PL232199B1 - Sposób otrzymywania topoli transgenicznych i topola transgeniczna - Google Patents

Abstract

Sposób otrzymywania drzew o zmienionych właściwościach fizykochemicznych i strukturalnych drewna w stosunku do drzew nietransformowanych, charakteryzuje się tym, że wprowadza się do rośliny, do komórki roślinnej lub tkanki rośliny zmodyfikowany gen CAO kodujący białko cpSRP43 odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystem II z systemem membran tylakoidowych. Wynalazek obejmuje również linie drzew z wprowadzonym do drzewa zmodyfikowanym genem CAO.

Description

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania transgenicznych drzew topoli o zmienionych właściwościach fizykochemicznych i strukturalnych drewna, które to właściwości umożliwiają technologię przetwarzania tego drewna w sposób bardziej ekonomiczny i ekologiczny. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania modyfikacji genetycznej drzew topoli dla otrzymywania zmienionej kompozycji ścian komórkowych, która to kompozycja ułatwia obróbkę mechaniczną i chemiczną materiału drzewnego oraz prowadzi do podwyższonej wydajności uzyskiwania masy celulozowej. Bardziej szczegółowo, niniejszy wynalazek odnosi się do modyfikacji sekwencji nukleotydowej genu CAO i modyfikacji sekwencji aminokwasowej białek będących produktem genu CAO, która to modyfikacja może być używana do modulowania składu i stabilności ścian komórkowych roślin topoli dla ich łatwiejszej hydrolizy metodami chemicznymi i enzymatycznymi. Niniejszy wynalazek dotyczy także wektorów, transformowanych komórek gospodarza i nowych transgenicznych genotypów topoli, w których gen CAO był zmodyfikowany tak, aby modulował skład i stabilność ścian komórkowych roślin dla ich łatwiejszej hydrolizy metodami chemicznymi i enzymatycznymi.

Skład chemiczny drewna zależy od rodzaju i odmiany drzewa. Zazwyczaj jego część stała składa się z około 45% celulozy, 25% hemiceluloz, 25% ligniny oraz 5% innych substancji organicznych i nieorganicznych. Celuloza, najczęściej występujący w przyrodzie polimer, zbudowana jest z licznych grup anhydroglukozy połączonych wiązaniami glikozydowymi. Celuloza w drewnie osiąga stopień polimeryzacji 9000-10000, a nawet do 15000. Hydroliza celulozy jest procesem trudnym, ponieważ włókna celulozy stabilizowane są przez wiązania wodorowe i otoczone przez polisacharydy hemieelulozy (mannany i ksylany) złączone za pomocą wiązań kowalencyjnych i wodorowych. Hemicelulozy są polisacharydami o mniejszym stopniu polimeryzacji, składającymi się z heksoz (D-galaktoza, L-galaktoza, D-mannoza, L-fruktoza) i pentoz (L-ramnoza, arabinoza, ksyloza) oraz kwasów uronowych (kwas D-glukoronowy). Lignina to makromolekuły o charakterze fenolowym, będące produktem kondensacji trzech monomerycznych alkoholi: trans-p-kumarylowego, trans-p-koniferylowego oraz trans-p-sinapylowego. Hydroliza ligniny jest procesem skomplikowanym ze względu na liczne wiązania eterowe i węglowe C-C. Lignina, jako polimer zapewniający integralność strukturalną ściany komórek roślinnych, jest wytrzymała mechanicznie i odporna na rozkład chemiczny, gdyż determinują trwałość mechaniczną i odporność na patogeny. Jednocześnie te same cechy są problematyczne, gdy rośliny stanowią surowiec dla niektórych zastosowań przemysłowych.

Istotne technologicznie właściwości drewna to w pierwszej kolejności zawartość składników strukturalnych, czyli celulozy, hemiceluloz oraz ligniny. Ważnym elementem jest także skład chemiczny polisacharydów, szczególnie zawartość heksozanów i pentozanów oraz zawartość i rodzaj substancji ekstrakcyjnych, zwłaszcza substancji ekotoksycznych, czyli kwasów tłuszczowych i związków fenolowych. Inne parametry, które mogą mieć wpływ na przydatność drewna to stopień polimeryzacji celulozy. Wszystkie te składowe determinują określone właściwości mikrostrukturalne, wytrzymałościowe i podatność materiału na obróbkę termiczną, chemiczną i enzymatyczną.

Wstępna obróbka biomasy jest istotnym krokiem przygotowującym do przetwarzania biomasy w procesie enzymatycznej hydrolizy. Każdorazowo celem obróbki wstępnej jest zwiększenie dostępu dla oddziaływania enzymów. Główne koszty ponoszone na wstępną obróbkę, oraz przygotowanie masy (lignino)celulozowej związane są z mechanicznym rozdrobnieniem materiału oraz ostateczną wydajnością procesów technologicznego przetwarzania. Koszty te stanowią o ekonomiczności uzyskiwania materiałów wyjściowych np. dla produkcji papieru i bioetanolu z masy ligninocelulozowej. Wszelkie czynniki przyśpieszające proces i obniżające koszty zużycia energii podczas przygotowania biomasy, ograniczają koszty całkowite.

Podatność materiału roślinnego na rozdrobnienie mechaniczne, chemiczne, temperaturowe jest bezpośrednio determinowana przez właściwości chemiczne, mechaniczne i strukturalne ściany komórkowej. Obniżenie wzajemnych oddziaływań włókien polimerowych celuloza-celuloza, celulozalignina bezpośrednio obniża zużycie energii w postaci pary i energii elektrycznej i obniża koszty uzyskania surowca celulozowego.

Znane są metody ulepszania odmian drzew w zakresie wykorzystania ich w przemyśle celulozowym, drzewnym i energetycznym. Przykładowo, z opisu europejskiego patentu EP 1261726 znana jest modyfikacja transgeniczna drzew, należących do rodziny Populus, które wykazują zwiększoną produkcję biomasy i większą długość włókien, w porównaniu z dziką odmianą takiego drzewa. Do genomu transgenicznego drzewa wprowadzono sekwencję DNA genu kodującego polipeptyd wy

PL 232 199 B1 kazujący aktywność GA20-oksydazy. Z kolei z opisu międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr W02015060773 znany jest sposób wytwarzania transgenicznego drzewa o zmniejszonej zawartości ksylanu w stosunku do drzewa dzikiego, polegający na redukcji ekspresji jednego lub większej liczby genów z rodziny glikozylotransferaz (GT43). Sposób według wspomnianego zgłoszenia obejmuje wprowadzenie wektora do komórek rośliny, przy czym ten wektor zawiera co najmniej jeden, lub więcej genów z rodziny GT43, w orientacji obniżającej ekspresję jednego lub większej liczby genów z rodziny GT43. Drzewa transgeniczne charakteryzują się poprawionymi parametrami wzrostu oraz lepszymi właściwościami mechanicznymi. Innym przykładem jest rozwiązanie znane z opisu zgłoszenia patentowego WO2010062240, w którym zostały wskazane geny wpływające na poziom ligniny w ścianie komórkowej. W 1997 r. powstała również platforma skupiająca naukowców (The Gene Discovery Platform) skoncentrowana na identyfikacji genów topoli kontrolujących formowanie drewna i kwitnienie drzew. Efektem ich pracy było opublikowanie bioinformatycznej bazy danych (the Populus EST database), dotyczącej topoli. Istnieje zatem ogromny potencjał innowacyjny dla ukierunkowanego ulepszenia topoli oraz zastosowania w praktyce linii z kontrolowanymi genami, zaangażowanymi w przyrost biomasy i regulację właściwości drewna na poziomie tkankowym i komórkowym.

