PL232494B1

PL232494B1 - Method for obtaining a transplant of cortical spongy bone debris for regeneration of bone tissue, and the transplant for this regeneration

Info

Publication number: PL232494B1
Application number: PL415287A
Authority: PL
Inventors: Henryk BURSIG; Henryk Bursig; Stanisław DYLĄG; Stanisław Dyląg; Fabian KĘPSKI; Fabian Kępski
Original assignee: Henryk Bursig; Dylag Stanislaw; Kepski Fabian; Regionalne Centrum Krwiodawstwa I Krwiolecznictwa
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2019-06-28
Also published as: PL415287A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej, oraz przeszczep do tej regeneracji.The subject of the invention is a method of obtaining a cortical-spongy debris graft for bone tissue regeneration and a graft for this regeneration.

Rozwiązania według wynalazku znajdują zastosowanie w klinice człowieka np. ortopedii, stomatologii, chirurgii onkologicznej do wypełniania ubytków kostnych - cyst, nowotworów, przetok, a także w zabiegach rewizyjnych endoprotezoplastyki stawu biodrowego.The solutions according to the invention are used in human clinics, e.g. in orthopedics, dentistry, oncological surgery for filling bone defects - cysts, tumors, fistulas, and also in revision procedures of hip arthroplasty.

Współczesna medycyna, zwłaszcza ortopedia odczuwa brak wystarczającej podaży allogenicznych przeszczepów tkanki kostnej gąbczastej. Pobranie tkanki własnej chorego nie zawsze jest możliwe (np. u dzieci), a u dorosłych występuje konieczność pobrania podczas tej samej operacji i przeszczepienia jej, co wydłuża czas zabiegu oraz zwiększa ryzyko ze względu na dwa pola operacyjne.Modern medicine, especially orthopedics, suffers from insufficient supply of allogeneic spongy bone grafts. The collection of the patient's own tissue is not always possible (e.g. in children), and in adults it is necessary to collect and transplant it during the same operation, which extends the time of the procedure and increases the risk due to two surgical fields.

Niewystarczająca liczba dawców tkanek ludzkich, powoduje, że dostępne w Bankach Tkanek przeszczepy tkanki kostnej gąbczastej nie są w stanie zabezpieczyć wszystkich potencjalnych odbiorców - szpitali oraz chorych, stąd poszukiwanie metod wytwarzania syntetycznych materiałów kościozastępczych, lub od zwierząt - przeszczepy ksenogeniczne.The insufficient number of human tissue donors means that the spongy bone transplants available in Tissue Banks are not able to secure all potential recipients - hospitals and patients, hence the search for methods of producing synthetic bone substitutes, or from animals - xenogeneic transplants.

Żaden z tych materiałów i substytutów, nie jest jednak tak efektywny w działaniu jak natywna kość ludzka.None of these materials and substitutes, however, are as effective as the native human bone.

Tkanka kostna to rodzaj tkanki łącznej zbudowanej z komórek - osteoblastów, osteocytów, osteoklastów, które stanowią ok. 5% masy tkanki oraz istoty międzykomórkowej.Bone tissue is a type of connective tissue made of cells - osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, which make up about 5% of the tissue mass and the intercellular substance.

Istota międzykomórkowa stanowiąca ok. 25% masy tkanki, składa się z części organicznej tzw. osteoidu, i części nieorganicznej, która stanowi 60-70% masy tkanki. Osteoid w skład którego wchodzi kolagen, osteonektyna, osteokalcyna, proteoglikany i mukopolisacharydy, nadaje tkance kostnej sprężystość i wytrzymałość, natomiast składniki nieorganiczne, którymi są sole wapnia, magnezu i fosforu, odpowiedzialne są za jej twardość. Tkanka kostna ma charakterystyczną organizację przestrzenną, tworząc kość.The intercellular substance, which constitutes about 25% of the tissue mass, consists of the organic part, the so-called the osteoid, and the inorganic portion that accounts for 60-70% of the mass of the tissue. The osteoid, which includes collagen, osteonectin, osteocalcin, proteoglycans and mucopolysaccharides, gives the bone tissue elasticity and strength, while the inorganic components, which are calcium, magnesium and phosphorus salts, are responsible for its hardness. Bone tissue has a characteristic spatial organization, forming bone.

Wyróżnia się tkankę kostną zbitą, która znajduje się w zewnętrznej części kości oraz tkankę kostną gąbczastą. Najwięcej tkanki kostnej gąbczastej, występuje przy nasadach kości długich.There are dense bone tissue located in the outer part of the bone and spongy bone tissue. The greatest amount of spongy bone tissue occurs at the epiphyses of long bones.

Na rynku dostępne są granulaty kostne wprowadzane do obrotu jako wyrób medyczny lub produkt leczniczy. W ortopedii i stomatologii w przypadku braku dostępności przeszczepów ludzkich stosowane są syntetyczne substytuty kości.There are bone granulates on the market that are marketed as a medical device or medicinal product. In orthopedics and dentistry, synthetic bone substitutes are used when human transplants are not available.

Przykładowo z publikacji P. Myciński, J. Zarzecka: Przegląd materiałów do rekonstrukcji kości stosowanych w chirurgii jamy ustnej, Poradnik Stomatologiczny, 2011, XI, 10; 426-431, znane są materiały ksenogenne (heterogenne), które są często stosowanymi w stomatologii wszczepami kostnymi. Materiały te pozyskiwane są z kości wołowych i wieprzowych i są praktycznie nieresorbowalne, biokompatybilne i bezpieczne w stosowaniu. Są przygotowywane w formie bloków lub granulatu zarówno kości gąbczastej, jak i zbitej, czasami z domieszką kolagenu. Przygotowanie takiego materiału polega na całkowitym odbiałczaniu pod wpływem wysokiej temperatury i promieniowania jonizującego. Pozostała matryca nieorganiczna stanowi rusztowanie dla nowej kości. W wyniku tego procesu dochodzi do usunięcia czynników wzrostowych, a tym samym właściwości osteoindukcyjnych. Odbiałczone kości zwierzęce stosowane do przeszczepów mają strukturę i powierzchnię zbliżoną do kości i dlatego wykazują potencjał osteokondukcyjny. Możliwe jest też otrzymywanie materiałów z wapniejących korali i alg, jednak są one rzadko stosowane ze względu na ryzyko późnych powikłań i gorsze właściwości osteokondukcyjne.For example, from the publication P. Myciński, J. Zarzecka: Review of materials for bone reconstruction used in oral surgery, Poradnik Stomatologiczny, 2011, XI, 10; 426-431, xenogeneous (heterogeneous) materials are known, which are often used bone implants in dentistry. These materials are obtained from beef and pork bones and are practically non-resorbable, biocompatible and safe to use. They are prepared in the form of blocks or granules of both spongy and compact bone, sometimes with an admixture of collagen. The preparation of such material consists in complete deproteinization under the influence of high temperature and ionizing radiation. The remaining inorganic matrix is the scaffold for the new bone. As a result of this process, the growth factors and thus the osteoinductive properties are removed. The deproteinized animal bones used for transplantation have a structure and surface similar to that of bone and therefore have osteoconductive potential. It is also possible to obtain materials from calcifying corals and algae, but they are rarely used due to the risk of late complications and poorer osteoconductive properties.

Na rynku znany jest preparat kostny pochodzenia bydlęcego produkowany przez firmę Geistlich Pharma AG z Wolhusen w Szwajcarii, który wykazuje bardzo wysoki stopień podobieństwa do ludzkiej kości, zarówno pod względem powierzchni, składu chemicznego jak i struktury materiału. Stanowi on jeden z najczęściej stosowanych obecnie substytutów kostnych w stomatologii. Preparat ten produkuje się ze specjalnie dobranego materiału w postaci kości kończyn bydlęcych, które spełniają konieczne wymogi dotyczące struktury i dojrzałości tkanki kostnej, jak również umożliwiają uzyskanie odpowiedniej ilości surowca. Przetwarzanie obejmuje kilka etapów, które wykazują wysoką skuteczność w zakresie inaktywacji prionów 10: produkt poddawany jest między innymi działaniu wysokich temperatur przez okres ponad 15 godzin, a także specyficznym procesom oczyszczania chemicznego, które obejmują poddawanie produktu działaniu roztworów silnych zasad przez okres kilku godzin. Zróżnicowane procesy chemiczne, jak również działanie wysokich temperatur wywierają silny efekt na inaktywację prionów, osiągając wysoką skuteczność usuwania potencjalnych czynników patogenetycznych.A bovine bone preparation produced by Geistlich Pharma AG from Wolhusen, Switzerland, is known on the market, which shows a very high degree of similarity to human bone, both in terms of surface, chemical composition and structure of the material. It is one of the most commonly used bone substitutes in dentistry. This preparation is made of specially selected material in the form of bovine limb bones, which meet the necessary requirements for the structure and maturity of bone tissue, as well as allow for obtaining the appropriate amount of raw material. The processing involves several steps which show a high efficiency in prion inactivation 10: the product is subjected, inter alia, to high temperatures for a period of more than 15 hours, and to specific chemical purification processes which involve treating the product with solutions of strong alkalis for a period of several hours. Diverse chemical processes as well as the action of high temperatures exert a strong effect on prion inactivation, achieving high efficiency in removing potential pathogenetic factors.

