PL234915B1 - Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 - Google Patents
Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 Download PDFInfo
- Publication number
- PL234915B1 PL234915B1 PL414469A PL41446915A PL234915B1 PL 234915 B1 PL234915 B1 PL 234915B1 PL 414469 A PL414469 A PL 414469A PL 41446915 A PL41446915 A PL 41446915A PL 234915 B1 PL234915 B1 PL 234915B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- grhl2
- grhl3
- cancer
- kidney cancer
- grhl1
- Prior art date
Links
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 102100034227 Grainyhead-like protein 2 homolog Human genes 0.000 title abstract description 5
- 101001069929 Homo sapiens Grainyhead-like protein 2 homolog Proteins 0.000 title abstract description 5
- 102100034228 Grainyhead-like protein 1 homolog Human genes 0.000 title abstract 2
- 101001069933 Homo sapiens Grainyhead-like protein 1 homolog Proteins 0.000 title abstract 2
- 101001069926 Homo sapiens Grainyhead-like protein 3 homolog Proteins 0.000 title abstract 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 9
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 208000030808 Clear cell renal carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 6
- 101100449524 Homo sapiens GRHL2 gene Proteins 0.000 description 6
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 6
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 206010073251 clear cell renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 3
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101150046474 Vhl gene Proteins 0.000 description 3
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 3
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000038030 PI3Ks Human genes 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 description 2
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 description 2
- 102100023085 Serine/threonine-protein kinase mTOR Human genes 0.000 description 2
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- 201000002919 Van der Woude syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000014646 age-related hearing impairment Diseases 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000031068 ectodermal dysplasia syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 2
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 2
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000011330 nonpapillary renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 1
- 102000038594 Cdh1/Fizzy-related Human genes 0.000 description 1
- 102100038423 Claudin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038447 Claudin-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010009260 Cleft lip and palate Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 108010025454 Cyclin-Dependent Kinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100026805 Cyclin-dependent-like kinase 5 Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102100034157 DNA mismatch repair protein Msh2 Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102100036945 Dead end protein homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100034579 Desmoglein-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 1
- 101000876610 Dictyostelium discoideum Extracellular signal-regulated kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100027909 Folliculin Human genes 0.000 description 1
- -1 GSK-33 Proteins 0.000 description 1
- 101000882908 Homo sapiens Claudin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000882890 Homo sapiens Claudin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001134036 Homo sapiens DNA mismatch repair protein Msh2 Proteins 0.000 description 1
- 101000924316 Homo sapiens Desmoglein-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001060703 Homo sapiens Folliculin Proteins 0.000 description 1
- 101001052493 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001130298 Homo sapiens Ras-related protein Rab-25 Proteins 0.000 description 1
- 101000874160 Homo sapiens Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000934888 Homo sapiens Succinate dehydrogenase cytochrome b560 subunit, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 208000000913 Kidney Calculi Diseases 0.000 description 1
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910015837 MSH2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000035346 Margins of Excision Diseases 0.000 description 1
- 102100024193 Mitogen-activated protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101100449528 Mus musculus Grhl3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000008636 Neoplastic Processes Diseases 0.000 description 1
- 206010029148 Nephrolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 108010077960 Neurocalcin Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101150073900 PTEN gene Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100031528 Ras-related protein Rab-25 Human genes 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100035726 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100025393 Succinate dehydrogenase cytochrome b560 subunit, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N Trichloroethylene Chemical compound ClC=C(Cl)Cl XSTXAVWGXDQKEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 238000000876 binomial test Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000016653 cleft lip/palate Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 208000002169 ectodermal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 101150089658 get1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150025003 grhl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006750 hematuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012335 pathological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960002415 trichloroethylene Drugs 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000006542 von Hippel-Lindau disease Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Zgłoszenie dotyczy metod identyfikacji polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism - SNP) w genach GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 oraz wykorzystania tych polimorfizmów jako markerów do określenia zwiększonej podatności pacjentów na zachorowanie na raka nerki.
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy diagnostyki chorób nowotworowych, a w szczególności - wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi. Dokładniej, niniejszy wynalazek dotyczy metod identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki w oparciu o polimorfizmy pojedynczych nukleotydów występujące w genach Grainyhead-like 1 (GRHL1), Grainyhead-Iike 2 (GRHL2) i Grainyhead-like 3 (GRHL3). Niniejszy wynalazek może znaleźć zastosowanie w prognostycznych badaniach genetycznych, mających na celu wskazanie pacjentów ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki oraz w diagnostyce medycznej.
Rak jest chorobą, na którą każdego roku umiera ponad 8 milionów ludzi (dane Światowej Organizacji Zdrowia). Według American Cancer Society, rak nerki jest jednym z 10 najczęściej występujących rodzajów raka. Ryzyko zachorowania na raka nerki ocenia się na 1/63, czyli 1,6% ludzi (16 osób na 1000) w ciągu swojego życia zachoruje na raka nerki. Najczęściej występującą odmianą raka nerki jest rak jasnokomórkowy (ang. clear cell renal cell carcinoma - ccRCC). Stanowi on około 70% przypadków raka nerki.
W leczeniu raka jasnokomórkowego nerki dotychczas stosowana chemio- i radioterapia okazuje się nieskuteczna, a zaaprobowane związki o działaniu immunoterapeutycznym często wykazują szereg efektów ubocznych. Jeśli po chirurgicznym usunięciu zmiany nowotworowej następuje nawrót choroby, rokowania pacjentów nie są pomyślne. Gdy dochodzi do rozprzestrzenienia się nowotworu do węzłów chłonnych, szanse 5-letniego przeżycia chorych wynoszą od 5 do 15%. Jeżeli przerzuty dotyczą innych narządów, szanse przeżycia są mniejsze niż 5%. Pełną remisję udaje się uzyskać tylko w 12-20% przypadków (źródło: News-Medical.net). Istnieje zatem ogromna potrzeba poszukiwania nowych metod zwalczania tego typu nowotworu. Jak dotąd zidentyfikowano wiele potencjalnych markerów molekularnych raka RCC, żaden jednak nie został jak dotąd zwalidowany i wdrożony do praktyki klinicznej (Audenet et al, 2012).