Celem obecnego wynalazku było opracowanie technologii w dziedzinie inżynierii genetycznej umożliwiającej otrzymanie nowego typu roślin o zmodyfikowanych właściwościach ściany komórkowej drewna, w kierunku, który zapewni podniesienie sprawności procesów technologicznych uzyskiwania masy celulozowej, przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowego wzrostu roślin i wysokiego plonu.

Cel ten został osiągnięty dzięki otrzymaniu drzewa topoli z rodziny Populus ze zmodyfikowanym genem CAO.

Istotą wynalazku jest więc sposób otrzymywania drzew topoli z rodziny Populus o zmienionych właściwościach fizykochemicznych i strukturalnych drewna w stosunku do drzew nietransformowanych, charakteryzujący się tym, że do rośliny, komórki roślinnej lub tkanki rośliny wprowadza się zmodyfikowany gen CAO kodujący białko cpSRP43 (chloroplast Signal Recognition Particle) odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystemu II z systemem membran tylakoidowych.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się sekwencje nukleotydowe genu CAO w orientacji powodującej zmianę poziomu ekspresji tego genu w porównaniu do roślin niemodyfikowanych, w celu wyciszenia jego ekspresji. Sekwencja nukleotydowa posiada co najmniej 60% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, korzystnie posiada co najmniej 80% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, bardziej korzystnie posiada co najmniej 95% identyczności z sekwencją SEQ ID 1.

Istotą wynalazku jest także linia drzew z rodziny Populus o właściwościach morfologicznych, fizykochemicznych i strukturalnych drewna zmienionych w stosunku do drzew nietransformowanych, w wyniku wprowadzenia do drzewa zmodyfikowanego genu CAO, kodującego białko cpSRP43, odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystem II z system em membran tylakoidowych.

Linia drzew według wynalazku charakteryzuje się tym, że drewno zawiera celulozę ulegającą relatywnie łatwemu procesowi rozluźnienia struktury krystalicznej i/lub depolimeryzacji, z ograniczonym procesem dehydratacji, korzystnie w zakresie temperatur 250-380°C.

Linia drzew według wynalazku charakteryzuje się także tym, że drewno zawiera ligninę ulegającą termicznej dekompozycji w temperaturach niższych niż dla standardowego materiału drzewnego roślin niezmodyfikowanych.

Drewno linii drzew według wynalazku zapewnia podwyższoną wydajność uzyskiwania masy celulozowej o co najmniej 0,5%, korzystnie o co najmniej 1%, bardziej korzystnie o co najmniej 2,5%.

Zmienione właściwości morfologiczne, fizykochemiczne i strukturalne drewna umożliwiają przetwarzanie tego drewna do masy celulozowej znanymi technologiami w sposób bardziej energooszczędny i ekologiczny. Cechy drzew, które wpływają na łatwiejsze przetwarzanie, a które zostały zmienione względem drzew niezmodyfikowanych, obejmują:

- wysokość i średnicę pnia, wyższe niż te uzyskane dla roślin niezmodyfikowanych genetycznie,

- większą liczbę komórek, suchą masę pnia, grubość ścian komórkowych, które determinują wyższą gęstość drewna,

- większą liczbę naczyń, większą średnicę wnętrza naczyń w drewnie, które determinują bardziej porowatą strukturę drewna,

PL 232 199 B1

- zawartość celulozy ulegającej relatywnie łatwemu procesowi rozluźnienia struktury krystalicznej i/lub depolimeryzacji, z ograniczonym procesem dehydratacji, korzystnie w zakresie temperatur 250-380°C,

- zawartość ligniny ulegającej termicznej dekompozycji w temperaturach niższych niż dla standardowego materiału drzewnego roślin niezmodyfikowanych,

- wyższą wydajność uzyskiwania masy celulozowej.

Na rysunku przedstawiono sekwencję genu CAO gatunku P. trichocarpa znajdującą się w bazach danych: EMBL-EBI (http://srs.ebi.ac.uk/) oraz NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). SEQ ID 1 gen CAO został wykorzystany do otrzymania transgenicznych linii topoli. Szarym kolorem zaznaczono miejsca przyłączania starterów (SEQ ID 1) - startery specyficzne do genu CAO.

Gen CAO (CHAOS, chlorophyll a/b binding protein harvesting-organelle specific) jest odpowiedzialny za kodowanie podjednostki białkowej cpSRP43 (chloroplast Signal Recognition Particie). cpSRP43 wraz z cpSRP54 są odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystem II (Lhcb) z systemem membran tylakoidowych. Fotosystem II jest kompleksem barwnikowo-lipidowo-białkowym absorbującym kwanty światła, a zatem jest odpowiedzialny za najwcześniejsze etapy fotosyntezy i jej efektywność. Białka tylakoidów są kodowane zarówno przez genom jądrowy oraz chloroplastowy. Białka kodowane przez jądro komórkowe są syntetyzowane z N-terminalnym przedłużeniem, dzięki któremu możliwy jest transport przez otoczkę membranową do strony. Wewnątrz chloroplastów transport białek ze stromy do membran tylakoidów obejmuje różne mechanizmy, w tym szlak cpSRP, ale również spontaniczne insercje, chloroplastowy szlak Sec r-zależny, oraz szlak wymagający tylko elektrochemicznego potencjału ApH. Do błony tylakoidów większość białek membranowych jest wstawiana przez specjalne cząsteczki rozpoznające sygnały (SRP, Signal Recognition Particle). Aktywują one adaptor między rybosomem a kanałem translokacji. Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne zawierają cytoplazmatyczne SRP składające się z 54-kDa białka (SRP54) oraz RNA. Kompozycja SRP jest zróżnicowana, jednak każde SPR posiada konserwatywny białkoworybosomalny trzon. Chloroplastowe SRP (cpSRP) różni się od cząstek w innych regionach komórki, ponieważ nie zawiera RNA i składa się z dwóch podjednostek białkowych: 54-kDa (cpSRP54) i 43-kDa (cpSRP43). W wyniku interakcji chloroplastowych rybosomów oraz cpSRP, białka kodowane jądrowo są transportowane najpierw do stromy chloroplastu następnie do membran tylakoidu. W posttranslacyjnym systemie transportu, cpSRP formuje heterodimer składający się z cpSRP54 i cpSRP43. cpSRP54 jest 54-kDa białkiem o aktywności GTPazy i stanowi chloroplastowy homolog dla białka rdzeniowego SRP. cpSRP43 jest 43-kDa białkiem przeznaczonym wyłącznie dla kompleksu LHCPcpSRP z unikalnym układem chromodomen o długości ~44 aminokwasy (CD1-3) i powtórzeń ankirynowych, każde o długości ~33 aminokwasy (Ank1-4). Dzięki takiej budowie powstaje silne rusztowanie dla białkowych interakcji. Chromodomena CD1 oraz cztery powtórzenia ankirynowe formują wydłużoną podkowę. Ank1 i Ank3 zawierają typowe zagięcie z motywem helisa-skręt-helisa, flankujące Ank1 i Ank4, natomiast CD1 ma klasyczne dla chromodomen zagięcie znane wcześniej dla wielu innych białek. CD1 i Ank1 są połączone przez fuzję helis CD i N-terminalnej ankirynowej. Ank4 charakteryzuje się największym odchyleniem od klasycznej struktury powtórzenia ankirynowego. Obserwowano wydłużenie dwóch α-helis (a7, a8), wystających z wypukłej strony podkowy. Wysoki poziom konserwatywności tego rozbudowania sugeruje, że pełni ono ważną rolę w interakcji białko - białko. Z powodu braku RNA w chloroplastowych SRP, strukturalnie i funkcjonalnie jego substytutem może być cpSRP43, tym bardziej, że obserwuje się molekularne podobieństwa między RNA i białkiem. Kształt i powierzchnia cpSRP43 przypomina helisę 8 SRP RNA, która wiąże się do cpSRP54 w klasycznym SRP. Na jednej stronie powierzchni cząsteczki cpSRP43 znajdują się dwa główne hydrofobowe rowki, pełniące rolę w interakcji z LHCP i/lub cpSRP54. Przeciwna strona powierzchni cpSRP43 wykazuje wysokie negatywne naładowanie. Regularne odstępy między negatywnymi ładunkami - 5,5 i 18 A przypominają grzbiet grup fosforanowych podwójnej helisy RNA. Kompleks transportowy cpSRP43cpSRP54, wiąże się do regionu L1 8 białka LHCP poprzez cpSRP43. Region L18 jest najbardziej konserwatywnym regionem łączącym transmembranowe helisy TM2 i TM3. L18p wiąże się do rowka 1 powierzchni powtórzeń ankirynowych białka cpSRP43 oraz, zawiera motyw DPLG (Asp - Pro - Leu - Gly), który stabilizuje interakcję z cpSRP43. Warunkiem transportowej aktywności cpSRP jest powstanie heterodimeru. Prawdopodobnie dochodzi do interakcji między chromodomeną CD2 białka cpSRP43 i unikalnym 10-aminokwasowym regionem białka cpSRP54 (cpSRP54pep). Chromodomeną CD2 białka cpSRP43 jest niezbędna również dla tworzenia wiązania z białkami LHCP, ponieważ CD2 wchodzi w interakcję z peptydem RRKR znajdującym się na C-terminalnym końcu cpSRP54. Model