PL 232 494 B1PL 232 494 B1

Znaną metodą oczyszczania kości zwierząt jest odbiałczanie, polegające na pozbawieniu kości wszystkich substancji biologicznych występujących pomiędzy tzw. beleczkam i kostnymi (szpik, naczynia, system nerwowy), jak też komórek kostnych obecnych w jamkach kostnych (osteoblasty, osteoklasty i osteocyty). W efekcie odbiałczania kości otrzymuje się produkt w postaci szkieletu kolagenowo-apatytowego, z którego wykonuje się kształtki nadające się do wszczepiania operacyjnego w miejsce ubytków kostnych. Obróbce i późniejszemu wszczepianiu podlega wyłącznie tak zwana kość gąbczasta.A well-known method of cleansing animal bones is deproteinization, which consists in removing all biological substances between the so-called trabeculae and bone (marrow, vessels, nervous system) as well as bone cells present in the bone cavities (osteoblasts, osteoclasts and osteocytes). As a result of bone deproteinization, a product in the form of a collagen-apatite skeleton is obtained, from which shapes are made that can be surgically implanted in place of bone defects. Only the so-called spongy bone is processed and subsequently implanted.

Z dokumentacji zgłoszeniowej polskiego wynalazku P.403805 znany jest sposób odbiałczania kości zwierzęcych, zwłaszcza z cieląt lub młodych świń w wieku około jednego roku, pobranych korzystnie z miednicy, charakteryzujący się tym, że w pierwszym etapie oczyszcza się pobraną kość z przylegających tkanek zewnętrznych, w tym przede wszystkim z pozostałości mięsa, a następnie w dowolnej kolejności kość tnie się mechanicznie, korzystnie za pomocą piły diamentowej, na plastry o grubości od 1 do 10 cm oraz mechanicznie pozbawia się ją zewnętrznej kości korowej, korzystnie poprzez jej odcięcie za pomocą piły diamentowej, otrzymując plastry kości gąbczastej, natomiast w drugim, korzystnie równolegle prowadzonym etapie przygotowuje się od 1,0 N do 0,5 N roztwór NaOH lub KOH oraz wodny roztwór perhydrolu w proporcji od 1:1 do 1:5 do wody destylowanej, po czym z tak otrzymanych roztworów wykonuje się mieszaninę do odbiałczania kości, o proporcjach objętościowych 20-50%, korzystnie 35% NaOH lub KOH, 20-30%, korzystnie 25% wodnego roztworu perhydrolu i 20-60%, korzystnie 40% wody destylowanej, następnie w trzecim etapie, w naczyniach, korzystnie szklanych prowadzi się zasadniczy proces odbiałczania kości polegający na tym, że przygotowane w pierwszym etapie plastry kości gąbczastej zanurza się w przygotowanej w drugim etapie mieszaninie roztworów, po czym naczynia umieszcza się na podgrzewanych mieszadłach, korzystnie magnetycznych, w których mieszaninę roztworów z zanurzonymi w niej plastrami kości gąbczastej miesza się intensywnie i podgrzewa stopniowo od temperatury około 20°C do temperatury nie przekraczającej 60°C, w czasie niezbędnym do zupełnego odbiałczenia kości i otrzymania wyłącznie czystego szkieletu kolagenowo-apatytowego, przy czym czas ten kontroluje się poprzez obserwację odbiałczanej kości, prowadzoną korzystnie za pomocą lupy binokularnej lub mikroskopu skaningowego. Przed zanurzeniem plastrów kości gąbczastej w mieszaninie roztworów, zawiesza się je na uchwytach, korzystnie na hakach wykonanych z drutu miedzianego izolowanego poliuretanem lub PCV. Po zakończeniu zasadniczego procesu odbiałczania, plastry kości przemywa się kilkukrotnie, korzystnie pięciokrotnie wodą destylowaną i kilkukrotnie, korzystnie trzykrotnie spirytusem, zwłaszcza etanolem 99%.From the Polish patent application, P.403805, a method of deproteinizing animal bones, especially from calves or young pigs of about one year old, preferably taken from the pelvis, is known, characterized in that in the first stage, the removed bone is cleaned from adjacent external tissues, in mainly from the remains of meat, and then in any order the bone is cut mechanically, preferably with a diamond saw, into slices with a thickness of 1 to 10 cm, and the outer cortex is mechanically removed, preferably by cutting it off with a diamond saw, to obtain spongy bone slices, while in the second, preferably parallelly carried out, step, a 1.0 N to 0.5 N NaOH or KOH solution and an aqueous perhydrol solution in a ratio of 1: 1 to 1: 5 to distilled water are prepared, and then with of the solutions thus obtained, a mixture for bone deproteinization is made, with a volume ratio of 20-50%, preferably 35% NaOH or KOH , 20-30%, preferably 25% of an aqueous solution of perhydrol and 20-60%, preferably 40%, distilled water, then in the third stage, the main process of bone deproteinization is carried out in the third stage, i.e. the slices prepared in the first stage of the spongy bone is immersed in the mixture of solutions prepared in the second stage, and then the vessels are placed on heated stirrers, preferably magnetic, in which the mixture of solutions with slices of spongy bone immersed in it is intensively mixed and heated gradually from a temperature of about 20 ° C to a temperature not greater than 60 ° C for the time necessary to completely deproteinize the bone and obtain only a pure collagen-apatite skeleton, this time being monitored by observation of the deproteinized bone, preferably with a binocular magnifier or scanning microscope. Before immersing the spongy bone slices in the solution mixture, they are hung on holders, preferably on hooks made of copper wire insulated with polyurethane or PVC. After completion of the main deproteinization process, the bone slices are washed several times, preferably five times with distilled water, and several times, preferably three times, with spirit, especially ethanol 99%.

Niedogodnością powyższego sposobu jest to, że następujące po sobie procesy prowadzone są z zastosowaniem agresywnych substancji chemicznych - KOH lub NaOH oraz silnego roztworu perhydrolu, a także wygrzewaniu w podwyższonej temperaturze aż do +60°C, co powoduje uszkodzenie i usunięcie wszystkich biologicznych substancji stymulujących przebudowę tkanki kostnej.The disadvantage of the above method is that the following processes are carried out with the use of aggressive chemicals - KOH or NaOH and a strong perhydrol solution, as well as heating at an elevated temperature up to + 60 ° C, which causes damage and removal of all biological substances stimulating the remodeling. bone tissue.

W ortopedii i stomatologii, w przypadku braku dostępności przeszczepów, stosowane są również syntetyczne substytuty kości.In orthopedics and dentistry, synthetic bone substitutes are also used when grafts are not available.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.295638 znana jest bioaktywna kompozycja szklista na implanty kości, włókna i inne wyroby z niej wykonane lub ją zawierające oraz sposób wyciągania tej kompozycji do postaci włókienek.From the patent application P.295638 there is known a bioactive vitreous composition for bone implants, fibers and other products made of or containing it, and a method for drawing this composition into the form of fibrils.

Ze zgłoszenia wynalazku P.310793 znany jest sposób i zestaw do wytwarzania porowatych namiastek kości. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania porowatych namiastek kości wykazujących częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% oraz zestawu do wytwarzania porowatej namiastki kości wykazującej częściowo lub całkowicie współpołączony układ porów o przypadającym udziale objętościowym rzędu 5%-60% złożonego z odrębnych jednostek opakowaniowych. Cechą sposobu jest to, że (a) 0%-48% wagowych stałego składnika, składającego się z drobnocząsteczkowego polimeru estrów kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak katalizatory polimeryzacji, środki kontrastowe do zdjęć rentgenowskich, napełniacze i barwniki, b) 2%-50% wagowych ciekłego składnika, składającego się z monomeru estru kwasu akrylowego i/lub metakrylowego oraz ewentualnie dalszych dodatków, takich jak przyspieszacze polimeryzacji i stabilizatory i c) 50%-98% wagowych grubo cząsteczkowego granulatu z biokompatybilnego materiału o średnicy największej cząstki 0,5-10 mm miesza się ze sobą, ewentualnie przeprowadza w żądaną postać i następnie utwardza się. Cechą zestawu jest to, że zawiera on jednostki opakowaniowe ww. składników (a), (b) i (c).From the application of the invention P.310793 a method and a set for the production of porous bone substitutes is known. The invention relates to a method for the production of porous bone substitutes having a partially or fully interconnected pore system with a volumetric fraction of 5% -60% and a kit for the production of a porous bone substitute showing a partially or fully interconnected pore system with a volumetric fraction of 5% -60% composed of separate packaging units. A feature of the process is that (a) 0% -48% by weight of a solid component consisting of a fine polymer of acrylic and / or methacrylic acid esters and optionally further additives such as polymerization catalysts, X-ray contrast agents, fillers and dyes, b) 2% -50% by weight of the liquid component consisting of acrylic and / or methacrylic acid ester monomer and optionally further additives such as polymerization accelerators and stabilizers and c) 50% -98% by weight of coarse-particle granulate made of biocompatible material with the largest diameter particles 0.5-10 mm are mixed with each other, optionally converted into the desired form and then hardened. A feature of the set is that it contains the packaging units mentioned above. components (a), (b) and (c).

PL 232 494 B1PL 232 494 B1

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.320083 znany jest sposób wytwarzania ubogiej w tlenek wapniowy ceramiki z istoty gąbczastej kości. Wynalazek ten polega na tym, że między mineralizacją materiału kostnego, a spiekaniem na ceramikę, prowadzi się proces wymywania zdemineralizowaną wodą, dzięki któremu usuwa się udziały tlenku wapniowego ze zmineralizowanej matrycy kostnej.From the patent application P.320083 there is known a method of producing low in calcium oxide ceramics from spongy bone. The invention consists in that between the mineralization of the bone material and the sintering into the ceramics, a washing process is carried out with demineralized water, whereby the calcium oxide fractions from the mineralized bone matrix are removed.