Należy podkreślić, że rak nerki we wczesnych stadiach rozwoju może nie wywoływać żadnych objawów, dlatego wczesna diagnoza raka nerki jest bardzo trudna. W późniejszych etapach jego objawy są podobne do objawów innych chorób, takich jak kamienie nerkowe lub infekcje dróg moczowych. Te objawy to między innymi:
• zmęczenie • utrata apetytu • utrata wagi nie spowodowana odchudzaniem • podwyższona temperatura ciała nie spowodowana infekcją • anemia • obecność krwi w moczu (krwiomocz) • ból w dolnej części pleców nie spowodowany urazem • wyczuwalny guz w dolnej części pleców lub w boku
Świadomość zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki będzie bardzo pomocna we wczesnym diagnozowaniu tej choroby i może się przyczynić do ratowania życia wielu chorych. Identyfikacja polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism - SNP) w regulatorowych sekwencjach genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 może być użyteczna do określenia podwyższonego ryzyka rozwoju raka nerki.
Czynniki ryzyka zachorowania na raka nerki to między innymi:
• palenie papierosów • otyłość • narażenia w miejscu pracy na kontakt z niektórymi substancjami (kadm, niektóre herbicydy i rozpuszczalniki organiczne, takie jak trichloroeten) • czynniki genetyczne
Występowanie u danej osoby nietypowych wariantów genów, odpowiedzialnych za prawidłowe funkcjonowanie nerek, może przyczynić się do zwiększenia ryzyka rozwoju raka nerki. Przykładem tego jest gen VHL. Mutacje w tym genie wywołują chorobę von Hippla-Lindaua, zwaną też naczyniakowatością siatkówkowo-móżdżkową. Gen VHL jest supresorem nowotworów, który kontroluje tempo rozmnażania się komórek. Mutacje w tym genie mogą być dziedziczone od rodziców. Gdy gen VHL jest zmutowany, nie jest on już w stanie tłumić nieprawidłowego wzrostu komórek, co zwiększa ryzyko zachorowania na nowotwory nerki. Z ryzykiem zachorowania na raka nerki są także związane mutacje w innych genach, takich jak MET, FH, FLCN, SDHB i SDHC (Clague et al, 2009). Te mutacje charak
PL 234 915 B1 teryzują się wysokim stopniem penetracji co oznacza, że spośród osób z tymi mutacjami wysoki odsetek zapada na raka. Jednakże takie mutacje są rzadkie, więc prawdopodobnie większość przypadków raka nerki nie jest z nimi związana. Inne mutacje o niższej penetracji mogą występować z większą częstością w populacji ludzkiej i to one mogą być odpowiedzialne za większość przypadków raka nerki (Hemminki & Li, 2004). Do tej kategorii mogą należeć mutacje w genach GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
Czynniki transkrypcyjne z rodziny GRHL (Grainyhead-like) uczestniczą w wielu procesach biologicznych, takich jak:
• rozwój i funkcjonowanie naskórka;
• rozwój i funkcjonowanie różnych nabłonków;
• rozwój ośrodkowego układu nerwowego;
• rozwój ektodermy;
• pozytywna regulacja transkrypcji przez polimerazę RNA typu II.
Zmiany w poziomie ekspresji genów z rodziny GRHL są związane z rozwojem wielu nowotworów u ludzi, takich jak rak piersi (Werner et al, 2013), skóry (Darido et al, 2011), wątroby (Tanaka et al, 2008), żołądka (Xiang et al, 2013), jelita grubego (Quan et al, 2014) oraz w nerwiaku płodowym (Fabian et al, 2014). W większości przypadków rozwojowi nowotworu towarzyszy spadek ekspresji genów GRHL. Badania przy użyciu kultur tkankowych pokazały, że w wielu nowotworowych liniach komórkowych poziom ekspresji genów GRHL jest niższy niż w nienowotworowych liniach komórkowych otrzymanych z analogicznych tkanek. Wyciszenie ekspresji genów GRHL w nienowotworowych liniach komórkowych prowadzi często do nabierania przez komórki cech nowotworowych, zaś zwiększenie ekspresji genów GRHL w nowotworowych liniach komórkowych powoduje utratę przez komórki cech nowotworowych. Pokazały to badania dotyczące roli genu GRHL1 w nerwiaku płodowym (Fabian et al, 2014), genu GRHL2 w raku żołądka (Xiang et al, 2013) oraz genu GRHL2 w raku jelita grubego (Quan et al, 2014). Ponadto za pomocą modeli zwierzęcych wykazano, że geny z rodziny GRHL pełnią funkcje ochronne przed zachorowaniem na choroby nowotworowe. W modelach mysich wyciszenie ekspresji genów Grhll i Grhl3 zwiększa ryzyko zachorowania na raka skóry (Darido et al, 2011; Mlacki et al, 2014). Uzasadniona jest zatem hipoteza, że ludzie z obniżonym poziomem ekspresji genów z rodziny GRHL mogą mieć zwiększone ryzyko zachorowania na choroby nowotworowe.
W przypadku raka jasnokomórkowego nerki poniżej przedstawione przykłady wskazują na związek genów GRHL1, GRHL2 i GRHL3 z powstawaniem i rozwojem tego typu nowotworów u ludzi.
Publikacja Peyrard-Janvid i wsp. „Dominant Mutations in GRHL3 Cause Van der Woude Syndrome and Disrupt Oral Periderm Development” The American Journal of Human Genetics 2014; 94(1):23-32, dotyczy mutacji w genie GRHL3 u pacjentów z zespołem Van der Woude (rozszczep wargi i podniebienia) i nie odnosi się do raka nerki.
