PL235564B1 - Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method - Google Patents
Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method Download PDFInfo
- Publication number
- PL235564B1 PL235564B1 PL419848A PL41984816A PL235564B1 PL 235564 B1 PL235564 B1 PL 235564B1 PL 419848 A PL419848 A PL 419848A PL 41984816 A PL41984816 A PL 41984816A PL 235564 B1 PL235564 B1 PL 235564B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- proteins
- alkbh
- group
- fto
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 100
- 108010005336 Histone H2a Dioxygenase AlkB Homolog 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 79
- 102000005882 Histone H2a Dioxygenase AlkB Homolog 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 title abstract description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title description 9
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 title description 2
- 102100030461 Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase FTO Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 101001062620 Homo sapiens Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase FTO Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102100027051 Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Human genes 0.000 claims abstract description 53
- 101000959152 Homo sapiens Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 3 Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 49
- 102100039086 Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 3 Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 101000959153 Homo sapiens RNA demethylase ALKBH5 Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102100039083 RNA demethylase ALKBH5 Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 101000836620 Homo sapiens Nucleic acid dioxygenase ALKBH1 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 35
- 102100039085 Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 4 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 101000959149 Homo sapiens Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 4 Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 45
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 34
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 32
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 31
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 30
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 16
- 210000000867 larynx Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 11
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 11
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical group [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 7
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims description 7
- -1 fendyline Chemical compound 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- YGEIMSMISRCBFF-UHFFFAOYSA-M 1-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-3-[2-(2,4-dichlorophenyl)-2-[(2,4-dichlorophenyl)methoxy]ethyl]imidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(Cl)=CC=C1C([N+]1=CN(CC(OCC=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)C=C1)C1=CC=C(Cl)C=C1 YGEIMSMISRCBFF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- HTGCJAAPDHZCHL-UHFFFAOYSA-N 3-[1-[(4-methyl-6H-pyrrolo[1,2-a][4,1]benzoxazepin-4-yl)methyl]-4-piperidinyl]-1H-benzimidazol-2-one Chemical compound O1CC2=CC=CC=C2N2C=CC=C2C1(C)CN1CCC(N2C(NC3=CC=CC=C32)=O)CC1 HTGCJAAPDHZCHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 4
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 4
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 4
- 239000005892 Deltamethrin Substances 0.000 claims description 4
- PLDUPXSUYLZYBN-UHFFFAOYSA-N Fluphenazine Chemical compound C1CN(CCO)CCN1CCCN1C2=CC(C(F)(F)F)=CC=C2SC2=CC=CC=C21 PLDUPXSUYLZYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N chlorpromazine Chemical compound C1=C(Cl)C=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZPEIMTDSQAKGNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001076 chlorpromazine Drugs 0.000 claims description 4
- DERZBLKQOCDDDZ-JLHYYAGUSA-N cinnarizine Chemical compound C1CN(C(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CCN1C\C=C\C1=CC=CC=C1 DERZBLKQOCDDDZ-JLHYYAGUSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000876 cinnarizine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002483 decamethrin Drugs 0.000 claims description 4
- OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N deltamethrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](C=C(Br)Br)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 OWZREIFADZCYQD-NSHGMRRFSA-N 0.000 claims description 4
- SMANXXCATUTDDT-QPJJXVBHSA-N flunarizine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(C=1C=CC(F)=CC=1)N1CCN(C\C=C\C=2C=CC=CC=2)CC1 SMANXXCATUTDDT-QPJJXVBHSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000326 flunarizine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960002690 fluphenazine Drugs 0.000 claims description 4
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims description 4
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229950009446 zaldaride Drugs 0.000 claims description 4
- DFOCUWZXJBAUSQ-UHFFFAOYSA-N Berbamine Natural products O1C(C(=CC=2)O)=CC=2CC(C=23)N(C)CCC3=CC(OC)=C(OC)C=2OC(=CC=23)C(OC)=CC=2CCN(C)C3CC2=CC=C1C=C2 DFOCUWZXJBAUSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N Desimpramine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2N(CCCNC)C2=CC=CC=C21 HCYAFALTSJYZDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QZVCTJOXCFMACW-UHFFFAOYSA-N Phenoxybenzamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1CN(CCCl)C(C)COC1=CC=CC=C1 QZVCTJOXCFMACW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N Promazinum Chemical compound C1=CC=C2N(CCCN(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 ZGUGWUXLJSTTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003914 desipramine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003418 phenoxybenzamine Drugs 0.000 claims description 3
- WIKYUJGCLQQFNW-UHFFFAOYSA-N prochlorperazine Chemical compound C1CN(C)CCN1CCCN1C2=CC(Cl)=CC=C2SC2=CC=CC=C21 WIKYUJGCLQQFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003111 prochlorperazine Drugs 0.000 claims description 3
- 229960003598 promazine Drugs 0.000 claims description 3
- PUAVTDKYTXNVBU-OIDHKYIRSA-N LSM-3111 Chemical compound C([C@@H]1N(C)CCC=2C=C(C(OC=3C(OC)=C(OC)C=C4CCN(C)[C@@H](C=34)C3)=CC=21)OC)C(C=C1)=CC=C1OC1=CC3=CC=C1OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 PUAVTDKYTXNVBU-OIDHKYIRSA-N 0.000 claims description 2
- IFFPICMESYHZPQ-UHFFFAOYSA-N Prenylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)CCNC(C)CC1=CC=CC=C1 IFFPICMESYHZPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OMMOSRLIFSCDBL-UHFFFAOYSA-N n-(6-aminohexyl)-5-chloronaphthalene-1-sulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2C(S(=O)(=O)NCCCCCCN)=CC=CC2=C1Cl OMMOSRLIFSCDBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZFIFHAKCBWOSRN-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonamide Chemical class C1=CC=C2C(S(=O)(=O)N)=CC=CC2=C1 ZFIFHAKCBWOSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960001989 prenylamine Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- VASFLQKDXBAWEL-UHFFFAOYSA-N emodin Natural products OC1=C(OC2=C(C=CC(=C2C1=O)O)O)C1=CC=C(C=C1)O VASFLQKDXBAWEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- YDQWDHRMZQUTBA-UHFFFAOYSA-N Aloe emodin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(CO)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O YDQWDHRMZQUTBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- VVEKCQAFOLKNKB-UHFFFAOYSA-N emodine Natural products C1=CC=C2C(=O)C3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O VVEKCQAFOLKNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N N-chlorosuccinimide Chemical compound ClN1C(=O)CCC1=O JRNVZBWKYDBUCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RHMXXJGYXNZAPX-UHFFFAOYSA-N emodin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O RHMXXJGYXNZAPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 206010023841 laryngeal neoplasm Diseases 0.000 description 14
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- VWDXGKUTGQJJHJ-UHFFFAOYSA-N Catenarin Natural products C1=C(O)C=C2C(=O)C3=C(O)C(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O VWDXGKUTGQJJHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000010282 Emodin Substances 0.000 description 10
- RBLJKYCRSCQLRP-UHFFFAOYSA-N Emodin-dianthron Natural products O=C1C2=CC(C)=CC(O)=C2C(=O)C2=C1CC(=O)C=C2O RBLJKYCRSCQLRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YOOXNSPYGCZLAX-UHFFFAOYSA-N Helminthosporin Natural products C1=CC(O)=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O YOOXNSPYGCZLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- NTGIIKCGBNGQAR-UHFFFAOYSA-N Rheoemodin Natural products C1=C(O)C=C2C(=O)C3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O NTGIIKCGBNGQAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N physcion Natural products C1=C(C)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O PKUBGLYEOAJPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 201000004959 laryngeal benign neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 6
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 9,10-anthraquinone Chemical group C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 RZVHIXYEVGDQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016972 AlkB Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108010000049 AlkB Enzymes Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 4
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 4
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000001768 microscale thermophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 4
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- NJMYODHXAKYRHW-BLLMUTORSA-N 2-[4-[(3e)-3-[2-(trifluoromethyl)thioxanthen-9-ylidene]propyl]piperazin-1-yl]ethanol Chemical compound C1CN(CCO)CCN1CC\C=C/1C2=CC(C(F)(F)F)=CC=C2SC2=CC=CC=C2\1 NJMYODHXAKYRHW-BLLMUTORSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102100039084 DNA oxidative demethylase ALKBH2 Human genes 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000959163 Homo sapiens DNA oxidative demethylase ALKBH2 Proteins 0.000 description 3
- 206010023825 Laryngeal cancer Diseases 0.000 description 3
- 235000009411 Rheum rhabarbarum Nutrition 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 3
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 102000046203 human ALKBH3 Human genes 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- ZEWQUBUPAILYHI-UHFFFAOYSA-N trifluoperazine Chemical compound C1CN(C)CCN1CCCN1C2=CC(C(F)(F)F)=CC=C2SC2=CC=CC=C21 ZEWQUBUPAILYHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002324 trifluoperazine Drugs 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVSZOSVPTLSHOV-UHFFFAOYSA-N 7-Chloroemodin Chemical compound ClC1=C(O)C=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O AVSZOSVPTLSHOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- FCDLCPWAQCPTKC-UHFFFAOYSA-N Rhein Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(C(=O)O)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O FCDLCPWAQCPTKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010062129 Tongue neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 2
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007336 electrophilic substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 2
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229960003910 promethazine Drugs 0.000 description 2
- BBNQQADTFFCFGB-UHFFFAOYSA-N purpurin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1 BBNQQADTFFCFGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 201000006134 tongue cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- BHPXQYXFPVEKFE-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2,4,5-trihydroxy-7-methylanthracene-9,10-dione Chemical compound C1=C(O)C(Cl)=C2C(=O)C3=CC(C)=CC(O)=C3C(=O)C2=C1O BHPXQYXFPVEKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPEYGERKUPVVRX-UHFFFAOYSA-N 2-chloronaphthalene-1-sulfonamide Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)N)=C(Cl)C=CC2=C1 KPEYGERKUPVVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710118202 43 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 229940123800 ALKBH3 inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N Alizarin Natural products C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100040436 Alkylated DNA repair protein alkB homolog 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100040429 Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 7, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- DFOCUWZXJBAUSQ-URLMMPGGSA-N Berbamine Chemical compound C([C@@H]1N(C)CCC=2C=C(C(OC=3C(OC)=C(OC)C=C4CCN(C)[C@@H](C=34)CC=3C=C(C(=CC=3)O)O3)=CC=21)OC)C1=CC=C3C=C1 DFOCUWZXJBAUSQ-URLMMPGGSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710102044 Envelope protein F13 homolog Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 241001528249 Frangula alnus Species 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000891521 Homo sapiens Alkylated DNA repair protein alkB homolog 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000891540 Homo sapiens Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 7, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010023856 Laryngeal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 230000006093 RNA methylation Effects 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219043 Rhamnus cathartica Species 0.000 description 1
- 241001149655 Rubia tinctorum Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003646 Spearman's rank correlation coefficient Methods 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000036844 Squamous cell carcinoma of the larynx Diseases 0.000 description 1
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006668 UniProt protein families Human genes 0.000 description 1
- 108020004729 UniProt protein families Proteins 0.000 description 1
- 238000000333 X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012996 alamarblue reagent Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HFVAFDPGUJEFBQ-UHFFFAOYSA-M alizarin red S Chemical compound [Na+].O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C2O HFVAFDPGUJEFBQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005775 apoptotic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- UIEATEWHFDRYRU-UHFFFAOYSA-N bepridil Chemical compound C1CCCN1C(COCC(C)C)CN(C=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 UIEATEWHFDRYRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003665 bepridil Drugs 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000044380 human ALKBH1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026037 malignant tumor of neck Diseases 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- IDEHCMNLNCJQST-UHFFFAOYSA-N n-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)NCCCCCCN)=CC=CC2=C1Cl IDEHCMNLNCJQST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000002705 pancreatic stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000019639 protein methylation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000235 small-angle X-ray scattering Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są białka z grupy ALKBH do zastosowania w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych, przy czym białka z grupy ALKBH są wybrane z grupy składającej się z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO, a wymieniony sposób diagnozowania nowotworów obejmuje równoczesną analizę poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch z wymienionych białek z grupy ALKBH w pobranych od pacjenta próbkach tkanki zdrowej i tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową, przy czym wynik podwyższonego poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej dla przynajmniej dwóch spośród wymienionych białek z grupy ALKBH dla tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową świadczy o występowaniu nowotworu. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie białek z grupy ALKBH do identyfikacji substancji o działaniu przeciwnowotworowym oraz pochodne antrachinonu do zastosowania jako lek i do zastosowania w sposobie leczenia i/lub zapobiegania chorobie nowotworowej.The subject of the application are proteins from the ALKBH group for use in a method of diagnosing cancer diseases, wherein the proteins from the ALKBH group are selected from the group consisting of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO, and the said method of diagnosing cancer includes the simultaneous analysis of the expression level and/or or enzymatic activity of at least two of said ALKBH proteins in samples of healthy tissue and tissue suspected of being cancerous tissue obtained from the patient, wherein the result of an increased level of expression and/or enzymatic activity for at least two of said ALKBH proteins for tissue suspected of being cancerous being cancerous tissue indicates the presence of cancer. The subject of the application is also the use of proteins from the ALKBH group for the identification of substances with anticancer activity and anthraquinone derivatives for use as a medicine and for use in the treatment and/or prevention of cancer.
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Dziedzina technikiTechnical field
Przedmiotem wynalazku są białka z grupy ALKBH do zastosowania w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro. Opisane jest również wykorzystanie białek z grupy ALKBH do identyfikacji substancji o działaniu przeciwnowotworowym. Przedmiotem wynalazku są również pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi choroby nowotworowej, wybranej z nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego.The invention relates to proteins of the ALKBH group for use in an in vitro method of diagnosing neoplastic diseases. The use of proteins from the ALKBH group for the identification of substances with anticancer activity is also described. The invention also relates to anthraquinone derivatives for use in the treatment or prevention of a neoplastic disease selected from neoplasia of the nasopharynx and / or gastrointestinal components.
Stan technikiState of the art
Pomimo zaawansowanych metod diagnostycznych oraz coraz nowocześniejszych sposobów leczenia, nowotwory są z roku na rok większym zagrożeniem i jedną z głównych przyczyn śmiertelności u ludzi.Despite advanced diagnostic methods and more and more modern methods of treatment, cancer is a greater threat every year and one of the main causes of mortality in humans.
W stanie techniki znane są naturalne źródła antrachinonów. Pochodne antrachinonów występują w wielu roślinach, jak na przykład w:Natural sources of anthraquinones are known in the art. Anthraquinone derivatives are found in many plants, such as in:
- Rabarbarze (Rheum rabarbarum), zawierającym reinę, emodynę oraz aloe-emodynę;- Rhubarb (Rheum rhubarbum), containing rhein, emodine and aloe-emodine;
- Kruszynie pospolitej (Frangula alnus), zawierającej emodynę;- Common buckthorn (Frangula alnus), containing emodine;
- Marzanie barwierskiej (Rubia tinctorum), zawierającej purpurynę oraz alizarynę.- Marzanie barwierska (Rubia tinctorum), containing purpurin and alizarin.
Związki te są dobrze znane ze swych właściwości oczyszczających, jednak ich medyczne zastosowania są o wiele szersze. Przykładem mogą być obiecujące aktywności cytotoksyczne i przeciwnowotworowe.These compounds are well known for their cleansing properties, but their medical uses are much wider. An example is the promising cytotoxic and anti-tumor activities.
Oddziaływanie naturalnych pochodnych antrachinonów z rodziną ALKBH jest wciąż niedostatecznie poznane. Rzadkie doniesienia dotyczą głównie białka FTO.The interaction of natural anthraquinone derivatives with the ALKBH family is still insufficiently understood. Rare reports mainly concern the FTO protein.