Ze zgłoszenia wynalazku P.323448 znana jest substancja zastępująca kość i sposób jej wytwarzania. Przedmiotem tego wynalazku jest m.in. sposób przekształcania osadu standardowego obojętnego bezpostaciowego fosforanu wapnia w silnie reaktywne bezpostaciowe ciało stałe, które można wykorzystać do reakcji z innymi stałymi fosforanami wapnia z wytworzeniem słabo krystalicznego syntetycznego hydroksyapatytu, wykazującego bioaktywność i strukturalną integralność. Tę nową substancję bezpostaciową można poddać reakcji z innymi fosforanami wapnia w temperaturze 37°C lub niższej z wytworzeniem podobnej do kości substancji, zawierającej słabo krystaliczny hydroksyapatyt.From the patent application P.323448 a bone substitute substance and a method of its production are known. The subject of this invention is, inter alia, a method of converting the precipitate of standard neutral amorphous calcium phosphate into a highly reactive amorphous solid which can be used to react with other solid calcium phosphates to form a weakly crystalline synthetic hydroxyapatite exhibiting bioactivity and structural integrity. This new amorphous material can be reacted with other calcium phosphates at or below 37 ° C to form a bone-like substance containing weakly crystalline hydroxyapatite.

W zgłoszeniu wynalazku P.328226 ujawniono sztyft z warstwy korowej trzonu kości długiej. Zawiera on wewnętrzny kanał szpikowy, który można wypełnić dowolnym z wielu materiałów kościotwórczych.The invention application P.328226 discloses a pin made of the cortical layer of the long bone shaft. It contains an internal medullary canal that can be filled with any of a variety of bone-forming materials.

Ze zgłoszenia wynalazku P.334303 znany jest sposób wytwarzania oczyszczonego, dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, który charakteryzuje się tym, że obejmuje poddawanie ciałek wtrętowych czynnika morfogenetycznego kości, wytworzonego technologią inżynierii genetycznej, następującym etapom: a) traktowanie ciałka wtrętowego czynnika morfogenetycznego kości czynnikiem denaturującym w celu otrzymania rozpuszczonego monomeru, b) traktowanie rozpuszczonego monomeru roztworem do ponownego fałdowania w celu otrzymania dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości, c) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości ultrafiltracji i zastąpienie rozpuszczalnika, d) poddanie dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości w zastępującym rozpuszczalniku precypitacji izoelektrycznej i e) poddanie tak precypitowanego dimerycznego czynnika morfogenetycznego kości chromatografii z odwróconymi fazami.The patent application P.334303 discloses a method of producing a purified, dimeric bone morphogenetic factor, which is characterized in that it comprises subjecting the inclusion bodies of the bone morphogenetic factor produced by genetic engineering to the following steps: a) treating the inclusion bodies of the bone morphogenetic factor with a denaturing agent in to obtain dissolved monomer, b) treating the dissolved monomer with a refolding solution to obtain the dimeric bone morphogenetic factor, c) subjecting the dimeric bone morphogenetic factor to ultrafiltration and replacing the solvent, d) subjecting the dimeric bone morphogenetic factor in a replacement solvent to isoelectric precipitation and e) subjecting yes the precipitated dimeric bone morphogenetic factor in reverse phase chromatography.

Ze zgłoszenia wynalazku P.335103 znany jest materiał zastępujący kość, na bazie porowatego materiału polimerowego, o powierzchni pokrytej peptydami o sekwencji aminokwasów RGD.From the invention application P.335103 a bone substitute material is known, based on a porous polymeric material, the surface of which is coated with peptides with the amino acid sequence RGD.

Z opisu patentowego PL 191497 znana jest wielowarstwowa membrana użyteczna do stosowania w rekonstrukcji kości lub tkanki chrzęstnej in vivo, sposób jej wytwarzania oraz jej zastosowanie. Membrana ta charakteryzuje się tym, że zawiera warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu II oraz co najmniej jedną warstwę graniczną o zamkniętej, względnie nieprzepuszczalnej budowie zbudowaną głównie z kolagenu typu I i III i stanowi warstwę graniczną z naniesioną i liofilizowaną zawiesiną kolagenu typu II tworzącą warstwę macierzową o otwartej, gąbczastej budowie stabilnie przytwierdzoną do tej warstwy. Korzystnie membrana charakteryzuje się tym, że obejmuje pojedynczą warstwę graniczną. Korzystnie warstwa macierzowa umieszczona jest pomiędzy dwiema warstwami granicznymi i utworzona jest z materiału zawierającego kolagen typu II pochodzącego z naturalnej chrząstki. Materiał zawierający kolagen typu II pochodzi z chrząstki szklistej świń. Materiał zawierający kolagen typu II jest usieciowany. Warstwa graniczna lub warstwy graniczne pochodzą z błony otrzewnowej cieląt lub świń. Warstwa macierzowa jest impregnowana chondrocytami wyizolowanymi z chrząstki stawowej, okostnej, tkanki okołochrzęstnej lub mezenchymalnymi komórkami macierzystymi ze szpiku kostnego. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne są impregnowane glikozoaminoglikanem. Glikozoaminoglikan jest kwasem hialuronowym, chondroityno-6-siarczanem, siarczanem keratyny lub siarczanem dermatanu. Warstwa macierzowa i warstwa graniczna lub warstwy graniczne są zasadniczo wolne od proteoglikanów. Warstwa macierzowa i/lub warstwa graniczna lub warstwy graniczne zawierają ponadto chondronektynę, lamininę, fibronektynę, alginian wapnia, anchorynę typu II, czynniki wzrostowe lub czynniki morfogenetyczne kości.From the patent description PL 191497 there is known a multilayer membrane useful for use in the reconstruction of bone or cartilage in vivo, a method of its production and its use. The membrane is characterized by the fact that it comprises a matrix layer with an open, spongy structure composed mainly of type II collagen and at least one boundary layer with a closed or impermeable structure composed mainly of type I and III collagen, and it constitutes a boundary layer with an applied and lyophilized suspension. type II collagen, forming a matrix layer with an open, spongy structure, stably attached to this layer. Preferably, the membrane is characterized in that it comprises a single boundary layer. Preferably, the matrix layer is sandwiched between two boundary layers and is made of a type II collagen-containing material derived from natural cartilage. Type II collagen material comes from porcine hyaline cartilage. Type II collagen material is cross-linked. The boundary layer or layers are derived from the peritoneal membrane of calves or pigs. The matrix layer is impregnated with chondrocytes isolated from articular cartilage, periosteum, periochondral tissue, or mesenchymal stem cells from bone marrow. The matrix layer and / or the boundary layer or layers are impregnated with glycosaminoglycan. The glycosaminoglycan is hyaluronic acid, chondroitin-6-sulfate, keratin sulfate or dermatan sulfate. The matrix layer and the boundary layer or layers are substantially free of proteoglycans. The matrix layer and / or boundary layer or boundary layers further comprises chondronectin, laminin, fibronectin, calcium alginate, type II anchorin, growth factors or bone morphogenetic factors.

Sposób wytwarzania określonej powyżej wielowarstwowej membrany charakteryzuje się tym, że zawiesinę kolagenu typu II nanosi się na powierzchnię warstwy granicznej, a następnie przeprowadza się liofilizację do uzyskania stabilnie przytwierdzonej warstwy macierzowej z kolagenu typu II o otwartej, gąbczastej strukturze.The method for producing the above-defined multilayer membrane is characterized in that a type II collagen suspension is applied to the surface of the boundary layer and then lyophilized to obtain a firmly attached type II collagen matrix layer with an open, spongy structure.

Przedmiotem tego wynalazku jest również zastosowanie opisanej powyżej membrany, do wytwarzania wszczepu do kierowanej regeneracji tkanki.The invention also relates to the use of a membrane as described above for the production of an implant for guided tissue regeneration.

Z opisu patentowego PL 208538 znany jest produkt zawierający ziarnisty materiał kostny oraz zastosowanie produktu mineralnego kości. Wynalazek dotyczy produktu zawierającego ziarnisty materiał kostny do naprawy złożonego urazu chrząstki i kości, który zawiera porowate cząstki minerału kostnego pochodzące z naturalnej kości, o strukturze zasadniczo identycznej ze strukturą naturalnej kości i zasadniczo pozbawione endogennej substancji organicznej, przy czym cząstki mają na powierzchniFrom the patent description PL 208538 a product containing granular bone material and the use of a bone mineral product are known. The invention relates to a product containing granular bone material for the repair of a complex cartilage and bone injury, which contains porous bone mineral particles derived from natural bone, with a structure substantially identical to that of natural bone and substantially free of endogenous organic matter, the particles having on the surface