Publikacja Petrof i wsp. „Mutations in GRHL2 Result in an Autosomal-Recessive Ectodermal Dysplasia Syndrome” AJGH 2014; 95(3):308-314 dotyczy mutacji w genie GRHL2 u pacjentów z dysplazją ektodermalną i nie odnosi się do raka nerki.
Publikacja Lin i wsp. „The grainyhead-like 2 gene (GRHL2) single nucleotide polymorphism is not associated with age-related hearing impairment in Han Chinese” The Laryngoscope 2011; 121 (6):1303-1307 odnosi się do SNP w genie GRHL2 w kontekście utraty słuchu i nie odnosi się do raka nerki.
Publikacja Van Laer i wsp. „The grainyhead like 2 gene (GRHL2), alias TFCP2L3, is associated with age-related hearing impairment” Human Molecular Genetics 2008; 17(2):159-169, dotyczy SNP w genie GRHL2, ale wyłącznie w odniesieniu do głuchoty i nie odnosi się do raka.
Publikacja Peters i wsp. „Mutation of a transcription factor, TFCP2L3, causes progressive autosomal dominant hearing loss, DFNA28” Human Molecular Genetics 2002; 11 (23):2877-2885 dotyczy SNP w genie GRHL2, ale wyłącznie w odniesieniu do głuchoty i nie odnosi się do raka.
Publikacja Kamiyama i wsp. „Polymorphisms in the 3'UTR in the neurocalcin δ gene affect mRNA stability, and confer susceptibility to diabetic nephropathy”
Human Genetics 2007; 122(3-4):397-407 dotyczy SNP, ale tylko w odniesieniu do cukrzycy i nie odnosi się do raka.
Publikacja Bhandari i wsp. „The Grainyhead transcription factor Grhl3/Get1 suppresses miR-21 expression and tumorigenesis in skin: modulation of the miR-21 target MSH2 by RNA-binding protein DND1” Oncogene 32:1497-1507 dotyczy funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale bez odniesienia do SNP.
PL 234 915 B1
Publikacja Darido i wsp. „Targeting of the Tumor Suppressor GRHL3 by a miR-21-Dependent Proto-Oncogenic Network Results in PTEN Loss and Tumorigenesis” Cancer Cell 2011; 20(5):635-648 odnosi się do funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale bez odniesienia do SNP.
Publikacja Panis i wsp. „Putative circulating markers of the early and advanced stages of breast cancer identified by high-resolution label-free proteomics” Cancer Letters 2013 330(1 ):57-66 wspomina o GRHL3 w nowotworach, ale odnosi się wyłącznie do raka piersi i nie wspomina o SNP.
Międzynarodowy wniosek patentowy WO2013029116A1 dotyczy między innymi funkcjonalnej roli GRHL3 w raku skóry, ale nie odnosi się do SNP ani do raka nerki.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu i narzędzi nadających się do wykorzystania w prewencyjnej diagnostyce dotyczącej chorób nowotworowych, a w szczególności - wykrywaniu zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi. Szczególnym celem wynalazku jest umożliwienie identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki w oparciu o polimorfizmy pojedynczych nukleotydów. Nieoczekiwanie powyższy cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) badanie próbki biologicznej pobranej od pacjenta w celu określenia struktury co najmniej jednego genu wybranego spośród: GRHL1, GRHL2 oraz GRHL3, obejmujące ustalanie obecności polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP), metody identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki w oparciu o polimorfizmy pojedynczych nukleotydów występujące w genach GRHL1, GRHL2 i GRHL3. Metody wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki charakteryzują się tym, że zawierają:
A) stwierdzenie zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi w przypadku identyfikacji co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) w obszarze regulatorowym genu GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3, występującego homozygotycznie lub heterozygotycznie w pozycji wymienionej w Tabeli 1 lub w Tabeli 2 lub w Tabeli 3.
PL 234 915 Β1
Tabela 1
Wykaz SNPów w sekwencjach promotorowych i regulatorowych genów GRHL u pacjentów z rakiem jasnokomórkowym nerki
| chromosom | gen | pozycja | rs | liczba pacjenta w | liczba alleli | częstość w populacji EUR(1000 Genomes DB) | £zę>fctśćw populacji badanej | kienmek imianf częstości | wartość P |
| 1 | GRHL3 | 24634151 | rs4648973 | 16 | 18 | 0,17 | 0,310 | + | 0,00790 |
| 1 | GRHL3 | 24636200 | ra1O99285 | 18 | 23 | 0,53 | 0,397 | - | 0,0481 |
| 1 | GRHL3 | 24641130 | ra2763209 | 13 | 21 | 0,001 | 0,362 | 3,23x1043 | |
| 1 | GRHL3 | 24641134 | 8 | 12 | 0,001 | 0,207 | 8,55x10’27 | ||
| 1 | GRHL3 | 24641157 | rs368879958 | 3 | 3 | 0,001 | 0,0517 | 4- | 2,96x105 |
| 1 | GRHL3 | 24641169 | rs150363797 | 8 | 13 | 0,001 | 0,224 | + | 3,03x10’27 |
