PL233199B1 - Pochodne 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu funkcjonalizowane wybranymi aminokwasami - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy nowych pochodnych 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu sfunkcjonalizowanych wybranymi aminokwasami.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowych środków o potencjale aktywności przeciwnowotworowej, opartych na bazie 9,10-antrachinonu.

Choroby nowotworowe stały się główną przyczyną umieralności, szczególnie w XXI wieku głównie dlatego, że są one bardzo trudne do zdiagnozowania i wyleczenia. Związki posiadające w swej strukturze szkielet 9,10-antrachinonu zaliczane są do najliczniejszej grupy antybiotyków nazywanych antracyklinami, bądź antybiotykami antrachinonowymi. Wśród stosowanych pochodnych antrachinonów można wyróżnić antracykliny (doksorubicyna, daunorubicyna, idarubicyna, epirubicyna, aklarubicyna, mitoksantron i ich syntetyczne pochodne). Leki te stosowane są głównie w terapii w leczeniu ostrych białaczek, chłoniaków i różnych guzów litych, w tym raka piersi, płuc, tarczycy, jajnika oraz raka tkanek miękkich (Zajca A., Gorczyca M. Chemia leków. PZWL, Warszawa., 1999.).

Antybiotyki antracyklinowe są najliczniejszą grupą antybiotyków cytostatycznych hamujących podział komórek stosowanych najczęściej w terapii przeciwnowotworowej. Zaproponowano kilka różnych mechanizmów wyjaśniających biologiczne działanie tych antybiotyków. Pierwszy z nich oparty jest na interkalacji, czyli wtłaczaniu chemioterapeutyku pomiędzy dwie sąsiadujące ze sobą pary zasad w DNA. Interkalacja w helisę DNA może spowodować jej wydłużenie lub pęknięcie oraz zmianę właściwości biochemicznych, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania zdolności do replikacji i transkrypcji (F. Gieseler, H. Biersack, T. Brieden, J. Manderscheid, V. Nubler, Annals of Hematology, 1994, 69, 13-17).

Cytostatyki oparte na strukturze 9,10-antrachinonu są inhibitorami topoizomeraz, enzymów biorącymi udział w procesie replikacji DNA. Hamowanie aktywności enzymów potrzebnych do replikacji DNA przez ich inhibitory prowadzi do stabilizacji kompleksu trójskładnikowego DNA-enzym-inhibitor. W procesie mitozy kompleks ten powoduje trwałe przerwanie nici prowadzące do apoptozy komórki (Y-H. Hsiang, L. Liu, Cancer Res. 1988, 48, 1722-1726).

Dodatkowo związki te związanie z błoną komórkową mogą mieć istotny wpływ na płynność błon komórkowych, transport jonów, a także zakłócają równowagę procesów biochemicznych w komórce. Właściwości redoks antybiotyków antracyklinowych mogą doprowadzić do wytworzenia wolnych rodników lub rodników hydroksylowych, które powodują uszkodzenie DNA, co w konsekwencji prowadzi do zablokowania procesu transkrypcji (Frederick C. A., Williams L. D., Ughetto G., Marel 1990, G. A., Boom

J. H., Rich A., Wang A. H. Biochemistry, 1990, 29, 2538-2549).

Bardzo istotne jest prowadzenie prac badawczych nad nowymi pochodnymi antybiotyków antracyklinowych, w celu opracowania serii nowych związków chemicznych charakteryzujących się wysoką aktywnością przeciwnowotworową przy jednocześnie niskiej toksyczności. Ważne jest również ograniczenie kardiotoksyczności nowych potencjalnych leków. Jednym ze sposobów ograniczenia kardiotoksyczności jest synteza nowych pochodnych opartych na szkielecie 9,10-antrachinonu modyfikowanych aminokwasami lub peptydami. Wprowadzenie do badanych molekuł aminokwasów może dodatkowo zwiększyć ich aktywność. (Gatto B., Zagotto G, Sissi C., Cera C., Uriarte E., Palu G., Capranico G., Palumbo M., Journal of Medicinal Chemistry, 1996, 39, 3114-3122).