PL 232 494 B1 możliwe do resorpcji, fizjologicznie zgodne włókna kolagenu II, przy czym stosunek wagowy włókien kolagenowych do porowatego minerału kostnego wynosi przynajmniej 1:40. Korzystnie cząstki mają przeciętną średnicę w zakresie od 0,1 do 5 mm. Korzystnie produkt dalej obejmuje przynajmniej jedną adsorbowaną substancję farmaceutycznie albo biologicznie czynną. Bardziej korzystnie substancja biologicznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej taurolidynę, tauraltam i ich mieszaniny. Bardziej korzystnie substancja farmaceutycznie czynna jest wybrana z grupy obejmującej białka morfogenetyczne kości (BMP), inne cząsteczki macierzy kostnej i peptydy sygnałowe, a najkorzystniej z grupy obejmującej BMP-2-8. TGF-β, TGF-βΤ VEGF, IGF, PTHrH i PDGF. Bardziej korzystnie produkt dalej obejmuje komórki macierzyste chrząstki albo kości. Korzystnie produkt dalej obejmuje żelatynę w fazie żelowej, przy czym włókna kolagenu II występują w tej fazie żelowej, zaś faza żelowa obejmuje od 2% do 20% wagowych materiału kostnego. Korzystnie kolagen pochodzi z chrząstki. Korzystnie stosunek wagowy włókien kolagenu wynosi około 1:20. Korzystnie produkt ponadto zawiera żelatynę w fazie żelu, przy czym włókna kolagenu II są obecne w fazie żelowej, która zawiera 2-8% wagowych materiału kostnego. Korzystnie produkt obejmuje mezenchymalne komórki macierzyste o zdolności do różnicowania w komórki do regeneracji chrząstki lub kości.Resorbable, physiologically compatible collagen II fibers, wherein the weight ratio of collagen fibers to porous bone mineral is at least 1:40. Preferably, the particles have an average diameter ranging from 0.1 to 5 mm. Preferably, the product further comprises at least one adsorbed pharmaceutically or biologically active substance. More preferably, the biologically active substance is selected from the group consisting of taurolidine, tauraltam and mixtures thereof. More preferably, the pharmaceutically active substance is selected from the group consisting of bone morphogenetic proteins (BMPs), other bone matrix molecules and signal peptides, and most preferably from the group consisting of BMP-2-8. TGF-β, TGF-βΤ VEGF, IGF, PTHrH and PDGF. More preferably, the product further comprises cartilage or bone stem cells. Preferably, the product further comprises gelatin in the gel phase, wherein collagen II fibers are present in this gel phase and the gel phase comprises 2% to 20% by weight of bone material. Preferably the collagen is derived from cartilage. Preferably, the weight ratio of collagen fibers is about 1:20. Preferably, the product further comprises gelatin in the gel phase, the collagen II fibers being present in a gel phase which comprises 2-8% by weight of bone material. Preferably the product comprises mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into cartilage or bone regeneration cells.

W zakres wynalazku wchodzi również zastosowanie produktu mineralnego kości określonego powyżej, do wytwarzania wyrobu chirurgicznego do stosowania w sposobie leczenia ludzi lub osobnika zwierzęcego, u którego ten wyrób jest wszczepiany do połączonego ubytku chrząstki i kości u pacjenta. Korzystnie ubytek chrząstki i kości jest zlokalizowany na zakończeniu kości stawowej. Korzystnie obejmuje wprowadzenie wyrobu do ubytku kostnego, a następnie pokrycie produktu mineralnego i ubytku kostnego membraną kolagenową. Bardziej korzystnie membrana kolagenowa obejmuje warstwę kolagenu II. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze oraz przynajmniej jednej warstwie barierowej o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej. Bardziej korzystnie warstwa barierowa jest głównie zbudowana z kolagenu I, kolagenu III albo ich mieszaniny. Korzystnie membrana obejmuje warstwę macierzy głównie z kolagenu II o otwartej, gąbczastej fakturze nałożonej na miękką, włóknistą warstwę błony kolagenu I/III o zwartej, gładkiej powierzchni barierowej przeciwległej do warstwy macierzy.Also within the scope of the invention is the use of a bone mineral product as defined above in the manufacture of a surgical device for use in a method of treating a human or an animal subject in which the device is implanted into a combined cartilage and bone defect in a patient. Preferably, the cartilage and bone defect is located at the end of an articular bone. Preferably, it comprises introducing the product into the bone defect and then covering the mineral product and the bone defect with a collagen membrane. More preferably, the collagen membrane comprises a collagen II layer. Preferably, the membrane comprises a predominantly collagen II matrix layer with an open spongy texture and at least one barrier layer with a compact, smooth barrier surface. More preferably the barrier layer is mainly composed of collagen I, collagen III or a mixture thereof. Preferably, the membrane comprises a predominantly collagen II matrix layer with an open, spongy texture applied over a soft, fibrous collagen I / III membrane layer with a dense, smooth barrier surface opposite the matrix layer.

Ze zgłoszenia wynalazku P.358848 znany jest materiał do leczenia kości, obejmujący macierz niosącą hodowane komórki kościotwórcze, którymi mogą być osteocyty, osteoblasty, macierzyste komórki zrębu lub komórki macierzyste zdolne różnicowania w kościotwórcze osteoblasty. Macierz jest oczyszczonym materiałem macierzy kolagenu pochodzącym z naturalnej tkanki zwierzęcej zawierającej kolagen, porowatym materiałem mineralnej macierzy kości pochodzącym z naturalnej kości mającym strukturę krystaliczną zasadniczo taką jak naturalna kość i będącym zasadniczo wolnym od endogennego materiału organicznego lub kombinacją materiału oczyszczonej macierzy kolagenowej i porowatego materiału macierzy mineralnej.From the invention application P.358848 there is known a bone treatment material comprising a matrix carrying cultured osteogenic cells, which may be osteocytes, osteoblasts, stromal stem cells or stem cells capable of differentiating into osteoblastic osteoblasts. The matrix is a purified collagen matrix material derived from natural animal tissue containing collagen, a porous bone mineral matrix material derived from natural bone having a crystalline structure essentially like natural bone and being essentially free of endogenous organic material, or a combination of a purified collagen matrix material and a porous mineral matrix material .

Znany ze stanu techniki wynalazek PL 216995 rozwiązuje problem otrzymywania kompozytowych materiałów implantacyjnych o podwyższonej wytrzymałości. W jednym z rozwiązań sposób polega na tym, że wyjściowy proszek składający się z półwodnego siarczanu wapnia (CSH) w ilości 40%-100% masowych z dodatkiem wysokoreaktywnego hydroksyapatytu korzystnie modyfikowanego jonami Mg, Ti, CO3 w ilości 0%-60% masowych zarabia się 0,5%-2,0% roztworem chitozanu w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu 0,2%-2,0% w ilości 0,4-0,7 ml/g mieszaniny, uzyskując pastę typu cementowego o konsystencji plastycznej masy wiążącej w miejscu implantacji.The invention PL 216995 known from the prior art solves the problem of obtaining composite implant materials with increased strength. In one embodiment, the method consists in the fact that the starting powder consisting of calcium sulphate hemihydrate (CSH) in the amount of 40% -100% by weight with the addition of highly reactive hydroxyapatite, preferably modified with Mg, Ti, CO3 ions in the amount of 0% -60% by weight, 0.5% -2.0% chitosan solution in aqueous acetic acid solution with a concentration of 0.2% -2.0% in the amount of 0.4-0.7 ml / g of the mixture, obtaining a cement-type paste with the consistency of a plastic mass binding at the site of implantation.

Z dokumentacji zgłoszeniowej wynalazku P.401954 znany jest wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości. Materiał stanowi co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa nanowłókien, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych połączonymi z warstwą nanowłókien techniką igłowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze warstwy nanowłókien, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy nanowłókien. W odmianie wynalazku wielowarstwowy materiał medyczny przeznaczony na implant do wypełnień kości stanowi także co najmniej jeden układ trzech warstw, z których środkową jest warstwa porowata z polimeru biodegradowalnego, w postaci pianki lub w postaci membrany, zaś zewnętrzne warstwy są warstwami włókniny igłowanej z włókien klasycznych, połączonymi z membraną lub pianką techniką klejenia lub prasowania. Materiał zawiera co najmniej jeden spośród dodatków ceramicznych, węglowych i metalicznych oraz czynnik wzrostu lub lek. Dodatek ceramiczny, węglowy lub metaliczny, w postaci nanododatku, jest zawarty w strukturze pianki lubFrom the application documentation of the invention P.401954 there is known a multi-layer medical material intended for an implant for bone filling. The material consists of at least one system of three layers, the middle of which is a nanofiber layer, and the outer layers are layers of a needle-punched non-woven fabric made of classic fibers connected to the nanofiber layer by needling. The material includes at least one of ceramic, carbon, and metal additives and a growth factor or drug. A ceramic, carbon or metallic additive, in the form of a nanoadditive, is contained in the structure of the nanofiber layer, and a growth factor or drug, encapsulated in biopolymer microspheres, is deposited on the surface of the nanofiber layer. In a variant of the invention, the multilayer medical material intended for an implant for bone fillings also comprises at least one system of three layers, the middle of which is a porous layer made of a biodegradable polymer, in the form of a foam or in the form of a membrane, and the outer layers are layers of a needle-punched non-woven fabric made of classic fibers, connected with a membrane or foam by gluing or pressing. The material includes at least one of ceramic, carbon, and metal additives and a growth factor or drug. A ceramic, carbon or metallic additive, in the form of a nano-additive, is contained in the foam structure or

PL 232 494 B1 membrany, zaś czynnik wzrostu lub lek, enkapsulowany w mikrosferach z biopolimeru, jest osadzony na powierzchni warstwy pianki lub membrany.The membrane, and the growth factor or drug, encapsulated in the biopolymer microspheres, is deposited on the surface of the foam layer or membrane.

Ze zgłoszenia wynalazku P.284988 znany jest sposób wytwarzania hydroksyapatytowego materiału implantacyjnego, przeznaczonego zwłaszcza do wypełniania ubytków w kościach.From the patent application P.284988 there is known a method of producing a hydroxyapatite implantable material, intended in particular for filling bone defects.

Celem twórców wynalazku było opracowanie nowej technologii otrzymywania przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej przy założeniu, że technologia ta znajdzie zastosowanie przede wszystkim w przypadku kości korowo-gąbczastej, i pozwoli wyeliminować niedogodności dotychczas znanych sposobów otrzymywania takich przeszczepów, zwłaszcza konieczność stosowania agresywnych substancji chemicznych jak KOH lub NaOH oraz silnego roztworu perhydrolu i wysokich temperatur.The aim of the inventors was to develop a new technology of obtaining a graft for bone tissue regeneration, assuming that this technology will be used primarily in cortico-spongy bone and will eliminate the disadvantages of previously known methods of obtaining such grafts, especially the need to use aggressive chemicals such as KOH or NaOH and a strong solution of perhydrol and high temperatures.

