PL235563B1 - Sposób biodegradacji zanieczyszczeń ropopochodnych z gleby wspomagany surfaktantami naturalnymi - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób usuwania z gleby zanieczyszczeń o charakterze substancji ropopochodnych.

Z polskiego patentu nr 209361 znany jest sposób fitoremediacji gleby z produktów ropopochodnych metodą „in situ” wspomaganej biopreparatem bakteryjnym. Jako preparat bakteryjny stosuje się autochtoniczne bakterie pobrane z próbek gruntu przeznaczonego do oczyszczania. Z próbek izoluje się bakterie dominujące, o największej zdolności do rozkładu węglowodorów, namnaża się je na podłożu i wprowadza do gruntu przeznaczonego do oczyszczania przez zraszanie. Po wprowadzeniu grunt obsiewa się rekultywowany teren roślinami.

Z patentu polskiego nr 207237 znany jest sposób mikrobiologicznego oczyszczania gruntów z węglowodorów, przeznaczony do remediacji gruntów metodą in situ i ex situ. Remediację prowadzi się w zamkniętym obiegu wodnym w sposób ciągły. Grunt nawilża się do poziomu 50% pojemności wodnej wodą lub odciekami zawierającymi autochtoniczne mikroorganizmy zdolne do rozkładu węglowodorów. Odcieki wprowadza się do bioreaktora i dodaje szczepionkę z namnażania organizmów autochtonicznych. Wyhodowany zaszczep wprowadza się do bioreaktora na początku procesu oczyszczania, a kolejne partie odcieków z remediowanego gruntu są głównym źródłem węgla organicznego, stanowiącego substrat pokarmowy dla kolejnych partii zawiesiny bakteryjnej zawracanej do remediacji gruntu. W procesie namnażania mikroorganizmów zapewnia im się odpowiednią dawkę pożywki w postaci związków azotu i fosforu. Proces namnażania prowadzi się w bioreaktorze w warunkach tlenowych.

W polskim patencie nr 205003 ujawniono sposób oczyszczania gleby gdzie w pierwszym etapie glebę natlenia się mechanicznie i wykonuje się rów odprowadzający odciek zawierający zanieczyszczenia ropopochodne. Gdy w odcieku nie będzie się już pojawiały zanieczyszczenia ropopochodne glebę natlenia się mechanicznie i dodaje nawozów tak by stosunek azotu do fosforu wynosił 10:1 po czym proces bioremediacji prowadzi się od 1 do 2 lat do zahamowania procesów rozkładu. Następnie do tak oczyszczonej gleby dodaje się biopreparat sporządzony z wcześniej wyizolowanych i namnożonych autochtonicznych mikroorganizmów. Glebę natlenia się mechanicznie i zrasza wodą oraz prowadzi proces bioaugmentacji od 3 miesięcy do 1 roku.

Biodegradację węglowodorów można przyspieszyć poprzez wprowadzenie do układu związków powierzchniowo czynnych, które mogą znacznie zwiększyć biodostępność hydrofobowych źródeł węgla dla mikroorganizmów. Substancje powierzchniowo czynne powodują emulgowanie zanieczyszczeń organicznych. Do tego celu stosowane są surfaktanty syntetyczne oraz ich biologiczne odpowiedniki, które są produkowane przez szereg bakterii. W swoich badaniach A. Franzetti, P. Di Gennaro, G. Bestetti, M. Lasagni, D. Pitea, E. Collina (Selection of surfactants for enhancing diesel hydrocarbons-contaminated media bioremediation, Journal of Hazardous Materials, 2008, 15, 1309-1316) pokazali, że dodanie związków powierzchniowo czynnych może przyczyniać się do wzrostu biodegradacji ropopochodnych przez pobudzenie rodzimych mikroorganizmów do degradacji węglowodorów. Naturalne związki powierzchniowo czynne poza tym, że same nie powodują zanieczyszczenia środowiska to jeszcze zwiększają rozpuszczalność węglowodorów polepszając ich biodostępność dla mikroorganizmów. W wielu innych doniesieniach literaturowych można znaleźć informacje o pozytywnym wpływie biosurfaktantów na szybkość biodegradacji węglowodorów: A. Abalos, M. Vinas, J. Sabate, M.A. Manresa, A. M. Solanas, Enhanced biodegradation of Casablanca crude oil by a microbial consortium in presence of a rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa AT10, Biodegradation, 2004, 15, 4, 249-260; Xiao-Xia Lu, Xu Zhang, Guang-He Li, and Wei-Hua Zhang, Production of biosurfactant and its role in the biodegradation of oil hydrocarbons, Journal of Environmental Science and Health PART A-Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 2003, 38, 3, 483-492.