Rabarbar jest jednym z najstarszych leków medycyny Chińskiej, który po raz pierwszy został wymieniony w „Classic of The Materia Medica”(1). Rabarbar jest źródłem dużej ilości związków chemicznych. Najbardziej aktywnymi cząsteczkami są między innymi pochodne antrachinonu, takie jak emodyna (1,3,8-trihydroksy-6-metylo-antrachinon znana również jako 1,3,8-trihydroksy-6-metyloantraceno-9,10-dion), aloe-emodyna (1,8-dihydroksy-3-hydroksylometyloantrachinon), reina (1,8-dihydroksy-3-karboksyantrachinon) (2). Związki te mają wpływ na tkanki z nowotworem.Rhubarb is one of the oldest drugs in Chinese medicine and was first mentioned in the "Classic of The Materia Medica" (1). Rhubarb is a source of many chemicals. The most active molecules are, among others, anthraquinone derivatives such as emodine (1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone also known as 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dione), aloe- emodine (1,8-dihydroxy-3-hydroxylmethylanthraquinone), rhein (1,8-dihydroxy-3-carboxyanthraquinone) (2). These compounds affect tumor tissues.
Badania farmakologiczne wskazują, że emodyna ma właściwości antybakteryjne (3), przeciwzapalne (4), immunosupresyjne (5) oraz przeciwnowotworowe (6). Emodyna wykazuje cytotoksyczny efekt wobec: ludzkiego nowotworu języka, linii komórkowej SCC-4 (7), linii komórkowej SMMC-7721 (8), ludzkiego kostnomięsaka (9), nowotworu płuc (10), nowotworu szyi (11), raka gruczołowego płuc (6), raka kosmówki i jajników (12) oraz nowotworu trzustki (13). Aloe-emodyna hamuje wzrost linii komórek nowotworowych (14), a także indukuje śmierć linii H460 poprzez ścieżkę apoptozy wywołaną kaspazą-3 (15). Aloe-emodyna działa cytotoksycznie na komórki ludzkiego raka piersi (16), raka przełyku (17), linię komórkową Huh-7 (18), komórki czerniaka (19). Reina z kolei inhibuje wzrost nowotworu wątroby szczura (20), dodatkowo wpływa również przeciwnowotworowo i przeciw-metastatycznie na komórki ludzkiego raka języka. Inhibuje także ekspresję genów metaloproteinaz z matriks mitochondrialnej (21). Reina wykazuje cytotoksyczną aktywność wobec ludzkiego glejaka (linia komórkowa U870) (22), trzustkowych komórek gwiaździstych (LTC-14), ludzkich komórek gruczolakoraka przewodowego trzustki (PANC-1), ludzkich komórek raka jelita grubego (SW480 i SW620) (23) czy też komórek raka wątrobowokomórkowego Hep-G2 (24).Pharmacological studies show that emodine has antibacterial (3), anti-inflammatory (4), immunosuppressive (5) and anti-cancer properties (6). Emodin has a cytotoxic effect against: human tongue cancer, SCC-4 cell line (7), SMMC-7721 cell line (8), human osteosarcoma (9), lung cancer (10), neck cancer (11), lung adenocarcinoma ( 6), chorionic and ovarian cancer (12) and pancreatic cancer (13). Aloe-emodin inhibits the growth of cancer cell lines (14) and also induces the death of the H460 lineage via the caspase-3-induced apoptosis pathway (15). Aloe-emodin is cytotoxic to human breast cancer cells (16), esophageal cancer (17), Huh-7 cell line (18), melanoma cells (19). Reina, in turn, inhibits the growth of rat liver tumors (20), and additionally, it also has anti-tumor and anti-metastatic effects on human tongue cancer cells. It also inhibits the expression of metalloproteinase genes from the mitochondrial matrix (21). Reina exhibits cytotoxic activity against human glioma (cell line U870) (22), pancreatic stellate cells (LTC-14), human pancreatic ductal adenocarcinoma cells (PANC-1), human colon cancer cells (SW480 and SW620) (23) and also of Hep-G2 hepatocellular carcinoma cells (24).
W roku 2012 grupa Chena pokazała pierwszy małocząsteczkowy inhibitor FTO (ALKBH9), naturalnie występującą reinę. Reina jest kompetytywnym inhibitorem FTO, który wypełnia miejsce aktywne tego białka (25). Ostatnie badania pokazały, że reina inhibuje również AlkB, ALKBH2 i ALKBH3 (26). Dodatkowo wiąże się ona do innych miejsc w centrum katalitycznym AlkB niż w FTO. Struktura krystalograficzna FTO z reiną pokazała że na interakcję pomiędzy tymi dwoma cząsteczkami największy wpływ ma oddziaływanie pomiędzy grupą karboksylową ligandu oraz resztami argininy w miejscu aktywnym białka. Struktura krystalograficzna dowiodła także, że obecność grup kwasowych jest kluczowa dla inhibicji.In 2012, the Chen group unveiled the first small molecule FTO inhibitor (ALKBH9), a naturally occurring rhein. Reina is a competitive FTO inhibitor that fills the active site of this protein (25). Recent studies have shown that rhein also inhibits AlkB, ALKBH2, and ALKBH3 (26). Additionally, it binds to other sites in the AlkB catalytic center than in the FTO. The crystallographic structure of the FTO with reina showed that the interaction between these two molecules was most influenced by the interaction between the carboxyl group of the ligand and arginine residues in the active site of the protein. The crystallographic structure also proved that the presence of acid groups is crucial for inhibition.
Ludzkie homologi AlkBHuman homologues of AlkB
Rodzina białek ALKBH to 9 homologów bakteryjnej dioksygenazy AlkB (27) odpowiedzialnych za usuwanie lub wprowadzanie grup metylowych. Specyficzność substratowa tej rodziny jest szeroka; obejmuje zarówno DNA, RNA jak i białka. Zaburzenia w ekspresji białek ALKBH prowadzą do szereguThe ALKBH protein family consists of 9 homologs of the bacterial AlkB dioxygenase (27) responsible for the removal or introduction of methyl groups. The substrate specificity of this family is broad; it includes both DNA, RNA and proteins. Disturbances in the expression of ALKBH proteins lead to a series
PL 235 564 B1 chorób jak chociażby bezpłodność, ograniczenie wzrostu i inne; co zostało dokładnie opisane w pracy Ouglanda i współpracowników w 2016 roku (28).Diseases such as, for example, infertility, growth restriction and others; which was precisely described in the work of Ougland and colleagues in 2016 (28).
Rola ALKBH w nowotworzeniuThe role of ALKBH in neoplasm
Regulacja rodziny białek ALKBH w nowotworach została wykazana przez kilka niezależnych grup badawczych. Badania przeprowadzone przez grupę Wu i wsp. wykazały, że zmniejszona ekspresja ALKBH2 w nowotworach, rośnie w odpowiedzi na chemioterapię, a więc jego pozytywna regulacja skutkuje wzrostem oporności na chemioterapię (29). Z kolei wyciszanie ekspresji ALKBH2 w nowotworze pęcherza moczowego skutkowało ograniczeniem jego wzrostu (30), a wyciszenie genu tego białka w komórkach glejaka uczulało komórki na MMS (31). Co więcej, nadekspresja ALKBH3 obserwowana była w nowotworach mózgu, płuc oraz układu moczowo płciowego (32) (33) (34) (35). W badaniach Shimady i wsp. wyciszenie genu Alkbh8 u myszy skutkowało inhibicją wzrostu nowotworu pęcherza moczowego (36). Z kolei ilość białka FTO (ALKBH9) była statystycznie wyższa w nowotworze piersi niż w komórkach zdrowych (37). Inna grupa badawcza wykazała potencjalną ścieżkę metaboliczną, dzięki której nadekspresja białka FTO w linii komórkowej nowotworu piersi pozytywnie wpływa na jego przeżywalność w warunkach braku glutaminy (38).Regulation of the ALKBH family of proteins in tumors has been demonstrated by several independent research groups. Studies by Wu et al. Have shown that decreased expression of ALKBH2 in tumors increases in response to chemotherapy, and therefore its positive regulation results in an increase in resistance to chemotherapy (29). On the other hand, silencing the expression of ALKBH2 in bladder cancer resulted in limiting its growth (30), and silencing the gene of this protein in glioblastoma cells sensitized the cells to MMS (31). Moreover, overexpression of ALKBH3 was observed in tumors of the brain, lungs and genitourinary system (32) (33) (34) (35). In a study by Shimada et al., Silencing the Alkbh8 gene in mice resulted in the inhibition of bladder tumor growth (36). In turn, the amount of FTO protein (ALKBH9) was statistically higher in breast cancer than in healthy cells (37). Another research group showed a potential metabolic pathway, thanks to which the overexpression of the FTO protein in the breast cancer cell line positively influences its survival in the absence of glutamine (38).
Ze stanu techniki znane były więc korelacje zmian poziomu pojedynczych przedstawicieli grupy białek ALKBH z niektórymi nowotworami. Nie opisano jednak możliwości szerokiego wykorzystania całej grupy tych białek do celów diagnostycznych oraz w celu opracowania nowych związków o działaniu przeciwnowotworowym.Therefore, the prior art has been known to correlate changes in the level of individual members of the ALKBH protein group with some neoplasms. However, the possibility of a wide use of the whole group of these proteins for diagnostic purposes and for the development of new compounds with anti-cancer activity has not been described.
Istota wynalazkuThe essence of the invention
Twórcy niniejszego wynalazku, nieoczekiwanie stwierdzili, że możliwe jest wykorzystanie w celach diagnostyki i leczenia nowotworów nosogardła, nowotworów elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu, równoczesnego podwyższonego poziomu białek z rodziny ALKBH w tych nowotworach (w szczególności podwyższonego poziomu ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO). Twórcy opracowali nowe pochodne antrachinonu będące nowymi inhibitorami białek z rodziny ALKBH wpływające na ich aktywność enzymatyczną oraz na ogólną przeżywalność komórek nowotworowych oraz przedstawili sposób syntezy nowych pochodnych antrachinonu.The present inventors have unexpectedly found that it is possible to use for the diagnosis and treatment of neoplasms of the nasopharynx, neoplasms of the digestive system components, in particular cancers of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, large intestine, rectum, anus, simultaneously increased levels of proteins from ALKBH family in these tumors (in particular, elevated levels of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO). The inventors have developed new anthraquinone derivatives which are new inhibitors of the ALKBH family proteins influencing their enzymatic activity and overall survival of cancer cells, and presented the method of synthesizing new anthraquinone derivatives.
Niniejszy wynalazek oparty jest więc na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że występowanie nowotworu, w szczególności nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu, powiązane jest ze zmianami ekspresji i/lub zmianami aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch z wymienionych białek z grupy ALKBH (białka FTO oraz co najmniej jednego z białek wybranego z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5). Twórcy opracowali więc sposób umożliwiający wykorzystywanie zmian ekspresji i/lub aktywności tych białek do diagnostyki i śledzenia zmian w nowotworze.The present invention is therefore based on the unexpected finding that the occurrence of a tumor, in particular a tumor of the nasopharynx and / or gastrointestinal components, in particular cancers of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, colon, rectum, anus, is associated with changes in expression and / or changes in the enzymatic activity of at least two of the said ALKBH proteins (FTO proteins and at least one of the proteins selected from ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5). Therefore, the inventors developed a method that makes it possible to use changes in the expression and / or activity of these proteins for the diagnosis and tracking of changes in the tumor.
Twórcy zaproponowali również wykorzystywanie takich zmian w poziomie i/lub aktywności tych białek do analizy wpływu potencjalnych substancji o działaniu przeciwnowotworowym.The inventors also proposed to use such changes in the level and / or activity of these proteins to analyze the effects of potential anticancer substances.
Przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro, przy czym białka z grupy ALKBH są wybrane z grupy składającej się z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO, a wymieniony sposób diagnozowania nowotworów obejmuje równoczesną analizę poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej białka FTO oraz co najmniej jednego z białek wybranego z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 w pobranych od pacjenta próbkach tkanki zdrowej i tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową, przy czym chorobą nowotworową jest nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego, przy czym wynik podwyższonego poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej dla białka FTO oraz co najmniej jednego z białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 dla tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową w porównaniu do tkanki zdrowej świadczy o występowaniu nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego. W korzystnym zastosowaniu białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro, analizowany jest poziom ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej co najmniej ALKBH1 i FTO.The subject of the invention is therefore the use of proteins from the ALKBH group in a method of diagnosing neoplastic diseases in vitro, the proteins of the ALKBH group being selected from the group consisting of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO, and said method of diagnosing tumors comprises a simultaneous analysis of the expression level and / or the enzymatic activity of the FTO protein and at least one of the proteins selected from ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 in healthy tissue samples taken from a patient and a tissue suspected of being neoplastic, where the neoplastic disease is a neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components , wherein the result of the increased level of expression and / or enzymatic activity for the FTO protein and at least one of the ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 proteins for the tissue suspected to be neoplastic tissue compared to healthy tissue indicates the presence of a nasopharyngeal tumor and / or system components alimentary. In a preferred use of the ALKBH group proteins in the in vitro method of diagnosing neoplastic diseases, the expression level and / or enzymatic activity of at least ALKBH1 and FTO is analyzed.
W korzystnym zastosowaniu białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro, nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego jest nowotworem jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu.In a preferred use of the ALKBH group proteins in the in vitro method of diagnosing neoplastic diseases, the neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components is cancer of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, colon, rectum, anus.
PL 235 564 B1PL 235 564 B1
W korzystnym zastosowaniu białek z grupy ALKBH w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych in vitro, poziom ekspresji wymienionych białek z grupy ALKBH mierzony jest metodą Western blot.In a preferred use of the ALKBH group proteins in the in vitro method of diagnosing neoplastic diseases, the expression level of said ALKBH group proteins is measured by Western blotting.
Wynalazek dotyczy również pochodnych antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego charakteryzującego się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej białka ALKBH3, FTO, korzystnie ponadto charakteryzującego się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej co najmniej jednego białka wybranego z ALKBH1, ALKBH4, ALKBH5, przy czym pochodne antrachinonu są wybrane z 2,4-dichloroemodyny, 2-chloroemodyny, 4-chloroemodyny lub ich mieszanin.The invention also relates to anthraquinone derivatives for use in treating or preventing the development of a neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components characterized by an increased level of expression and / or enzymatic activity of the ALKBH3 protein, FTO, preferably further characterized by an increased level of expression and / or enzymatic activity of at least one a protein selected from ALKBH1, ALKBH4, ALKBH5, wherein the anthraquinone derivatives are selected from 2,4-dichloroemodine, 2-chloroemodine, 4-chloroemodine or mixtures thereof.
Korzystnie pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego są stosowane w chorobie nowotworowej charakteryzującej się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej ALKBH1, ALKBH3 oraz FTO.Preferably, the anthraquinone derivatives for use in treating or preventing the development of neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components are used in a neoplastic disease characterized by elevated levels of expression and / or enzymatic activity of ALKBH1, ALKBH3 and FTO.
Korzystnie pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego są stosowane gdy nowotworem nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego jest nowotwór jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu.Preferably, the anthraquinone derivatives for use in treating or preventing the development of a tumor of the nasopharynx and / or gastrointestinal components are used when the tumor of the nasopharynx and / or gastrointestinal components is cancer of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, colon, rectum, anus.
