.89, H 3.85 [a] D = 109 (c 1.0, CHCl3)

Produkt 5g węglan (S)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH²Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = CF3) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju (139.5 mg, 74%) ¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.66-7.63 (dt, 1H, Ji = 2.0 Hz, J₂ = 7.2 Hz), 7.37-7.10 (m, 7H), 6.69 (s, 1H), 5.80-5.75 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.62 (d, 3H, J = 6.4 Hz), ¹³CNMR (CDCI3, 100 MHz) δ 158.4, 155.0, 154.1, 151.8, 139.9, 128.7, 128.6, 126.5, 126.3, 126.2, 120.0, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1 UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.13), 280 (3.98), 315 (3.87). Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; znaleziona: C 61.27, H 3.72 [a]D = -112 (c 1.0, CHCI3).Product 5g (S) -1-Phenylethyl- (2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = O, R3 = Me, R4 = CH ² Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R 6 = CF 3) was obtained as a colorless oil (139.5 mg, 74%) ¹ H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 7.66-7.63 (dt, 1H, J = 2.0 Hz, J ₂ = 7.2 Hz), 7.37 -7.10 (m, 7H), 6.69 (s, 1H), 5.80-5.75 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.62 (d, 3H, J = 6.4 Hz), CNMR ¹³ (CDCl3, 100 MHz ) δ 158.4, 155.0, 154.1, 151.8, 139.9, 128.7, 128.6, 126.5, 126.3, 126.2, 120.0, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1 UV / Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.13 ), 280 (3.98), 315 (3.87). Analysis calculated for C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; found: C 61.27, H 3.72 [a] D = -112 (c 1.0, CHCl3).

Produkt 5h węglan (R)-1-fenyloetyloamino-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=N, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130°C).Product 5h (R) -1-Phenylethylamino- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = N, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H , R6 = Me) obtained as a white powder (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130 ° C).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.49-7.45 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.32-7.28 (m, 4H), 7.25-7.20 (m, 1H), 7.05-7.03 (m, 2H), 6.15-6.14 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.43-5.42 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.88-4.81 (q, 1 H, J = 7.2 Hz), 2.32 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.52-1.50 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.8, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1, 22.1, 18.6, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (3.95), 310 (3.94), Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; znaleziona: C 70.09, H 5.29, N 4.16, [a]D = 81 (c 1.0, CHCI3) ¹ H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ 7.49-7.45 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.32-7.28 (m, 4H), 7.25-7.20 (m, 1H), 7.05-7.03 (m, 2H) , 6.15-6.14 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.43-5.42 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.88-4.81 (q, 1H, J = 7.2 Hz), 2.32 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.52-1.50 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³ C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.8, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1, 22.1, 18.6, UV / Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (3.95), 310 (3.94), Analysis calculated for C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; found: C 70.09, H 5.29, N 4.16, [a] D = 81 (c 1.0, CHCl3)

Produkt 5i węglan (S)-1-fenyloetyloamino-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=N, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130°C).Product 5i (S) -1-Phenylethylamino- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = N, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H , R6 = Me) obtained as a white powder (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130 ° C).

¹H NMR (CDCI3, 200 MHz) δ 7.79-7.75 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.61-7.49 (m, 5H), 7.35-7.33 (m, 2H), 6.45 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.81-5.77 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 5.22-5.11 (q, 1H, J = 7.0 Hz), 2.63 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.83-1.79 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 50 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.7, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1,22.1, 18.6, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (3.96), 310 (3.94) ¹ H NMR (CDCl 3, 200 MHz) δ 7.79-7.75 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.61-7.49 (m, 5H), 7.35-7.33 (m, 2H), 6.45 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.81-5.77 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 5.22-5.11 (q, 1H, J = 7.0 Hz), 2.63 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.83-1.79 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³ C NMR (CDCl 3, 50 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.7, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1,22.1, 18.6, UV / Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (3.96), 310 (3.94)

Analiza obliczona dla: C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; znaleziona: C 70.52, H 5.52, N 4.25, [a]D = -74 (c 1.0, CHCI3).Analysis calculated for: C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; found: C 70.52, H 5.52, N 4.25, [a] D = -74 (c 1.0, CHCl3).

