PL231230B1

PL231230B1 - An agent increasing effectiveness of DNA vaccine directed against a virus, DNA plasmid preparation, DNA vaccine, method for obtaining modified expressive vector and the application of nucleotide sequence recognized by the agent NF kappa B.

Info

Publication number: PL231230B1
Application number: PL411543A
Authority: PL
Inventors: Agnieszka Sirko; Anna GÓRA-SOCHACKA; Anna Góra-Sochacka; Włodzimierz ZAGÓRSKI-OSTOJA; Włodzimierz Zagórski-Ostoja; Anna STACHYRA; Anna Stachyra; Patrycja REDKIEWICZ; Patrycja Redkiewicz; Patrick Midoux; Chantal Pichon
Original assignee: Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2015-03-11
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2019-02-28
Also published as: EP3268033A1; WO2016144194A1; PL411543A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest czynnik zwiększający efektywność szczepionki DNA skierowanej przeciw wirusowi, preparat plazmidowy DNA, szczepionka DNA, sposób otrzymywania zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego 3NF oraz zastosowanie sekwencji nukleotydowej rozpoznawanej przez NFkB. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy zastosowania w szczepionce DNA sekwencji rozpoznawanej przez jądrowy czynnik transkrypcyjny NF kappa B (NFkB. ang. nuclear factor kappa B) w celu zapewnienia efektywnego transportu plazmidu szczepionkowego do jądra oraz podwyższenia poziomu transkrypcji wprowadzanego genu kodującego wybrany antygen.The subject of the invention is a factor increasing the effectiveness of a DNA vaccine against a virus, a DNA plasmid preparation, a DNA vaccine, a method of obtaining a modified 3NF expression vector and the use of a nucleotide sequence recognized by NFkB. More specifically, the solution relates to the use of a sequence recognized by nuclear transcription factor NF kappa B (NFkB) in a DNA vaccine to ensure efficient transport of the vaccine plasmid to the nucleus and to increase the transcription level of the introduced gene encoding the selected antigen.

Szczepionki DNA zwane również genetycznymi należą do nowej generacji szczepionek. Do immunizacji zwierząt po raz pierwszy zostały użyte kilkanaście lat temu. Wiadomo, że wstrzyknięcie DNA w formie plazmidu lub formie liniowej może prowadzić do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom kodowanym przez zastosowaną szczepionkę. Poziom tej odpowiedzi, istotny ze względu na zapewnienie ochrony przez szczepionkę, zależy od wielu czynników. Oprócz wyboru wystarczająco silnego antygenu kluczowe jest zapewnienie jego wydajnej ekspresji w komórkach szczepionego organizmu. Stosowane są różne strategie w celu zwiększenia wydajności szczepionek DNA. Związane są one z modyfikacjami kasety ekspresyjnej, stosowaniem różnych adiuwantów zarówno biologicznych jak i chemicznych, stosowaniem różnych nośników, różnymi drogami podania bądź immunizacją z innymi szczepionkami.DNA vaccines, also called genetic vaccines, belong to a new generation of vaccines. They were first used to immunize animals several years ago. It is known that injection of DNA in plasmid or linear form can induce an immune response against the antigens encoded by the vaccine used. The level of this response, which is important in providing vaccine protection, depends on many factors. Besides selecting a strong enough antigen, it is essential to ensure its efficient expression in the cells of the vaccinated organism. Various strategies are used to increase the efficiency of DNA vaccines. They are related to the modification of the expression cassette, the use of various adjuvants, both biological and chemical, the use of various carriers, different routes of administration or immunization with other vaccines.