Korzystnie pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego są stosowane do leczenia choroby nowotworowej u osobnika, który dodatkowo obejmuje podawanie osobnikowi związków hamujących wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny, w szczególności antagonistów kalmoduliny.Preferably, the anthraquinone derivatives for use in treating or preventing the development of a neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components are used to treat a neoplastic disease in a subject which further comprises administering to the subject compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade, in particular calmodulin antagonists.
Korzystnie pochodne antrachinonu do zastosowania do leczenia lub zapobiegania rozwojowi nowotworu nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego są stosowane gdy związki hamujące wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny wybrane są z grupy: bepridyl, cetiedyl, chlorek kalmidazolium, chlorowodorek terodyliny, chlorowodorek N-(6-aminoheksylo)-5-chloro-1-naftalenosulfonamidu, chlorpromazyna, cyklosporyna A, cynaryzyna, deltametryna, dezypramina, E6 berbamina, fendylina, fenoksybenzamina, flufenazyna, flunaryzyna, jabłczan zaldarydu określany też jako CGS 9343B, naftaleno-sulfonamidy, ofibolina A, prenylamina, prochlorperazyna, promazyna, prometazyna, trans-flupentyksol, trifluoroperazyna, W5, W7, W13, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i estry.Preferably the anthraquinone derivatives for use in treating or preventing the development of neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components are used when the compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade are selected from the group: bepridil, cetieidyl, calmidazolium chloride, theodiline hydrochloride, N- (6- aminohexyl) -5-chloro-1-naphthalenesulfonamide, chlorpromazine, cyclosporin A, cinnarizine, deltamethrin, desipramine, E6 berbamine, fendyline, phenoxybenzamine, fluphenazine, flunarizine, zaldaride malate also known as CGS 9343B, naphthalenesulfinB prochlorperazine, promazine, promethazine, trans-flupentixol, trifluoroperazine, W5, W7, W13, and pharmaceutically acceptable salts and esters thereof.
Opisane zostały również białka z grupy ALKBH do zastosowania w sposobie diagnozowania chorób nowotworowych, przy czym białka z grupy ALKBH są wybrane z grupy składającej się z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO, a wymieniony sposób diagnozowania nowotworów obejmuje równoczesną analizę poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch z wymienionych białek z grupy ALKBH w pobranych od pacjenta próbkach tkanki zdrowej i tkanki podejrzewanej o zmiany nowotworowe, przy czym wynik podwyższonego poziomu ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej dla przynajmniej dwóch spośród wymienionych białek z grupy ALKBH dla tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową świadczy o wystąpieniu nowotworu.Also described are proteins of the ALKBH group for use in a method of diagnosis of neoplastic diseases, wherein the proteins of the ALKBH group are selected from the group consisting of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO, and said method of diagnosing tumors includes a simultaneous analysis of the expression level and / or the enzymatic activity of at least two of the listed ALKBH proteins in healthy tissue samples collected from the patient and of the tissue suspected of being neoplastic, where an elevated level of expression and / or enzymatic activity for at least two of the said ALKBH proteins for the tissue suspected to be neoplastic tissue indicates the occurrence of neoplasm.
Sekwencje aminokwasowe ludzkich białek z grupy ALKBH są znane i dostępne w bazie sekwencji białkowych UniProt pod adresem strony www.uniprot.org, i tak odpowiednio pod przypisanymi im numerami dla ALKBH1 jako Q13686, ALKBH3 jako Q96Q83, ALKBH4 jako Q9NXW9, ALKBH5 jako Q6P6C2 oraz FTO (ALKBH9) jako Q9C0B1.The amino acid sequences of human ALKBH proteins are known and available in the UniProt protein sequence database at www.uniprot.org, and so respectively under the assigned numbers for ALKBH1 as Q13686, ALKBH3 as Q96Q83, ALKBH4 as Q9NXW9, ALKBH5 as Q6P6C2 and FTO (ALKBH9) as Q9C0B1.
W korzystnym przykładzie wykonania opisanego zastosowania, białka z grupy ALKBH, dla których analizowany jest poziom ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej obejmują co najmniej ALKBH1 i FTO (ALKBH9).In a preferred embodiment of the described use, the ALKBH group proteins for which the expression level and / or enzymatic activity are analyzed include at least ALKBH1 and FTO (ALKBH9).
W korzystnym przykładzie wykonania opisanego zastosowania chorobą nowotworową jest nowotwór wybrany z grupy o składzie nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu.In a preferred embodiment of the described application, the neoplastic disease is a neoplasm selected from the group consisting of neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components, in particular neoplasms of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, large intestine, rectum, anus.
W korzystnym przykładzie wykonania opisanego zastosowania, poziom ekspresji wymienionych białek z grupy ALKBH mierzony jest metodą Western blot.In a preferred embodiment of the described application, the expression level of said ALKBH proteins is measured by Western blot.
Ujawnione zostało również zastosowanie białek z grupy ALKBH do identyfikacji substancji o działaniu przeciwnowotworowym, przy czym białka z grupy ALKBH są wybrane z grupy składającej się z ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO (ALKBH9), przy czym wpływ identyfikowanej substancji hamujący ekspresję i/lub aktywność enzymatyczną przynajmniej dwóch spośród wymienionych białek z grupy ALKBH wskazuje na potencjalne działanie przeciwnowotworowe identyfikowanej substancji.The use of proteins from the ALKBH group for the identification of substances with antitumor activity was also disclosed, with the proteins from the ALKBH group being selected from the group consisting of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO (ALKBH9), with the effect of the identified substance inhibiting the expression and / or the enzymatic activity of at least two of the said ALKBH proteins indicates a potential antitumor activity of the substance being identified.
PL 235 564 Β1PL 235 564 Β1
W korzystnym opisanym przykładzie wykonania zastosowania, białka z grupy ALKBH, dla których analizowany jest wpływ identyfikowanej substancji na ekspresję i/lub aktywność enzymatyczną obejmują co najmniej ALKBH1 i FTO.In a preferred embodiment of the use described, the ALKBH group proteins for which the effect of the identified substance on expression and / or enzymatic activity is analyzed include at least ALKBH1 and FTO.
Okazało się bowiem, że największą różnicą pomiędzy tkankami zdrowymi i nowotworowymi to zwiększony poziom zarówno ALKBH1 jak i FTO (co w badaniach wystąpiło u 80% przebadanych pacjentów).It turned out that the greatest difference between healthy and neoplastic tissues is the increased level of both ALKBH1 and FTO (which occurred in 80% of the examined patients in the studies).
W korzystnym opisanym przykładzie wykonania zastosowania, chorobą nowotworową jest nowotwór wybrany z grupy o składzie nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotwór jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu.In a preferred embodiment of the use described, the neoplastic disease is a neoplasm selected from the group consisting of neoplasm of the nasopharynx and / or of the digestive system components, in particular neoplasm of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, colon, rectum, anus.
Twórcy wynalazku wykazali, że dwa do pięciu białek z rodziny ALKBH jest nadeksprymowanych w tkankach nowotworowych. W związku z tym małocząsteczkowe ligandy, które oddziałują z homologami AlkB będą wykazywać aktywność przeciwnowotworową lub przeciwdziałać wzrostowi nowotworu. Do takich związków należą związki z grupy antrachinonów, ponieważ Twórcy wykazali, że na białka z rodziny ALKBH wpływają zarówno naturalne antrachinony (reina, emodyna i aloe-emodyna) ale również ulepszone ich nowosyntetyzowane pochodne stworzone za pomocą reakcji substytucji elektrofilowej emodyny - halogenowania (np. szczególnie korzystnie 2-chloroemodyna (czyli 2-chloro-1,3,8-trihydroksy-6-metylo-antrachinon), 4-chloroemodyna (czyli 4-chloro-1,3,8-trihydroksy-6-metylo-antrachinon), oraz 2,4-dichloroemodyna (czyli 2,4-chloro-1,3,8-trihydroksy-6-metylo-antrachinon), nitrowania lub sulfonowania.The inventors have shown that two to five proteins of the ALKBH family are overexpressed in tumor tissues. Accordingly, small molecule ligands that interact with AlkB homologues will exhibit anti-tumor activity or counteract tumor growth. Such compounds include compounds from the anthraquinone group, because the inventors have shown that the proteins from the ALKBH family are influenced by both natural anthraquinones (rhein, emodin and aloe-emodin) but also their improved newly synthesized derivatives created by electrophilic substitution of emodin - halogenation (e.g. particularly preferably 2-chloroemodine (i.e. 2-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone), 4-chloroemodine (i.e. 4-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone), and 2,4-dichloroemodine (i.e., 2,4-chloro-1,3,8-trihydroxy-6-methyl anthraquinone), nitration or sulfonation.
Twórcy opracowując rozwiązanie wykorzystali fakt, że wszystkie białka z rodziny ALKBH mają podobne centrum aktywne (39) (40).When developing the solution, the authors used the fact that all proteins from the ALKBH family have a similar active site (39) (40).
Chorobą nowotworową w rozumieniu niniejszego wynalazku jest nieprawidłowo rozrastająca się tkanka, w szczególności z okolic nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu. Rozwiązanie może mieć zastosowanie również do innych typów nowotworów, w których dochodzi do równoczesnej nadekspresji i/lub zwiększania aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch białek z rodziny ALKBH.A neoplastic disease within the meaning of the present invention is abnormally growing tissue, in particular from the area of the nasopharynx and / or elements of the digestive system, in particular cancers of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, colon, rectum, anus. The solution may also apply to other types of cancer in which there is a simultaneous overexpression and / or increase of the enzymatic activity of at least two proteins from the ALKBH family.
Opisane zostały również pochodne antrachinonu zawierające grupę dołączoną poprzez reakcję substytucji elektrofilowej korzystnie poprzez halogenowanie i/lub nitrowanie i/lub sulfonowanie, przy czym pochodne antrachinonu określone są wzorem ogólnym IAnthraquinone derivatives having a group linked by electrophilic substitution, preferably by halogenation and / or nitration and / or sulfonation, have also been described, the anthraquinone derivatives having the general formula I
OH O OHOH O OH
Wzór I w którym,Formula I in which,
Ri i R2 oznaczają, niezależnie od siebie, wodór, chlor, brom, jod, fluor, grupę SO2OH lub grupę NO2; przy czym R1 i R2 nie są jednocześnie wodorem;Ri and R2 are, independently of each other, hydrogen, chlorine, bromine, iodine, fluoro, SO2OH or NO2; with the proviso that R1 and R2 are not both hydrogen;
R3 oznacza, niezależnie od siebie wodór, grupę hydroksylową, metylową, grupę -COOH lub -CH2OH;R3 is, independently of each other, hydrogen, hydroxyl, methyl, -COOH or -CH2OH;
i/lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole lub estry do zastosowania jako lek.and / or a pharmaceutically acceptable salt or ester thereof for use as a medicament.
Korzystnie, w pochodnych antrachinonu przynajmniej jedno spośród R1 i R2 to chlor, brom lub fluor.Preferably, in the anthraquinone derivatives, at least one of R1 and R2 is chlorine, bromine or fluoro.
PL 235 564 B1PL 235 564 B1
Korzystnie, pochodna antrachinonu wybrana jest z grupy o składzie monochloroemodyna (2-chloroemodyna oraz 4-chloroemodyna), w której jedno spośród Ri i R2 to chlor, a drugie to wodór, a R3 to grupa metylowa oraz 2,4-dichloroemodyna, w której zarówno Ri jak i R2 to chlor, a R3 to grupa metylowa.Preferably, the anthraquinone derivative is selected from the group consisting of monochloroemodine (2-chloroemodine and 4-chloroemodine) where one of Ri and R2 is chlorine and the other is hydrogen and R3 is a methyl group and 2,4-dichloroemodine in which Ri and R2 are both chlorine and R3 is a methyl group.
Korzystnie pochodne antrachinonu są przeznaczone do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej.Preferably, the anthraquinone derivatives are intended for use as a medicament in a method of treating cancer.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, choroba nowotworowa charakteryzuje się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch spośród białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 i/lub FTO.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating neoplastic disease, the neoplastic disease is characterized by an elevated level of expression and / or enzymatic activity of at least two of the proteins ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and / or FTO.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, choroba nowotworowa charakteryzuje się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej białek ALKBH1 i FTO.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating a neoplastic disease, the neoplastic disease is characterized by an increased level of expression and / or enzymatic activity of the ALKBH1 and FTO proteins.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, choroba nowotworowa charakteryzuje się podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej białka ALKBH3.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating neoplastic disease, the neoplastic disease is characterized by an increased level of expression and / or enzymatic activity of the ALKBH3 protein.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, choroba nowotworowa wybrana jest z grupy o składzie: nowotwór nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating a neoplastic disease, the neoplastic disease is selected from the group consisting of: neoplasm of the nasopharynx and / or gastrointestinal components, in particular cancers of the oral cavity, larynx, liver, stomach, small intestine, large intestine , rectum, anus.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, sposób leczenia choroby nowotworowej u osobnika dodatkowo obejmuje podawanie osobnikowi związków hamujących wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny, w szczególności antagonistów kalmoduliny.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating cancer, the method of treating cancer in a subject further comprises administering to the subject compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade, in particular calmodulin antagonists.
W korzystnym przykładzie wykonania pochodnych antrachinonu do zastosowania jako lek w sposobie leczenia choroby nowotworowej, związki hamujące wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny wybrane są z grupy: bepridyl, cetiedyl, chlorek kalmidazolium, chlorowodorek terodyliny, chlorowodorek N-(6-aminoheksylo)-5-chloro-1-naftalenosulfonamidu, chlorpromazyna, cyklosporyna A, cynaryzyna, deltametryna, dezypramina, E6 berbamina, fendylina, fenoksybenzamina, flufenazyna, flunaryzyna, jabłczan zaldarydu określany też jako CGS 9343B, naftaleno-sulfonamidy, ofibolina A, prenylamina, prochlorperazyna, promazyna, prometazyna, trans-flupentyksol, trifluoroperazyna, W5, W7, W13, i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i estry.In a preferred embodiment of anthraquinone derivatives for use as a medicament in a method of treating cancer, the compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade are selected from the group: bepridyl, cetiedyl, calmidazolium chloride, theodiline hydrochloride, N- (6-aminohexyl) -5- hydrochloride. chloro-1-naphthalenesulfonamide, chlorpromazine, cyclosporin A, cinnarizine, deltamethrin, desipramine, E6, berbamine, fendyline, phenoxybenzamine, fluphenazine, flunarizine, zaldaride malate also known as CGS 9343B, naphthalenesulfinase, Aprochlorazin of the sulfonamides , trans-flupenthixol, trifluoroperazine, W5, W7, W13, and pharmaceutically acceptable salts and esters thereof.
Twórcy wynalazku wykazali, że poziom ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej dwóch spośród białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz ALKBH9 (FTO) rośnie w nowotworach, w szczególności nosogardła i/lub elementów układu pokarmowego w szczególności nowotworów jamy ustnej, krtani, wątroby, żołądka, jelita cienkiego, jelita grubego, odbytnicy, odbytu. Dalsze analizy wykazały ogólny wzrost białek ALKBH, który stanowi środek umożliwiający rozróżnienie tkanki zdrowej od nowotworowej.The inventors have shown that the level of expression and / or enzymatic activity of at least two of the proteins ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and ALKBH9 (FTO) increases in neoplasms, in particular of the nasopharynx and / or elements of the digestive system, in particular cancers of the oral cavity, larynx, liver , stomach, small intestine, large intestine, rectum, anus. Further analyzes showed an overall increase in ALKBH proteins, which is a means of distinguishing between healthy and neoplastic tissue.