Produkt 5j węglan 1-fenyloetylotio-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=S, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci jasnożółtego proszku (78.3 mg, 23%, t1 = 87-88°C).Product 5j 1-Phenylethylthio- (2-oxo-4-methyl-2H-chromen-7-yl) carbonate (X = S, R3 = Me, R4 = CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me ) obtained as a light yellow powder (78.3 mg, 23%, t1 = 87-88 ° C).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.53-7.49 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.29-7.18 (m, 5H), 7.08-7.01 (m, 2H), 6.19-6.18 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.64-4.58 (q, 1H, J = 7.2 Hz), 2.34 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.71-1.69 (d, 3H, J = 7.2 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 168.9, 160.3, 154.1, 153.2, 151.7, 141.6, 128.7, 127.8, 127.2, 125.4, 118.0, 117.6, 114.7, 110.2, 45.7, 22.2, 18.7, UV/Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.30), 270 (4.02), 310 (3.95), Analiza obliczona dla: C19H13F3O5: C 67.04, H 4.74; znaleziona: C 67.12, H 4.9.9 ¹ H NMR (CDCl 3, 400 MHz) δ 7.53-7.49 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.29-7.18 (m, 5H), 7.08-7.01 (m, 2H), 6.19-6.18 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.64-4.58 (q, 1H, J = 7.2 Hz), 2.34 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.71-1.69 (d, 3H, J = 7.2 Hz), ¹³ C NMR ( CDCI3,100 MHz) δ 168.9, 160.3, 154.1, 153.2, 151.7, 141.6, 128.7, 127.8, 127.2, 125.4, 118.0, 117.6, 114.7, 110.2, 45.7, 22.2, 18.7, UV / Vis 7max (MeCN, nm, loge ): 215 (4.30), 270 (4.02), 310 (3.95). Analysis calculated for: C19H13F3O5: C 67.04, H 4.74; found: C 67.12, H 4.9.9

P r z y k ł a d IIP r z x l a d II

Fluorymetryczne oznaczenie aktywności hydrolazFluorimetric determination of the activity of hydrolases

Wyznaczano prędkości początkowe hydrolizy 100 μM roztworów substratów 5a, 5b, 5c, 5d, 5e o stężeniu 5 milimoli w buforze fosforanowym o pH 7.4, w temperaturze 30°C, w obecności albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml i 100 μg enzymu. Stosowano długość fali wzbudzenia ex = 360 nm, a dane rejestrowano przy długości fali emisji em = 445 nm przez 2 godziny. Pomiary prowadzono za pomocą spektrofluorymetru SHIMAZU F7000. Do obliczenia prędkości początkowych zestawionych w Tabeli 1 wykorzystano zależność intensywności fluorescencji od stężenia 7-hydroksy-4-metylokumaryny.The initial rates of hydrolysis of 100 μM 5a, 5b, 5c, 5d, 5e substrate solutions with a concentration of 5 mmoles in phosphate buffer at pH 7.4, at a temperature of 30 ° C, in the presence of bovine serum albumin (BSA) at a concentration of 2 mg / ml and 100 were determined. μg of enzyme. The excitation wavelength used was ex = 360 nm and data was recorded at the emission wavelength em = 445 nm for 2 hours. Measurements were performed using a SHIMAZU F7000 spectrofluorimeter. The dependence of the fluorescence intensity on the concentration of 7-hydroxy-4-methyl coumarin was used to calculate the initial velocities listed in Table 1.

PL 235 848 Β1PL 235 848 Β1

Tabela 1. Prędkości początkowe reakcji autohydrolizy związków 5a-5e w buforze fosforanowym w obecności BSA i w przypadku jego brakuTable 1. Initial rates of the autohydrolysis reaction of compounds 5a-5e in phosphate buffer in the presence and absence of BSA

Związek Relationship bez BSA [nM s’¹]without BSA [nM s' ¹ ] BSA [nM s¹]BSA [nM s ¹ ] BSA/bez BSA BSA / without BSA 5a 5a 0.4 0.4 3.0 3.0 8 8 5b 5b 0.1 0.1 2.5 2.5 18 18 5c 5c 0.9 0.9 2.1 2.1 3 3 5d 5d 2.2 2.2 3.9 3.9 2 2 5e 5e 2.9 2.9 5.1 5.1 2 2

Wartości prędkości netto (V_net) podane w Tabeli 2 obliczono ze wzoru V_net = Venz- VnoE, gdzie Venz to prędkości początkowe reakcji w obecności enzymu i BSA, a VnoE to prędkości początkowe reakcji w obecności BSA.The net velocities (V _ne t) given in Table 2 are calculated from the formula V _ne t = Venz-VnoE, where Venz are the initial reaction rates in the presence of enzyme and BSA and VnoE are the initial reaction rates in the presence of BSA.