Powyższy cel osiągnięto, łącząc w innowacyjny sposób dostępne metody cięcia, odtłuszczania, płukania, liofilizowania i mielenia w specjalnych warunkach i pod szczególnymi, standaryzowanymi parametrami poszczególnych procesów.The above goal was achieved by combining in an innovative way the available methods of cutting, degreasing, rinsing, freeze-drying and grinding in special conditions and under specific, standardized parameters of individual processes.

Istotą sposobu otrzymywania przeszczepu gruzu korowo-gąbczastego do regeneracji tkanki kostnej według wynalazku jest to, że składa się z następujących po sobie etapów: oczyszczania mechanicznego kości, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego z tkanek miękkich, dzielenia kości na fragmenty, zamrażania kości w temp. około -40°C, mielenia zamrożonych kości aż do uzyskania gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwania rozmrożonego gruzu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczania gruzu w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczania gruzu w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukiwania gruzu NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, odsączania gruzu z NaCl, i sterylizacji radiacyjnej gruzu, korzystnie w dawce 35 kGy.The essence of the method of obtaining a cortical-spongy debris graft for bone tissue regeneration according to the invention is that it consists of the following stages: mechanical cleansing of the bones, preferably the human hip plate from soft tissues, dividing the bones into fragments, freezing the bones at approx. -40 ° C, grinding frozen bones to obtain rubble with a grain size of 0.5 mm to 15 mm, preferably 5 mm - 10 mm, thawing obtained after grinding the rubble in water at + 15 ° C to + 35 ° C , rinsing thawed debris with water at a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably degreasing debris in C2H5OH with a concentration of 60% to 96%, degreasing debris in H2O2 with a concentration of 1% to 40%, rinsing debris with NaCl at a concentration of 0.1 % to 10%, drainage of the debris with NaCl, and radiation sterilization of the debris, preferably at a dose of 35 kGy.

W odmianie wynalazku, pomiędzy etapem odsączania z resztek NaCl i etapem sterylizacji radiacyjnej gruzu, następuje etap zamrożenia gruzu w temp. około -40°C, a po nim etap liofilizacji zamrożonego gruzu przy parametrach temperatury od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.In a variant of the invention, between the stage of draining the remains of NaCl and the stage of radiation sterilization of debris, there is a stage of freezing the debris at about -40 ° C, followed by the stage of freeze drying of the frozen debris at temperatures from -52 ° C to -50 ° C, vacuum from 0.016 mBar to 0.018 mBar, most preferably for a period of 48 hours.

Korzystnie do oczyszczania mechanicznego kości, stosuje się tnące narzędzia chirurgiczne.Preferably, surgical cutting tools are used for the mechanical cleaning of bones.

Korzystnie kości dzieli się na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej.Preferably, the bones are divided into fragments using a hand saw or a power saw.

Korzystnie fragmenty kości wynoszą max. 5 cm na 5 cm.Preferably, the bone fragments are max. 5 cm by 5 cm.

Korzystnie zamrażanie kości albo gruzu prowadzi się w temp. od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.Preferably, the freezing of bones or debris is carried out at a temperature of from -80 ° C to -20 ° C, most preferably for a period of 24 h to 72 h, preferably in a freezer.

Korzystnie mielenie kości prowadzi się młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.Preferably, the grinding of the bones is carried out with a hand grinder using rotating cutting inserts.

Korzystnie do rozmrażania uzyskanego po mieleniu gruzu stosuje się wodę dejonizowaną o temp. + 25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), a rozmrażanie prowadzi się w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.Preferably, deionized water at a temperature of + 25 ° C is used for thawing of the rubble obtained after grinding, maintaining the proportion of 2: 1 (2 ml of water per 1 g of bone), and the thawing time is from 10 minutes to 60 minutes, most preferably 15 minutes. .

Korzystnie w czasie rozmrażania gruzu, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.Preferably, during thawing of the debris, it is shaken at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 minutes at a rotation of 160 rpm.

Korzystnie do przepłukiwania rozmrożonego gruzu stosuje się wodę pod ciśnieniem 8 MPa, a przepłukiwanie prowadzi się w czasie od 2 min do 5 min, najkorzystniej 3 min.Preferably, water under the pressure of 8 MPa is used to rinse the thawed debris, and the rinsing time is from 2 min to 5 min, most preferably 3 min.

Korzystnie odłuszczanie gruzu w C2H5OH prowadzi się stosując C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.Preferably, the degreasing of debris in C2H5OH is carried out using C2H5OH with a concentration of 70%, maintaining the 4: 1 ratio (4 ml C2H5OH per 1 g of bone), for a period of 24 hours at room temperature.

Korzystnie odtłuszczanie gruzu w H2O2 prowadzi się stosując H2O2 o stężeniu 3%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).Preferably, the degreasing of the debris in H2O2 is carried out with 3% H2O2, maintaining the proportion of 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone).

Korzystnie w czasie odtłuszczania gruzu w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.Preferably, during the degreasing of the debris in H2O2, it is shaken at least once on a shaker, preferably an orbital, for 15 minutes at a rotation of 160 rpm.

Korzystnie w czasie odtłuszczania gruzu jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsa się go na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym H2O2, w którym następowało wytrząsanie odlewa się, a gruz zalewa się nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawia na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.Preferably, when degreasing the debris in H2O2 only, shake it at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 min at 160 rpm, then the shaking H2O2 is poured and the debris is poured with new, unreacted portion of H2O2, and set aside for 24 h at + 2 ° C to + 8 ° C, conveniently in a refrigerator.

Korzystnie przepłukiwanie gruzu NaCl prowadzi się stosując NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.Preferably, washing of the debris with NaCl is carried out with NaCl at a concentration of 0.9%, maintaining the ratio of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of bone), for 5 minutes to 30 minutes, most preferably 15 minutes.

Korzystnie odsączanie gruzu z NaCl, prowadzi się na papierze bezpyłowym.Preferably, the filtration of the rubble with NaCl is carried out on dust-free paper.

Istotą przeszczepu do regeneracji tkanki kostnej według wynalazku jest to, że stanowi go tkanka kostna korowo-gąbczasta, korzystnie talerza biodrowego pochodzenia ludzkiego, w postaci gruzu o wielkości ziarna od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie 5 mm - 10 mm, oczyszczona mechanicznie z tkanek miękkich, podzielona na fragmenty, zamrożona w temp. ok. -40°C, mielona w stanie zamrożenia aż doThe essence of the graft for bone tissue regeneration according to the invention is that it is a cortical-spongy bone tissue, preferably a iliac plate of human origin, in the form of debris with a grain size from 0.5 mm to 15 mm, preferably 5 mm - 10 mm, mechanically cleaned from soft tissues, divided into fragments, frozen at a temperature of approx. -40 ° C, ground in a frozen state until

PL 232 494 B1 uzyskania gruzu o pożądanej wielkości ziarna, rozmrożona po mieleniu w wodzie o temp. +15°C do +35°C, przepłukiwana po rozmrożeniu wodą pod ciśnieniem od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie odłuszczona w C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%, odtłuszczona w H2O2 o stężeniu od 1% do 40%, przepłukana NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%, pozbawiona resztek NaCI, H2O2, korzystnie również C2H5OH, sterylizowana radiacyjnie w dawce 35 kGy.Obtaining debris of the desired grain size, thawed after grinding in water at a temperature of + 15 ° C to + 35 ° C, rinsed after thawing with water under a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably degreased in C2H5OH with a concentration of 60 % to 96%, degreased in H2O2 at a concentration of 1% to 40%, rinsed with NaCl at a concentration of 0.1% to 10%, devoid of residual NaCl, H2O2, preferably also C2H5OH, radiation sterilized at a dose of 35 kGy.

W odmianie wynalazku przeszczep stanowi tkanka, poddana po odsączaniu z resztek NaCl przed sterylizacją radiacyjną, zamrożeniu w temp. około -40°C, a po nim liofilizacji przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, najkorzystniej przez okres 48 h.In a variant of the invention, the graft is a tissue that has been subjected to drainage from the remains of NaCl before radiation sterilization, frozen at about -40 ° C, and then freeze-dried at the temperature parameters from -52 ° C to -50 ° C, vacuum from 0.016 mBar up to 0.018 mBar, most preferably for a period of 48 h.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę oczyszczoną mechanicznie, za pomocą tnących narzędzi chirurgicznych.Preferably, the graft comprises tissue cleaned mechanically using cutting surgical instruments.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę podzieloną na fragmenty za pomocą piły ręcznej lub mechanicznej, najlepiej na fragmenty o wielkości max. 5 cm na 5 cm.Preferably, the graft comprises tissue divided into fragments using a hand or power saw, preferably into fragments of max. 5 cm by 5 cm.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę zamrożoną w temp. od -80°C do -20°C, najkorzystniej przez okres od 24 h do 72 h, najlepiej w zamrażarce.Preferably, the graft comprises tissue frozen at -80 ° C to -20 ° C, most preferably for a period of 24 h to 72 h, preferably in a freezer.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę mieloną młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących.Preferably, the graft comprises tissue ground with a hand grinder using rotary cutting inserts.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę rozmrożoną wodą dejonizowaną o temp. +25°C, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), w czasie od 10 min do 60 min, najkorzystniej 15 min.Preferably, the graft contains tissue that has been thawed with deionized water at + 25 ° C, maintaining the proportion of 2: 1 (2 ml of water per 1 g of bone), for 10 minutes to 60 minutes, most preferably 15 minutes.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie rozmrażania na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.Preferably, the graft comprises tissue at least once shaken during thawing on a shaker, preferably orbital, for 15 min at 160 rpm.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę przepłukaną wodą, pod ciśnieniem 8 MPa, w czasie od min do 5 min, najkorzystniej 3 min.Preferably, the graft comprises tissue flushed with water at a pressure of 8 MPa for a period ranging from min to 5 min, most preferably 3 min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odłuszczoną w C2H5OH o stężeniu 70% z zachowaniem proporcji 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości), przez okres 24 h, w temp. pokojowej.Preferably, the graft contains tissue degreased in C2H5OH with a concentration of 70%, keeping the proportion of 4: 1 (4 ml of C2H5OH per 1 g of bone), for a period of 24 hours at room temperature.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odłuszczoną w H2O2 o stężeniu 3% z zachowaniem proporcji 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości).Preferably, the graft contains tissue degreased in 3% H2O2 with the proportion being 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone).