Twórcy przeprowadzili również analizę możliwych wielkocząsteczkowych (np. białek) interaktorów białek grupy ALKBH, mając na uwadze fakt, iż działający inhibitor musi oddziaływać z dostępną dla niego powierzchnią w białku. Wprowadzenie kolejnej cząsteczki w takim miejscu może być powodem powstawania zawady sterycznej i zaburzeniem funkcji tego białka. Takie powierzchnie też stanowią cel dla syntezy kolejnych leków.The inventors also performed an analysis of possible macromolecular (e.g. proteins) protein interactions of the ALKBH group, bearing in mind that the active inhibitor must interact with its accessible surface in the protein. Introducing another molecule in such a place may cause steric hindrance and disrupt the function of this protein. Such surfaces are also targets for the synthesis of other drugs.
Twórcy wykorzystali fakt, że antrachinony oddziałują z centrum aktywnym białek grupy ALKBH. Ponieważ centrum aktywne jest podobne we wszystkich białkach tej rodziny (39) (40), możliwe okazuje się inhibowanie całej grupy białek ALKBH za pomocą jednego związku, co jest korzystne dla terapii przeciwnowotworowej, jako że, jak wykazano, wiele chorób nowotworowych charakteryzuje się podniesionym poziomem więcej niż jednego białka z grupy ALKBH.The inventors took advantage of the fact that anthraquinones interact with the active center of the ALKBH group proteins. Since the active site is similar in all proteins of this family (39) (40), it is possible to inhibit the entire group of ALKBH proteins with one compound, which is beneficial for anti-cancer therapy as many cancers have been shown to be characterized by elevated levels of more than one protein of the ALKBH group.
Na podstawie sączenia molekularnego Twórcy wykazali, iż ALKBH3 występuje w tkankach nowotworów nosogardła i/lub krtani w formie monomeru, dzięki czemu cała jego powierzchnia jest dostępna dla cząsteczek o charakterze leku. Białka ALKBH1 i ALKBH5 formują wielkocząsteczkowe kompleksy. Z kolei FTO występuje in vivo oraz in vitro w formie dimeru, a jego C-domena tworzy kompleks z białkiem kalmoduliną (CaM).On the basis of molecular filtration, the inventors have shown that ALKBH3 is present in the tissues of nasopharyngeal and / or laryngeal neoplasms in the form of a monomer, thanks to which its entire surface is available for drug-like molecules. The ALKBH1 and ALKBH5 proteins form macromolecular complexes. In turn, FTO occurs in vivo and in vitro in the form of a dimer, and its C-domain forms a complex with the protein calmodulin (CaM).
Twórcy wynalazku badali wpływ naturalnych (reiny, emodyny i aloe-emodyny) antrachinonów na wiązanie homologów AlkB nadeksprymowanych w komórkach nowotworowych oraz ich cytotoksyczny efekt na trzy linie komórkowe. Twórcy stwierdzili, że emodyna i aloe-emodyna nie wykazują wyraźnegoThe inventors investigated the effect of natural (rhein, emodin and aloe-emodin) anthraquinones on the binding of AlkB homologs overexpressed in cancer cells and their cytotoxic effect on three cell lines. The inventors found that emodin and aloe-emodin show no pronounced
PL 235 564 B1 wpływu hamującego aktywność enzymatyczną białek z grupy ALKBH. Poszukiwali więc związków, które mogłyby silniej oddziaływać z centrum aktywnym białek z grupy ALKBH.The effect of inhibiting the enzymatic activity of proteins from the ALKBH group. So they searched for compounds that could interact more strongly with the active center of ALKBH group proteins.
Twórcy wynalazku zmodyfikowali emodynę poprzez chlorowanie z wykorzystaniem N-chlorosukcynimidu (ang. N-chlorosuccimide (NCS)), co doprowadziło do powstania trzech produktów - dwóch monochloroemodyn oraz jednej dichloroemodyny.The inventors modified emodin by chlorination with N-chlorosuccinimide (NCS), which led to the formation of three products - two monochloroemodines and one dichloroemodine.
Otrzymane monochloroemodyny (2-chloroemodyna oraz 4-chloroemodyna) zostały rozdzielone jako mieszanina od 2,4-dichloroemodyny z użyciem chromatografii cieczowej. Zaobserwowano, że wprowadzenie atomu fluorowca, ściągającego elektrony do struktury antrachinonu znacząco podniosło kwasowość grup fenolowych. 2-chloroemodyna oraz 4-chloroemodyna były bardziej polarne od emodyny, wykazywały także lepszą rozpuszczalność w wodzie niż w DMSO, a co za tym idzie lepszą biodostępność. 2,4-dichloroemodyna wykazywała bardziej kwasowe właściwości niż emodyna i monochloroemodyny. Efekt ten miał przełożenie na właściwości biologiczne. Mieszanina monochloroemodyn oraz 2,4-dichloroemodyna inhibowały reakcję enzymatyczną bakteryjnego białka AlkB oraz ludzkiego ALKBH3 w sposób podobny do reiny. Ta obserwacja wykazała więc, że obecność elektrofilowej grupy w pochodnej antrachinonu jest kluczowa dla wiązania się do homologów AlkB, w związku z oddziaływaniem z resztami argininowymi w miejscu aktywnym białka. Emodyna i Aloe-emodyna miały niewielki wpływ na aktywność enzymatyczną badanych białek.The obtained monochloroemodines (2-chloroemodine and 4-chloroemodine) were separated as a mixture from 2,4-dichloroemodine by liquid chromatography. It was observed that the introduction of the electron-withdrawing halogen atom to the anthraquinone structure significantly increased the acidity of the phenolic groups. 2-chloroemodine and 4-chloroemodine were more polar than emodin, they also showed better solubility in water than in DMSO, and thus better bioavailability. 2,4-dichloroemodine showed more acidic properties than emodine and monochloroemodine. This effect translated into biological properties. The mixture of monochloroemodines and 2,4-dichloroemodine inhibited the enzymatic reaction of the bacterial AlkB protein and human ALKBH3 in a manner similar to rhein. This observation thus showed that the presence of an electrophilic group in the anthraquinone derivative is essential for binding to AlkB homologs due to its interaction with arginine residues at the protein active site. Emodine and Aloe-emodine had little effect on the enzymatic activity of the studied proteins.
Uzyskane przez Twórców wyniki wykazują wpływ wybranych antrachinonów zarówno na poziomie komórkowym (przeżywalność) jak i molekularnym (inhibicja reakcji enzymatycznej). Dlatego też nieoczekiwanie stwierdzili oni, że możliwe jest wykorzystanie pochodnych antrachinonów, w szczególności otrzymanych przez Twórców nowych pochodnych naturalnych związków antrachinonów, jako leków o właściwościach przeciwnowotworowych.The results obtained by the authors show the influence of selected anthraquinones both at the cellular level (survival) and at the molecular level (inhibition of the enzymatic reaction). Therefore, they unexpectedly found that it is possible to use anthraquinone derivatives, in particular those obtained by the inventors of new derivatives of natural anthraquinone compounds, as drugs with anti-cancer properties.
Zastosowanie opisanych związków do leczenia i/lub przeciwdziałania chorobie nowotworowej, w szczególności chorobie powiązanej z podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej jednego białka z grupy ALKBH, wybranego spośród białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz ALKBH9 (FTO), ma wiele zalet w stosunku do sposobów przeciwdziałania chorobie nowotworowej znanych ze stanu techniki.The use of the described compounds for the treatment and / or prevention of a neoplastic disease, in particular a disease associated with an increased level of expression and / or enzymatic activity of at least one protein from the ALKBH group, selected from the proteins ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and ALKBH9 (FTO), has many advantages over methods for counteracting neoplastic disease known in the art.
• wykorzystywane są związki otrzymywane ze związków obecnych w żywności (pochodzenia naturalnego; nieszkodliwych) oraz ich pochodne;• compounds are used obtained from compounds present in food (natural origin; harmless) and their derivatives;
• w związku z tym, że możliwe jest określenie czy mamy do czynienia z nowotworem w którym doszło do podwyższenia poziomu białek z grupy ALKBH, wybranych spośród białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz ALKBH9 (FTO), możliwe jest określenie czy zastosowane związki będą skuteczne i w ten sposób stosowanie ich jako terapii celowanej w konkretny typ nowotworu, powiązanego z podwyższonym poziomem ekspresji i/lub aktywności enzymatycznej przynajmniej jednego białka z grupy ALKBH, wybranego spośród białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz ALKBH9 (FTO).• due to the fact that it is possible to determine whether we are dealing with a tumor in which the level of ALKBH proteins has been increased, selected from the proteins ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and ALKBH9 (FTO), it is possible to determine whether the compounds used will be effectively and thus using them as a targeted therapy for a particular type of cancer associated with an increased level of expression and / or enzymatic activity of at least one protein from the ALKBH group, selected from the proteins ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and ALKBH9 (FTO).
W opisanych przykładach wykonania opisane związki mogą być stosowane jako lek do leczenia chorób nowotworowych u osobnika, przy czym sposoby te dodatkowo obejmują podawanie osobnikowi związków hamujących wapniową kaskadę sygnału zależną od kalmoduliny, w szczególności antagonistów kalmoduliny.In the described embodiments, the described compounds can be used as a medicament for the treatment of neoplastic diseases in a subject, the methods further comprising administering to the subject compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade, in particular calmodulin antagonists.
Twórcy stwierdzili bowiem, że wszystkie białka z grupy ALKBH mają potencjalne miejsce wiązania kalmoduliny oraz wykazali, że jedno z tych białek (białko FTO), rzeczywiście bardzo silnie wiąże kalmodulinę. Połączenie więc w sposobie leczenia nowotworów opisanych związków, obniżających ekspresję i/lub aktywność białek z grupy ALKBH ze związkami hamującymi szlak zależny od kalmoduliny, w szczególności antagonistów kalmoduliny, zapewni więc wzmocnienie wpływu przeciwnowotworowego.The inventors found that all ALKBH proteins have a potential calmodulin binding site and showed that one of these proteins (FTO protein) does indeed bind calmodulin very strongly. Thus, the combination in the method of treating tumors of the described compounds that lower the expression and / or activity of ALKBH proteins with compounds that inhibit the calmodulin-dependent pathway, in particular calmodulin antagonists, will thus provide an enhancement of the anti-tumor effect.
Związki hamujące wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny, w szczególności związki o działaniu antagonistów kalmoduliny, są znane w dziedzinie. Tego typu związki opisano m.in. w japońskim zgłoszeniu patentowym JP 2014-101849 (nr publikacji JP2015218129); amerykańskich zgłoszeniach patentowych US 14/785,946 i US 08/660,747; patentach amerykańskich US 2,645,640, US 3,262,977, US 4,117,118, patencie niemieckim DE 1,100,031; w publikacjach S. Corsano et al., Arch. Pharm., 322, 873-878 (1989), Hidaka et al., PNAS, 78:4354-4357 (1981). Nieograniczające przykłady takich związków obejmują związki wybrane z grupy: bepridyl, cetiedyl, chlorek kalmidazolium, chlorowodorek terodyliny, chlorowodorek N-(6-aminoheksylo)-5-chloro-1-naftalenosulfonamidu, chlorpromazyna, cyklosporyna A, cynaryzyna, deltametryna, dezypramina, E6 berbamina, fendylina, fenoksyben8Compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade, in particular compounds with activity as calmodulin antagonists, are known in the art. Such compounds are described, among others in Japanese Patent Application JP 2014-101849 (Publication No. JP2015218129); U.S. Patent Applications US 14 / 785,946 and US 08 / 660,747; US patents US 2,645,640, US 3,262,977, US 4,117,118, German patent DE 1,100,031; in S. Corsano et al., Arch. Pharm., 322, 873-878 (1989), Hidaka et al., PNAS, 78: 4354-4357 (1981). Non-limiting examples of such compounds include compounds selected from the group: bepridyl, cetiedyl, calmidazolium chloride, theodiline hydrochloride, N- (6-aminohexyl) -5-chloro-1-naphthalenesulfonamide hydrochloride, chlorpromazine, cyclosporin A, cinnarizine, deltamethrin, desibramine, , fendylin, phenoxyben8
PL 235 564 B1 zamina, flufenazyna, flunaryzyna, jabłczan zaldarydu określany też jako CGS 9343B, naftaleno-sulfonamidy, ofibolina A, prenylamina, prochlorperazyna, promazyna, prometazyna, trans-flupentyksol, trifluoroperazyna, W5, W7, W13 , i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole i estry.PL 235 564 B1, fluphenazine, flunarizine, zaldaride malate also referred to as CGS 9343B, naphthalene sulfonamides, ofiboline A, prenylamine, prochlorperazine, promazine, promethazine, trans-flupentixol, trifluoroperazine, W5, W7, W13, pharmaceutically acceptable salts, and esters.
W sposobach leczenia z zastosowaniem opisanych pochodnych antrachinonu oraz do zastosowania ich jako lek, związki te mogą być podawane równocześnie ze związkami hamującymi wapniową kaskadę sygnałów zależną od kalmoduliny, w szczególności antagonistami kalmoduliny, lub też sekwencyjnie, razem w jednej postaci dawkowania lub osobno.In the treatment methods using the described anthraquinone derivatives and for their use as a medicament, the compounds can be administered simultaneously with compounds that inhibit the calmodulin-dependent calcium signal cascade, in particular calmodulin antagonists, or sequentially, together in one dosage form or separately.
Osobnikiem w rozumieniu niniejszego wynalazku jest zwierzę, korzystnie ssak, w szczególności człowiek.A subject within the meaning of the present invention is an animal, preferably a mammal, in particular a human.
Przykładowa analiza próbki tkanki od pacjenta wykonywana w celu diagnozowania nowotworu obejmuje:Sample analysis of a tissue sample from a patient for cancer diagnosis includes:
a) przygotowanie próbki od pacjenta;a) preparing a sample from the patient;
b) analizę zmian poziomu przeciwciał przeciwko białkom z grupy ALKBH z próbki od pacjenta, korzystnie z wykorzystaniem metody Western Blot;b) analysis of changes in the level of antibodies against ALKBH proteins from a patient sample, preferably by Western Blot method;
przy czym wynik podwyższonego poziomu ekspresji dla przynajmniej dwóch spośród wymienionych białek z grupy ALKBH dla tkanki podejrzewanej o bycie tkanką nowotworową świadczy o występowaniu nowotworu.wherein the result of an elevated expression level for at least two of said ALKBH group proteins on a tissue suspected of being a neoplastic tissue is indicative of a tumor.
Przykładowa analiza próbki, wykonywana w celu analizy wpływu pochodnej antrachinonu na wzrost komórek nowotworowych, obejmuje:An example of a sample analysis performed to analyze the effect of an anthraquinone derivative on the growth of cancer cells includes:
a) hodowlę linii komórkowych;a) culturing cell lines;
b) badanie przeżywalności komórek i/lub oznaczanie stopnia zahamowania reakcji enzymatycznej katalizowanej przez białko z grupy ALKBH, korzystnie oznaczanie stopnia zahamowania reakcji demetylacji;b) test for cell viability and / or determination of the inhibition rate of an enzymatic reaction catalyzed by a protein from the ALKBH group, preferably determination of the inhibition rate of the demethylation reaction;
przy czym wpływ identyfikowanej substancji zmniejszający przeżywalność komórek i/lub hamujący ekspresję i/lub aktywność enzymatyczną przynajmniej dwóch spośród wymienionych białek z grupy ALKBH wskazuje na potencjalne działanie przeciwnowotworowe identyfikowanej substancji.wherein the effect of the identified substance decreasing the viability of the cells and / or inhibiting the expression and / or enzymatic activity of at least two of said ALKBH proteins is indicative of the potential antitumor activity of the identified substance.