Badania literaturowe wyraźnie sugerują, iż cząsteczki zawierające aminokwasy bądź peptydy są biologicznie aktywne i mogą być stosowane, jako chemioterapeutyki. Za pośrednictwem aminokwasów lub peptydów można swobodnie wpływać na aktywność całej molekuły w wyniku wprowadzenia do układu dodatkowego ładunku, układu heterocyklicznego lub aktywnego fragmentu peptydowego wykazującego aktywność przeciwnowotworową (Varvaresou A., Iakovou K., Gikas E., Fichtner I., Fiebig H.H., Kelland L.R., Double J.A., Bibby M.C., Hendriks H.R., Anticancer Research, 2004, 24, 907-920).

Ponadto dołączenie peptydu do antracyklin ułatwia wychwytywanie proleku przez komórki nowotworowe, co więcej takie koniugaty mogą być inhibitorami topoizomerazy I i topoizomerazy II. Topoizomerazy są więc ważnym celem komórkowym w projektowaniu nowych, skutecznych leków przeciwnowotworowych.

Znane i opisane rozwiązania środków o aktywności przeciwnowotworowej i sposobów ich otrzymywania wykazują następujące wady. Wadą antybiotyków antracyklinowych jest ich kardiotoksyczność oraz rozwój oporności w komórkach nowotworowych występująca obok innych działań niepożądanych. Zaburzenia w krążeniu przypisuje się produktom powstającym podczas biotransformacji antracyklin, szczególnie przy redukcji ugrupowań chinonowych do hydrochinonowych. Powstające rodniki tlenowe

PL233 199 Β1 oraz rodniki hydroksylowe powodują tworzenie struktur nadtlenkowych w lipidach, a ich stopniowy rozkład prowadzi do związków działających uszkadzająco na mięsień sercowy.

Dlatego też, oczywistą potrzebą współczesnej medycyny jest poszukiwanie nowych związków, potencjalnych chemoterapeutyków przeciwnowotworowych.

Wynalazek rozwiązuje zagadnienie opracowania nowych środków o aktywności przeciwnowotworowej opartych na bazie 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu oraz sposobu ich otrzymywania. W wynalazku oparto się na otrzymaniu aminokwasowych pochodnych 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu podstawionego w pozycji 4-pierścienia piperazynowego wybranymi aminokwasami.

Związki te mają wzór ogólny:

O-s. ^.R

I

gdzie R oznacza:

dla związku (1) 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu:

R= L-asparagina, dla związku (2) 1-(4-L-glutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu: R= L-glutamina, dla związku (3) 1-(4-L-piroglutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu: R= L-piroglutamina, dla związku (4) 1-(4-L-serynylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu: R= L-seryna.

Związki według wynalazku przedstawiono szczegółowo poniżej:

1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon o wzorze:

1-(4-L-glutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon o wzorze:

PL233 199 Β1

-(4-L-piroglutaminylopiperazyn-1 -ylo)-9,10-antrachinon o wzorze:

1-(4-L-serynylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon o wzorze:

Sposób otrzymywania 1-(4-L-asparginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu polega na tym, że przeprowadza się reakcję w dichlorometanie w czasie 24 godzin, stosując etapy postępowania w kolejności, w etapie pierwszym rozpuszcza się w dichlorometanie (DCM) i ochładza do 0°C w odrębnym naczyniu technologicznym 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon, rozpuszcza w drugim naczyniu technologicznym w dichlorometanie (DCM) Na-(9-fluorenylometoksykarbonylo)-NY-trytylo-L-asparaginę (Fmoc-Asn(Trt)-OH), dodaje się środek sprzęgający w postaci Ν,Ν'-dicykloheksylokarbodiimidu (DIC), a następnie umieszcza się naczynie technologiczne na około 20 minut w temperaturze około -10°C, po których upływie miesza się zawartość obu naczyń technologicznych w mieszadle najkorzystniej magnetycznym przez około 24 godziny, kontrolując przebieg reakcji na płytkach cienkowarstwowej chromatografii cieczowej (ang. Thin Layer Chromatography) TLC przy zastosowaniu układu rozwijającego DCM:MeOH w stosunku objętościowym 5:1, po czym po upływie około 24 h odsącza powstałe produkty stałe i odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce zwłaszcza próżniowej, a następnie przeprowadza się „zdejmowanie” grup ochronnych znajdujących się zarówno w łańcuchu głównym jak i bocznym L-aminokwasu, stosując odpowiednią znaną kolejność oraz odpowiednie znane procedury preparatywne ich usuwania, przy czym w przypadku zastosowania do syntezy chronionej L-asparaginy (Fmoc-Asn(Trt)-OH), grupa a aminowa w łańcuchu głównym chroniona jest przez ugrupowanie -Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa, natomiast grupa amidowa w łańcuchu bocznym -Trt (grupa trytylowa), po czym w pierwszej kolejności usuwa się osłonę -Trt, a otrzymany wcześniej osad rozpuszcza się w małej ilości DCM - dichlorometanu i dodaje się TFA - kwas trifluorooctowy w celu zdjęcia osłony -Trt, reakcję prowadzi się przez czas około 1 h, po czym odparowuje się rozpuszczalnik organiczny na wyparce zwłaszcza próżniowej, powstały osad przemywa się eterem dietylowym i rozpuszcza się go w małej ilości DCM i dodaje 10 ml piperydyny w celu zdjęcia osłony -Fmoc, prowadząc tę reakcję przez około 1 h, po upływie której odparowuje się rozpuszczalnik na wyparce zwłaszcza próżniowej i oczyszcza się powstały produkt stosując zwłaszcza wysokosprawną chromatografię cieczową w układzie faz odwróconych w skali preparatywnej (RP-HPLC), przy użyciu kolumny preparatywnej korzystnie Macherey Nagel z wypełnieniem Nucleosil 100-7 C18, z eluentem ACN - acetonitryl i H2O w liniowym gradiencie acetonitrylu 40-100-40%, w czasie 0-30-35 min, przy zastosowaniu przepływu około 10 ml/min i detekcji UV przy długość fali około 254 nm.

PL 233 199 B1

Sposób otrzymywania 1-(4-L-glutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu polega na tym, że postępuje się jak opisano wyżej, ale jako substraty używa się 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon i Fmoc-Gln(T rt)-OH a-(9-fluorenylometoksykarbonylo)-N5-trytylo-L-glutaminę.

Sposób otrzymywania kwasu 1-(4-L-piroglutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonowego polega na tym, że postępuje się jak opisano wyżej, ale jako substraty używa się 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon i Fmoc-Gln(Trt)-OH a-(9-fluorenylometoksykarbonylo)-N5-trytylo-L-glutaminę.

Sposób otrzymywania 1-(4-L-serynylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu polega na tym, że postępuje się jak opisano wyżej, ale w celu usunięcia osłony -tBu - grupa tert-butylowa otrzymany w wyniku reakcji osad rozpuszcza się w małej ilości DCM (dichlorometanu) i dodaje się doń TFA - kwasu trifluorooctowego, reakcję prowadzi się przez około 1 h, po czym odparowuje rozpuszczalnik organiczny na wyparce najkorzystniej próżniowej, a otrzymaną suchą pozostałość rozpuszcza się w DCM i przemywa pentanem w celu wytrącenia osadu, a następnie tak wytrącony osad rozpuszcza się w małej ilości DCM i dodaje piperydynę w celu zdjęcia osłony -Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksy-karbonylowa, przy czym do oczyszczania finalnej mieszaniny otrzymanej w wyniku reakcji stosuje się liniowy gradient acetonitrylu w przedziałach około 30-45-51-56-70% w czasie odpowiednio około 0-15-20-25-30 min.

Wszystkie nowe związki chemiczne według wynalazku scharakteryzowano technikami spektroskopowymi i masowymi.

Poniżej przedstawiono analizy masowe MALDI, IR oraz HPLC. Dla wszystkich związków wykonano analizy wykorzystując zestaw analityczny HPLC firmy Schimadzu, używając kolumny (firmy Phenomenex Luna C8(2), 150 x 3 mm, o średnicy ziaren sorbentu 5 μm i wielkości porów 100 A), w linowym gradiencie rozpuszczalników 0-100% A (A = H2O + 0,1% TFA, B = ACN + 0,1% TFA), w czasie 15 minut, przy zastosowaniu przepływu 1 ml/min i długości fali 254 nm.