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę co najmniej raz wytrząsaną w czasie odtłuszczania w H2O2 na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min.Preferably, the graft comprises tissue at least once shaken during degreasing in H 2 O 2 on a shaker, preferably orbital, for 15 min at 160 rpm.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę, którą w czasie odtłuszczania jedynie w H2O2, co najmniej raz wytrząsano na wytrząsarce, najlepiej orbitralnej, przez 15 min przy obrotach 160 obr./min, po czym zalano nową, nieprzereagowaną porcją H2O2, i odstawiono na 24 h w temp. +2°C do +8°C, dogodnie w chłodziarce.Preferably, the graft comprises tissue which, during degreasing only in H2O2, was shaken at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 minutes at 160 rpm, then flooded with a new, unreacted portion of H2O2, and allowed to stand for 24 hours at + 2 ° C to + 8 ° C, conveniently in a refrigerator.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę przepłukaną NaCl o stężeniu 0,9%, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości), w czasie od 5 min do 30 min, najkorzystniej 15 min.Preferably, the graft contains 0.9% NaCl flushed tissue, maintaining a 3: 1 ratio (3 ml of NaCl per 1 g of bone), for 5 min to 30 min, most preferably 15 min.

Korzystnie przeszczep zawiera tkankę odsączoną z NaCl na papierze bezpyłowym.Preferably the graft comprises NaCl drained tissue on dust-free paper.

Zaletą wynalazku jest to, że w wyniku nowej technologii uzyskano przeszczep do regeneracji tkanki kostnej, o niespotykanych dotąd właściwościach, który może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej.The advantage of the invention is that the new technology results in a bone regeneration graft with unprecedented properties, which can be used to treat bone defects.

Zastosowanie w sposobie według wynalazku łagodnych substancji chemicznych jak C2H5OH, H2O2 i NaCl oraz wyeliminowanie konieczności wygrzewania kości w podwyższonej temp., dochodzącej do +60°C umożliwiło zachowanie w przeszczepie biologicznych substancji stymulujących budowę tkanki kostnej. Dzięki temu przeszczep jest biologicznie zgodny, oczyszczony z komórek szpiku o silnych właściwościach immunogennych.The use of mild chemicals in the method according to the invention, such as C2H5OH, H2O2 and NaCl, and the elimination of the need to heat the bones at elevated temperatures, up to + 60 ° C, made it possible to preserve biological substances stimulating the structure of bone tissue in the transplant. Thanks to this, the graft is biologically compatible, purified from bone marrow cells with strong immunogenic properties.

Dzięki starannie dobranym czynnościom i parametrom przygotowania, przeszczep jest bezpieczny dla potencjalnego biorcy, i może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej u ludzi.Thanks to carefully selected activities and preparation parameters, the transplant is safe for a potential recipient and can be used to treat bone defects in humans.

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą,The hip plate, preferably of human origin, tested for infectious diseases, is cleaned of soft tissues using surgical cutting tools. Then, using a hand saw or a mechanical saw, it is cut into fragments of max. 5 cm by 5 cm. The fragments cleared of soft tissues are frozen at -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period of 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material before the grinding process). The frozen preparation is then ground with a manual grinder, using rotary cutting inserts selected according to the intended final granulation, which may be from 0.5 mm to 15 mm, preferably from 5 mm to 10 mm. The bone debris formed after grinding is weighed on a laboratory balance and placed in a 1000 ml beaker. Weighed 100 g of rubble is poured with water,

PL 232 494 B1 korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny odtłuszcza się za pomocą alkoholu etylowego C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temp. pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po tym czasie C2H5OH odlewa się, a gruz kostny zalewa się w celu pozbycia się pozostałość komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 o stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Wytrząsanie w H2O2 powtarza się dwukrotnie. Po zakończeniu odtłuszczania H2O2 odlewa się, i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Następnie przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, preparat dzieli się na porcje o objętości 10 cm³ oraz 20 cm³, poporcjowany preparat pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego. Przeszczep przechowuje się w temp. poniżej - 40°C, korzystnie w temp. od -80°C do -40°C.PL 232 494 B1 preferably with deionized water at a temperature of + 15 ° C to + 35 ° C, preferably + 25 ° C, in the amount of about 200 ml, keeping the ratio 2: 1 (2 ml of water per 1 g of bone), for 10 minutes to 60 minutes, preferably 15 minutes, for final defrosting of the preparation. The preparation is then shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. The shaking operation is repeated twice. After shaking, the water is poured off and the preparation is rinsed with water in a 500 ml sieve using a pressure washer, applying a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably 8 MPa, for 2 min to 5 min, preferably 3 min. The bone debris prepared in this way is degreased with 70% C2H5OH ethyl alcohol, keeping the proportion of 4: 1 (4 ml C2H5OH per 1 g of bone) and set aside for 24 h at room temperature. It is also allowed to use C2H5OH with a concentration of 60% to 96%. After this time, C2H5OH is poured off and the bone debris is poured over in order to get rid of the remaining red and yellow marrow cells with hydrogen peroxide H2O2 at a concentration of 3% in the amount of approx. 300 ml, keeping the ratio 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone ) and shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. It is also allowed to use H2O2 with a concentration from 1% to 40%. Shaking in H2O2 was repeated twice. After the degreasing of H2O2 is completed, the debris is poured over with sodium chloride 0.9% NaCl in the amount of 300 ml, keeping the proportion of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of bone) and set aside for a period of 5 min to 30 min, preferably 15 min. You can also use NaCl with a concentration of 0.1% to 10%. After the indicated time has elapsed, the NaCl is poured off and its remains are filtered off on dust-free paper. Then, using a syringe, preferably with a capacity of 30 cm ³ , the preparation is divided into portions of 10 cm ³ and 20 cm ³ , the portioned preparation is packed in tightly closed containers, which are covered with an identification label, and then radiation sterilized in a dose of 35 kGy . After the entire process of qualification, processing, packaging and sterilization has been checked, bone debris transplant is approved for clinical use. The graft is stored at a temperature below - 40 ° C, preferably at a temperature from -80 ° C to -40 ° C.

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałość komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po zakończeniu wytrząsania odlewa się H2O2, ponownie zalewa świeżym H2O2, zachowując proporcje 3:1 i odstawia na 24 h do chłodziarki o temp. +2°C do +8°C. Po tym czasie odlewa się H2O2 i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g tkanki) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Następnie przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, preparat dzieli się na porcje o objętości 10 cm oraz 20 cm³, poporcjowany preparat pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego. Przeszczep przechowuje się w temp. poniżej -40°C, korzystnie w temp. od -80°C do -40°C.The hip plate, preferably of human origin, tested for infectious diseases, is cleaned of soft tissues using surgical cutting tools. Then, using a hand saw or a mechanical saw, it is cut into fragments of max. 5 cm by 5 cm. The fragments cleared of soft tissues are frozen at -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period of 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material before the grinding process). The frozen preparation is then ground with a manual grinder, using rotary cutting inserts selected according to the intended final granulation, which may be from 0.5 mm to 15 mm, preferably from 5 mm to 10 mm. The bone debris formed after grinding is weighed on a laboratory balance and placed in a 1000 ml beaker. Weighed 100 g of rubble is poured with water, preferably deionized water, at a temperature of + 15 ° C to + 35 ° C, preferably + 25 ° C, in the amount of approx. 200 ml, keeping the ratio 2: 1 (2 ml of water per 1 g bone), for 10 min to 60 min, preferably 15 min, for final thawing of the preparation. The preparation is then shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. The shaking operation is repeated twice. After shaking, the water is poured off and the formulation is rinsed with water in a 500 ml sieve using a pressure washer using a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably 8 MPa, for 2 min to 5 min, preferably 3 min. The bone debris prepared in this way is poured over, in order to get rid of the remaining red and yellow marrow cells, with hydrogen peroxide H2O2 at a concentration of 3% in the amount of approx. 300 ml, keeping the proportion 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone), shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. It is also allowed to use H2O2 with a concentration from 1% to 40%. After shaking, the H2O2 is poured off, poured again with fresh H2O2, keeping the proportion of 3: 1 and set aside for 24 hours in a refrigerator with a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C. After this time, H2O2 is poured and to get rid of its residues, the debris is flooded with sodium chloride NaCl with a concentration of 0.9% in the amount of 300 ml, keeping the ratio of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of tissue) and set aside for 5 min to 30 min, preferably 15 min. You can also use NaCl with a concentration of 0.1% to 10%. After the indicated time has elapsed, the NaCl is poured off and its remains are filtered off on dust-free paper. Then, using a syringe, preferably with a capacity of 30 cm ³ , the preparation is divided into portions of 10 cm 3 and 20 cm ³ , the portioned preparation is packed in tightly closed containers, which are covered with an identification label, and then radiation sterilized at a dose of 35 kGy. After the entire process of qualification, processing, packaging and sterilization has been checked, bone debris transplant is approved for clinical use. The graft is stored at a temperature below -40 ° C, preferably at a temperature of -80 ° C to -40 ° C.