Krótki opis figurBrief description of the figures
Fig. 1 przedstawia wyniki analizy typu Western-Blot dla białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 i FTO. Analiza tkanek z gardła (CH 1-36). Zastosowano Western Blot do wykrywania określonych białek w próbce homogenatu z tkanki lub ekstraktu komórkowego. Zastosowana procedura transfekcji siRNA, daje informację o specyficzności przeciwciał rozpoznających badane białka. Skróty: CH nowotwór, Z - zdrowa tkanka, M - marker białkowy, H - linia komórkowa HeLa, siRNA - wyciszające RNAi, k - kontrola (poziom białka niewyciszonego), FTO - poziom białka FTO nadeksprymowanego.Fig. 1 shows the results of Western-Blot analysis for the ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO proteins. Throat tissue analysis (CH 1-36). Western Blot was used to detect specific proteins in a sample of a tissue homogenate or cell extract. The applied siRNA transfection procedure gives information about the specificity of the antibodies recognizing the proteins under study. Abbreviations: CH tumor, Z - healthy tissue, M - protein marker, H - HeLa cell line, siRNA - silencing RNAi, k - control (un-silenced protein level), FTO - overexpressed FTO protein level.
Fig. 2 przedstawia zmiany poziomu białka ALKBH1 (reprezentowanego przez prążek o masie 43 kDa; strzałka) w tkankach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani, badaną metodą Western blot. Oznaczenia: Z - tkanka zdrowa, CH - tkanka z nowotworem, H - linia komórkowa HeLa, NC - kontrola negatywna eksperymentu; blot inkubowany tylko z przeciwciałem drugorzędowym.Fig. 2 shows the changes in the level of ALKBH1 protein (represented by a 43 kDa band; arrow) in tissues from patients after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor by Western blot analysis. Markings: Z - healthy tissue, CH - tumor tissue, H - HeLa cell line, NC - negative control of the experiment; blot incubated with the secondary antibody only.
Fig. 3 przedstawia zmiany poziomu białka ALKBH3 (reprezentowanego przez prążek o masie 33 kDa; strzałka) w tkankach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani, badana metodą Western blot. Oznaczenia: Z - tkanka zdrowa, CH - tkanka z nowotworem, H - linia komórkowa HeLa, NC - kontrola negatywna eksperymentu; blot inkubowany tylko z przeciwciałem drugorzędowym.Figure 3 shows the changes in the level of ALKBH3 protein (represented by a 33 kDa band; arrow) in tissues from patients after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor by Western blotting. Markings: Z - healthy tissue, CH - tumor tissue, H - HeLa cell line, NC - negative control of the experiment; blot incubated with the secondary antibody only.
Fig. 4 przedstawia zmiany poziomu białka ALKBH4 (reprezentowanego przez prążek o masie 40 kDa; strzałka) w tkankach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani, badana metodą Western blot. Oznaczenia: Z - tkanka zdrowa, CH - tkanka z nowotworem, H - linia komórkowa HeLa, RNAi ALKBH4 - linia komórkowa HeLa u której ekspresja białka ALKBH4 była wyciszana za pomocą RNAi, NC - kontrola negatywna eksperymentu; blot inkubowany tylko z przeciwciałem drugorzędowym.Figure 4 shows the changes in the level of ALKBH4 protein (represented by a 40 kDa band; arrow) in tissues from patients after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor by Western blot. Assays: Z - healthy tissue, CH - tumor tissue, H - HeLa cell line, RNAi ALKBH4 - HeLa cell line in which ALKBH4 expression was silenced with RNAi, NC - negative control of the experiment; blot incubated with the secondary antibody only.
Fig. 5 przedstawia zmiany poziomu białka ALKBH5 (reprezentowanego przez prążek o masie 53 kDa; strzałka) w tkankach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani, badana metodą Western blot. Oznaczenia: Z - tkanka zdrowa, CH - tkanka z nowotworem, H - linia komórkowa HeLa, RNAi ALKBH5 - linia komórkowa HeLa u której ekspresja białka ALKBH5 była wyciszana za pomocą RNAi, NC - kontrola negatywna eksperymentu; blot inkubowany tylko z przeciwciałem drugorzędowym.Figure 5 shows changes in the level of ALKBH5 protein (represented by a 53 kDa band; arrow) in tissues from patients after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor by Western blotting. Assays: Z - healthy tissue, CH - tumor tissue, H - HeLa cell line, RNAi ALKBH5 - HeLa cell line in which ALKBH5 expression was silenced with RNAi, NC - negative control of the experiment; blot incubated with the secondary antibody only.
PL 235 564 B1PL 235 564 B1
Fig. 6 przedstawia zmiany poziomu białka FTO (reprezentowanego przez prążek o masie 58 kDa; strzałka) w tkankach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani, badana metodą Western blot. Oznaczenia: Z - tkanka zdrowa, CH - tkanka z nowotworem, H - linia komórkowa HeLa, F - oczyszczone białko FTO NC - kontrola negatywna eksperymentu; blot inkubowany tylko z przeciwciałem drugorzędowym.Fig. 6 shows the changes in the level of FTO protein (represented by the 58 kDa band; arrow) in tissues from patients after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor by Western blotting. Markings: Z - healthy tissue, CH - tissue with tumor, H - HeLa cell line, F - purified FTO NC protein - negative control of the experiment; blot incubated with the secondary antibody only.
Fig. 7 pokazuje tworzenie się kompleksu FTO-kalmodulina. a) Analiza za pomocą Termoforezy Mikroskalowej (MST) oddziaływania FTO-CaM w obecności Ca2+, Fe2+ i α-ketoglutaranu (czarny kwadrat) oraz po usunięciu jonów dwuwartościowych za pomocą 250 nM roztworu EDTA (szary trójkąt); b) Poziom wymiany proton-deuter (analizowany za pomocą spektrometrii mas - HDX-MS) we fragmencie kalmoduliny wiążącym wapń w obecności i pod nieobecność FTO (roztwór reakcji: 500 gM Ca2+, 500 gM Fe2+ oraz 1 mM α-ketoglutaran); pik reprezentujący populację wykazującą wyższy poziom wymiany zaznaczono czarnym kołem; c) model interakcji kalmoduliny z C-domeną FTO.Fig. 7 shows the formation of the FTO-calmodulin complex. a) Micro-scale thermophoresis (MST) analysis of the FTO-CaM interaction in the presence of Ca 2+ , Fe 2+ and α-ketoglutarate (black square) and after removal of divalent ions with 250 nM EDTA solution (gray triangle); b) Level of proton-deuterium exchange (analyzed by mass spectrometry - HDX-MS) in the calcium-binding fragment of calmodulin in the presence and absence of FTO (reaction solution: 500 gM Ca 2+ , 500 gM Fe 2+ and 1 mM α-ketoglutarate ); a peak representing a population showing a higher level of exchange is marked with a black circle; c) model of calmodulin interaction with the C-domain of the FTO.
Fig. 8 przedstawia występowanie form białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH5 oraz FTO in vivo w próbkach od pacjentów po operacji usunięcia nowotworu nosogardła lub krtani oraz w linii komórkowej HeLa. Analiza przeprowadzona za pomocą sączenia molekularnego. Roztwór preparatu o objętości 500 gl wprowadzono do aparatu FPLC, na kolumnę Enrich 650 (Bio-Rad), z detektorem UV-Vis. Masy kompleksów określano porównując ze standardem wielkości (BioRad- #1511901).Figure 8 shows the occurrence of the protein forms ALKBH1, ALKBH3, ALKBH5 and FTO in vivo in patient samples after surgery to remove a nasopharyngeal or laryngeal tumor and in the HeLa cell line. The analysis was carried out by means of molecular filtration. The 500 µl solution of the preparation was loaded into the FPLC apparatus, on an Enrich 650 column (Bio-Rad) with a UV-Vis detector. Complex weights were determined by comparison to a size standard (BioRad- # 1511901).
Fig. 9 przedstawia trójwymiarowy model FTO. (A) nisko rozdzielczy model dimeru FTO otrzymany z użyciem techniki rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małymi kątami (SAXS); (B) miejsca fosforylacji FTO otrzymane z wykorzystaniem analizy fosfoproteomu z użyciem spektrometrii mas, (C) model dimeru FTO-CaM otrzymany na podstawie danych bioinformatycznych (baza danych interaktorów kalmoduliny) oraz biofizycznych (HDX-MS).Fig. 9 shows a three-dimensional FTO model. (A) low resolution FTO dimer model obtained using low angle x-ray scattering (SAXS) technique; (B) FTO phosphorylation sites obtained by means of phosphoproteome analysis by mass spectrometry, (C) FTO-CaM dimer model obtained on the basis of bioinformatics (calmodulin interactors database) and biophysical (HDX-MS) data.
Fig. 10 przedstawia zmiany poziomu białek ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO w tkankach pacjentów po usunięciu innych typów nowotworów w porównaniu do tkanek zdrowych oraz innych zmian patogennych badane metodą Western blot. Oznaczenia: 1 - Ogniskowa ziarnina z owrzodzeniem, 2 - Włókniak, 3 - Kikut odbytu, 4 - Fragment guza przerzutowego, 5 - Rak wątrobowokomórkowy, 6 - Rak wątrobowokomórkowy, 7 - Rak wątrobowokomórkowy, CH - Nowotwór, Z - Tkanka przylegająca, P32 - pacjent z nowotworem krtani, P130 - pacjent z nowotworem jamy ustnej.Fig. 10 shows the changes in the levels of ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO proteins in patients' tissues after removal of other types of tumors compared to normal tissues and other pathogenic lesions examined by Western blot. Markings: 1 - Focal granulation tissue ulcerated, 2 - Fibroma, 3 - Anal stump, 4 - Metastatic tumor fragment, 5 - Hepatocellular carcinoma, 6 - Hepatocellular carcinoma, 7 - Hepatocellular carcinoma, CH - Neoplasm, Z - Adjacent tissue, P32 - patient with laryngeal cancer, P130 - patient with oral cancer.
Fig. 11 przedstawia immunoreaktywność ALKBH3, ALKBH5 i FTO w skrawkach tkankowych niezmienionej nowotworowo krtani oraz w wycinkach tkanki nowotworowej. Brak immunoreaktywności ALKLBH3 w tkance nienowotworowej (A) oraz w guzie (B). (C) Skrawek parafinowy prawidłowej krtani ze słabym sygnałem ALKBH5 w jądrze komórkowym (strzałki). (D i E) Tkanki nowotworowe wykazujące umiarkowaną (D) i silną (E) immunoekspresję ALKBH5. (F) Immunoreaktywność ALKBH5 w cytoplazmie komórek nowotworowych. (G) Słaba immunoreaktywność FTO w tkance niezmienionej nowotworowo (strzałki). (H) Immunohistochemiczna lokalizacja FTO w komórkach nowotworowych (strzałki). Skala w A, B, C, D, G i H:, 50 gm; F: 20 gm.Fig. 11 shows the immunoreactivity of ALKBH3, ALKBH5 and FTO in tissue sections of non-neoplastic larynx and in neoplastic tissue sections. Lack of ALKLBH3 immunoreactivity in non-neoplastic tissue (A) and in tumor (B). (C) Paraffin section of the normal larynx with a weak ALKBH5 signal in the nucleus (arrows). (D and E) Tumor tissues moderately (D) and strongly (E) immuno-expressing ALKBH5. (F) Immunoreactivity of ALKBH5 in the cytoplasm of cancer cells. (G) Weak FTO immunoreactivity in unchanged tissue (arrows). (H) Immunohistochemical localization of FTO in cancer cells (arrows). Scale in A, B, C, D, G and H :, 50 gm; F: 20 gm.
Fig. 12 pokazuje związki przebadane pod kątem interakcji z homologami AlkB. Kolejno: a) reina, b) emodyna, c) aloe-emodyna, d) 2-chloroemodyna, e) 4-chloroemodyna, f) 2,4-dichloroemodyna.Figure 12 shows compounds tested for interaction with AlkB homologues. Sequentially: a) rhein, b) emodine, c) aloe-emodine, d) 2-chloroemodine, e) 4-chloroemodine, f) 2,4-dichloroemodine.
Fig. 13 pokazuje schemat chlorowania emodyny z wytworzeniem 2-chloroemodyny, 4-chloroemodyny i 2,4-dichloroemodyny, odpowiednio.Fig. 13 shows a diagram of the chlorination of emodine to give 2-chloroemodine, 4-chloroemodine and 2,4-dichloroemodine, respectively.
Fig. 14 pokazuje ograniczenie wzrostu linii komórkowych HeLa, HEK293 oraz U87 przez reinę, emodynę oraz aloe-emodynę uwidocznione za pomocą oznaczenia z odczynnikiem alamarBlue® (A, B, C). Wyniki analizy Western blot dla białek ALKBH3, ALKBH5 oraz FTO na liniach komórkowych HEK293 oraz U87 (D, E).Fig. 14 shows the growth restriction of HeLa, HEK293 and U87 cell lines by rhein, emodin and aloe-emodin as visualized by the alamarBlue® reagent (A, B, C). Western blot analysis results for ALKBH3, ALKBH5 and FTO proteins on HEK293 and U87 (D, E) cell lines.
Fig. 15 przedstawia wykresy przeżywalności linii komórkowej HEK293, inkubowanej 24 godziny z pochodnymi antrachinonów, w porównaniu do komórek inkubowanych w samej pożywce.Fig. 15 shows graphs of the survival of the HEK293 cell line, incubated 24 hours with anthraquinone derivatives, compared to cells incubated in medium only.
Fig. 16 przedstawia wykresy przeżywalności linii komórkowej HeLa, inkubowanej 24 godziny z pochodnymi antrachinonów, w porównaniu do komórek inkubowanych w samej pożywce.Fig. 16 shows the survival charts of the HeLa cell line incubated 24 hours with anthraquinone derivatives, compared to cells incubated in medium alone.
Fig. 17 przedstawia wykresy przeżywalności linii komórkowej U87, inkubowanej 24 godziny z pochodnymi antrachinonów, w porównaniu do komórek inkubowanych w samej pożywce.Fig. 17 shows the survival charts of the U87 cell line incubated 24 hours with anthraquinone derivatives, compared to cells incubated in medium alone.
PRZYKŁADYEXAMPLES
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody biologii molekularnej lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.The following examples used standard molecular biology materials and methods or followed manufacturers' recommendations for specific materials and methods unless otherwise indicated.
PL 235 564 B1PL 235 564 B1
P r z y k ł a d 1 Analiza próbki tkanki zdrowej/nowotworowej pacjentów po usunięciu nowotworu na obecność przeciwciał przeciwko białkom z rodziny ALKBHExample 1 Analysis of a sample of healthy / neoplastic tissue from patients after tumor removal for the presence of antibodies against ALKBH family proteins
Wstępnie przebadano 20 komercyjnie dostępnych przeciwciał; pięć z nich określono jako odpowiednie do diagnostyki. Skuteczność poszczególnych przeciwciał wobec białek z grupy ALKBH sprawdzano wykorzystując linie komórkowe HeLa, u których ekspresję danego białka wyciszano za pomocą siRNA (według procedury producenta). Na tej podstawie udało się określić pięć przeciwciał, dzięki którym za pomocą techniki Western Blot analizowano poziom ekspresji pięciu białek: ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO.20 commercially available antibodies were pre-tested; five of them were found suitable for diagnosis. The effectiveness of individual antibodies against proteins from the ALKBH group was checked using HeLa cell lines in which the expression of a given protein was silenced using siRNA (according to the manufacturer's procedure). On this basis, five antibodies were identified, thanks to which the expression level of five proteins was analyzed using the Western Blot technique: ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO.