| 1 | GRHL3 | 24645854 | rs115551059 | 3 | 3 | 0,01 | 0,0517 | 4- | 0,0205 |
| 1 | GRHL3 | 24663822 | rs151171718 | 2 | 2 | 0,0013 | 0,0345 | * | 0,00266 |
| 1 | GRHL3 | 24669794 | rs3887581 | 8 | 9 | 0,3 | 0,155 | - | 0,0146 |
| 1 | GRHL3 | 24671482 | rs28722749 | 4 | 4 | 0,001 | 0,0690 | + | 4,06x107 |
| 1 | GRHL3 | 24671485 | rs28565954 | 2 | 3 | 0,001 | 0,0517 | 4* | 2,96x105 |
| 1 | GRHL3 | 24680665 | rs12029270 | 8 | 9 | 0,3 | 0,155 | - | 0,0146 |
| 2 | GRHŁ1 | 10085067 | 17 | 22 | 0,001 | 0,379 | 4- | 5.43Χ10-51 | |
| 2 | GRHL1 | 10085217 | 6 | 6 | 0,001 | 0,103 | 4- | 3,87x10'11 | |
| 2 | GRHL1 | 10086732 | 5 | 5 | 0,001 | 0,0862 | 4- | 4,38χΐσ® | |
| 2 | GRHL1 | 10087414 | r$72784421 | 5 | 5 | 0,03 | 0,0862 | 4- | 0,0299 |
| 2 | GRHL1 | 10091422 | rs115898376 | 1 | 1 | 0,23 | 0,0172 | - | 6,64x10® |
| 2 | GRHL1 | 10091465 | rs533381656 | 3 | 5 | 0,001 | 0,0862 | + | 4,38x10® |
| 2 | GRHL1 | 10091472 | rs4630741 | 24 | 41 | 0,52 | 0,707 | 4- | 0,00534 |
| 2 | GRHL1 | 10101945 | rs4669512 | 23 | 45 | 0,91 | 0,776 | - | 0,00166 |
| 2 | GRHL1 | 10126416 | rs16867274 | 24 | 34 | 0,42 | 0,586 | 0,0114 | |
| 2 | GRHL1 | 10131078 | rs1430621 | 5 | 5 | 0,23 | 0,0862 | 0,00734 | |
| 2 | GRHŁ1 | 10131094 | r$ 1367388 | 4 | 4 | 0,23 | 0,0690 | - | 0,00254 |
| 2 | GRHL1 | 10131122 | rs 1367389 | 5 | 5 | 0,23 | 0,0862 | 0,00734 | |
| 2 | GRHL1 | 10138927 | rs142706233 | 1 | 2 | 0,55 | 0,0345 | 1.96x10-17 | |
| 2 | GRHL1 | 10139017 | rs2O1584869 | 3 | 6 | 0,001 | 0,103 | 3,87x1011 | |
| 8 | GRHL2 | 102494964 | rs541189 | 29 | 48 | 0,65 | 0,828 | 4» | 0,00365 |
| 8 | GRHŁ2 | 102495233 | rs518898 | 29 | 50 | 0,73 | 0,862 | 0,0255 | |
| 8 | GRHL2 | 102495862 | rs492289 | 29 | 50 | 0,73 | 0,862 | + | 0.0255 |
| 8 | GRHL2 | 102495873 | rs137856798 | 3 | 3 | 0,01 | 0,0517 | + | 0,0205 |
| 8 | GRHL2 | 102497612 | 2 | 2 | 0,001 | 0,0345 | 4* | 0,00159 | |
| 8 | GRHL2 | 102498493 | rs60538573 | 3 | 3 | 0,001 | 0,0517 | 2,96x10-® | |
| 8 | GRHL2 | 102499855 | rs665572 | 10 | 11 | 0,33 | 0,190 | - | 0,0248 |
| 8 | GRHL2 | 102501160 | rs525132 | 8 | 8 | 0,29 | 0,138 | 0,00891 | |
| 8 | GRHL2 | 102501729 | rs74764975 | 4 | 4 | 0,01 | 0,0690 | 4- | 0,00276 |
| 8 | GRHi-2 | 102502836 | 18 | 1B | 0,001 | 0,310 | + | 4,33x1040 | |
| 8 | GRHL2 | 102503717 | rs611419 | 8 | 8 | 0,26 | 0,138 | • | 0,0354 |
| 8 | GRHL2 | 102506074 | rs688324 | 25 | 46 | 0,92 | 0,793 | 0,00188 | |
| 8 | GRHL2 | 102508080 | 17 | 17 | 0,001 | 0,293 | 4- | 1.90Χ10-37 | |
| 8 | GRHL2 | 102511670 | rs554509 | 22 | 41 | 0,92 | 0,707 | - | 1,81x10-® |
| 8 | GRHL2 | 102512007 | 5 | 5 | 0,001 | 0,0862 | 4- | 4,38x10® | |
| 8 | GRHL2 | 102648952 | 6 | 6 | 0,001 | 0,103 | 4- | 3,87χ10τ1 | |
| 8 | GRHL2 | 102649525 | rs7017592 | 1 | 2 | 0,24 | 0,0345 | - | 3,84x10'5 |
Polimorfizmy oznaczone „+” występują w populacji pacjentów częściej niż w populacji europejskiej zaś rzadziej. Numeracja pozycji w kolumnie „pozycja” jest zgodna z annotacją GRCh37/hg19.
W jednym z korzystnych przykładów realizacji, rak jest jasnokomórkowym rakiem nerki.
W drugim z przykładów realizacji, rak jest innym typem raka nerki.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, obecność wariantu genotypowego wykrywana jest na podstawie analizy DNA, RNA lub białek.
Badania DNA, RNA lub białka mogą być przeprowadzone przy użyciu dowolnych metod pozwalających na identyfikację homozygotycznych lub heterozygotycznych SNP w sekwencji genomowej, genetycznej lub białkowej, w tym metodą Western biot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierzy SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamicznej hybrydyzacji spe
PL 234 915 B1 cyficznej dla alleli (dynamie allele-specific hybridization - DASH), latarni molekularnych (molecular beacons), sond typu TaqMan, wydłużania starterów (primer extension), spektrometria masowa typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight), metody ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i podobne, test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforezę żelową w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), denaturującej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) w materiale wyizolowanym z próbki tkanki lub krwi pobranej od pacjenta, przy czym co najmniej jeden z takich SNP obecny na statystycznie znaczącym poziomie wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) wybranego spośród SNP wymienionych w Tabeli 1, Tabeli 2 lub Tabeli 3 jako markerów do określania in vitro zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi.