PL 232 199 B1 interakcji między cpSRP43 i cpSRP54, obejmuje miejsce wiązania sekwencji sygnałowej w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca wiązania regionu L18 i cpSRP43. W ten sposób region TM3 i region L18 mogą być rozpoznawane jednocześnie.

Chloroplastowe cząstki rozpoznające sygnały cpSRP43 (chlorophyll a/b binding protein harvesting-organelle specific) kodowane są przez gen CAO. Gen CAO koduje komponent unikalny dla roślin, ponieważ produkt tego genu nie jest podobny do żadnego białka w bazach danych, chociaż zawiera motywy, które pośredniczą w interakcjach białko-białko. W genomie rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) wykryto występowanie jednej kopi genu CAO na chromosomie 2 (At2g47450). Występowanie mRNA genu CAO stwierdzono w liściach, nie wykryto go natomiast w korzeniach. Prawdopodobnie ekspresja genu CAO zachodzi wyłącznie tkankach zawierających chlorofil. Z szacunków wynika, że ponad 90% cpSRP43 znajduje się w stromie chloroplastów. Poziom CAO mRNA jest związany z wahaniami dobowymi. Maksymalny poziom akumulacji mRNA miał miejsce w późną nocą i spadał w ciągu dnia.

Recesywna mutacja genu CAO, wprowadzona została dla Arabidopsis thaliana pod nazwą chaos (chlorophyll a/b binding protein harvesting-organelle specific). Fenotyp mutanta chaos wykazuje na specyficzną redukcję pigmentów związanych z redukcją anten fotosyntetycznych. cpSRP43 uczestniczy w ochronie i przystosowaniu się do warunków środowiskowych oraz reakcjach związanych ze stresem fotooksydacyjnym. Niedobór cpSRP43 prowadzi do częściowej utraty białek anteny fotosystemu II (PSU). Mutacja wpływa na proces absorpcji światła (light-harvesting), jednak maksymalna wydajność kwantowa w fotosystemie II uzyskana zarówno dla dzikiego typu jak i mutanta chaos wynosiła około 0,80, co stanowi typową wartość dla zdrowych roślin. Podczas analizy rzeczywistej wydajności kwantowej w fotosystemie II w białym świetle nie zaobserwowano różnicy pomiędzy mutantem chaos i typem dzikim. Wskazuje to, że u mutanta fotosynteza i wzrost nie muszą być ograniczone. Ponadto, siewki mutanta chaos wykazują znacznie wyższą tolerancję na stres fotooksydacyjny, zarówno w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, jak i w różnorodnych warunkach polowych. Zwiększona tolerancja roślin chaos jest widoczna w zmniejszonych fotooksydacyjnych uszkodzeniach komórek i szybszej regeneracji wzrostu w młodych siewkach. W warunkach polowych mutanty chaos wykazują lepszą wydajność fotosyntezy i większe szanse na przeżycie. Ponieważ gen bierze udział w procesach wzrostowych roślin, stąd wysunięto hipotezę, że modyfikacja tego genu wpływa również na zmiany morfologii roślin drzewiastych. Wprowadzenie zmodyfikowanego genu do gatunku Populus tremula x tremuloides jest pierwszą taką próbą na świecie. Dlatego, też brak doniesień wskazujących, że zakres działania genu w roślinach drzewiastych jest bardziej holistyczny niż dla roślin modelowych Arabidopsis. Nieoczekiwanie uzyskano efekt wpływu modyfikacji genu CAO na strukturę i stabilność komponentów ścian komórkowych, a dalej właściwości drewna oraz jego stabilność termiczną.

Dotychczas nie wykazano, że modyfikacja genu CAO może kontrolować antagonistyczne procesy podziałów komórkowych i programowanej śmierci komórki. W przypadku roślin drzewiastych procesy te determinują efektywność produkcji ksylemu w systemie sezonowym, są odpowiedzialne za wielkość komórek (a pośrednio ich przyleganie i wielkość powstających porów w drewnie) oraz gr ubość i skład wtórnych ścian komórek drewna. Efektem wynalazku jest stwierdzenie korelacji pomiędzy modyfikacją genetyczną, a otrzymaną charakterystyką drzew oraz dostarczenie linii drzew o drewnie bardziej przydatnym do przetwarzania na bioetanol oraz przez przemysł papierniczy. Efektem dodatkowym są parametry drewna modyfikowanego decydujące o podwyższonej wartości opałowej i niewielkich pozostałościach popiołu, pożądane w przypadku bezpośredniego spalania drewna.

Drzewo ze zmodyfikowanym genem CAO może znaleźć zastosowanie jako surowiec dla produkcji celulozy i papieru, procesów Krafta, produkcji biopaliw z biomasy celulozowej, produkcji polimeru ligniny.

W procesach produkcji celulozy i papieru znaczna redukcja kosztów i podniesienie ekologiczności procesu przygotowania masy celulozowej ma miejsce dzięki zastosowaniu materiału o obniżonej ilości ligniny (dotychczasowe podejście inżynierii genetycznej i biotechnologicznych prób modyfikacji roślin). Jednak obniżenie naturalnej ilości ligniny w roślinie powoduje osłabienie jej właściwości mechanicznych i podatność na patogeny. W przypadku obecnego wynalazku możliwe jest zastosowanie materiału o obniżonej stabilności ligniny w określonych warunkach oddziaływania chemicznego czy enzymatycznego, a nie jako efektu drastycznego obniżenia zawartości ligniny. Modyfikacja genetyczna nie zmienia bowiem morfologicznych, wzrostowych, mechanicznych właściwości tkanek w warunkach naturalnych in vivo, ale stabilność ścian celulozowych jest zmniejszona znacznie w warunkach

PL 232 199 B1 podwyższonej temperatury, lub w standardowych warunkach otrzymywania pulpy celulozowej. Drewno podlega zatem łatwiejszej obróbce niż rośliny typu dzikiego. Mniejsza stabilność ligniny powoduje mniejsze zużycie chemikaliów procesowych (Na2SO4 i NaOH), więc także mniejszy ładunek zanieczyszczeń (ChZT). Istotną kwestią jest tu ponadto zminimalizowanie ilości substancji ekstrakcyjnych, które w dużej mierze przyczyniają się do ekotoksyczności ciekłych odpadów poprodukcyjnych.