Wykonano analizę próbek tkanek od 66 pacjentów (Klinika Otorynolaryngologii Wydziału Lekarsko-Dentystycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego) ze zróżnicowanymi nowotworami nosa i gardła. Pacjenci zostali przebadani na obecność nadekspresji ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO, za pomocą techniki Western Blot.Tissue samples were analyzed from 66 patients (Department of Otorhinolaryngology, Faculty of Medicine and Dentistry, Medical University of Warsaw) with diverse neoplasms of the nose and throat. The patients were tested for ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO overexpression using the Western Blot technique.
W żadnym z badanych przypadków nie włączono do badania pacjentów po uprzednim leczeniu radioterapią lub chemioterapią. Analiza obejmowała:In none of the investigated cases patients were included in the study after prior radiotherapy or chemotherapy. The analysis included:
a) przygotowanie próbki od pacjenta pobranie tkanki od pacjenta, przez wykwalifikowany personel medyczny według procedury w zależności od rodzaju nowotworu:a) preparation of a patient sample, collection of tissue from a patient, by qualified medical personnel according to the procedure depending on the type of tumor:
A. Nowotwór krtani (standardowa procedura, znana ze stanu techniki)A. Laryngeal cancer (standard procedure, known in the art)
- znieczulenie ogólne pacjenta, u którego wykryto wczesne stadium płaskonabłonkowego raka krtani na podstawie pobranego wycinka guza;- general anesthesia of the patient in whom early stage squamous cell carcinoma of the larynx was diagnosed on the basis of a tumor specimen;
- przeprowadzenie zabiegu laryngektomii częściowej lub całkowitej w zależności od rozległości nacieku nowotworowego;- partial or total laryngectomy depending on the extent of the tumor infiltration;
- preparat natychmiast po usunięciu z pacjenta był transportowany w roztworze 0,9% NaCI do pracowni patomorfologii, gdzie po wstępnej ocenie przez patomorfologa pobierano stosowny fragment tkanki i zamrażano w -20°C;- the preparation, immediately after removal from the patient, was transported in a 0.9% NaCl solution to the pathology laboratory, where, after preliminary assessment by a pathologist, the appropriate tissue fragment was collected and frozen at -20 ° C;
- pobieranie fragmentu niezmienionej nowotworowo tkanki z sąsiedztwa i zamrażanie.- taking a fragment of non-cancerous tissue from the neighborhood and freezing.
B. Nowotwór nosogardła (standardowa procedura, znana ze stanu techniki)B. Neoplasm of the nasopharynx (standard procedure, known in the art)
- pobieranie fragmentu guza nosogardła jednoczasowo wraz z pobieraniem materiału do badania histopatologicznego. Pobór w większości przypadków dokonywano w znieczuleniu miejscowym, jeśli zachodziła taka konieczność - w znieczuleniu ogólnym;- taking a fragment of the nasopharyngeal tumor simultaneously with collecting material for histopathological examination. In most cases, the collection was performed under local anesthesia, if necessary - under general anesthesia;
- pobieranie materiału pod kontrolą endoskopu za pomocą kleszczyków endoskopowych, precyzyjnie oceniając miejsce z którego pochodził fragment tkankowy;- collecting the material under the control of the endoscope with the use of endoscopic forceps, precisely assessing the place from which the tissue fragment came;
- stosowny fragment tkanki zamrażano w -20°C.- the relevant piece of tissue was frozen at -20 ° C.
C. Nowotwór jamy ustnej (standardowa procedura, znana ze stanu techniki).C. Oral cancer (standard procedure, known in the art).
D. Rak wątrobowokomórkowy (standardowa procedura, znana ze stanu techniki).D. Hepatocellular carcinoma (standard procedure, known in the art).
E. Fragment guza przerzutowego (standardowa procedura, znana ze stanu techniki).E. A fragment of a metastatic tumor (standard procedure, known in the art).
F. Kikut odbytu (standardowa procedura, znana ze stanu techniki).F. Anal stump (standard procedure, known in the art).
Dla wszystkich pobranych tkanek przeprowadzono następujące procedury:The following procedures were performed for all the harvested tissues:
- mrożenie materiału w -20°C i transport do laboratorium;- material freezing at -20 ° C and transport to the laboratory;
- rozmrożenie w temperaturze pokojowej (~23°C) i pobranie próbki reprezentatywnej;- thawing at room temperature (~ 23 ° C) and taking a representative sample;
- dodanie buforu RIPA z 50 mM EDTA oraz 40 mM PMSF w objętości 100 μl na każde 100 mg materiału;- addition of RIPA buffer with 50 mM EDTA and 40 mM PMSF in a volume of 100 µl for every 100 mg of material;
- homogenizacja próbki z użyciem elektrycznej pestli i piasku szklanego przez 20 sekund;- homogenization of the sample with electric pestle and glass sand for 20 seconds;
- inkubacja próbki 10 min na lodzie;- sample incubation 10 min on ice;
- homogenizacja próbki z użyciem elektrycznej pestli i piasku szklanego przez 20 sekund;- homogenization of the sample with electric pestle and glass sand for 20 seconds;
- wirowanie próbki przez 30 minut na 30 tys. x g w 4°C i pobranie supernatantu;- centrifugation of the sample for 30 minutes per 30 thousand. x g at 4 ° C and taking the supernatant;
- pomiar stężenia białka w supernatancie metodą Bradford;- measurement of the protein concentration in the supernatant by the Bradford method;
- rozcieńczenie próbki do stężenia białka 3 mg/ml;- diluting the sample to a protein concentration of 3 mg / ml;
- przygotowanie próbek i przeprowadzenie standardowej procedury SDS-PAGE.- sample preparation and standard SDS-PAGE procedure performed.
b) Następnie prowadzono analizę zmian poziomu przeciwciał grupy ALKBH z próbki od pacjenta z wykorzystaniem metody Western Blot:b) Then, the analysis of changes in the level of ALKBH antibodies from the patient's sample was performed using the Western Blot method:
- transfer półsuchy z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową przy użyciu buforu (Tris 96 mM, Glicyna 78 mM, SDS 0,075% (m/v), Metanol 40% (v/v)) do transferu przez 1 h przy napięciu 10 V;- semi-dry transfer from polyacrylamide gel to nitrocellulose membrane using buffer (Tris 96 mM, Glycine 78 mM, SDS 0.075% (w / v), Methanol 40% (v / v)) for 1 h transfer at 10 V;
- blokowanie membrany w 10% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka rozpuszczonego w PBST (bufor PBS o pH 7,4 z 0,1% (v/v) TWEEN® 20 (CAS# 9005-64-5)) przez 1 h;- blocking the membrane in a 10% (w / v) solution of skim milk dissolved in PBST (PBS buffer pH 7.4 with 0.1% (v / v) TWEEN® 20 (CAS # 9005-64-5)) for 1 h;
PL 235 564 Β1PL 235 564 Β1
- inkubację w 5% (m/v) roztworze mleka w PBST przez noc z odpowiednimi przeciwciałami anti-ALKBH w stężeniu 1:500;- incubation in 5% (m / v) milk solution in PBST overnight with the appropriate anti-ALKBH antibodies at a concentration of 1: 500;
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min);- decanting of unbound antibodies and milk with PBST buffer (5 times 5 min);
- inkubację w 5% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka w PBST przez 3 h z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysimi lub anty-króliczymi (w zależności od przeciwciała pierwszorzędowego) w stężeniu 1:5000;- incubation in 5% (m / v) skim milk solution in PBST for 3 h with anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies (depending on the primary antibody) at a concentration of 1: 5000;
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min);- decanting of unbound antibodies and milk with PBST buffer (5 times 5 min);
- usunięcie TWEENu za pomocą buforu PBS (3 razy po 5 min);- removal of TWEEN with PBS buffer (3 times 5 min);
- wywoływanie z użyciem odczynnika do chemiluminescencji i kamery CCD.- development with chemiluminescence reagent and CCD camera.
Tabela 1 pokazuje podsumowanie wyników analiz 66 pacjentów ze zróżnicowanymi nowotworami nosa i gardła. Pacjenci zostali przebadani na obecność nadekspresji ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 oraz FTO, za pomocą techniki Western Biot. Wyniki porównano z rezultatami uzyskanymi z 66 tkanek zdrowych. Większość pacjentów wykazywała wzrost ekspresji u przynajmniej 2 z 5 badanych białek.Table 1 summarizes the results of the analyzes of 66 patients with differentiated nasopharyngeal neoplasms. The patients were tested for ALKBH1, ALKBH3, ALKBH4, ALKBH5 and FTO overexpression using the Western Biot technique. The results were compared with the results obtained from 66 healthy tissues. Most of the patients showed an increase in expression in at least 2 out of 5 tested proteins.
Tabela 1. Liczba pacjentów z nadekspresją poszczególnych białek z grupy ALKBH w nowotworzeTable 1. Number of patients with overexpression of individual ALKBH proteins in the tumor
Wyniki analiz próbek pochodzących od pacjentów po usunięciu nowotworu nosogardła, krtani, jamy ustnej lub wątroby pokazują poziom przeciwciał przeciwko białkom z rodziny ALKBH (Fig. 1,2-6 oraz 10). Poszczególnym białkom odpowiadają prążki o masach:The results of analyzes of patient samples after removal of the nasopharyngeal, laryngeal, oral or liver tumors show the level of antibodies against the ALKBH family proteins (Figures 1,2-6 and 10). The individual proteins correspond to bands with masses:
1.ALKBH1 -43 kDa1.ALKBH1 -43 kDa
2. ALKBH3 - 33 kDa2. ALKBH3 - 33 kDa
3. ALKBH4 - 33 kDa3. ALKBH4 - 33 kDa
4. ALKBH5 - 53 kDa4. ALKBH5 - 53 kDa
5. ALKBH9 (FTO) - 58 kDa5. ALKBH9 (FTO) - 58 kDa
Na podstawie porównania poziomu przeciwciał w tkance zdrowej oraz w tkance z nowotworem, stwierdzono wzrost poziomu białek z rodziny ALKBH w nowotworze. Bez wiązania się teorią, można tłumaczyć to odpowiedzią komórki na podwyższony poziom uszkodzeń metylacyjnych DNA, RNA i białek, które występują w nowotworach i które komórka rakowa stara się usunąć.Based on the comparison of the level of antibodies in healthy tissue and in tumor tissue, an increase in the level of ALKBH family proteins in the tumor was found. Without being bound by theory, this could be explained by the cell's response to increased levels of DNA, RNA and protein methylation damage that occurs in tumors and that the cancer cell is trying to remove.
Powyższe wyniki poddano analizie statystycznej - Współczynnik korelacji rang Spearmana oraz Analizie głównych składowych (PCA). Wnioski z analizy przedstawiają się następująco:The above results were analyzed statistically - Spearman's rank correlation coefficient and Principal Component Analysis (PCA). The conclusions of the analysis are as follows:
Test par Wilcoxona wykazał, że ALKBH3 nie jest dobrym markerem występowania nowotworów nosogardła lub krtani - jego p-wartość była najwyższa we wszystkich badanych przypadkach.The Wilcoxon pair test showed that ALKBH3 is not a good marker of nasopharyngeal or laryngeal neoplasms - its p-value was the highest in all examined cases.
Tabela 2. p-wartości testów par Wilcoxona porównujących poziom ekspresji poszczególnych białek rodziny ALKBH w tkankach chorych w porównaniu do tkanek zdrowych pobranych od pacjentów z nowotworami nosogardła oraz krtani. Im niższa wartość tym większa pewność występowania statystycznie istotnych różnic w poziomie ekspresji pomiędzy tkanką chorą i zdrową.Table 2. p-values of Wilcoxon pair tests comparing the expression level of individual ALKBH family proteins in the tissues of patients compared to healthy tissues collected from patients with nasopharyngeal and laryngeal neoplasms. The lower the value, the greater the certainty that there will be statistically significant differences in expression levels between diseased and healthy tissue.
PL 235 564 Β1PL 235 564 Β1
Poziom ekspresji białek grupy ALKBH jest ze sobą powiązany (współczynniki Spearmana poszczególnych par wynosiły od 0,6-0,7). Jednakże w przypadku chorych korelacja pomiędzy białkami była słabsza niż w przypadku tkanek zdrowych.The level of expression of ALKBH group proteins is related to each other (Spearman's coefficients of individual pairs ranged from 0.6-0.7). However, in patients, the correlation between proteins was weaker than in healthy tissues.
Analiza głównych składowych wykazała, że najlepszą wartość dla rozróżniania tkanek zdrowych i z nowotworem ma suma białek grupy ALKBH. Jednakże w przypadku pojedynczych białek markerowych najlepszą zdolność predykcyjną ma para ALKBH1 i FTO oraz samo ALKBH1.Principal component analysis showed that the sum of ALKBH group proteins is the best value for discriminating between healthy and tumor tissues. However, for single marker proteins, the pair ALKBH1 and FTO and ALKBH1 alone have the best predictive ability.
Przykład 2 Poszukiwanie interaktorów białek z rodziny ALKBHExample 2 Search for protein interactors of the ALKBH family
Analiza bioinformatycznaBioinformatic analysis
Analiza sekwencji białka FTO w bazie interaktorów kalmoduliny (ang. CaM-białka odpowiedzialnego za homoeostazę) wykazała istnienie potencjalnego miejsca interakcji FTO-CaM. Te badania metodą bioinformatyczną zostały potwierdzone techniką termoforezy mikroskalowej (MST), a następnie poszerzone o wyniki spektrometrii mas z wymianą proton-deuter. Zastosowane metody pokazały dynamiczne formowanie się kompleksu CaM-FTO. Wiązanie kalmoduliny do FTO skutkowało dużą zmianą poziomu wymiany w rejonach wiążących wapń, co wskazuje na regulację FTO w ścieżce zależnej od wapnia/kalmoduliny. Na Fig. 7 przedstawiono dane dla tworzenia się kompleksu FTO-kalmodulina.Sequence analysis of the FTO protein in the calmodulin (CaM-homoeostasis protein) database revealed the existence of a potential FTO-CaM interaction site. These bioinformatics studies were confirmed by the microscale thermophoresis (MST) technique, and then extended with the results of proton-deuterium exchange mass spectrometry. The applied methods showed the dynamic formation of the CaM-FTO complex. Binding of calmodulin to FTO resulted in a large change in the level of exchange in the calcium-binding regions, indicating the regulation of FTO in the calcium / calmodulin dependent pathway. Fig. 7 shows the data for the FTO-calmodulin complex formation.
FTO posiada na swojej powierzchni reszty serynowe, które są fosforylowane w wyniku modyfikacji potranslacyjnych. N-domena, katalityczna jest również miejscem interakcji dimeru FTO. C-domena jest odpowiedzialna za interakcję z kalmoduliną (Fig. 9). Przeprowadzone analizy strukturalne są podstawą do opracowania terapii łączących zastosowanie substancji obniżających ekspresję i/lub aktywność enzymatyczną białek z grupy ALKBH takich jak pochodne antrachinowe, szczególnie 2-chloroemodyna, 4-chloroemodyna i 2,4-dichloroemodyna oraz substancji hamujących szlak zależny od kalmoduliny.The FTO has serine residues on its surface that are phosphorylated as a result of post-translational modifications. The catalytic N-domain is also the site of the FTO dimer interaction. The C-domain is responsible for the interaction with calmodulin (Fig. 9). The performed structural analyzes are the basis for the development of therapies combining the use of substances that reduce the expression and / or enzymatic activity of ALKBH proteins, such as anthraquinone derivatives, especially 2-chloroemodine, 4-chloroemodine and 2,4-dichloroemodine, and substances inhibiting the calmodulin-dependent pathway.