Związek (1) 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon MALDI - TOF MS: m/z 407,2 [M+H]+, (MW = 406,44).

IR (KBr) (cm^-1): 3427, 2926, 1668, 1581,1447, 1446, 1429, 1385, 1319, 1269, 1236, 1202, 1132, 1030, 1001, 894, 834, 800, 736, 710, 663, 606, 561.

RP-HPLC: Rt=8.545, gradient 0-100% (A-B) w 15 min.

Związek (2) 1-(4-L-glutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon

MALDI - TOF MS: m/z 422,8 [M+2H]+, (MW = 420,27).

IR (KBr) (cm^-1): 3206, 3049, 2924, 2852, 1665, 1581,1446, 1320, 1270, 1203, 1134, 1032, 1003, 907, 839, 801, 723, 711, 664.

RP-HPLC: Rt=8.583, gradient 0-100% (A-B) w 15 min.

Związek (3) 1-(4-L-piroglutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinona

MALDI - TOF MS: m/z 404,2 [M+H]+, (MW = 403,44).

IR (KBr) (cm^-1): 3417, 2923, 2853, 1701,1650, 1579, 1468, 1443, 1427, 1380, 1315, 1266, 1230, 1200, 1151, 1079, 1029, 1001,902, 833, 801,758, 736, 710, 662, 602.

RP-HPLC: Rt=9.583 gradient 0-100% (A-B) w 15 min.

Związek (4) 1-(4-L-serynylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinon

MALDI - TOF MS: m/z 381,3 [M+2H]+, (MW = 379,42).

IR (KBr) (cm^-1): 3860, 3849, 3342, 2968, 2932, 1666, 1580, 1519, 1468, 1447, 1429, 1384, 1319, 1269, 1236, 1202, 1130, 1048, 1028, 1001,934, 900, 834, 799, 736, 709, 662.

RP-HPLC: Rt=8.608, gradient 0-100% (A-B) w 15 min.

Wykazano, że związki chemiczne według wynalazku mają potencjał w kierunku aktywności cytostatyczną wobec linii komórek nowotworowych zwłaszcza: ludzkiego czerniaka Hs-294T, mysiego czerniaka B16, ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego LoVo, ludzkiego gruczolakoraka jelita grubego opornego na doksorubicynę LoVo/DX.

Wszystkie pochodne 9,10-antrachinonu według wynalazku zostały przebadane pod kątem aktywności cytostatycznej również wobec komórek prawidłowych morfologicznie, gdzie do badań zostały użyte komórki prawidłowe mysich fibroblastów BALB/3T3.

Aktywność cytotoksyczną testowanych związków wobec komórek linii B16, Hs 294T, LoVo, LoVo/DX oraz Balb/3T3, do oceny aktywności cytostatycznej testowanych związków, użyto testu SRB mierzącego zahamowanie proliferacji komórek docelowych w 96-godzinnej hodowli in vitro [Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112, 1990]. W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia preparatu nanoszono w trzech powtórzeniach. Doświadczenia powtarzano co najmniej trzy razy. Dla każdego z badanych związków zostało wyznaczone stężenie związku powodujące zahamowanie proliferacji komórek w 50% (IC50).

PL233 199 Β1

Z przeprowadzonych badań wynika, że testowana seria związków wykazuje wysoką aktywność antyproliferacyjną, żaden z testowanych związków nie wykazuje lekooporności. Ponadto związki wykazują stosunkowo niską toksyczność wobec komórek prawidłowych mysich fibroblastów BALB/3T3, a jednocześnie dość silne działają w stosunku do badanych linii komórkowych.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Pochodna 1-(piperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu funkcjonalizowana wybraną pochodną aminokwasu o wzorze ogólnym:

   ^XC

   O gdzie R oznacza:

   dla związku (1) 1-(4-L-asparaginylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu:

   R= L-asparagina, dla związku (2) 1-(4-L-glutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu:

   R= L-glutamina, dla związku (3) 1-(4-L-piroglutaminylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu:

   R= L-piroglutamina, dla związku (4) 1-(4-L-serynylopiperazyn-1-ylo)-9,10-antrachinonu: R= L-seryna.