W procesie produkcji biopaliw z biomasy celulozowej zastosowanie zmodyfikowanego drzewa w uprawie wieloletniej spowodować może ok. 40% wzrost wydajności przeliczeniowej biopaliwa z 1 ha i rozwój rolnictwa w kierunku jego dywersyfikacji. Zmniejszona stabilność ścian komórkowych gwarantuje bowiem w warunkach prowadzenia procesu hydrolizy znacznie łatwiejszy dostęp do wewnętrznych powierzchni polimerów ligninocelulozowych w tkankach. Zmieniona struktura materiału ligninocelulozowego zmniejsza energię i wymagania chemiczne i enzymatyczne dla obróbki biomasy. Dobór odmian hodowlanych szybkorosnących gatunków drzew jest kwestią pierwszorzędną przy ocenie opłacalności produkcji biopaliw.

Zmienione właściwości materiału ligninocelulozowego otrzymanego z drewna w wyniku modyfikacji genetycznej umożliwiają zmniejszenie zużycia energii do obróbki wstępnej, ze względu na zmniejszone wymagania temperaturowe i zmniejszone zapotrzebowanie stosowania silnych związków chemicznych, a w dalszej kolejności znacznie łatwiejszy proces izolacji ligniny. Wynalazek dotyczy bowiem strategii regulacji genetycznej właściwości ściany komórkowej, które umożliwiają zmniejszenie siły oddziaływań międzycząsteczkowych w ścianie komórkowej pod wpływem, temperatury, czy substancji chemicznych znacznie bardziej efektywne niż dla roślin dzikiego typu.

Wynalazek w szczególności może być stosowany dla drzew z rodziny Populus (topola). Zmodyfikowane topole mogą być z powodzeniem sadzone i uprawiane, gdyż wycinka następuje na długo przed osiągnięciem przez drzewo dojrzałości, a więc zdolności do samoistnego wysiewania. Trwa to w zależności od gatunku i genotypu 15-20 lat, podczas gdy wycinkę prowadzi się po zakończeniu okresu najszybszego przyrostu biomasy, zazwyczaj nie dłuższego niż trzy do siedmiu lat. Jednocześnie w przeciwieństwie do znanych dotychczas modyfikowanych genetycznie drzew, uzyskane obecnie linie nie charakteryzuje obniżenie potencjału wzrostu, a niektóre parametry fizjologiczne i morfologiczne przewyższają rośliny kontrolne dzikiego typu.

W ramach przykładów obrazujących niniejszy wynalazek, scharakteryzowano morfologię roślin i tkanek drewna pochodzącego z 9-cio miesięcznych i 3 letnich drzew transgenicznych oraz linii typu dzikiego, rosnących na polu doświadczalnym „Wolica” Katedry Genetyki i Biotechnologii Roślin w Warszawie. Spośród wyprowadzonych linii z zmodyfikowanymi licznymi genami stwierdzono, że linie z wyciszonym genem CAO, biorącym udział w procesach fotosyntezy stanowią nowy genotyp o znacznie ulepszonych właściwościach drewna przy jednoczesnym poziomie parametrów fizjologicznych, wzrostowych i rozwojowych utrzymanych lub przewyższających poziom dzikiego typu (niestransformowane rośliny kontrolne).

P r z y k ł a d 1 Morfologia otrzymanych linii transgenicznych ze zmodyfikowanym genem CAO.

Generowanie transgenicznych linii przeprowadzano w oparciu o pośrednią metodę transformacji, z wykorzystaniem Agrobacterium tumefaciens, zawierającym odpowiednią konstrukcję wyciszającą w wektorze pH7GWIWG2(I) (oparty na systemie Gateway, M., Inze, D., Depicker, A. „Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation”. Trends Plant Sci. 2002 May;7(5): 193-195). Powyższy wektor zawiera krótkie sekwencje kodujące genu CAO ułożone w orientacji sens/intron/antysens, co umożliwia wyciszenie docelowego genu w roślinie na wysokim poziomie. Celem potwierdzenia transformacji prowadzono genotypowanie kontrolne linii rosnących na polu doświadczalnym „Wolica”. Pozytywnie zweryfikowano wszystkie pojedyncze drzewa w obrębie badanych linii przy użyciu starterów komplementarnych z jednej strony do pH7intronu (R1), z drugiej zaś do wstawki wyciszającej dany gen (CAO-F_2RNAi).

Dodatkowo celem określenia stopnia wyciszenia poszczególnych genów w pierwszej kolejności analizowano materiał roślinny (liście) pochodzący z 2,5 letnich linii caol. W liściach otrzymanych linii wykazano redukcję ekspresji CAO w stosunku do dzikiego typu, na poziomie: 60%, 30%, 45%, odpowiednio dla linii cao1-6, cao1-7, cao1-10.

Dla linii z wyciszonym genem określono morfologię, celem stwierdzenia, czy cechy związane z przyrostem biomasy, podlegają modyfikacji genu CAO.

W Tabeli 1 przedstawiono regulację wzrostu drzew oraz procesów fizjologicznych przez gen CAO w P. tremula x tremuloides. Parametry określano dla topoli roślin typu dzikiego t89 i linii transgenicznych: cao1-6, cao1-7, cao1-10 dla których wartości przedstawiono w postaci uśrednionych

PL232 199 Β1 wyników wszystkich linii i potworzeń (cao///TOTAL, 3-6 roślin w ramach poszczególnych sublinii). Do pomiarów użyto rośliny 9-cio miesięczne z warunków szklarniowych, oraz rośliny 3,5 letnie z warunków polowych. Średnicę pnia (mm) analizowano dla przekrojów poprzecznych na różnej wysokości drzewa począwszy od wierzchołkowej części rośliny (0,01 m), a następnie w punktach odpowiadających długości odcinków 0.1 m, 0.3 m, 1.5 m, 1.0 m, 2.0 m i 2.5 m. Błąd standardowy nie przekracza 10% wartości średniej.

Tabela 1

Parametr	Długość pnia	t89	eaolTOTAL
długość pnia (cm) rośliny 9-cio miesięcznej		270.8	273.6
długość pnia (cm) rośliny 3,5 letniej		785.0	804.0
średnica pnia (mm) rośliny 9-cio miesięcznej	0.01 m	3.03	3.48
	0.10 ni	4.35	4.94
	0.30 m	5.80	6.27
	1.00 m	7.55	8.22
	1.50 m	9.39	9.72
	2.00 m	10.41	10.82
	2.50 m	13.35	15.67
objętość pnia (cm3) rośliny 9-cio miesięcznej		18.83	21.92
liczba pędów bocznych		26.35	27.43
liczba warstw komórek kory		6.2	6.9
liczba liści rośliny 9-cio miesięcznej		140.00	133.17
powierzchnia liści (cm2)		51.5	48.3
liczba aparatów szparkowych/mm2 liścia rośliny 9-cio miesięcznej		67.2	66.9
liczba aparatów szparkowych/mm2 liścia		132.5	149.8
rośliny 3,5 letniej transpiracja (ml H2O/24h/cm2)		0.147	0.154
fluorescencja chlorofilu a - parametr Fv/Fm		0.8326	0.8294
lluorescencja chlorofilu a - parametr NPQ		0.5470	0.6153