Jądrowy czynnik transkrypcyjny NFkB został odkryty w 1986 roku przez Sen i Baltimore w jądrach mysich limfocytów B jako konstytutywne białko niezbędne do transkrypcji łańcucha lekkiego kappa immunoglobulin. Pełni ono ważną rolę w procesach odpornościowych i zapalnych. Istotnym elementem struktury białek NFkB jest konserwatywny region - domena RHD (Rei homology domain). Zawiera sekwencje umożliwiające dimeryzację podjednostek białka i łączenie się z białkami hamującymi IkB (inhibitory jądrowego czynnika kB). Oprócz lego domena ta odpowiada za wiązanie się podjednostek NFkB z sekwencjami kB składającymi się z 10 par zasad (5’GGGPuNNPyPyCC3’, Pu - puryna, N - dowolna zasada, Py - pirymidyna) w łańcuchu DNA, co związane jest z regulacją transkrypcji genów. W jej obrębie znajduje się również sekwencja lokalizacji jądrowej NLS (nuclear localization signal) zapewniająca transport czynnika NFkB z cytoplazmy do jądra.Nuclear transcription factor NFkB was discovered in 1986 by Sen and Baltimore in murine B cell nuclei as a constitutive protein necessary for immunoglobulin kappa light chain transcription. It plays an important role in immune and inflammatory processes. An important element of the structure of NFkB proteins is a conserved region - the RHD domain (Rei homology domain). It contains sequences that enable the dimerization of protein subunits and binding to IkB inhibitory proteins (nuclear factor kB inhibitors). In addition to Lego, this domain is responsible for the binding of NFkB subunits with kB sequences consisting of 10 base pairs (5'GGGPuNNPyPyCC3 ', Pu - purine, N - any base, Py - pyrimidine) in the DNA chain, which is related to the regulation of gene transcription. There is also a nuclear localization signal (NLS) sequence which ensures the transport of the NFkB factor from the cytoplasm to the nucleus.

Wpływ sekwencji kB na poziom ekspresji heterologicznego genu w transfekowanych komórkach w warunkach in vitro opisano w 2001 roku przez Mesika i wsp. Do doświadczeń użyto rekombinowanych plazmidów ekspresyjnych niosących (lub nie) 5-krotne powtórzenia sekwencji kB (5-GGGGACTTTCC-3’) oraz gen reporterowy - lucyferazę. Zaobserwowano zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego. Wykazano, że na całkowite podwyższenie poziomu ekspresji miały wpływ dwa czynniki: (i) stwierdzone kilkunastokrotne zwiększenie wydajności transfekcji oraz (ii) kilkunastokrotne zwiększenie poziomu transkrypcji, co było zależne od lokalizacji wprowadzonej sekwencji 5 x kB. Badana sekwencja kB działała jako czynnik wspomagający transport plazmidu do jądra oraz jako wzmacniacz transkrypcji jeśli była umieszczona na plazmidzie w okolicy promotorowej.The influence of the kB sequence on the expression level of the heterologous gene in the transfected cells in vitro was described in 2001 by Mesik et al. Recombinant expression plasmids carrying (or not) 5-fold repeats of the kB sequence (5-GGGGACTTTCC-3 ') and reporter gene - luciferase. An increase in the expression level of the reporter gene was observed. It was shown that the total increase of the expression level was influenced by two factors: (i) the observed several-fold increase in the transfection efficiency and (ii) the several-fold increase in the level of transcription, which depended on the location of the introduced 5 x kB sequence. The tested kB sequence acted as a factor promoting plasmid transport to the nucleus and as a transcription enhancer when placed on the plasmid in the promoter region.