Korzystnie, warianty genetyczne, zawierające polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), zarówno homozygotyczne jak i heterozygotyczne, związane z rakiem nerki w genach Grainyhead-like 1 (GRHL1) i/lub Grainyhead-like 2 (GRHL2) i/lub Grainyhead-like 3 (GRHL3) lub ich produktach są wykrywane za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
W przykładowych realizacjach prowadzi się analizę próbek tkanki lub krwi pobranych od ludzkiego dawcy, w których co najmniej jeden z takich SNP jest obecny na statystycznie znaczącym poziomie co wskazuje na zaburzenie funkcjonowania procesów zależnych od działania GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
W jednym z przykładów realizacji, rak jest jasnokomórkowym rakiem nerki.
W drugim z przykładów realizacji, rak jest rakiem nerki innego typu.
Szczegółowy opis
Ujawniono polimorfizmy pojedynczych nukleotydów zidentyfikowane w sekwencjach regulatorowych oraz w sekwencjach kodujących genów GRHL1, GRHL2 i GRHL3 specyficzne dla pacjentów z rakiem jasnokomórkowym nerki. Ich obecność w sekwencji DNA może prowadzić do upośledzenia ekspresji genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3, i/lub funkcjonowania kodowanych przez nie białek GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3, a zatem może wywoływać zaburzenia w funkcjonowaniu ścieżek i szlaków przekazywania sygnału, w których uczestniczą produkty genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
Ujawniono metody służące do określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki, zwłaszcza typu jasnokomórkowego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genach GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3.
Ponadto ujawniono zastosowanie metod określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki, w szczególności typu jasnokomórkowego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genach GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3, w badaniach przesiewowych populacji ludzkiej w celu wykrywania osób ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki.
Opisano także sposób określania u pacjentów zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki, w szczególności typu jasnokomórkowego, w oparciu o identyfikację co najmniej jednego z wymienionych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genach GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 w populacyjnych programach profilaktyki i wczesnego wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki.
Istota niniejszego wynalazku została zilustrowana przykładami, które nie wyczerpują wszystkich możliwości realizacji wynalazku. W ramach rutynowych prac laboratoryjnych można wprowadzić liczne zmiany lub warianty stosowanych procedur, które mieszczą się jednak w zakresie niniejszego wynalazku, zdefiniowanym w załączonych zastrzeżeniach.
P r z y k ł a d 1
Identyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów charakterystycznych dla pacjentów z rakiem nerki.
Rakowe zmiany nerki wraz z marginesem zdrowej tkanki zostały usunięte chirurgicznie i poddane wstępnej ocenie patologicznej. Fragmenty tkanki nowotworowej oraz tkanki zdrowej z marginesu wyciętej zmiany zostały pobrane od 29 pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki. Tkanki przecho
PL 234 915 B1 wywano w temperaturze -80°C do czasu przeprowadzenia analizy. Następnie, za pomocą zestawu do izolacji DNA (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen) wyizolowano genomowe DNA. Wzbogacenie próbek w wybrane sekwencje docelowe przeprowadzono za pomocą indywidualnie zaprojektowanego zestawu HaloPlex (Agilent) i tak przygotowaną bibliotekę DNA zawierającą fragmenty genów GRHL1, GRHL2 i GRHL3 poddano ukierunkowanemu głębokiemu sekwencjonowaniu nowej generacji w systemie MiSeq (Illumina).
Inne znane metody, które mogą zostać wykorzystane do wykrywania obecności polimorfizmów w sekwencji genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 z tkanek bądź płynów ustrojowych pobranych od pacjentów obejmują, ale nie są ograniczone do: Western blot za pomocą specyficznych przeciwciał, mikromacierze SNP, SNP-RFLP (restriction fragment length polymorphism), dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla alleli (dynamic allele-specific hybridization - DASH), latarnie molekularne (molecular beacons), sondy typu TaqMan, wydłużanie starterów (primer extension), spektrometria mas typu MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight), metody ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) i podobne, test ligacji oligonukleotydów, polimorfizm konformacji pojedynczej nici DNA (single-strand conformation polymorphism), elektroforeza żelowa w gradiencie temperaturowym (temperature gradient gel electrophoresis - TGGE), denaturująca wysokosprawna chromatografia cieczowa (high performance liquid chromatography - HPLC), wysokorozdzielcze topnienie całego amplikonu (high resolution melting polymerase chain reaction - HRM PCR), SNPlex i/lub sekwencjonowanie nowej generacji (new generation sequencing - NGS) oraz trawienie restrykcyjne poprzedzone reakcją PCR.
P r z y k ł a d 2
Analiza częstości i korelacja występowania alleli w badanej populacji
Częstość występowania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w grupie pacjentów z rakiem nerki porównano do częstości ich występowania w populacji europejskiej na podstawie danych z bazy 1000Genomes. Do określenia statystycznej istotności odchyleń (przy poziomie istotności p < 0,05) dla częstości występowania SNP w badanej populacji zastosowano test dwumianowy. Rozkład SNP o odmiennej częstości występowania w badanej grupie pacjentów przedstawia Manhattan Plot (Fig. 1).
Na podstawie wyżej opisanej analizy wytypowano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w sekwencjach regulatorowych genów GRHL1, GRHL2 i GRHL3, które występują w populacji badanych pacjentów z rakiem nerki ze statystycznie istotnie zmienioną częstością niż w populacji europejskiej. Opisywane polimorfizmy pojedynczych nukleotydów pokazano w Tabeli 1, Tabeli 2 oraz w Tabeli 3.