PL 232 494 B1PL 232 494 B1

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C, w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałości komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Po zakończeniu wytrząsania odlewa się H2O2, ponownie zalewa świeżym H2O2, zachowując proporcje 3:1 i odstawia na 24 h do chłodziarki o temp. +2°C do +8°C. Po tym czasie odlewa się H2O2 i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g kości) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Uzyskany gruz kostny zamraża się w temperaturze od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału), a następnie liofilizuje się, przy parametrach temperatury od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, przez okres 48 h. Po liofilizacji, przy pomocy strzykawki, najlepiej pojemności 30 cm³, gruz dzieli się na porcje o objętości 10 cm oraz 20 cm , poporcjowany gruz pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego i przechowuje się go w temperaturze pokojowej.The hip plate, preferably of human origin, tested for infectious diseases, is cleaned of soft tissues using surgical cutting tools. Then, using a hand saw or a mechanical saw, it is cut into fragments of max. 5 cm by 5 cm. The fragments cleared of soft tissues are frozen at -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period of 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material before the grinding process). The frozen preparation is then ground with a manual grinder using rotating cutting inserts selected according to the intended final granulation, which may be from 0.5 mm to 15 mm, preferably from 5 mm to 10 mm. The bone debris formed after grinding is weighed on a laboratory balance and placed in a 1000 ml beaker. Weighed 100 g of rubble is poured over with water, preferably deionized water, at a temperature of + 15 ° C to + 35 ° C, preferably + 25 ° C, in the amount of about 200 ml, keeping the ratio 2: 1 (2 ml of water per 1 liter). g bone), for 10 to 60 min, preferably 15 min, for final thawing of the preparation. The preparation is then shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. The shaking operation is repeated twice. After shaking, the water is poured off and the formulation is rinsed with water in a 500 ml sieve using a pressure washer using a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably 8 MPa, for 2 min to 5 min, preferably 3 min. The bone debris prepared in this way is poured over, in order to get rid of the remains of the red and yellow marrow cells, with hydrogen peroxide H2O2 at a concentration of 3% in the amount of approx. 300 ml, maintaining the proportion of 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone) and shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. It is also allowed to use H2O2 with a concentration from 1% to 40%. After shaking, the H2O2 is poured off, poured again with fresh H2O2, keeping the proportion of 3: 1 and set aside for 24 hours in a refrigerator with a temperature of + 2 ° C to + 8 ° C. After this time, H2O2 is poured and to get rid of its residues, the debris is flooded with sodium chloride NaCl with a concentration of 0.9% in the amount of 300 ml, keeping the ratio 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of bone) and set aside for 5 min to 30 min, preferably 15 min. You can also use NaCl with a concentration of 0.1% to 10%. After the indicated time has elapsed, the NaCl is poured off and its remains are filtered off on dust-free paper. The obtained bone debris is frozen at a temperature of -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period from 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material), and then lyophilized according to the parameters temperatures from -52 ° C to -50 ° C, vacuum from 0.016 mBar to 0.018 mBar, for a period of 48 hours. After lyophilization, using a syringe, preferably with a capacity of 30 cm ³ , the debris is divided into 10 cm and 20 cm portions , the proportioned debris is packed in tightly closed containers, which are covered with an identification label, and then radiation sterilized at a dose of 35 kGy. After the entire qualification, processing, packaging and sterilization process has been checked, the bone debris graft is released for clinical use and stored at room temperature.

P r z y k ł a d 4P r z k ł a d 4

Talerz biodrowy, korzystnie pochodzenia ludzkiego, przebadany pod kątem chorób zakaźnych, oczyszcza się z tkanek miękkich przy użyciu tnących narzędzi chirurgicznych. Następnie, przy użyciu piły ręcznej bądź mechanicznej, przycina się na fragmenty o rozmiarach max. 5 cm na 5 cm. Oczyszczone z tkanek miękkich fragmenty, zamraża się w temp. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału przed procesem mielenia). Zamrożony preparat mieli się następnie młynkiem ręcznym, przy zastosowaniu obrotowych wkładów tnących, dobranych stosownie do zamierzonej granulacji końcowej, która może wynosić od 0,5 mm do 15 mm, korzystnie od 5 mm do 10 mm. Powstały po mieleniu gruz kostny, waży się na wadze laboratoryjnej i umieszcza w zlewce o pojemności 1000 ml. Odważone 100 g gruzu zalewa się wodą, korzystnie wodą dejonizowaną, o temp. od +15°C do +35°C, korzystnie +25°C w ilości ok. 200 ml, zachowując proporcje 2:1 (2 ml wody na 1 g kości), przez 10 min do 60 min, korzystnie 15 min, celem ostatecznego rozmrożenia preparatu. Preparat wytrząsa się następnie na wytrząsarce orbitalnej, przez 15 min przy obrotach 160 rpm. Czynność wytrząsania powtarza się dwukrotnie. Po wytrząsaniu wodę odlewa się, a preparat przepłukuje się wodą w pojemniku z sitem, o pojemności 500 ml, przy użyciu myjki ciśnieniowej, stosując ciśnienie od 5 MPa do 11 MPa, korzystnie 8 MPa, przez 2 min do 5 min, korzystnie 3 min. Tak przygotowany gruz kostny odtłuszcza się za pomocą alkoholu etylowego C2H5OH o stężeniu 70%, zachowując proporcje 4:1 (4 ml C2H5OH na 1 g kości) i odstawia na 24 h w temperaturze pokojowej. Dopuszcza się również stosowanie C2H5OH o stężeniu od 60% do 96%. Po tym czasie C2H5OH odlewa się, a gruz kostny zalewa się, w celu pozbycia się pozostałości komórek szpiku czerwonego i żółtego, nadtlenkiem wodoru H2O2 o stężeniu 3% w ilości ok. 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml H2O2 na 1 g kości) i wytrząsa na wytrząsarce orbitalnej przez 15 min przy obrotach 160 rpm.The hip plate, preferably of human origin, tested for infectious diseases, is cleaned of soft tissues using surgical cutting tools. Then, using a hand saw or a mechanical saw, it is cut into fragments of max. 5 cm by 5 cm. The fragments cleared of soft tissues are frozen at -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period of 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material before the grinding process). The frozen preparation is then ground with a manual grinder, using rotary cutting inserts selected according to the intended final granulation, which may be from 0.5 mm to 15 mm, preferably from 5 mm to 10 mm. The bone debris formed after grinding is weighed on a laboratory balance and placed in a 1000 ml beaker. Weighed 100 g of rubble is poured with water, preferably deionized water, at a temperature of + 15 ° C to + 35 ° C, preferably + 25 ° C, in the amount of approx. 200 ml, keeping the ratio 2: 1 (2 ml of water per 1 g bone), for 10 min to 60 min, preferably 15 min, for final thawing of the preparation. The preparation is then shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm. The shaking operation is repeated twice. After shaking, the water is poured off and the formulation is rinsed with water in a 500 ml sieve using a pressure washer using a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably 8 MPa, for 2 min to 5 min, preferably 3 min. The bone debris prepared in this way is degreased with C2H5OH ethyl alcohol at a concentration of 70%, keeping the proportion 4: 1 (4 ml C2H5OH per 1 g of bone) and allowed to stand for 24 h at room temperature. It is also allowed to use C2H5OH with a concentration of 60% to 96%. After this time, C2H5OH is poured off and the bone debris is poured over, in order to get rid of the remnants of the red and yellow marrow cells, with hydrogen peroxide H2O2 at a concentration of 3% in the amount of approx. 300 ml, keeping the proportion 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g bone) and shaken on an orbital shaker for 15 min at 160 rpm.

PL 232 494 B1PL 232 494 B1

Dopuszcza się również stosowanie H2O2 o stężeniu od 1% do 40%. Wytrząsanie w H2O2 powtarza się dwukrotnie. Po zakończeniu odtłuszczania H2O2 odlewa się, i aby pozbyć się jego pozostałości, gruz zalewa się chlorkiem sodu NaCl o stężeniu 0,9% w ilości 300 ml, zachowując proporcje 3:1 (3 ml NaCl na 1 g tkanki) i odstawia na okres od 5 min do 30 min, korzystnie 15 min. Można również stosować NaCl o stężeniu od 0,1% do 10%. Po upływie wskazanego czasu NaCl odlewa się, a jego resztki odsącza się na papierze bezpyłowym. Uzyskany gruz kostny zamraża się w tem p. od -20°C do -80°C, korzystnie około -40°C, najlepiej na okres od 24 h do 72 h (czas potrzebny do właściwego zamrożenia materiału), a następnie liofilizuje się przy parametrach temp. od -52°C do -50°C, próżni od 0,016 mBara do 0,018 mBara, przez okres 48 h.It is also allowed to use H2O2 with a concentration from 1% to 40%. Shaking in H2O2 was repeated twice. After the degreasing of H2O2 is completed, the debris is poured over with sodium chloride 0.9% NaCl in the amount of 300 ml, keeping the proportion of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of tissue), and set aside for the period of 5 min to 30 min, preferably 15 min. You can also use NaCl with a concentration of 0.1% to 10%. After the indicated time has elapsed, the NaCl is poured off and its remains are filtered off on dust-free paper. The obtained bone debris is frozen at -20 ° C to -80 ° C, preferably around -40 ° C, preferably for a period of 24 h to 72 h (the time needed to properly freeze the material), and then lyophilized at temperature parameters from -52 ° C to -50 ° C, vacuum from 0.016 mBar to 0.018 mBar, for a period of 48 hours.