Mechanizmy podziału komórkowego i programowej śmierci komórki, dwóch antagonistycznych procesów odpowiedzialnych za prawidłowy wzrost i rozwój roślin, stanowią nieoczekiwanie jeden z elementów podlegających kontroli genu CAO, który został wybrany do modyfikacji genetycznej topoli. Ponieważ funkcja genu CA O związana jest ze szlakami sygnałowymi, w które zaangażowane są reaktywne formy tlenu i hormony roślinne np. kwas salicylowy, dlatego też reakcje na biotyczne i abiotyczne czynniki środowiskowe mogą być znacznie bardziej sprawne dla roślin z zmodyfikowanym genem CA O niż w przypadku roślin dzikiego typu. Prowadzone analizy biometryczne wzrostu roślin wskazują, że topole typu dzikiego nie różniły się w sposób statystycznie istotny od linii topoli zmodyfikowanych genetycznie pod względem wysokości roślin, jednakże zarówno w warunkach szklarniowych jak i polowych utrzymywał się trend wyższych roślin cao1. Potwierdzeniem lepszego funkcjonowania roślin w warunkach naturalnych jest zwiększone tempo podziałów komórkowych oraz przyrost biomasy, wyrażone większą średnicą pędów roślin transgenicznych w stosunku do roślin niezmodyfikowanych genetycznie. Parametry te powodowały, że finalna objętość pędu roślin transgenicznych była również większa. Przyrost biomasy był również wyrażony większą ilością pędów bocznych, a lepsze przystosowanie do warunków polowych wyrażone było grubszą warstwą kory, która stanowi naturalną warstwę ochronną roślin. Jednocześnie, nieznacznie mniejsza liczba liści i redukcja ich powierzchni, rekompensowana była większą liczbą aparatów szparkowych, która gwarantowała, szcze

PL 232 199 B1 gólnie w warunkach polowych, efektywną wymianę gazową (transpiracja) i prawidłowe prowadzenie procesów fizjologicznych.

Celem zweryfikowania efektywności procesu fotosyntezy i potencjału akumulacji świeżej i suchej masy przeprowadzona została analiza aktywności fotosystemu PSII (fluorescencji chlorofilu a) dla roślin P. tremula x tremuloides typu dzikiego i roślin transgenicznych cao1-6, cao1-7, cao1-10. Wszystkie eksperymenty wykonywano w sezonie letnim na liściach drzew, które rosły na polu doświadczalnym „Wolica” (52° 8' 30” N, 21° 4' 12” E). Liście do analiz pobierano w godzinach porannych (8-10.00) z pędu bocznego (5-7 liść) na wysokości 1-1.5 m od powierzchni gruntu. Nie stwierdzono istotnych różnic wyrażonych parametrem fluorescencji chlorofilu a na poziomie maksymalnej fotochemicznej wydajności PSII (F_v/Fm). Wartości dla poszczególnych genotypów były na poziomie zdrowych roślin. Jedynie w przypadku linii cao1-7 obserwowano niewielki spadek wartości F_v /Fm, świadczący o zwiększonym poziomie stresu. Obniżona wartość do poziomu (0,8164) obniżyła średnią wartość wyliczoną wszystkich linii. Jednocześnie, wartości niefotochemicznego wygaszania (NPQ), będącego mechanizmem rozpraszania nadmiaru energii i ochrony roślin przed nadmiarem produkowanych reaktywnych form tlenu były podwyższone dla roślin transgenicznych, sugerując sprawniejszą ochronę fotosystemów.

Otrzymano zatem linie drzew, znamienne tym, że drzewo posiada zwiększony przyrost biomasy, wyrażony zwiększeniem długości i szerokości pnia.

P r z y k ł a d 2. Właściwości drewna otrzymanych linii transgenicznych ze zmodyfikowanym genem CAO.

Wszystkie eksperymenty wykonywano w sezonie jesiennym po ścięciu drzew, które rosły na polu doświadczalnym „Wolica”. Obserwacje przekrojów poprzecznych pędów z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego i skaningowego mikroskopu elektronowego wskazały, że zmniejszona masa pędu drzew transgenicznych, pomimo większej akumulacji suchej masy, związana była z różnicami w ilości i rozmieszczeniu naczyń w poszczególnych pierścieniach przyrostu wtórnego różnych genotypów. Naczynia nie zawierają protoplastów, są martwymi komórkami drewna, wyspecjalizowanymi w transporcie wody i soli mineralnych. Dodatkowo naczynia pełnią funkcje mechaniczne i nadają roślinie sztywność. Transport wody z korzeni do liści jest zależny od ilości i średnicy naczyń. Z powodu większego zapotrzebowania na wodę wiosną obserwowano, że rosnące tkanki pędów formowały większą ilość naczyń. Jesienią liczebność naczyń zmniejszała się, były one rozłożone bardziej równomiernie. Jednak ilość i wielkość naczyń była zależna w największym stopniu od badanego genotypu. W materiale pochodzącym z cao1-7, oraz cao1-10 stwierdzono wyższą ilość naczyń we wszystkich pierścieniach pochodzących z trzech sezonów oraz stosunkowo większą ich średnicę w porównaniu do kontroli. Na tej podstawie można stwierdzić, że obniżona masa pnia związana była bezpośrednio z większą objętością pustych przestrzeni naczyń. Jednak cecha ta jest pożądana zarówno ze względu na fizjologiczne aspekty efektywnego transportu wody z korzeni do liści (podwyższone dla linii cao1), jak i ze względu na zwiększenie powierzchni dostępu substancji hydrolizujących podczas procesów technologicznego przetwarzania drewna. Nie zmniejszyła się jednak gęstość drewna linii transgenicznych względem kontroli. Spowodowane to było większą ilością mniejszych komórek pozostałych tkanek drewna.

Gen CAO kontroluje również formowanie ściany komórkowej, ponieważ oddziaływania pomiędzy poszczególnymi komponentami ściany komórkowej determinują wzrost komórek. Redukcję wzrostu komórek innego typu niż naczynia, wskazuje całkowita liczba komórek na jednostkę powierzchni, większa dla linii transgenicznych, pomimo większej ilości naczyń o większej średnicy na tej samej powierzchni. Sugeruje to, że procesy podziałów komórkowych zachodziły z większą intensywnością podczas formowania tkanek drewna.

W Tabeli 2 przedstawiono regulację właściwości drewna przez gen CAO w P. tremula x tremuloides. Parametry określano dla topoli roślin typu dzikiego t89 i linii transgenicznych: cao1-6, cao1-7, cao1-10 dla których wartości przedstawiono w postaci uśrednionych wyników wszystkich linii i potworzeń (cao1/TOTAL, 3-6 roślin w ramach poszczególnych sublinii). Do pomiarów użyto rośliny 3,5 letnie z warunków polowych. Liczbę naczyń, średnicą naczyń, oraz liczbę komórek analizowano dla przekrojów poprzecznych na różnej wysokości drzewa począwszy od wierzchołkowej części rośliny (0,01 m), a następnie w punktach odpowiadających długości rośliny 0.1 m i 0.3 m. Błąd standardowy nie przekracza 10% wartości średniej.