Wprowadzanie związków powierzchniowo czynnych może mieć czasami ujemny wpływ poprzez nadmierne zwiększenie mobilności zanieczyszczenia na danym obszarze. Nadmierna ilość surfaktantu może spowodować wymywanie związków ropopochodnych z miejsca zanieczyszczonego i jego przedostawanie się do innych środowisk. Stąd niezmiernie ważne jest silne pobudzenie flory bakteryjnej do wzrostu poprzez połączenie związków powierzchniowo czynnych oraz innych substancji silnie stymulujących wzrost mikroorganizmów. Zjawisko to opisali M. Nikolopoulou, N. Kalogerakis, Enhanced bioremediation of crude oil utilizing lipophilic fertilizers combined with biosurfactants and molasses, Marine Pollution Bulletin, 2008, 56, 11, 1855-1861.

PL 235 563 B1

Z polskich opisów wynalazków 212221,212222 i 212223 znane są także sposoby usuwania zanieczyszczeń substancjami ropopochodnymi z gleby poprzez pobudzenie do biodegradacji zanieczyszczeń autochtonicznych mikroorganizmów, występujących w zanieczyszczonej glebie, w wyniku działania ekstraktów z soi, lucerny lub ekstraktu z mydlnicy lekarskiej.

Nieoczekiwanie okazało się, że ekstrakt z buraka cukrowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa) zawierający saponiny, znacznie przyspiesza wzrost biologicznego rozkładu oleju napędowego względem układu bez dodatku tego ekstraktu.

Istotą wynalazku jest sposób usuwania zanieczyszczeń substancjami ropopochodnymi, który polega na tym, że do zanieczyszczonego układu wprowadza się ekstrakt z buraka cukrowego zawierający saponiny triterpenoidowe w ilości nie mniejszej niż 2,5 ml ekstraktu na kg gleby zanieczyszczonej węglowodorami. Korzystnie, ekstrakt wprowadza się do gleby w postaci wodnego roztworu o stężeniu od 1 do 10%, korzystnie 5%. Ekstrakt z buraka, poprzez zawartość saponin, znaczne obniża napięcie powierzchniowe przez co hydrofobowe substancje organiczne ulegają emulgacji i są bardziej dostępne dla mikroorganizmów degradujących.

Ekstrakt uzyskuje się poprzez zalanie rozdrobnionego materiału roślinnego wodą o odczynie lekko alkalicznym w proporcjach 2:1 i gotowanie przez 1 h. Po schłodzeniu uzyskany wywar oddziela się od pozostałości materiału roślinnego poprzez wirowanie (1500 x g). W oparciu o metodę HPLC-MS stwierdzono zawartość saponin w ekstrakcie z buraka na poziomie 10 mg/ml. Zidentyfikowano 9 saponin triterpenoidowych zwanych betavulgarozydami I-X.

Korzystne jest, gdy do zanieczyszczonego układu wprowadza się szczepionkę bakteryjną w ilości co najmniej 105 komórek na 1 g suchej masy gruntu. Szczepionkę może stanowić wyspecjalizowane w degradacji węglowodorów, glebowe konsorcjum bakteryjne złożone np. ze szczepów: Achromobacter sp. i/albo Alcaligenes sp. i/albo Citrobacter sp. i/albo Comamonadaceae sp. i/albo Pseudomonas sp. i/albo Sphingobacterium sp. i/albo Bacillus sp. Mikroorganizmy przyczyniają się do realizacji skutecznego i wydajnego procesu usuwania zanieczyszczeń. W praktyce można wykorzystywać wyizolowane i namnożone mikroorganizmy autochtoniczne z zanieczyszczonego gruntu lub w przypadku ich braku do układu wprowadza się bakterie o znanej aktywności biodegradacyjnej.

Opis doświadczenia przedstawiającego istotę wynalazku.

Biodegradację prowadzono w dwóch układach bez i z dodatkiem wodnego roztworu ekstraktu z buraka cukrowego. Biodegradację prowadzono z zastosowaniem konsorcjum mikroorganizmów o zdefiniowanych właściwościach biodegradacyjnych w stosunku do węglowodorów, zawierające bakterie z rodzaju: Achromobacter sp., Alcaligenes sp., Citrobacter sp., Comamonadaceae, Sphingobacterium sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp. Identyfikację konsorcjum bakteryjnego przeprowadzono w oparciu analizę o regionu IV bakteryjnego 16S RNA. Po zamplifikowaniu, produkty PCR oczyszczano a następnie w reakcji reamplifikacji konstruowano biblioteki z wykorzystaniem starterów fuzyjnych dla systemu Illumina. Sekwencjonowanie przeprowadzono z wykorzystaniem sekwenatora Illumina MiSeq (Illumina, USA) używając sparowanych końców (2x250) MiSeq Reagent Kits v2 (Illumina, USA). Dane z sekwencjonowania zostały przetworzone z wykorzystaniem CLC Genomic Workbench 8.5 i CLC Microbial Genomics Module 1.2. (Qiagen, USA). Odczyty porównano z bazą danych SILVA v119. Charakterystyczne sekwencje dla mikroorganizmów konsorcjum przedstawiono w tab. 1.