Tabela 3. Potencjalne sekwencje wiązania kalmoduliny w białkach z rodziny ALKBH u siedmiu różnych gatunków. Na podstawie Calmodulin Target Database (41)Table 3. Potential calmodulin binding sequences in proteins of the ALKBH family in seven different species. Based on the Calmodulin Target Database (41)
Przykład 3 Analiza kompleksów białkowych w komórkach nowotworowychExample 3 Analysis of protein complexes in tumor cells
W celu określenia, czy białka z rodziny ALKBH występują w kompleksach in vivo w komórkach nowotworowych (nowotwory nosogardła lub krtani oraz linie komórkowe HeLa), wykorzystano metodę biochemiczną - sączenie molekularne na próbkach lizatów komórkowych.In order to determine whether the ALKBH family proteins are present in complexes in vivo in neoplastic cells (nasopharyngeal or laryngeal tumors and HeLa cell lines), a biochemical method was used - molecular filtration on samples of cell lysates.
Białka ALKBH1 (m = 43 kDa) oraz ALKBH5 (m = 53 kDa) występują w formie kompleksów, FTO (m = 58 kDa) tworzy dimer, a ALKBH3 (m = 33 kDa) ma formę monomeru. Efekt ten występował zarówno w próbkach od pacjentów z nowotworami nosogardła lub krtani, jak w badanej nowotworowej linii komórkowej HeLa (Fig. 8).The proteins ALKBH1 (m = 43 kDa) and ALKBH5 (m = 53 kDa) are in the form of complexes, FTO (m = 58 kDa) is in the form of a dimer, and ALKBH3 (m = 33 kDa) is in the form of a monomer. This effect was present both in samples from patients with nasopharyngeal or laryngeal neoplasms, and in the HeLa tumor cell line tested (Fig. 8).
W celu określenia w jakiej formie natywnej występują białka ALKBH in vivo w tkance nowotworowej i w komórkach HeLa przeprowadzono sączenie molekularne (ang. Size Exlusiori) (Fig. 8). Zaobserwowano, że białko ALKBH1 o masie ~43 kDa dominowało we frakcjach 4 i 9. Obecność ALKBH1 we frakcji 9 wskazuje na formę monomeryczną białka, natomiast obecność ALKBH1 we frakcji 4 wskazuje,Size Exlusiori was performed in order to determine the native form of ALKBH proteins in vivo in neoplastic tissue and in HeLa cells (Fig. 8). It was observed that the ~ 43 kDa protein ALKBH1 dominated in fractions 4 and 9. The presence of ALKBH1 in fraction 9 indicates the monomeric form of the protein, while the presence of ALKBH1 in fraction 4 indicates that
PL 235 564 Β1 że białko to występuje w dużym kompleksie z innymi białkami. ALKBH3 o masie ~33 kDa dominowało jedynie we frakcji 10 co wskazuje, że in vivo występuje ono w formie monomeru. W przypadku ALKBH5 (~53 kDa) i FTO (~58 kDa) zaobserwowano przesunięcie prążków z frakcji 9 do 8. Obecność ALKBH5 i FTO we frakcji 8, która odpowiada masie 44-158 kDa wskazuje, że badane białka występują w kompleksie jako homo- lub heterodimery. Natomiast obecność we frakcjach 4-5 wskazuje, że wyżej wymienione białka mogą także występować w dużych kompleksach białkowych. ALKBH1 dominuje w formie monomerycznej, niewykluczone, że wchodzi w skład kompleksów nukleoproteinowych, ALKBH3 występuje jedynie w formie monomerów, natomiast ALKBH5 i FTO tworzą oligomery oraz wchodzą w skład kompleksów nukleoproteinowych.PL 235 564 Β1 that this protein is highly complex with other proteins. ALKBH3 of ~ 33 kDa dominated only in fraction 10, indicating that it exists in vivo as a monomer. In the case of ALKBH5 (~ 53 kDa) and FTO (~ 58 kDa), a shift of bands from fractions 9 to 8 was observed. The presence of ALKBH5 and FTO in fraction 8, which corresponds to 44-158 kDa, indicates that the tested proteins are present in the complex as homo- or heterodimers. On the other hand, the presence in fractions 4-5 indicates that the above-mentioned proteins may also be present in large protein complexes. ALKBH1 dominates in the monomeric form, it is possible that it is part of nucleoprotein complexes, ALKBH3 occurs only in the form of monomers, while ALKBH5 and FTO form oligomers and are part of nucleoprotein complexes.
Przykład 4 Lokalizacja białek z rodziny ALKBH w komórkach nowotworowychExample 4 Localization of ALKBH family proteins in neoplastic cells
Skrawki tkankowe pochodziły od 7 pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem krtani. Grupę kontrolną stanowiło 7 skrawków nienowotworowej tkanki krtani przylegających do tkanki zmienionej nowotworowo.Tissue sections were obtained from 7 patients diagnosed with laryngeal cancer. The control group consisted of 7 sections of non-neoplastic larynx tissue adjacent to the neoplastic tissue.
Skrawki parafinowe o grubości 4 urn zostały od pa rafinowane w ksylenie i nawodnione w alkoholach. Następnie przeprowadzono proces odmaskowania epitopu poprzez inkubację preparatów w buforze cytrynianowym ogrzewanym do 99°C przez 20 minut. W celu zablokowania aktywności endogennej peroksydazy skrawki zostały umieszczone w 3% roztworze wody utlenionej na 30 minut. Następnie blokowano niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał roztworem 5% surowicy oślej (Jackson Immunoresearch, USA). W kolejnym etapie barwienia skrawki tkankowe inkubowano z roztworem pierwszorzędowych przeciwciał (Tabela 3) w temperaturze 4°C przez 24 h. Do detekcji zastosowano ośle antymysie i anty-królicze przeciwciała drugorzędowe sprzężone bezpośrednio z cząsteczkami peroksydazy chrzanowej (Jackson Immunoresearch) oraz 3,3’-diaminobenzydynę (Dako, Dania) jako chromogen. Po immunoreakcji jądra komórkowe uwidoczniono w barwieniu kontrastowym hematoksyliną i analizowano pod mikroskopem świetlnym.4 [mu] m thick paraffin sections have been paraffinated in xylene and rehydrated with alcohols. The epitope unmasking process was then performed by incubating the slides in a citrate buffer heated to 99 ° C for 20 minutes. In order to block the endogenous peroxidase activity, the sections were placed in a 3% hydrogen peroxide solution for 30 minutes. The nonspecific antibody binding sites were then blocked with a 5% donkey serum solution (Jackson Immunoresearch, USA). In the next staining step, the tissue sections were incubated with the primary antibody solution (Table 3) at 4 ° C for 24 h. Anti-mouse donkey and anti-rabbit secondary antibodies directly conjugated to horseradish peroxidase (Jackson Immunoresearch) and 3.3 'were used for detection. -diaminobenzidine (Dako, Denmark) as a chromogen. After immunoreaction, the cell nuclei were visualized in hematoxylin counterstaining and analyzed under a light microscope.
Tabela 4. Przeciwciała użyte w barwieniach immunohistochemicznych.Table 4. Antibodies used in immunohistochemical staining.
W celu określenia lokalizacji oraz ekspresji ALKBH3, ALKBH5 i FTO na poziomie komórkowym przeprowadzono barwienia immunohistochemiczne. We wszystkich badanych skrawkach tkankowych nie zaobserwowano immunoreaktywności ALKBH3 (Fig. 11 A, B). Figura 11C-F pokazuje immunoreaktywność ALKBH5 w komórkach nienowotworowych i w guzach. Zarówno w komórkach prawidłowych, jak i w tkance nowotworowej stwierdzono lokalizację ALKBH5 w cytoplazmie i w jądrze komórkowym (Fig. 11C, D, E). Komórki nienowotworowe wykazywały słabą lub umiarkowaną intensywność barwienia przeciwciałem anty-ALKBH5 (Fig. 11C). Przeciwnie, większość skrawków tkanki nowotworowej wykazywała umiarkowaną lub silną immunoreaktywność białka ALKBH5 (Fig. 11D, E). Wśród analizowanych przypadków nowotworów, dwa przypadki wykazywały nieco wyższą ekspresję ALKBH5 w cytoplazmie w porównaniu do ekspresji w jądrze komórkowym (Fig. 11F). Immunoreaktywność FTO zaobserwowano w jądrze komórkowym (Fig. 11H). Większość tkanek prawidłowych oraz komórek nowotworowych wykazywała słabą intensywność barwienia z przeciwciałem anty-FTO (Fig. 11G, H).Immunohistochemical staining was performed to determine the localization and expression of ALKBH3, ALKBH5 and FTO at the cellular level. No ALKBH3 immunoreactivity was observed in all the tissue sections tested (Fig. 11 A, B). Figure 11C-F shows the immunoreactivity of ALKBH5 in non-cancer cells and tumors. Both in normal cells and in neoplastic tissue, ALKBH5 was found to be localized in the cytoplasm and in the nucleus (Fig. 11C, D, E). Non-tumor cells showed weak to moderate intensity of staining with the anti-ALKBH5 antibody (Fig. 11C). In contrast, most of the tumor tissue sections showed moderate or strong immunoreactivity with the ALKBH5 protein (Fig. 11D, E). Among the analyzed tumor cases, two cases showed slightly higher expression of ALKBH5 in the cytoplasm compared to expression in the cell nucleus (Fig. 11F). FTO immunoreactivity was observed in the cell nucleus (Fig. 11H). Most of the normal tissues and neoplastic cells showed a weak staining intensity with the anti-FTO antibody (Fig. 11G, H).
Przykład 5 Nowe Inhibitory ALKBH dla ALKBH nadeksprymowanych w komórkach nowotworowychExample 5 New ALKBH Inhibitors for ALKBH Overexpressed in Tumor Cells
Twórcy wynalazku wykazali, że pięć białek z rodziny ALKBH jest nadeksprymowanych w tkankach nowotworowych. W związku z tym sprawdzono czy małocząsteczkowe ligandy, które oddziałują z homologami AlkB będą wykazywać aktywność przeciwnowotworową lub przeciwdziałać wzrostowi nowotworu. Zaobserwowano, że naturalne antrachinony (reina, emodyna i aloe-emodyna) oraz ich nowosyntetyzowane pochodne (2-chloroemodyna, 4-chloroemodyna i 2,4-dichloroemodyna) (Fig. 13) wpływają na białka z rodziny ALKBH, w związku z czym są odpowiednimi kandydatami do zastosowania jako leki przeciwnowotworowe.The inventors have shown that five ALKBH family proteins are overexpressed in tumor tissues. Therefore, it was checked whether small-molecule ligands that interact with AlkB homologues would have anti-tumor activity or prevent tumor growth. It was observed that natural anthraquinones (rhein, emodine and aloe-emodin) and their newly synthesized derivatives (2-chloroemodine, 4-chloroemodine and 2,4-dichloroemodine) (Fig. 13) affect the ALKBH family proteins, therefore they are suitable candidates for use as anti-cancer drugs.
Twórcy wynalazku wykazali możliwości naturalnych (reiny, emodyny i aloe-emodyny) oraz zmodyfikowanych (2-chloroemodyna, 4-chloroemodyna i 2,4-dichloroemodyna) antrachinonów do wiązaniaThe inventors demonstrated the possibility of natural (rhein, emodin and aloe-emodine) and modified (2-chloroemodine, 4-chloroemodine and 2,4-dichloroemodine) anthraquinones to bind
PL 235 564 B1 homologów AlkB nadeksprymowanych w komórkach nowotworowych oraz ich cytotoksyczny efekt na trzy linie komórkowe. Na podstawie wyników stwierdzono, że naturalne antrachinony: reina, aloe-emodyna i emodyna wpływają na przeżywalność linii komórkowych. Jednak największy efekt na linie komórkowe wyprowadzone od komórek nowotworowych (U87, HeLa) wykazuje emodyna. Dlatego stała się podstawą do syntezy kolejnych inhibitorów (Fig. 14).AlkB homologs overexpressed in tumor cells and their cytotoxic effect on three cell lines. Based on the results, it was found that the natural anthraquinones: rhein, aloe-emodine and emodin affect the survival of cell lines. However, emodin has the greatest effect on cell lines derived from neoplastic cells (U87, HeLa). Therefore, it became the basis for the synthesis of further inhibitors (Fig. 14).
Twórcy wynalazku zmodyfikowali emodynę poprzez chlorowanie z wykorzystaniem N-chlorosukcynimidu (ang. N-chlorosuccimide (NCS)) (Fig. 13), co doprowadziło do powstania trzech produktów dwóch monochloroemodyn oraz jednej dichloroemodyny.The inventors modified emodin by chlorination using N-chlorosuccinimide (NCS) (Fig. 13), resulting in three products of two monochloroemodines and one dichloroemodine.
Procedura modyfikacji emodyny wyglądała następująco:The procedure for modifying emodyna was as follows:
114,0 mg emodyny (0.42 mmola, 1 eq.) rozpuszczono w 5 ml THF (tetrahydrofuran), na następnie do uzyskanego roztworu dodano 56,3 mg (0.42 mmola, 1 eq.) NCS (N-chlorosukcynimid). Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 18 godzin, w temperaturze pokojowej, a następnie dosypano 112.6 mg (0.84 mmola, 2 eq.) NCS i pozostawiono na kolejne 24 godziny. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej, a uzyskane produkty poddano oczyszczeniu i rozdziałowi za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Do elucji 2-chloroemodyny i 4-chloroemodyny użyto 2.5% metanolu w chloroformie, do elucji 2,4-dichloroemodyny użyto 20% metanolu w chloroformie. Otrzymano: 91.1 mg (0.30 mmola) mieszaniny 2-chloroemodyny i 4-chloroemodyny, 19.8 mg (0.07 mmola) czystej 2-chloroemodyny oraz 16.2 mg (0.05 mmola) 2,4-dichloroemodyny.114.0 mg of emodine (0.42 mmol, 1 eq.) Was dissolved in 5 ml of THF (tetrahydrofuran), then 56.3 mg (0.42 mmol, 1 eq) of NCS (N-chlorosuccinimide) was added to the resulting solution. The reaction mixture was left on the magnetic stirrer for 18 hours at room temperature, then 112.6 mg (0.84 mmol, 2 eq.) Of NCS was sprinkled on it and left for a further 24 hours. The solvent was evaporated under reduced pressure on a rotary evaporator, and the obtained products were purified and separated by silica gel column chromatography. 2.5% methanol in chloroform was used to elute 2-chloroemodine and 4-chloroemodine, and 20% methanol in chloroform was used to elute 2,4-dichloroemodine. Obtained: 91.1 mg (0.30 mmol) of a mixture of 2-chloroemodine and 4-chloroemodine, 19.8 mg (0.07 mmol) of pure 2-chloroemodine and 16.2 mg (0.05 mmol) of 2,4-dichloroemodine.