P r z y k ł a d 3
Zmiany poziomu ekspresji genów GRHL w jasnokomórkowych rakach nerki
Czynniki transkrypcyjne z rodziny GRHL są ewolucyjnie zachowaną, tkankowo-specyficzną grupą białek. Ich rola sprowadza się do regulacji transkrypcji (poprzez aktywację lub represję) genów istotnych dla utrzymania właściwej struktury i funkcji nabłonka. Kontrolują one ekspresję m.in. takic h genów jak: DSG1, CDH1, RAB25, CLDN3 i CLDN4, geny z kompleksu EDC, hTERT oraz PCNA. Zaburzenia w poziomie ekspresji genów GRHL mogą być pośrednio powiązane z wieloma chorobami nerki i mogą sprzyjać nowotworzeniu.
RNA wyizolowano z tkanki nowotworowej oraz tkanki zdrowej pobranej z marginesu wyciętej zmiany, przy użyciu moździerza oraz zestawu GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit (Euryx). Odwrotną transkrypcję przeprowadzono dla 250 ng mRNA z pomocą RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Detekcję zmian poziomu ekspresji w tkance nowotworowej w odniesieniu do tkanki zdrowej danego pacjenta przeprowadzono za pomocą odczynników Thermo Scientific: Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix:
PL 234 915 Β1
| Gen | Sekwencje starterów PCR |
| GRHL1 | Forward: CAGCGACCAAAGCGATGATGA Reverse: GGGGAAGGACAATGTTAAATGGC |
| GRHL2 | Forward: TCAATACCCGAAGAGCCTACA Reverse: CTTGGCTGTCACTTGCTTTGC |
| GRHL3 | Forward: CAGAGACTGACCTGGAGACG Reverse: AGGCTCAAACTCCTCAGTGAA |
| HPRT | Forward: ACCAGTCAACAGGGGACATAA Reverse: CTTCGTGGGGTCCI I IICACC |
Reakcję ilościowego PGR w czasie rzeczywistym (ang. Quantitative Real-Time POR - O-RT-PCR) przeprowadzono w systemie Eco lllumina. W próbkach jasnokomórkowego raka nerki zaobserwowano spadek poziomu ekspresji genów GRHL1 i GRHL2, w porównaniu z okalającą guzy zdrową tkanką (Fig. 2).
Zastosowanie: Spadek poziomu ekspresji genów GRHL molekularnym znacznikiem raka nerki.
Wpływ polimorfizmów pojedynczych nukleotydów na poziom ekspresji genów GRHL w rakach nerki
Regulacja ekspresji genów jest procesem złożonym i zależy od wielu czynników. Co więcej, każdy z etapów ekspresji genów może być regulowany za pomocą różnych mechanizmów. Ekspresja genów GRHL w komórkach nerki zależy od rodzaju komórek oraz od ich stanu metabolicznego i fizjologicznego.
a) Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w sekwencjach promotorowych i regulatorowych
Sekwencjonowanie nowej generacji genów GRHL pozwoliło na wskazanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w regionach promotorowych i regulatorowych genów GRHL u pacjentów z rakiem nerki (Tabela 1). Na podstawie przygotowanej analizy Manhattan Plot (opisano wcześniej) wskazano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, które mogą być powiązane ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki. Zmiana częstości ich występowania w populacji badanych pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki w porównaniu z populacją europejską była statystycznie istotna.
Sens biologiczny
Obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej przez czynniki transkrypcyjne może prowadzić do utraty, osłabienia, wzmocnienia lub utworzenia miejsca wiązania białko/DNA, co w konsekwencji prowadzi do zmian w poziomie ekspresji genów.
b) Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w regionach 3’UTR genów GRHL
U pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki zaobserwowano spadek poziomu ekspresji genów GRHL1 i GRHL2. Poziom ekspresji genów może zależeć od regulacji przez mikroRNA (miRNA). Cząsteczki miRNA regulują poziom ekspresji genów poprzez wiązanie się do specyficznych 7-nukleotydowych sekwencji w obszarze 3’UTR (ang. UnTranslated Region - region nie ulegający translacji) cząsteczek mRNA. Poprzez obniżenie efektywności translacji informacji genetycznej do białka, dochodzi do wyciszenia poziomu ekspresji genu. Zaburzenie regulacji poziomu ekspresji genów może mieć kluczowe znaczenie w procesie nowotworżenia. Jedną z przyczyn zaburzenia interakcji miRNA/mRNA może być obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w sekwencji 3’UTR. W efekcie może dochodzić do likwidacji istniejących lub tworzenia nowych specyficznych 6-8-nukleotydowych sekwencji rozpoznawanych przez miRNA i w efekcie do niepożądanego podwyższenia lub obniżenia poziomu ekspresji danego genu. Sekwencjonowanie nowej generacji genów GRHL pozwoliło na wskazanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów u pacjentów z rakiem nerki w regionach 3’UTR genów GRHL. Na podstawie przygotowanej analizy Manhattan Plot wskazano polimorfizmy pojedynczych nukleotydów, które mogą być powiązane ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka nerki. Zmiana częstości ich występowania w populacji badanych pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki w porównaniu z populacją europejską była statystycznie istotna.
PL 234 915 Β1
Tabela 2
Wykaz SNPów w sekwencjach 3’UTR genów GRHL u pacjentów z rakiem jasnokomórkowym nerki
| chromosom | ęen | pozycja | rs | liczba pacjentów | liczba alleli | częstość w populacji EUR (1000 Genomes OB) | częstość* populacji badanej | kierunek zmiany częstości | wartość P |
| 8 | GRHL2 | 102681482 | rs7820879 | 12 | 12 | 0,001 | 0,207 | 8,54x10’25 | |
| 8 | GRHL2 | 102681820 | rs11342848 | 4 | 4 | 0,001 | 0,0690 | + | 4,06x10'7 |
| 8 | GRHL2 | 102681857 | 13 | 15 | 0,001 | 0,259 | + | 2,86x10'32 |
Polimorfizmy oznaczone „+” występują w populacji pacjentów częściej niż w populacji europejskiej zaś rzadziej. Numeracja pozycji w kolumnie „pozycja” jest zgodna z annotacją GRCh37/hg19.