Tabela 2. Prędkości netto reakcji hydrolizy enzymatycznej związków 5a-5eTable 2. Net rates of enzymatic hydrolysis of compounds 5a-5e

Enzym _ Enzyme _ V_net [nM s ¹]V _net [nM s ¹ ] 5a 5a 5b 5b 5c 5c 5d 5d 5e 5e 5f 5f 5g 5g Lipaza z Candida rugosa Candida rugosa lipase 145 145 129 129 24 24 8 8 27 27 15 15 43 43 Esteraza z wątroby końskiej Horse liver esterase 44 44 9 9 35 35 25 25 18 18 Lipaza z Candida antarctica Lipase from Candida antarctica 75 75 15 15 25 25 4 4 2 2 Lipaza z Candida cylindracea Lipase from Candida cylindracea 15 15 10 10 1 1 13 13 20 twenty Lipaza z Porcine pancreas Lipaza from Porcine pancreas 11 11 7 7 8 8 15 15 1 1 9 9 2 2 Lipaza z Hog pancreas Lipaza from Hog pancreas 6 6 4 4 1 1 12 12 1 1 Lipaza z Candida lipolityca Lipase from Candida lipolytic 15 15 3 3 0.3 0.3 9 9 1 1 Lipaza z Rhizopus arrhizus Rhizopus arrhizus lipase 14 14 1 1 2 2 10 10 1 1 Lipaza z Pseudomonas fluorescens Lipase from Pseudomonas fluorescens 4 4 2 2 3 3 14 14 11 11 Lipaza z Pseudomonas cepacia Lipase from Pseudomonas cepacia 8 8 2 2 4 4 8 8 1 1 Esteraza z wątroby świńskiej Porcine liver esterase 7 7 6 6 3 3 88 88 67 67 Esteraza z Pseudomonas fluorescens Esterase from Pseudomonas fluorescens 4 4 2 2 0 0 6 6 6 6

V net—νθηζΎποΕV net — νθηζΎποΕ

Przykład IIIExample III

Spektrofotometryczne oznaczenie aktywności hydrolazSpectrophotometric determination of the activity of hydrolases

Substraty przygotowano w postaci 5 mM roztworów w acetonitrylu. Sporządzono krzywe zależności absorbancji w czasie dla reakcji hydrolizy pochodnych kumaryny dla serii lipaz i esteraz. Wyznaczono prędkości początkowe hydrolizy 100 μΜ roztworów substratów 5d, 5e, 5f, 5g w buforze fosforanowym o pH 7.4, w temperaturze 30°C w obecności 200 μg enzymu. Pomiary prowadzono za pomocą spektrofotometru Hitachi U-1900 przez 1 godzinę. Dane rejestrowano przy długości fali 360 nm dla związków 5d, 5e lub 410 nm dla związków 5f, 5g.The substrates were prepared as 5 mM solutions in acetonitrile. Curves of absorbance versus time were prepared for the hydrolysis of coumarin derivatives for a series of lipases and esterases. Initial rates of hydrolysis of 100 μΜ of substrate solutions 5d, 5e, 5f, 5g in phosphate buffer at pH 7.4 at the temperature of 30 ° C in the presence of 200 μg of the enzyme were determined. Measurements were performed with a Hitachi U-1900 spectrophotometer for 1 hour. Data were recorded at 360 nm for compounds 5d, 5e or 410 nm for compounds 5f, 5g.