PL232 199 Β1

Tabela 2

Parametr	t89	caoiTOTAL
świeża masa pędu głównego (kg)		7.48	7.34
sucha masa pnia (%)		55.85	57.24
liczba naczyń / mm2	0.01 ni	140.1	156.00
	0.10 m	153.6	160.3
	0.30 m	110.1	159.0
średnica wnętrza naczyń (mm)	0.01 ni	0.018	0.023
	0.10 in	0.023	0.028
	0.30 ni	0.020	0.027
liczba komórek / mm2	0.01 m	757.5	779.2
	0.10 m	600.0	765.1
	0.30 ni	560.1	728.6

Sposób różnicowania komórek, ich rozmiar i kształt jest również efektem procesów zachodzących podczas formowania ściany komórkowej, jej składu chemicznego i proporcji poszczególnych składników (celulozy, hemiceluloz, lignin). Sposób formowania włókien celulozowych oraz ich sieciowania przez inne składniki determinuje bowiem elastyczność ścian podczas wzrostu komórek, a w konsekwencji ich wielkość. Natomiast ilość odkładanych warstw celulozowo-ligninowych decyduje o ostatecznej grubości ścian komórek zróżnicowanych, pełniących funkcję martwych elementów przewodzących. Ponadto, zarówno struktura na poziomie ścian komórkowych, jak i struktura na poziomie komórek stanowi o jakości i cechach drewna, jego porowatości i właściwościach fizykochemicznych. Dlatego też, celem oceny właściwości morfologicznych i fizyko-chemicznych ściany komórkowej wycięto fragmenty z świeżych pędów na przekroju poprzecznym. Próbki suszono 24 h w 110°C w wago-suszarce suszarce firmy Radwag. Następnie próbki zostały pokryte cienką (około 15 nm) warstwą złota (przy użyciu napylarki Cressington 108 Auto). Analizę mikroskopową prowadzono przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego. Ponadto określono gęstość próbek, ich zmiany wymiarowe po uwodnieniu (suwmiarka) i przy wysychaniu (dylatometr NETZSCH 402C) oraz siłę zgięcia próbki i jej elastyczność (MTS Criterion 43).

W Tabeli 3 przedstawiono regulację właściwości histologicznych i fizykochemicznych drewna przez gen CAO w P. tremula x tremuloides. Parametry określano dla topoli roślin typu dzikiego t89 (wt) i linii transgenicznych: cao1-6, cao1-7, cao1-10. Do pomiarów użyto rośliny 3,5 letnie z warunków polowych. Analizy wykonano dla prób z przekrojów poprzecznych wykonanych na wysokości 0.3 m drzewa począwszy od wierzchołkowej części rośliny. Błąd standardowy nie przekracza 10% wartości średniej.

Tabela 3

	tS9	caoJ
grubość ścian komórkowych (nm)	811.0	1112.2
gęstość drewna (g/cm2)	0.421	0.431
zmiany masy po uwodnieniu (%)	297.27	292.14
pęcznienie drewna (%)	27.78	27.41
zmiany dylatometryczne (dL/Lo/%)
próby powietrznie suche	-0.31	-0.18
próby uwodnione	-0.7 (piki: 74°C, 100°C)	-0.54 (piki: 113°C, 119°C)
średnia siła zgięcia (N)	10.60	10.75
elastyczność (ugięcie, mm)	4.89	4.55

PL232 199 Β1

Analiza morfologii tkanek i komórek pędów poszczególnych linii przy powiększeniu 400x dla mikroskopu fluorescencyjnego oraz 2000x dla skaningowego mikroskopu elektronowego umożliwiła porównanie grubości ścian komórkowych. Ściany komórek drewna, które znajdowały się pomiędzy naczyniami dla wszystkich linii transgenicznych były grubsze w porównaniu do ściany komórkowej kontroli. Konsekwencją było mniejsze światło komórek. Niezmieniona była natomiast struktura komórek łyka. Mając na uwadze znaczne różnice pomiędzy badanymi liniami w strukturze tkanek drewna przeprowadzono szczegółowe badania właściwości fizyko-chemicznych. Pomimo zwiększonej grubości ścian komórkowych i większej zawartości suchej masy pnia, większość parametrów fizycznych drewna topoli transgenicznej było porównywalne do kontroli. Jedynym wyjątkiem były zmiany wymiarowe drewna powietrznie suchego, które uwadniano w wodzie przez 24 h w temperaturze pokojowej. Pomiar dylatometryczny w zakresie temperatur 30-150°C, wskazał na zdecydowanie niższe kurczenie drewna z transgenicznych topoli podczas stopniowego wysychania.

W dalszej kolejności dla określenia stabilności ścian komórkowych przeprowadzono analizę procesu spalania i analizy termicznej (zgodnie z metodyką Hebda et al. 2013). Z pędów usunięto korę, oraz znajdujący się w środku miękisz. Otrzymane drewno rozdrobniono na małe kawałki, a następnie wysuszono 24 h w temperaturze 110°C (wago-suszarka Radwag). Następnie odważono próbki wysuszonego drewna o masie 10 mg, umieszczono w tygielku aluminiowym i poddano procesowi pirolizy. Analizę termiczną wykonano z zastosowaniem trzech równoległych technik badawczych: termograwimetrii (TG), różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), oraz kwadrupolowej spektrometrii masowej (analizy produktów gazowe pirolizy) (NETZSCH STA 409 C/CD). Analizowane próbki ogrzewano z szybkością 10°C/min do temperatury 600°C w atmosferze obojętnej helu. Szybkość przepływu gazu wynosiła 80 ml/min. Zarejestrowane krzywe TG, DTG, DOS oraz intensywności sygnału poszczególnych mas produktów gazowych analizowano przy pomocy oprogramowania komputerowego Proteus.

W Tabeli 4 przedstawiono regulację właściwości fizykochemicznych drewna przez gen CAO w P. tremula x tremuloides. Parametry określano dla topoli roślin typu dzikiego t89 (wt) i linii transgenicznych: cao1-6, cao1-7, cao1-10. Do pomiarów użyto rośliny 3,5 letnie z warunków polowych. Spalanie drewna w powietrzu związane z zmianą masy podano w wybranych punktach temperaturowych. Dodatkowo zarejestrowano temperaturę zapłonu (*) i całkowity ubytek masy po skończonym procesie. Degradację poszczególnych składników ścian komórkowych dla oceny ich stabilności termicznej określono metodami analizy termicznej wskazując temperatury (°C) i wartości efektów cieplnych DSC (mW/mg) zmierzone przy extremach zachodzących reakcji (pików). Błąd standardowy nie przekracza 10% wartości średniej.

Tabela 4

Spalanie (% zmiana masy)	analiza termiczna temp (°C)/ DSC (mW/mg)
temperatura	t89	caol	H2O	celuloza	lignina
t89	caol	t89	caol	t89	caol
117°C	0	0	110°C/	105°C/	302°C/	297°C/	372°C/	362“C/
			-0.351	-0.272	0.211	0.320	0.368	0.411
235 PC	3,58	2,00	-	-	-	-	-	-
250°C	2,87*	-1,59	-	-	-	-	-	-
279 °C	-7,01	-2,50			372 °C	362 °C	402°C	402°C
					0.368	0.411	0.372	0.386
340°C	-15,52	-2,51	-	-	-	-	-	-
348°C	-15.52	-2,58*	-	-	-	-	-	-
350°C	-15,53	-19,38					470°C	457°C
							0.409	0.257
391°C	-15,55	-23,86	-	-	-	-	-	-
% ubytek masy	99.5	99.6	0	0	65	63	74	72

Całkowity ubytek masy był podobny dla cao1 i topoli niezmodyfikowanych genetycznie, jednakże kurczenie prób i zmniejszanie masy próbki związane z spalaniem i wydzielaniem produktów gazoPL 232 199 B1 wych zachodziło wyższych temperaturach dla prób z drzew modyfikowanych genetycznie. Podobnie temperatura zapłonu prób caol była prawie o 100°C wyższa względem kontroli, wskazując na istotne zmiany właściwości drewna.