Sens biologiczny
Obecność polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w sekwencji rozpoznawanej przez miRNA może prowadzić do utraty, osłabienia, wzmocnienia lub utworzenia miejsca wiązania miRNA/mRNA.
c) Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów w obszarach kodujących genów GRHL
Czynnik transkrypcyjny GRHL3 bezpośrednio pozytywnie reguluje ekspresję genu PTEN, którego produkt białkowy jest inhibitorem szlaku PI3K/AKT/mTOR (Darido et al, 2011). Jednym z przedmiotów niniejszego zgłoszenia jest polimorfizm pojedynczego nukleotydu zidentyfikowany w sekwencji kodującej genu GRHL3 i specyficzny dla pacjentów z rakiem jasnokomórkowym nerki. Jego obecność w sekwencji DNA może prowadzić do upośledzenia funkcji białka GRHL3, a zatem może wpływać na obniżanie aktywności białka PTEN i aktywację szlaku PI3K/AKT/mTOR, który sprzyja proliferacji komórek i rozwojowi nowotworów. Według bazy danych UCSC ten polimorfizm znajduje się we wszystkich wariantach alternatywnego składania transkryptu GRHL3, które kodują białko (http://genome.ucsc.edu). Zatem obecność tego polimorfizmu prowadzi do zmiany sekwencji aminokwasowej i potencjalnie może wpływać na prawidłowe funkcjonowanie wszystkich izoform białka GRHL3. Co więcej, reszta aminokwasowa, w kodonie której zlokalizowany jest ten polimorfizm, znajduje się w motywie potencjalnie rozpoznawanym przez kinazy białkowe takie jak GSK-33, ERK1, ERK2 oraz CDK5 (http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/). Jest bardzo wysoce prawdopodobne, że fosforylacja białka GRHL3 przez te kinazy jest kluczowa dla jego prawidłowego funkcjonowania.
Tabela 3
Wykaz SNPów w sekwencjach kodujących genów GRHL u pacjentów z rakiem jasnokomórkowym nerki
| chromosom | gen | pozycja | rs | liczba pacjentów | liczba alleli | częstość w populacji EUR (1000 Genomes DB) | częstość w populacji badanej | kierunek zmiany częstości | wartość P |
| 1 | GRHL3 | 24669457 | rs41268753 | 5 | 5 | 0,03 | 0,0862 | 0,0299 |
Polimorfizmy oznaczone „+” występują w populacji pacjentów częściej niż w populacji europejskiej zaś rzadziej. Numeracja pozycji w kolumnie „pozycja” jest zgodna z annotacją GRCh37/hg19.
Sens biologiczny
Obecność polimorfizmu rs41268753 powoduje utratę miejsca fosforylacji białka GRHL3. Konsekwencje molekularne opisywanego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu na modyfikacje potranslacyjne i funkcjonowanie białka GRHL3 są przedmiotem dalszych badań autorów patentu.
PL 234 915 B1
Literatura:
Audenet F, Yates DR, Cancel-Tassin G, Cussenot O, Roupret M (2012) Genetic pathways involved in carcinogenesis of clear cell renal cell carcinoma: genomics towards personalized medicine. BJU international 109: 1864-1870
Clague J, Lin J, Cassidy A, Matin S, Tannir NM, Tamboli P, Wood CG, Wu X (2009) Family history and risk of renal cell carcinoma: results from a case-control study and systematic meta-analysis. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention: a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology 18: 801-807
Darido C, Georgy SR, Wilanowski T, Dworkin S, Auden A, Zhao Q, Rank G, Srivastava S, Finlay MJ, Papenfuss AT, Pandolfi PP, Pearson RB, Jane SM (2011) Targeting of the Tumor Suppressor GRHL3 by a miR-21 -Dependent Proto-Oncogenic Network Results in PTEN Loss and Tumorigenesis. Cancer Cell 20: 635-648
Fabian J, Lodrini M, Oehme I, Schier MC, Thole TM, Hielscher T, Kopp-Schneider A, Opitz L, Capper D, von Deimling A, Wiegand I, Milde T, Mahlknecht U, Westermann F, Popanda O, Roels F, Hero B, Berthold F, Fischer M, Kulozik AE, Witt O, Deubzer HE (2014) GRHL1 Acts as Tumor Suppressor in Neuroblastoma and Is Negatively Regulated by MYCN and HDAC3. Cancer Res 74: 2604-2616
Hemminki K, Li X (2004) Familial renal cell cancer appears to have a recessive component. Journal of medical genetics 41: e58
Mlacki M, Darido C, Jane SM, Wilanowski T (2014) Loss of Grainy head-like 1 is associated with disruption of the epidermal barrier and squamous cell carcinoma of the skin. PloS one 9: e89247
Quan Y, Jin R, Huang A, Zhao H, Feng B, Zang L, Zheng M (2014) Downregulation of GRHL2 inhibits the proliferation of colorectal cancer cells by targeting ZEB1. Cancer biology & therapy 15: 878-887
Tanaka Y, Kanai F, Tada M, Tateishi R, Sanada M, Nannya Y, Ohta M, Asaoka Y, Seto M, Shiina S, Yoshida H, Kawabe T, Yokosuka O, Ogawa S, Omata M (2008) Gain of GRHL2 is associated with early recurrence of hepatocellular carcinoma. J Hepatol 49: 746-757
Werner S, Frey S, Riethdorf S, Schulze C, Alawi M, Kling L, Vafaizadeh V, Sauter G, Terracciano L, Schumacher U, Pantel K, Assmann V (2013) Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer. J Biol Chem 288: 22993-23008
Xiang J, Fu X, Ran W, Chen X, Hang Z, Mao H, Wang Z (2013) Expression and role of grainyhead-like 2 in gastric cancer. Medical oncology 30: 714
Claims (6)
1. Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi, znamienny tym, że obejmuje:
a) badanie próbki biologicznej pobranej od pacjenta w celu określenia struktury co najmniej jednego genu wybranego spośród: GRHL1, GRHL2 oraz GRHL3, obejmujące ustalanie obecności polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP),
b) stwierdzenie zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi w przypadku identyfikacji co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) wybranego spośród SNP wymienionych w Tabeli 1, Tabeli 2 lub Tabeli 3.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym rak jest jasnokomórkowym rakiem nerki.