Po liofilizacji, przy pomocy strzykawki, najlepiej o pojemności 30 cm³, gruz dzieli się na porcje o objętości 10 cm³ oraz 20 cm³, poporcjowany gruz pakuje się w szczelnie zamknięte pojemniki, które okleja się etykietą identyfikacyjną, a następnie sterylizuje radiacyjnie w dawce 35 kGy. Po kontroli całego procesu kwalifikacji, przetwarzania, pakowania i sterylizacji, przeszczep gruzu kostnego dopuszczany jest do użytku klinicznego i przechowuje się go w temp. pokojowej.After lyophilization, with a syringe, preferably with a capacity of 30 cm ³ , the debris is divided into portions of 10 cm ³ and 20 cm ³ , the portioned rubble is packed in tightly closed containers, which are covered with an identification label and then sterilized by radiation in a dose 35 kGy. After the entire process of qualification, processing, packaging and sterilization has been controlled, the bone debris transplant is approved for clinical use and stored at room temperature.

W wyniku powyżej opisanych sposobów postępowania, otrzymuje się przeszczep w postaci korowo-gąbczastego gruzu z talerza biodrowego mrożony lub liofilizowany, zwłaszcza ludzki, który jest biologicznie zgodny, oczyszczony z komórek szpiku o silnych właściwościach immunogennych.As a result of the above-described procedures, a graft in the form of cortical-spongy debris from the iliac plate is obtained, frozen or freeze-dried, especially human, which is biologically compatible, purified from bone marrow cells with strong immunogenic properties.

Dzięki starannie dobranym czynnościom i parametrom przygotowania, przeszczep jest niezwykle bezpieczny dla potencjalnego biorcy, i może być stosowany do zaopatrywania ubytków tkanki kostnej u ludzi.Thanks to carefully selected activities and preparation parameters, the transplant is extremely safe for a potential recipient and can be used to treat bone defects in humans.

Claims

Patent claims

1. The method of obtaining a graft of cortical-spongy debris for the regeneration of bone tissue, characterized by the fact that it consists of the following stages: mechanical cleansing of bones, preferably the human hip plate from soft tissues, dividing the bone into fragments, freezing the bones at a temperature of approx. -40 ° C, grinding frozen bones to obtain rubble with a grain size of 0.5 mm to 15 mm, preferably 5 mm - 10 mm, thawing obtained after grinding the rubble in water at + 15 ° C to + 35 ° C , rinsing thawed debris with water at a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably degreasing debris in C2H5OH with a concentration of 60% to 96%, degreasing debris in H2O2 with a concentration of 1% to 40%, rinsing debris with NaCl at a concentration of 0.1 % to 10%, drainage of the debris with NaCl, and radiation sterilization of the debris, preferably at a dose of 35 kGy.

2. The method according to p. 1, characterized in that in a variant of the invention, between the stage of draining the remains of NaCl and the stage of radiation sterilization of debris, there is a stage of freezing the debris at a temperature of about -40 ° C, followed by a stage of freeze drying of the debris at temperature parameters of -52 ° C C to -50 ° C, vacuum from 0.016 mBar to 0.018 mBar, most preferably for a period of 48 hours.

3. The method according to p. The method of claim 1 or 2, characterized in that surgical cutting instruments are used for the mechanical cleaning of the bones.

4. The method according to p. A method as claimed in claim 1 or 2, characterized in that the bones are fragmented using a hand saw or a power saw.

5. The method according to p. 1 or 2, characterized in that the bone fragments amount to max. 5 cm by 5 cm.

6. The method according to p. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the freezing of the bones or debris is carried out at a temperature of -80 ° C to -20 ° C, most preferably for a period of 24 h to 72 h, preferably in a freezer.

7. The method according to p. A method as claimed in claim 1 or 2, characterized in that the grinding of the bones is carried out with a manual mill using rotating cutting inserts.

8. The method according to p. 1 or 2, characterized in that deionized water at a temperature of + 25 ° C is used to defrost the rubble obtained after grinding, maintaining the ratio of 2: 1 (2 ml of water per 1 g of bone), and thawing is carried out within 10 minutes up to 60 min, most preferably 15 min.

PL 232 494 B1

9. The method according to p. The method of claim 1 or 2, characterized in that during the thawing of the rubble, it is shaken at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 minutes at a rotation of 160 rpm.

10. The method according to p. The method of claim 1 or 2, characterized in that water under the pressure of 8 MPa is used for washing the thawed debris, and the washing time is from 2 minutes to 5 minutes, most preferably 3 minutes.

11. The method according to p. 1 or 2, characterized in that the degreasing of debris in C2H5OH is carried out using C2H5OH with a concentration of 70%, maintaining the proportion of 4: 1 (4 ml of C2H5OH per 1 g of bone), for a period of 24 hours at room temperature.

12. The method according to p. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the degreasing of the debris in H2O2 is carried out using H2O2 at a concentration of 3%, maintaining the proportion of 3: 1 (3 ml H2O2 per 1 g of bone).

13. The method according to p. The method according to claim 1 or 2, characterized in that during degreasing of the debris in H2O2, it is shaken at least once on a shaker, preferably an orbital, for 15 minutes at a rotation of 160 rpm.

14. The method according to p. 1 or 2, characterized in that during the degreasing of the debris only in H2O2, it is shaken at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 minutes at a revolutions of 160 rpm, and then the H2O2 in which shaking took place is poured, and the rubble is poured over with a new, unreacted portion of H2O2, and set aside for 24 h at + 2 ° C to + 8 ° C, conveniently in a refrigerator.

15. The method according to p. The method according to claim 1 or 2, characterized in that washing the debris with NaCl is carried out with NaCl at a concentration of 0.9%, maintaining the proportion of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of bone), for 5 minutes to 30 minutes, most preferably 15 minutes.

16. The method according to p. The method of claim 1 or 2, characterized in that the filtration of the rubble with NaCl is carried out on dust-free paper.

17. A graft for bone tissue regeneration, characterized in that it is a cortical-spongy bone tissue, preferably a hip plate of human origin, in the form of debris with a grain size of 0.5 mm to 15 mm, preferably 5 mm - 10 mm, mechanically cleaned from soft tissues, divided into fragments, frozen at about -40 ° C, ground in a frozen state until obtaining the desired grain size debris, thawed after grinding in water at + 15 ° C to + 35 ° C, rinsed after thawing with water under a pressure of 5 MPa to 11 MPa, preferably degreased in C2H5OH at a concentration of 60% to 96%, degreased in H2O2 at a concentration of 1% to 40%, rinsed with NaCl at a concentration of 0.1% to 10% , devoid of residual NaCl, H2O2, preferably also C2H5OH, radiation sterilized at a dose of 35 kGy.

18. A transplant according to claim 17, characterized in that in a variant of the invention, it is a tissue that has been subjected, after draining from the remains of NaCl and before radiation sterilization, to freezing at a temperature of about -40 ° C, and then freeze-drying at temperature parameters from -52 ° C to - 50 ° C, vacuum from 0.016 mBar to 0.018 mBar, most preferably for a period of 48 hours.

19. The transplant according to claim 1 The method according to claim 17 or 18, characterized in that the tissue is cleaned mechanically using surgical cutting tools.

20. The transplant according to claim 1 17 or 18, characterized in that it comprises tissue divided into fragments using a hand or a power saw, preferably into fragments with a size of max. 5 cm by 5 cm.

21. A transplant according to claim 1 17. The method as claimed in claim 17 or 18, wherein the tissue is frozen at -80 ° C to -20 ° C, most preferably for 24 h to 72 h, preferably in a freezer.

22. A transplant according to claim 22 17 or 18, characterized in that the tissue is ground with a hand grinder using rotary cutting inserts.

23. A transplant according to claim 1 17 or 18, characterized in that it contains the tissue thawed with deionized water at the temperature of + 25 ° C, maintaining the proportion of 2: 1 (2 ml of water per 1 g of bone), for 10 minutes to 60 minutes, most preferably 15 minutes.

24. A transplant according to claim 24 The method of claim 17 or 18, wherein the tissue is shaken at least once during thawing on a shaker, preferably an orbital shaker, for 15 min at 160 rpm.

25. A transplant according to claim 25 17 or 18, characterized in that the tissue is rinsed with water, under pressure of 8 MPa, for 2 min to 5 min, most preferably 3 min.

PL 232 494 B1

26. A transplant according to claim 1 17 or 18, characterized in that it contains 70% W2H5OH exfoliated tissue with the proportion 4: 1 (4 ml C2H5OH per 1 g of bone), for 24 hours at room temperature.

27. A transplant according to claim 27 The method according to claim 17 or 18, characterized in that the tissue is degummed in H2O2 at a concentration of 3% with a 3: 1 ratio (3 ml H2O2 per 1 g of bone).

28. A transplant according to claim 28 17 or 18, characterized in that the tissue is shaken at least once during degreasing in H 2 O 2 on a shaker, preferably orbital, for 15 min at 160 rpm.

29. A transplant according to claim 1, 17 or 18, characterized in that it comprises tissue which, during degreasing only in H2O2, was shaken at least once on a shaker, preferably orbital, for 15 min at 160 rpm, after which it was poured with a new, unreacted portion of H2O2, and stood for 24 h at + 2 ° C to + 8 ° C, conveniently in a refrigerator.

30. A transplant according to claim 1 17 or 18, characterized in that the tissue is rinsed with NaCl at a concentration of 0.9%, maintaining the ratio of 3: 1 (3 ml of NaCl per 1 g of bone), for 5 min to 30 min, most preferably 15 min.

31. A transplant according to claim 1 17 or 18, characterized in that the NaCl-drained tissue is on a dust-free paper.