PL 235 848 Β1PL 235 848 Β1

Tabela 3. Prędkości początkowe hydrolizy enzymatycznej związków 4-5 wyznaczane metodą spektrometrii UV-VisTable 3. Initial rates of enzymatic hydrolysis of compounds 4-5 determined by UV-Vis spectrometry

Enzym _ Enzyme _ V [nM/s] V [nM / s] 5f 5f 5g 5g 5d 5d 5e 5e Lipaza z Porcine pancreas. Lipaza from Porcine pancreas. 23 23 14 14 83 83 6 6 Lipaza z Candida rugosa Candida rugosa lipase 30 thirty 113 113 18 18 89 89

Przykład IVExample IV

Stosując procedurę opisaną w przykładzie II przeprowadzono analizę fluorometryczną aktywności hydrolaz według poniższej tabeli.Using the procedure described in Example 2, the fluorometric analysis of the activity of the hydrolases was carried out according to the table below.

Tabela 4. Prędkości początkowe hydrolizy enzymatycznej fluorogennych substratów 5h, 5iTable 4. Initial rates of enzymatic hydrolysis of fluorogenic substrates 5h, 5i

Enzym — Enzyme - V [nM/s] V [nM / s] 5h 5h 5i 5i 5j 5j Autodroliza Autodrolysis 5 5 5 5 0.2 0.2 Proteaza z Bovine Pancreas Protease from Bovine Pancreas 18 18 15 15 Proteaza Bacillus Licheniformis Bacillus Licheniformis protease 7 7 13 13 Lipaza z Candida cylindracea Lipase from Candida cylindracea 0.9 0.9 Lipaza z Candida rugosa Candida rugosa lipase 2 2 Lipaza z Candida antardica Lipase from Candida antardica 2 2 Esteraza z wątroby końskiej Horse liver esterase 4 4

Zastrzeżenia patentowePatent claims

Claims

1. A new coumarin derivative of formula 5,

Formula 5 where R ³ and R ⁴ are each independently hydrogen, C1-C25 alkyl, optionally substituted at the α, β, γ position with -OH, C1-C5 alkoxy, NH2, COOH;

C2-C25 alkene, C2-C25 alkyne or C6-C10 aryl;

R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ are independently of each other hydrogen, C1-C5 alkyl, C1-C5 alkoxy, phenyl, Cl, -Br, -J, NO2, trifloromethyl, trichloromethyl,

X is oxygen, sulfur or nitrogen.

2. A method for producing a compound according to claim 1 The process of claim 1, wherein the compound of formula 3

R4

Formula 3

PL 235 848 Β1 where R ³ and R ⁴ are, independently of each other, hydrogen, C1-C25 alkyl, optionally substituted at the α, β, γ position with: -OH, C1-C5 alkoxy, NH2, COOH; C2-C25 alkene, C2-C25 alkyne or C6-C10 aryl; X is oxygen, sulfur or nitrogen and reacted with phosgene to give a compound of formula 6,

Formula 6 where R ³ , R ⁴ and X are as above which is then reacted with the coumarin of formula 4

R7 R6

R9

Formula 4 where R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , R ⁹ are, independently of each other, hydrogen, C1-C5 alkyl, C1-C5 alkoxy, phenyl,

-Cl, -Br, -J, NO2, trifloromethyl, trichloromethyl to give the compound of formula 5:

R7 R6

R9

Formula 5

3. The method according to p. The process of claim 2, characterized in that the reactions are carried out in polar aprotic solvents, preferably tetrahydrofuran, methylene chloride, chloroform or aromatic hydrocarbons or mixtures thereof; for 1-24 hours; at a temperature of 0 to 100 ° C; in the presence of an organic base, preferably EtsN, pyridine, lutidine, dimethylaminopyridine; or an inorganic base, preferably sodium carbonate or potassium carbonate.

A method for determining the activity of hydrolases, characterized in that the test sample is contacted with a substrate, and then the presence of the substrate hydrolysis product is checked, wherein the substrate is a compound as defined in claim 1. 1, and its hydrolysis is investigated by spectrophotometric or fluorescence measurement.

5. The method according to p. A process as claimed in claim 4, characterized in that the activity of the hydrolases is determined in crude or purified organic preparations and / or biological preparations.

6. The method according to p. The process of claim 4, characterized in that the stereoselectivity of the hydrolase-catalyzed reactions is determined, the determination using enantiomerically pure or enriched coumarin derivatives of formula 5.