Zaobserwowano, że wprowadzenie atomu fluorowca, ściągającego elektrony z pierścienia antrachinonu znacząco podniosło kwasowość grup fenolowych. Chloroemodyna (2-chloroemodyna, 4-chloroemodyna) była bardziej polarna od emodyny. 2,4-dichloroemodyna wykazywała bardziej kwasowe właściwości niż emodyna i chloroemodyna. Efekt ten miał przełożenie na właściwości biologiczne. Mieszanina monochloroemodyn (2-chloroemodyny i 4-chloroemodyny) oraz 2,4-dichloroemodyna inhibowały reakcję enzymatyczną bakteryjnego białka AlkB oraz ludzkiego ALKBH3 w sposób podobny do reiny. Ta obserwacja wykazuje, że obecność kwasowej grupy w pochodnej antrachinonu jest kluczowa dla wiązania się do homologów AlkB, w związku z oddziaływaniem z resztami argininowymi w miejscu aktywnym białka. Emodyna i Aloe-emodyna miały niewielki wpływ na aktywność enzymatyczną badanych białek.It was observed that the introduction of a halogen atom that removed electrons from the anthraquinone ring significantly increased the acidity of the phenolic groups. Chloroemodine (2-chloroemodine, 4-chloroemodine) was more polar than emodine. 2,4-dichloroemodine showed more acidic properties than emodine and chloroemodine. This effect translated into biological properties. A mixture of monochloroemodine (2-chloroemodine and 4-chloroemodine) and 2,4-dichloroemodine inhibited the enzymatic reaction of the bacterial AlkB protein and human ALKBH3 in a manner similar to rhein. This observation demonstrates that the presence of an acidic group in the anthraquinone derivative is essential for binding to AlkB homologs due to its interaction with arginine residues at the protein active site. Emodine and Aloe-emodine had little effect on the enzymatic activity of the studied proteins.
5.1. Wpływ pochodnych antrachinonu na przeżywalność ludzkich linii komórkowych (HeLa, U87, HEK293)5.1. Effect of anthraquinone derivatives on the survival of human cell lines (HeLa, U87, HEK293)
Wykonano analizę w celu sprawdzenia wpływu pochodnych antrachinonu na wzrost komórek. Analizy prowadzono według następującej procedury:An analysis was performed to check the effect of anthraquinone derivatives on cell growth. The analyzes were carried out according to the following procedure:
a) Hodowla określonych linii komórkowycha) Cultivation of specific cell lines
- Hodowla linii komórkowej na medium DMEM (Life Technology) z dodatkiem 10% FBS (płodowa surowica bydlęca, ang. fetal bovine serum; Life Technology), 0,1% odpowiedniego antybiotyku (penicylina, streptomycyna: Life Technology)- Cultivation of the cell line on DMEM (Life Technology) medium with the addition of 10% FBS (fetal bovine serum; Life Technology), 0.1% of the appropriate antibiotic (penicillin, streptomycin: Life Technology)
- Wzrost komórek w nawilżonej atmosferze z mieszanką CO2/powietrza w stosunku 5%:95% (V:V) w temperaturze 37°C- Cell growth in a humidified atmosphere with a CO2 / air mixture of 5%: 95% (V: V) at 37 ° C
b) Oznaczanie cytotoksycznościb) Determination of cytotoxicity
- Wprowadzenie próbek z komórkami do 96-dołkowych mikropłytek w ilości 3*103 komórek/dołek;- Loading of samples with cells into 96-well microplates at 3 * 10 3 cells / well;
- Po 18 godzinach do komórek dodano pochodnej antrachinonu w odpowiednim stężeniu, rozpuszczonego w 10 mM TRIS i 10 mM NaOH;- After 18 hours, an appropriate concentration of anthraquinone derivative, dissolved in 10 mM TRIS and 10 mM NaOH, was added to the cells;
- Inkubacja komórek przez 24 godziny;- Incubation of cells for 24 hours;
- Dodanie odczynnika 10% Alamar Blue (Invotrogen) i inkubacja przez 4 godziny;- Addition of 10% Alamar Blue reagent (Invotrogen) and incubation for 4 hours;
- Pomiar emisji fali o długości 585 nm przy wzbudzeniu falą o długości 570 nm, z wykorzystaniem spektrofotometru DTX 880.- Measurement of emission at 585 nm with excitation at 570 nm, using the DTX 880 spectrophotometer.
Podsumowanie wpływu badanych związków na przeżywalność komórek przedstawiono na Fig. 14. Na podstawie porównania przeżywalności komórek z różnych linii stwierdzono wpływ powyższych związków na komórki nowotworowe. Linie komórkowe wyprowadzone z komórek nowotworowych (U87 oraz HeLa) inkubowane z mieszaniną monochloroemodyn oraz 2,4-dichloroemodyną wykazują niższą przeżywalność niż linia wyprowadzona od komórki zdrowej (HEK293) (Fig. 15-17).A summary of the effect of tested compounds on cell survival is shown in Fig. 14. Based on the comparison of the survival of cells from different lines, the effect of the above compounds on tumor cells was found. Cell lines derived from tumor cells (U87 and HeLa) incubated with a mixture of monochloroemodines and 2,4-dichloroemodine show lower survival than the line derived from healthy cells (HEK293) (Figs. 15-17).
PL 235 564 Β1PL 235 564 Β1
5.2. Wpływ pochodnych antrachinonu na aktywność enzymatyczną białek5.2. The influence of anthraquinone derivatives on the enzymatic activity of proteins
Mieszanina monochloroemodyn (2-chloroemodyna i 4-chloroemodyna) oraz 2,4-dichloroemodyna inhibowały reakcję enzymatyczną bakteryjnego białka AlkB oraz ludzkiego ALKBH3 w sposób podobny do reiny. Ta obserwacja wspiera założenie, że obecność kwasowej grupy w pochodnej antrachinonu jest kluczowa dla wiązania się do homologów AlkB, w związku z oddziaływaniem z resztami argininowymi w miejscu aktywnym białka. Emodyna i Aloe-emodyna miały niewielki wpływ na aktywność enzymatyczną badanych białek.A mixture of monochloroemodine (2-chloroemodine and 4-chloroemodine) and 2,4-dichloroemodine inhibited the enzymatic reaction of the bacterial AlkB protein and human ALKBH3 in a manner similar to rhein. This observation supports the assumption that the presence of an acidic group in the anthraquinone derivative is essential for binding to AlkB homologues due to its interaction with arginine residues at the protein active site. Emodine and Aloe-emodine had little effect on the enzymatic activity of the studied proteins.
Tabela 5 pokazuje wpływ poszczególnych inhibitorów na demetylację substratu białek AlkB oraz ALKBH3. Wartość podana w tabeli określa procent substratu rozłożonego w wyniku reakcji enzymatycznej przez dane białko.Table 5 shows the effect of individual inhibitors on the demethylation of the substrate for the AlkB and ALKBH3 proteins. The value given in the table represents the percentage of substrate degraded by the protein in question by the enzymatic reaction.
Dla poszczególnych związków i białek przeprowadzono następujące doświadczenie:The following experiment was performed for the individual compounds and proteins:
a) Reakcja demetylacjia) Demethylation reaction
- Do probówki dodawano poszczególnych reagentów w kolejności (objętość końcowa mieszaniny - 20 μΙ):- The individual reagents were added to the test tube in the following order (final volume of the mixture - 20 μΙ):
1. Woda destylowana (V = 10,2 μΙ)1. Distilled water (V = 10.2 μΙ)
2. Bufor - 0,4 M HEPES/NaOH pH 7,5, 4 mM DTT (V = 5 μΙ)2. Buffer - 0.4 M HEPES / NaOH pH 7.5, 4 mM DTT (V = 5 μΙ)
3. Kosubstrat - 500 μΜ α-ketogiutaran (V = 2 μΙ), Kofaktor - 2 mM Fe(ll) (V = 1 μΙ)3. Cosubstrate - 500 μΜ α-ketogiutarate (V = 2 μΙ), Co-factor - 2 mM Fe (ll) (V = 1 μΙ)
4. Inhibitor (V = 0,2 μΙ) - 35 mM reina, emodyna, aloe-emodyna, mieszanina monochloroemodyn lub 2,4-dichloroemodyna, odpowiednio4. Inhibitor (V = 0.2 μΙ) - 35 mM rhein, emodine, aloe-emodine, a mixture of monochloroemodines or 2,4-dichloroemodine, respectively
5. Substrat (V = 1,5 μΙ) - 6,67 nM pentameru TT(3-metyloC)TT5. Substrate (V = 1.5 μΙ) - 6.67 nM pentamer TT (3-methylC) TT
6. Enzym-7 nM ALKBH3 lub 2 nM AlkB (V= 0,2 μΙ)6. Enzyme-7 nM ALKBH3 or 2 nM AlkB (V = 0.2 μΙ)
- Uzyskano mieszaninę reakcyjną o następujących stężeniach: HEPES/NaOH (100 mM), DTT (1 mM), a-ketoglutaran (50 μΜ), Fe(ll) (100 μΜ), Inhibitor (350 μΜ), TT(3-metyloC)TT (500 μΜ), ALKBH3 (70 pM) AlkB (20 pM), reakcję prowadzono w 37°C przez 30 min.- The reaction mixture was obtained with the following concentrations: HEPES / NaOH (100 mM), DTT (1 mM), α-ketoglutarate (50 μΜ), Fe (II) (100 μΜ), Inhibitor (350 μΜ), TT (3-methylC ) TT (500 µM), ALKBH3 (70 pM) AlkB (20 pM), the reaction was carried out at 37 ° C for 30 min.
b) Rozdział reagentów za pomocą HPLC (kolumna analityczna Waters):b) Separation of the reagents by HPLC (Waters analytical column):
- Nałożenie na kolumnę 20 μΙ próbki;- Loading of the column with 20 μΙ of the sample;
- Przepływ kolumny 1 ml/min w gradiencie acetonitrylu (ACN) (0-100 mM);- Column flow 1 ml / min in acetonitrile (ACN) gradient (0-100 mM);
- Analiza eluowanych cząsteczek za pomocą spektrofotometru (długość fali 260 nm).- Analysis of the eluting molecules with a spectrophotometer (wavelength 260 nm).
Tabela 5. Wpływ poszczególnych inhibitorów na demetylację substratu białek AlkB oraz ALKBH3. Testem była zdolność badanych białek do usuwania grupy metylowej substratu-pentameru TT(3-metyloC)TT w obecności poszczególnych inhibitorów. Wydajność inhibicji określała procentowa wartość ilości substratu która została zdemetylowana w czasie trwania reakcji. Warunki reakcji: Bufor HERES: 100 mM, pH: 7,5, Fe(ll): 100 μΜ, α-ketoglutaran: 50 μΜ, temperatura: 37°C, czas trwania reakcji: 30 minTable 5. The effect of individual inhibitors on the demethylation of the substrate for AlkB and ALKBH3 proteins. The test was the ability of the studied proteins to remove the methyl group of the substrate pentamer TT (3-methylC) TT in the presence of individual inhibitors. The inhibition efficiency was the percentage of the amount of substrate that was demethylated over the course of the reaction. Reaction conditions: HERES buffer: 100 mM, pH: 7.5, Fe (II): 100 μΜ, α-ketoglutarate: 50 μΜ, temperature: 37 ° C, reaction time: 30 min
Powyższe wyniki wskazują na wpływ wybranych antrachinonów zarówno na poziomie komórkowym (przeżywalność) jak i molekularnym (inhibicja reakcji enzymatycznej). Dlatego też wykorzystanie pochodnych antrachinonów jako leków o właściwościach przeciwnowotworowych jest zasadne.The above results indicate the influence of selected anthraquinones both on the cellular (survival) and molecular level (inhibition of the enzymatic reaction). Therefore, the use of anthraquinone derivatives as drugs with anti-cancer properties is justified.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL419848A PL235564B1 (en) | 2016-12-18 | 2016-12-18 | Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL419848A PL235564B1 (en) | 2016-12-18 | 2016-12-18 | Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL419848A1 PL419848A1 (en) | 2018-07-02 |
| PL235564B1 true PL235564B1 (en) | 2020-09-07 |
Family
ID=62705143
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL419848A PL235564B1 (en) | 2016-12-18 | 2016-12-18 | Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL235564B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111233650B (en) * | 2020-02-03 | 2023-03-10 | 四川大学华西医院 | Antiviral anthraquinone derivative and application thereof |
-
2016
- 2016-12-18 PL PL419848A patent/PL235564B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL419848A1 (en) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zou et al. | Piperlongumine as a direct TrxR1 inhibitor with suppressive activity against gastric cancer | |
| Zhang et al. | RETRACTED ARTICLE: Natural product pectolinarigenin inhibits osteosarcoma growth and metastasis via SHP-1-mediated STAT3 signaling inhibition | |
| Novohradsky et al. | New insights into the molecular and epigenetic effects of antitumor Pt (IV)-valproic acid conjugates in human ovarian cancer cells | |
| US20220175977A1 (en) | Compounds and methods for the detection of trpv-6 cancers and drug delivery | |
| US9486545B2 (en) | Method of screening for colon cancer using biomarkers | |
| US10280178B2 (en) | Compound for inhibiting binding between DX2 protein and p14/ARF protein, and pharmaceutical composition for treating or preventing cancer disease containing same as effective ingredient | |
| Liu et al. | Targeting RAS-RAF pathway significantly improves antitumor activity of Rigosertib-derived platinum (IV) complexes and overcomes cisplatin resistance | |
| Wang et al. | The novel ER stress inducer Sec C triggers apoptosis by sulfating ER cysteine residues and degrading YAP via ER stress in pancreatic cancer cells | |
| Deng et al. | Dauricine inhibits proliferation and promotes death of melanoma cells via inhibition of Src/STAT3 signaling | |
| Zhang et al. | Dissection of targeting molecular mechanisms of aristolochic acid-induced nephrotoxicity via a combined deconvolution strategy of chemoproteomics and metabolomics | |
| Hou et al. | Norcantharidin inhibits renal interstitial fibrosis by downregulating PP2Ac expression | |
| Ma et al. | Identification of tumor specific peptide as EpCAM ligand and its potential diagnostic and therapeutic clinical application | |
| Zhang et al. | Pectolinarigenin acts as a potential anti-osteosarcoma agent via mediating SHP-1/JAK2/STAT3 signaling | |
| PL235564B1 (en) | Proteins from ALKBH group to be applied in the method of diagnosing tumour diseases, their application for identification of substances with antitumour properties, and derivatives of anthraquinone to be used as the anticancer drug in the tumour disease treatment and/or preventing method | |
| Dong et al. | Discovery of a potent inhibitor of chaperone‐mediated autophagy that targets the HSC70–LAMP2A interaction in non‐small cell lung cancer cells | |
| LT6874B (en) | Use of combination of valproic acid and dichloroacetate for the treatment of cancer | |
| Zhao et al. | Mediated imaging and improved targeting of farnesylthiosalicylic acid delivery for pancreatic cancer via conjugation with near-infrared fluorescence heptamethine carbocyanine dye | |
| Yuan et al. | Rational design of mitochondria-targeted fluorescent biosensors for in vivo elucidation of the interaction between breast cancer metastasis and mitochondrial autophagy | |
| Du et al. | Induction of apoptosis and cell cycle arrest by NS398 in oral squamous cell carcinoma cells via downregulation of E2 promoter-binding factor-1 | |
| Lu et al. | Thioredoxin-interacting protein-activated intracellular potassium deprivation mediates the anti-tumour effect of a novel histone acetylation inhibitor HL23, a fangchinoline derivative, in human hepatocellular carcinoma | |
| Hu et al. | Synthesis and biological activity of 1H-imidazo [4, 5-f][1, 10] phenanthroline as a potential antitumor agent with PI3K/AKT/mTOR signaling | |
| Huang et al. | miR-325-3p Reduces Proliferation and Promotes Apoptosis of Gastric Cancer Cells by Inhibiting Human Antigen R | |
| Bader | Targeting Cell Surface GRP78 for Specific Nanoparticle Mediated Drug Delivery to Breast Cancer | |
| Wang | The Development of Nanodiamond-Based Drug Delivery Complexes for Treatment and Diagnosis of Oncogene-Specific Hepatocellular Carainoma | |
| Zhang et al. | A novel L-shaped ortho-quinone analog as PLK1 inhibitor blocks prostate cancer cells in G2 phase |