Dla określenia właściwości poszczególnych komponentów ścian komórkowych drewna przeprowadzono analizę termiczną uwzględniając zmiany charakterystyczne dla celulozy i ligniny. Pod wpływem wzrostu temperatury, którą na potrzeby dekompozycji termicznej drewna, przyjęto w zakresie 30-600°C, dla wszystkich genotypów topoli obserwowano bardzo zbliżony kształt krzywych termograwimetrycznych. Ubytek masy następował w trzech etapach. Pierwszą zmianę masy zaobserwowano w temperaturze do ok. 150°C i efekt ten związany jest z utratą wody. W temperaturze ok. 210°C do ok. 378°C stwierdzono gwałtowny ubytek masy badanych próbek o ok. 65%, wskazujący na główny etap dekompozycji termicznej drewna odpowiadający depolimaryzacji i dehydratacji celulozy. Dalszy spadek masy, o znacznie łagodniejszym przebiegu, zachodził do temperatury 600°C i wartości ok.74% wskazując rozkład ligniny.

Krzywe różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) informują o zmianie różnicy strumienia cieplnego, zachodzącego pomiędzy próbką badaną i referencyjną podczas przemiany termicznej. Pik na krzywej DSC w temperaturze ok. 100°C potwierdzał wyłącznie proces desorpcji wody wolnej (niezwiązanej chemicznie), ponieważ dla produktów gazowych w tym zakresie temperatur stwierdzono zmiany wyłącznie dla mas m/z18 i m/z17, odpowiadających cząsteczkom wody (H2O). Jest to endotermiczny proces, związany z pochłanianiem energii. Topola zmodyfikowana genetycznie wymagała dostarczenia mniejszej ilości energii podczas procesu desorpcji, a efekt ten był związany z mniejszą ilością odparowanej wody w niższej temperaturze (105°C) w porównaniu do drewna topoli niezmodyfikowanego. Zatem, linie topoli z wyciszonym genem CAO, mają strukturę drewna, która absorbuje wodę w mniejszych ilościach i jest ona najłatwiejsza do usunięcia (przy najmniejszym zapotrzebowaniu energii do przeprowadzenia tego procesu). Jak stwierdzono podczas analizy mikroskopowej linie topoli z wyciszonymi genem CAO, mają strukturę drewna z największą ilością naczyń o dużej średnicy. Jednocześnie grubość ścian komórkowych jest znacznie większa dla drewna topoli zmodyfikowanych genetycznie. Można zatem postawić wniosek, że absorpcja/desorpcja wody jest związana z różnicami w budowie tkanek drewna na poziomie komórkowym i poziomie ściany komórkowej. Zwarta budowa ścian zapobiega absorpcja wody, a duża powierzchnia naczyń ułatwia desorpcję tej obecnej w drewnie.

Proces dekompozycji celulozy zachodzi zwykle dwuetapowo obejmując etap depolimeryzacji i dehydratacji. W wyniku procesu depolimeryzacji polimery lignino-celulozowe ulegają rozpadowi na mniejsze organiczne fragmenty i produkty pośrednie termicznego rozpadu: lewoglukozan (m/z 60), a także wysokoenergetyczne substancje organiczne, np. m/z 16 (metan), m/z 30 (etan), m/z 42 (propen), m/z 58 (propanon/aceton). Ulegają one następnie dalszej kondensacji, tworząc smołę. W procesie dehydratacji próbka ulega zwęgleniu (C, m/z12), w wyniku czego powstają drobnocząsteczkowe gazy, o następujących masach cząsteczkowych: m/z 18 (H2O), m/z 28 (CO), m/ z 44 (CO2). W wyniku szczegółowej analizy produktów gazowych stwierdzono, że oba procesy zachodzą w dwóch etapach (dwa piki) jednak drugi pik przy temperaturze ok. 370°C jest efektem nakładania się rekcji rozkładu celulozy i ligniny. Linie transgeniczne wydzielały więcej ciepła w zakresach temperatur odpowiadających pikom rozkładu celulozy, a maxima reakcji przypadały na niższe temperatury, oraz wydzielana była niska ilość produktów gazowych. Zatem celuloza budująca ściany komórkowe drewna transgenicznych topoli caol ulega ograniczonemu rozpadowi całkowitemu, a dominują raczej procesy relatywnie łatwego rozluźnienia struktury krystalicznej i/lub depolimeryzacji, z ograniczonym procesem dehydratacji depolimeryzacji. Taka struktura sprzyja procesom technologicznego przetwarzania drzewa, gdzie niezbędne jest uzyskanie dużej wydajności nieuszkodzonych włókien, ale jednocześnie łatwy dostęp substancji chemicznych lub enzymatycznych do wewnętrznych partii drewna/ścian komórkowych. Rozkład ligniny, jako polimeru kompleksowego zachodzi stopniowo, w przypadku transgenicznych topoli caol trzyetapowo, przy niższych temperaturach, wskazując niższą stabilność ligniny.

Otrzymano zatem linie drzew, w których drzewo posiada zwiększony przyrost biomasy, wyrażony zwiększeniem: zawartości suchej masy, liczby komórek drewna, grubości ścian komórkowych i gęstości drewna. Jednocześnie otrzymane linie drzew charakteryzowały się zmienionymi parametrami fizykochemicznymi drewna:

- zwiększoną liczbą naczyń drewna o większej średnicy wnętrza naczyń, co w efekcie ułatwia suszenie drewna (zmniejsza energochłonność procesu), zmniejsza elastyczność, zwiększa kruchość drewna podczas obróbki wstępnej i zmniejsza koszty rozdrabniania,

PL232 199 Β1

- zwartą budową ścian komórkowych, która zapobiega wtórnej absorpcji wody,

- celulozą, która ulega relatywnie łatwemu rozluźnieniu struktury krystalicznej i/lub depolimeryzacji, z ograniczonym procesem dehydratacji oraz ligniną, o niższej stabilności.

Przykład 3 Wydajność masy celulozowej otrzymanej z drewna linii transgenicznych ze zmodyfikowanym genem CAO.

Pnie topoli były składowane przez 6 miesięcy w celu wstępnego wysuszenia drewna. Mierzono suchość drewna miernikiem suchości Testo 606-1. Gdy suchość drewna spadła poniżej 20%, drewno cięto na plastry o grubości 25 mm (ukośnice Metabo KGS 254). Otrzymane plastry drewna niezwłocznie cięto przy użyciu tasaka na klocki o wymiarach 16x8 mm. Do roztwarzania skierowano tylko zrębki bez zanieczyszczeń, sęków lub śladów kory. Do roztwarzania pobierano porcję 1000g bezwzględnie suchego drewna. Zrębki wsypywane były do warnika, a następnie zalewane były wodą, siarczkiem sodowych i wodorotlenkiem sodowym, tak by uzyskać roztwór warzelny o zadanym stężeniu alkaliów czynnych, odpowiedniej siarczkowości i module cieczy. Dla wszystkich badanych topól, dla których wyniki przedstawione są w tabeli parametry procesu roztwarzania były następujące:

Temperatura maksymalne roztwarzania: 160°C

Siarczkowość ługu: 30%

Moduł cieczy: 4

Czas podgrzewania do temperatury maksymalnej: 2 godziny

Czas roztwarzania w temperaturze maksymalnej: 2 godziny

Alkalia czynne: 26% (główna zmienna procesowa)

Po roztwarzaniu otrzymano masę celulozową oraz ług warzelny. Masę celulozową poddawano procesowi mycia poprzez przepłukanie warnika około 501100 dm³ wody. Następnie zalewano warnik objętością około 12 dm³ wody i pozostawiano na minimum 8 h.