3. Sposób według zastrzeżenia 1, w którym obecność SNP jest wykrywana za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
4. Zastosowanie co najmniej jednego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) wybranego spośród SNP wymienionych w Tabeli 1, Tabeli 2 lub Tabeli 3 jako markera do określania in vitro zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki u ludzi.
5. Zastosowanie według zastrzeżenia 4, w którym warianty genetyczne, zawierające polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP), zarówno homozygotyczne jak i heterozygotyczne, związane z rakiem nerki w genach Grainyhead-like 1 (GRHL1) i/lub Grainyhead-like 2 (GRHL2) i/lub Grainyhead-like 3 (GRHL3) lub ich produktach są wykrywane za pomocą analizy DNA, RNA lub białek.
6. Zastosowanie według zastrzeżenia 4, w którym rak jest jasnokomórkowym rakiem nerki.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL414469A PL234915B1 (pl) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 |
| PCT/IB2015/059225 WO2017068402A1 (en) | 2015-10-23 | 2015-11-30 | A method for detecting an increased risk of kidney cancer and the use of genotype variants of genes grhl1 and / or grhl2 and / or grhl3 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL414469A PL234915B1 (pl) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL414469A1 PL414469A1 (pl) | 2017-04-24 |
| PL234915B1 true PL234915B1 (pl) | 2020-05-18 |
Family
ID=55359545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL414469A PL234915B1 (pl) | 2015-10-23 | 2015-10-23 | Sposób wykrywania zwiększonego ryzyka zachorowania na raka nerki oraz zastosowania genotypowych wariantów genów GRHL1 i/lub GRHL2 i/lub GRHL3 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL234915B1 (pl) |
| WO (1) | WO2017068402A1 (pl) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005024603A2 (en) * | 2003-09-10 | 2005-03-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for detecting, diagnosing and treating human renal cell carcinoma |
| WO2013029116A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Monash University | Method for predicting treatment responsiveness |
| WO2015093998A1 (en) * | 2013-12-19 | 2015-06-25 | Instytut Biologii Doświadczalnej Im. M. Nenckiego Polskiej Akademii Nauk | A method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the grhl3 gene |
-
2015
- 2015-10-23 PL PL414469A patent/PL234915B1/pl unknown
- 2015-11-30 WO PCT/IB2015/059225 patent/WO2017068402A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL414469A1 (pl) | 2017-04-24 |
| WO2017068402A1 (en) | 2017-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Danielsen et al. | Portrait of the PI3K/AKT pathway in colorectal cancer | |
| Shih et al. | Promoter methylation of the secreted frizzled‐related protein 1 gene SFRP1 is frequent in hepatocellular carcinoma | |
| Pavlidou et al. | Diagnostic significance and prognostic role of the ARID1A gene in cancer outcomes | |
| Catanzaro et al. | The miR‐139‐5p regulates proliferation of supratentorial paediatric low‐grade gliomas by targeting the PI3K/AKT/mTORC1 signalling | |
| Ibragimova et al. | A global profile of gene promoter methylation in treatment-naive urothelial cancer | |
| Molnár et al. | Circulating cell-free nucleic acids as biomarkers in colorectal cancer screening and diagnosis-an update | |
| Zhao et al. | The rs6983267 SNP and long non‐coding RNA CARLo‐5 are associated with endometrial carcinoma | |
| Yan et al. | RUNX3 methylation as a predictor for disease progression in patients with non‐muscle‐invasive bladder cancer | |
| Barros-Filho et al. | Oncogenic drivers in 11q13 associated with prognosis and response to therapy in advanced oropharyngeal carcinomas | |
| Vashist et al. | Heme oxygenase‐1 germ line GTn promoter polymorphism is an independent prognosticator of tumor recurrence and survival in pancreatic cancer | |
| Jia et al. | CeRNA expression profiling identifies KIT-related circRNA-miRNA-mRNA networks in gastrointestinal stromal tumour | |
| Wang et al. | Effects of KRAS mutation and polymorphism on the risk and prognosis of oral squamous cell carcinoma | |
| Thomas et al. | Molecular heterogeneity in malignant peripheral nerve sheath tumors associated with neurofibromatosis type 1 | |
| Zhang et al. | Up-regulation of CRKL by microRNA-335 methylation is associated with poor prognosis in gastric cancer | |
| US20210238696A1 (en) | Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer and Methods of Use | |
| Li et al. | Promoter hypermethylation of DNA damage response genes in hepatocellular carcinoma | |
| Sung et al. | Integrative analysis of copy number alteration and gene expression profiling in ovarian clear cell adenocarcinoma | |
| Yu et al. | Application of RUNX3 gene promoter methylation in the diagnosis of non-small cell lung cancer | |
| Park et al. | TAGLN expression is upregulated in NF1-associated malignant peripheral nerve sheath tumors by hypomethylation in its promoter and subpromoter regions | |
| KR20180108820A (ko) | 암 후생유전적 프로파일링 | |
| Kutilin | Regulation of gene expression of cancer/testis antigens in colorectal cancer patients | |
| US10000816B2 (en) | Method for detecting an increased risk of developing skin cancer and a use of a genotype variant of the GRHL3 gene | |
| Chiacchiarini et al. | Role of tissue and circulating microRNAs and DNA as biomarkers in medullary thyroid cancer | |
| Kanabe et al. | Expression patterns of LncRNA-GAS5 and its target APOBEC3C gene through miR-103 in breast cancer patients | |
| Samir et al. | Competing endogenous RNA network crosstalk reveals novel molecular markers in colorectal cancer |