PL 235 563 Β1

Tab. 1

Identyfikowany mikroorganizm	Sekwencja nukleotydowa
Sphingobacteriu m sp.	GTGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGAACCGTCCAAACGTTATTCGGTATCAC TGGGCTTAAAGCGTGCGTAGGCGGCCTGGAAGGTGAGATGTGAAAGCCCAC GGCTCAACCGTGGAATTGCGTTTCAAACCGCCAGGCTTGAGGAAGACAGGG GTGTAGGGAACTTATGGTGGAGCGGTGAAATGCGTTGATATCATAGGGAACA CCGGTGGCGAAGGCGCAACACTGGGTCTTTTCTGACGCTGAGGCACGAAAGC TAGGGTAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAG
Bacillus sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAATTACTG GGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCGGGC TCAACCrGGGAATTGCATTGGATACTGGCGGGCTAGAGTACGGTAGAGGGTG GCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCC GTGGCGAAGGCGGCCACCTGGACCAGTACTGACACTGAGGCACGAAAGCGT GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC
Achromobacter sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTGTTCGGAATTATTG GGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGCICITI .AAGlClCTrGGTGAAAGGCCGGGG CTCAACCCTGAGCATGCCGGGGATACTGGGGAGCTGGAGACAGGCAGAGGC CAGCGGAATTCCGGGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGAGATCCGGAAGAACAC CGGAGGCGAAGGCGGCTGGCTGGGCCTGATCTGACGCTGAGGTGCGAAAGC GTGGGGAGCGAACAAGATTAGATACCCTGGTAGT
Alcaligenes sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGATTTACTG GGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGGCTGGTCAGTCCGGGGTGAAATCTCACGG CTCAACCGTGAGCGGTCCCCGGATACTGCCAGTCTTGAGGTGTCTAGAGGAG AGCGGAATTCCCGGTGTAGTGGTGGAATGCGTAGATATCGGGAAGAACACC AGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGGGACCACCTGACGCTGAGGCGCGAAAGCG TGGGGAGCGAACCGGATTAGATACCCGGGTAGTC
Citrobactcr sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAAlACAGAGAGTGCGAGCGTrAATCGGAATJ'ACTG GGCGTAAAGCGCACGTAGGTGGATATTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCCGGG CTTAACCTGGGAATTGCATTTGATACTGGATGTCTTGAATATAGTAGAGGGA GGTGGAATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCGGAAGGAACATCA GTGGCGAAAGCGGCCTCCTGGACTAATATTGACACTTAGGTGCGAAAGCGTG GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC
Comamonadacea e sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAACTGTGCAAACGTTATTCGGAATCACTG GGCTTAAAGGGTGCGTAGGCGGCTGTCTAAGCAGGGTGTGAAAGCCCCCGG CTCAACCGGGGAATTGCGTTCTGAACTGGACGGCTGGAGTGGGATAGAGGTG TGCGGAAGrrCCGGTGGAGCGGlGAAATGTGTlGATATCGGAAGGAACGCCG GTGGCGAAAGCGGCACACTGGGTCTCAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCCA GGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTC
Pseudomonas sp.	GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTG GGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTCGTAAGACAGACGTGAAATCCCCGGG CTCAACCTGGGAACTGCGTTTGTGACTGCGAGGCTAGAGTTTGGCAGAGGGG GGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACC GATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCG TGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC

Procesowi biodegradacji poddawany był olej napędowy. Glebę skażano do 2% olejem napędowym po czym zraszano medium zawierającym związki azotu i fosforu oraz mikroelementy w stosunku N:P 10:1. Następnie glebę zraszano 50 ml/kg wodnego roztworu (5%) ekstraktu z buraka cukrowego oraz wprowadzano do układu zawiesinę mikroorganizmów w ilości co najmniej 10⁵ komórek na 1 g suchej masy gleby. Całość pozostawiono na 90 dni. Po tym czasie sprawdzono stopień biodegradacji oleju napędowego w układzie bez dodatku ekstraktu z buraka cukrowego w stosunku do układu z ekstraktem. Stopień degradacji oleju napędowego analizowano metodą wagową poprzez ekstrakcje eterem dietylowym. Uzyskano 63% wzrost stopnia biodegradacji oleju w układach z ekstraktem z buraka cukrowego.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób usuwania ze środowiska zanieczyszczeń substancjami ropopochodnymi z użyciem substancji powierzchniowo czynnych, znamienny tym, że do zanieczyszczonego układu wprowadza ekstrakt z buraka cukrowego zawierający saponiny triterpenoidowe, przy czym ekstrakt wprowadza się w ilości nie mniejszej niż 2,5 ml ekstraktu/kg gleby zanieczyszczonej węglowodorami.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekstrakt wprowadza się do gleby w postaci wodnego roztworu o stężeniu od 1 do 10%, korzystnie 5%.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że do układu wprowadza się bakteryjne konsorcjum glebowe zawierające bakterie Achromobacter sp. i/albo Alcaligenes sp. i/albo Citrobacter sp. i/albo Comamonadaceae sp. i/albo Pseudomonas sp. i/albo Sphingobacterium sp. i/albo Bacillus sp. w ilości co najmniej 105 komórek na 1 g suchej masy skażonego gruntu.