W dwóch pracach opisano wykorzystanie zmodyfikowanego motywu tzw. 3NF: 5’-CTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGG-3’ złożonego ze zoptymalizowanej sekwencji kB (podkreślone zasady) o długości 10 par zasad oraz sekwencji rozdzielających o długości 5 par zasad. Celem było zwiększenie transportu plazmidowego DNA do jądra komórkowego oraz podwyższenie ekspresji genów heterologicznych. Komórki linii HeLa i C2C12 transfekowano rekombinowanymi plazmidami ekspresyjnymi ze sklonowaną sekwencją kodującą lucyferazę oraz zoptymalizowaną sekwencję 3NF (Breuzard i wsp. 2008). Metodą mikroskopii konfokalnej (skanujący laserowy mikroskop konfokalny, confocal laser scanning microscopy, CLSM) pokazano zwiększony transport rekombinowanego plazmidu z sekwencją 3NF w porównaniu z plazmidem bez tej sekwencji. Po 5 godzinach od transfekcji w jądrach komórek wykryło około 1500 kopii rekombinowanego plazmidu z 3NF, natomiast tylko 250 kopii plazmidu bez 3NF. Ponadto, zastosowanie inhibitora aktywacji czynnika NFkB (BAY 11-7085) wpływało na spadek ilości kopii plazmidu 3NF w jądrach komórek. Potwierdziło to. że sekwencja 3NF była rozpoznawana przez czynnik NFkB, co istotnie wpływało na zwiększenie transportu do jądra komórkowego.Two works describe the use of a modified motif of the so-called 3NF: 5'-CTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGCTGGGGACTTTCCAGG-3 'composed of an optimized 10 bp kB sequence (underlined bases) and 5 bp spacers. The aim was to increase the transport of plasmid DNA to the cell nucleus and to increase the expression of heterologous genes. HeLa and C2C12 cells were transfected with recombinant expression plasmids with the cloned luciferase coding sequence and an optimized 3NF sequence (Breuzard et al. 2008). By confocal microscopy (confocal laser scanning microscopy, CLSM) the increased transport of the recombinant plasmid with the 3NF sequence compared to the plasmid without this sequence was shown. Five hours after transfection, about 1500 copies of the recombinant plasmid with 3NF were detected in the nucleus of the cells, while only 250 copies of the plasmid without 3NF. Moreover, the use of the NFkB activation inhibitor (BAY 11-7085) decreased the number of copies of the 3NF plasmid in the nucleus of cells. It confirmed it. that the 3NF sequence was recognized by the NFkB factor, which significantly increased transport to the cell nucleus.

W 2009 roku Gonęalves i wsp. pokazali istotne wspomaganie transportu plazmidu do jąder transfekowanych komórek przez zastosowanie sekwencji 3NF. Co więcej, wykazali również pozytywny wpływ na poziom ekspresji genu lucyferazy, który był wprowadzany do komórki na plazmidzie 3NF. Stwierdzono również, że po szczepieniu myszy preparatami plazmidowego DNA niosącego sekwencjęIn 2009, Gonęalves et al. Showed significant support of plasmid transport into the nuclei of transfected cells by using the 3NF sequence. Moreover, they also showed a positive effect on the expression level of the luciferase gene that was introduced into the cell on the 3NF plasmid. It was also found that after vaccination of mice with the plasmid DNA preparations carrying the sequence

PL 231 230 B1 kodującą lucyferazę oraz dwie kopie sekwencji 3NF (p3NF-luc-3NF), czas ekspresji genu lucyferazy był przedłużony w porównaniu z plazmidem bez 3NF lub z jedną kopią 3NF. Podsumowując, z danych literaturowych wynika, że NFkB wiąże się z sekwencjami kB wprowadzonymi do plazmidowego DNA i transportuje to DNA z cytoplazmy do jądra. Ponadto, poprzez wiązanie z sekwencjami kB zlokalizowanymi w odpowiednim regionie regulatorowym plazmidu może działać jako czynnik wzmacniający transkrypcję, co prowadzi do zwiększenia ekspresji genu heterologicznego (Breuzard et al., 2008; Gonęalves et al., 2009).By coding luciferase and two copies of the 3NF sequence (p3NF-luc-3NF), the time of expression of the luciferase gene was prolonged compared to a plasmid without 3NF or with one copy of 3NF. In conclusion, from the literature data it appears that NFkB binds to kB sequences inserted into plasmid DNA and transports this DNA from the cytoplasm to the nucleus. Moreover, by binding to kB sequences located in the appropriate regulatory region of a plasmid, it can act as a transcription enhancer leading to increased expression of the heterologous gene (Breuzard et al., 2008; Gonęalves et al., 2009).

W zgłoszeniu patentowymi US2014/0141036A1 (opubl. 2014-05-22) wskazano na zastosowanie w szczepionkach substancji indukujących translokację NFkB do jąder w komórkach prezentujących antygen. Substancja ta jest wskazana jako wzmacniająca działanie szczepionki.Patent application US2014 / 0141036A1 (published 2014-05-22) indicates the use of substances in vaccines that induce NFkB translocation to the nucleus in antigen presenting cells. This substance is indicated to enhance the effect of the vaccine.