Po raz kolejny przepłukiwano masę celulozową wodą w takiej ilości by wypływająca woda była bezbarwna. Masę poddawano procesowi rozwłóknienia (laboratoryjny rozwłókniacz, typ R1). Proces rozwłókniania prowadzono porcjami po około 40 g masy celulozowej. Rozwłóknioną masę celulozową umieszczano w zbiorniku i zalewano około 90 dm³ wody na 24h w celu dyfuzyjnego usunięcia pozostałości ługu. Rozwłóknioną masę celulozową sortowano na sortowniku membranowym z płytą sortowniczą o szczelinie 0,2 mm. Nieprzesortowane elementy pozostałe na płycie sortowniczej podawano ponownemu rozwłónieniu i ponownie sortowano. Elementy, które po dwukrotnym rozwłóknieniu nie przeszły przez płytę sortowniczą, zbierano i suszono przez 24 h w temperaturze 105°C. Następnie ważono je i w ten sposób określano ilość niedowarków. Masę przesortowaną, zbieraną na sicie o numerze 120, odwadniano do suchości około 15%, a następnie rozdzielano na porcje (fragmenty ok. 0,5x0,5 cm) i suszono w warunkach otoczenia przez 72 h. Masę ważono i dzielono na próbki około 1i-2 g. Dla tych próbek określano suchość, wyliczono ilość masy przesortowanej i określano stopień roztworzenia, wyrażony jako liczba kappa. Oznaczenie wykonywano 3-krotnie.

W Tabeli 5 przedstawiono wydajność mas celulozowych otrzymanych z drewna linii transgenicznych ze zmodyfikowanym genem CA O w Populus tremula x tremuloides. Przeprowadzono analizy porównawcze również dla innych gatunków topoli Populus trichocarpa i Populus maximowiczii. Do pomiarów użyto rośliny 3,5 letnie z warunków polowych.

Tabela 5

Drewno	alkalia resztkowe (g/dm3)	Kappa	udział niedowarków (%)	wydajność masy sortowanej (%)
P. trichocarpa	6.78	24.50	3.15	46.74
P. maximowiczii	7.20	25.16	1.16	45.40
P. tremula r tremuloides t89	8.99	16.99	0.32	47.62
P. tremula x tremuloides caol	7.79	17.84	0.23	50.21

Stwierdzono zdecydowanie wyższą wydajność masy celulozowej przesortowanej uzyskaną z drewna topoli o zmodyfikowanym genie CAO. Dla drewna cao1 wydajność była wyższa o 4.81%, 2.59% i 3.47% odpowiednio w porównaniu do nietransgenicznych topoli gatunków P. tremula x tremuloides, P. trichocarpa i P. maximowiczii. Wskazuje to jednoznacznie na możliwość zastosowania w praktyce nowych linii drzew o zmienionej kompozycji ścian komórkowych dla prowadzenia bardziej

PL232 199 Β1 przyjaznych środowisku, technologii przetwarzania drewna. Zastosowanie modyfikacji genetycznej dla otrzymywania drewna o zmienionej strukturze prowadzi bowiem do łatwiejszej obróbki mechanicznej i chemicznej materiału drzewnego i ograniczenia zużycia energii i koszów otrzymania masy celulozowej. Produkt genu CAO, bierze udział w modulowaniu składu i stabilności ścian komórkowych roślin. Otrzymano zatem linie drzew, w których w wyniku procesów przetwarzania drewna uzyskana jest wyższa wydajność masy celulozowej.

SEQ1D:1_______________________________________________________________ >gi 1224078.4451 ref] XM_002305506.1| Populus trichocarpa predicted protein, mRNA (936 pz) ATGGAAAATATATTGGGAAAACAGTTGTTGCATAACACTATGCTTAAATATAATACTCAGGTCTCCCATTTGTTAATTTATG AAIGGATTGTAAAGTTTTTCTTTTTTTGGGTTGATCGGGATTrCGTAGCTAAAAACGTGGTGGCAGAGTACGAGACACCAT GGTGGACGGCAGCCAAGAAAGCCGACGAGTCGTCTTTTAGTCAGATTCTATCAGAGAATGAAGATGGACTCCGTGACGTC AATGCTGTGGACAGTGACGGACGAACAGCTTTGCTTTTTGTATCTGGGCTCGGCTCTGAGCCGTGTGTTAAGCTTTTAGCC GAAGCTGGAGCTGACTTGGATCATAGAGACAATAGTGGTGGCTTGACGGCTCTTCATATGGCAGCTGGGTATGTCAGGCC GGGTGTCGTCAAATTATTGGTTGACGTAGGTGCTGATCCTGAGGTGAAGGATGATAGAGGATTAACTCCCTTTGATTTGGC TAAGGAAATTTTAAGAGTGACCCCAAAAGGGAATCCAATGCAATTTGAAAGAAGATTGGGGTTAGAAAGTATAATAAGG ATTTTAGAAGAGGAAATATTCGAGTACGCTGAGGTACAGGAAATATTGGAGAAAAGAGGGAAAGGGAGGGATATGGAG TATTTGGTAAAATGGAAGGATGGCGGTGCCAATGAATGGGTCAAAGCAAGGTTCATAGGGGAGGATTTGGTGAGGGATT TTGAGGCAGGGTTAGAGTATGCCGTGGCAGAGGGGGTGATGGGTAAGAGACCAGGTGATGATGGGAAGAATGAGTATC TTGTGAAATGGACGGATATTGATGAGGCCACGTGGGAGCCTGAGGAGAATGTTGATCCTGATCTGATTAAAGAGTTTGAG CAGGCACAGATTAATGTAGAGGTTCCATCAAGTAGTGATGGGTGCCCAGGTGAGTAA

Zastrzeżenia patentowe

Claims (4)

1. Sposób otrzymywania transgenicznych drzew topoli z rodziny Populus o zmienionych właściwościach fizykochemicznych i strukturalnych drewna w stosunku do drzew nietransformowanych, w którym wprowadza się do rośliny, do komórki roślinnej lub do tkanki rośliny zmodyfikowany gen CAO kodujący białko cpSRP43, odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystem II z systemem membran tylakoidowych, przy czym stosuje się sekwencje nukleotydowe genu CAO w orientacji powodującej zmianę poziomu ekspresji tego genu w porównaniu do roślin niemodyfikowanych w celu wyciszenia jego ekspresji, znamienny tym, że stosuje się sekwencję nukleotydową genu CAO, która posiada co najmniej 60% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, korzystnie posiada co najmniej 80% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, bardziej korzystnie posiada co najmniej 95% identyczności z sekwencją SEQ ID 1.

2. Linia transgenicznych drzew topoli z rodziny Populus o zmienionych właściwościach fizykochemicznych i strukturalnych drewna, z wprowadzonym do drzewa zmodyfikowanym genem CAO, kodującym białko cpSRP43 odpowiedzialne za prawidłową integrację białek budujących antenę fotosystem II z systemem membran tylakoidowych, z sekwencjami nukleotydowymi genu CAO w orientacji powodującej zmianę poziomu ekspresji tego genu w porównaniu do roślin niemodyfikowanych w celu wyciszenia jego ekspresji, znamienna tym, że sekwencja nukleotydową genu CAO posiada co najmniej 60% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, korzystnie posiada co najmniej 80% identyczności z sekwencją SEQ ID 1, bardziej korzystnie posiada co najmniej 95% identyczności z sekwencją SEQ ID 1.

3. Linia drzew według zastrz. 2, znamienna tym, że ich drewno zawiera celulozę ulegającą relatywnie łatwemu procesowi rozluźnienia struktury krystalicznej i/lub depolimeryzacji, z ograniczonym procesem dehydratacji.

4. Linia drzew według zastrz. 2, znamienna tym, że ich drewno zawiera ligninę ulegającą termicznej dekompozycji w temperaturach niższych niż dla standardowego materiału drzewnego roślin niezmodyfikowanych.