Zgłoszenie patentowe WO2011/150421 (opubl. 2011-12-01) dotyczy bakterii uzyskanych drogą rekombinacji, których zastosowanie prowadzi do ograniczenia wzrostu guza. W dokumencie opisano również (por. par. [0089] wektor szczepionkowy zawierający miejsca wiązania w tym przez czynniki transkrypcyjne takie jak NFkB i AP-2. Zastosowanie miało na celu zapewnienie transportu wektora do jądra komórki.Patent application WO2011 / 150421 (published 2011-12-01) relates to recombinantly obtained bacteria, the use of which leads to a reduction in tumor growth. The document also describes (cf. par. [0089] a vaccine vector containing binding sites including transcription factors such as NFkB and AP-2. The use was to ensure the transport of the vector into the cell nucleus.

Opis patentowy US 897 751 ujawnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą nanocząsteczki z biokompatybilnego polimeru utrzymującego na swojej powierzchni sekwencję wiążącą NFkB w celu hamowania jego aktywności. Kompozycje te są stosowane w leczeniu chorób skóry, w tym atopowego zapalenia skóry. Pomimo istniejących rozwiązań istnieje ciągła potrzeba zapewnienia efektywnego transportu plazmidu szczepionkowego do jądra oraz podwyższenia poziomu transkrypcji wprowadzanego genu kodującego wybrany antygen.US patent 897 751 discloses a pharmaceutical composition containing biocompatible polymer nanoparticles keeping on its surface the NF? B binding sequence in order to inhibit its activity. These compositions are used in the treatment of skin diseases including atopic dermatitis. Despite the existing solutions, there is a continuing need to ensure efficient transport of the vaccine plasmid to the nucleus and to increase the level of transcription of the introduced gene encoding the selected antigen.

Celem wynalazku jest zapewnienie efektywnego transportu plazmidu szczepionkowego do jądra oraz podwyższenie poziomu transkrypcji wprowadzanego genu kodującego wybrany antygen poprzez zastosowanie w szczepionce DNA sekwencji rozpoznawanej przez jądrowy czynnik transkrypcyjny NF kappa B (NFkB. ang. nuclear factor kappa B). Sekwencja ta może być stosowana w szczepionkach DNA skierowanych przeciwko różnym chorobom. Bardzo dobrym przykładem jest zastosowanie w szczepionce przeciwko grypie. Obecnie dostępne i stosowane zarówno u ludzi jak i ptaków są szczepionki zawierające inaktywowane cząsteczki wirusów grypy namnażanych w kurzych zarodkach. Od niedawna dostępne są również preparaty zawierające antygeny wirusa otrzymane w hodowlach komórkowych (Flucelvax, Novatrix). Ze względu na charakter wirusa grypy, jego dużą zmienność genetyczną, skład szczepionek jest ustalany co roku tylko na jeden sezon, co nieodzownie wiąże się z koniecznością częstej optymalizacji ich produkcji. Dodatkowo, ze względu na możliwość wystąpienia pandemii grypy konieczne jest opracowanie szczepionki, której proces produkcji będzie dużo krótszy. Możliwość taką dają właśnie szczepionki typu DNA. W niniejszym wynalazku proponowane jest zwiększenie wydajności tego typu szczepionek.The aim of the invention is to ensure efficient transport of the vaccine plasmid to the nucleus and to increase the level of transcription of the introduced gene encoding the selected antigen by using the sequence recognized by the nuclear transcription factor NF kappa B (NFkB) in the DNA vaccine. This sequence can be used in DNA vaccines against a variety of diseases. A very good example is the use in an influenza vaccine. Currently available and used in both humans and birds are vaccines that contain inactivated influenza virus particles grown in chicken embryos. Recently, preparations containing virus antigens obtained in cell cultures (Flucelvax, Novatrix) are also available. Due to the nature of the influenza virus and its high genetic variability, the composition of vaccines is determined only for one season each year, which necessarily requires frequent optimization of their production. In addition, due to the possibility of an influenza pandemic, it is necessary to develop a vaccine whose production process will be much shorter. Such a possibility is offered by DNA-type vaccines. In the present invention, it is proposed to increase the yield of such vaccines.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z zapewnieniem wyboru wystarczająco silnego antygenu oraz zapewnienie jego wydajnej ekspresji w komórkach szczepionego organizmu, a tym samym zwiększenie wydajności szczepionek DNA zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.The present invention has achieved the realization of the aim defined and solving the problems described in the prior art related to ensuring the selection of a sufficiently strong antigen and ensuring its efficient expression in the cells of the vaccinated organism, and thus increasing the yield of DNA vaccines.

Przedmiotem wynalazku jest czynnik zwiększający efektywność szczepionki DNA skierowanej przeciw wirusowi, charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą antygen oraz sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez jądrowy czynnik transkrypcyjny NF kappa B (NFkB), i że zawiera co najmniej jedną sekwencję opisaną jako SEQ. ID. No. 1, przy czym każda z sekwencji złożona jest z co najmniej trzykrotnie powtórzonego motywu kB. 5’-GGGACTTTCC-3’, będącego miejscem wiązania czynnika NFkB, przy czym powtórzenia są rozdzielone zoptymalizowanymi sekwencjami łączącymi o długości 5 par zasad (5’-AGCTG-3’) oraz, że rozdzielenie od siebie 10 nukleotydowych miejsc wiązania umożliwia jednoczesne przyłączenie co najmniej trzech czynników Nb.The subject of the invention is an agent increasing the effectiveness of a DNA vaccine against a virus, characterized in that it contains a nucleotide sequence encoding an antigen and nucleotide sequences recognized by the nuclear transcription factor NF kappa B (NFkB), and that it contains at least one sequence described as SEQ. ID. Well. 1, wherein each sequence consists of at least a triplicate kB pattern. 5'-GGGACTTTCC-3 ', which is the NFkB binding site, the repeats separated by optimized 5 bp linker sequences (5'-AGCTG-3') and that the separation of 10 nucleotide binding sites allows simultaneous attachment of at least three factors Nb.

Korzystnie, gdy czynnik zapewnia efektywny transport plazmidu szczepionkowego do jądra.Preferably, the agent ensures efficient transport of the vaccine plasmid into the nucleus.

Korzystnie, gdy czynnik podwyższa poziom transkrypcji wprowadzanego genu kodującego wybrany antygen.Preferably, the factor increases the level of transcription of the introduced gene encoding the selected antigen.

Korzystnie, gdy szczepionka skierowana jest przeciw wirusowi grypy H5N1.Preferably, the vaccine is directed against the influenza virus H5N1.

Korzystnie, gdy szczepionka przeznaczona jest dla ptaków i ssaków.Preferably, the vaccine is intended for birds and mammals.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest preparat plazmidowy DNA, charakteryzujący się tym, że zawiera dodatkowe sekwencje (kB) wiązania białka NEkB, i że zawiera co najmniej jedną sekwencję opisaną jako SEQ. ID. No. 1, przy czym każda z sekwencji złożona jest z co najmniej trzykrotnie powtórzonego motywu kB. 5’-GGGACTTTCC-3’ będącego miejscem wiązania czynnika NFkB, przyA further object of the invention is the plasmid DNA preparation, characterized in that it contains additional sequences (kB) of NEkB protein binding and that it contains at least one sequence described as SEQ. ID. Well. 1, wherein each sequence consists of at least a triplicate kB pattern. 5'-GGGACTTTCC-3 'which is the binding site of the NFkB factor, with

PL 231 230 B1 czym powtórzenia są rozdzielone zoptymalizowanymi sekwencjami łączącymi o długości 5 par zasad (5'-AGCTG-3'), i że rozdzielenie od siebie 10 nukleotydowych miejsc wiązania umożliwia jednoczesne przyłączenie co najmniej trzech czynników Nb.The repeats are separated by optimized 5 bp linker sequences (5'-AGCTG-3 '), and that separation of the 10 nucleotide binding sites from one another allows the attachment of at least three Nb factors simultaneously.

Korzystnie, gdy preparat zapewnia efektywny transport plazmidu szczepionkowego do jądra.Preferably, the formulation ensures efficient transport of the vaccine plasmid into the nucleus.

Korzystnie, gdy preparat podwyższa poziom transkrypcji wprowadzanego genu kodującego wybrany antygen.Preferably, the preparation increases the level of transcription of the introduced gene encoding the selected antigen.

Korzystnie, gdy preparat skierowany jest przeciw wirusowi grypy H5N1.Preferably, the formulation is directed against the influenza virus H5N1.

Korzystnie, że preparat stosowany jest w szczepionce DNA.Preferably, the formulation is used in a DNA vaccine.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest szczepionka DNA zawierająca preparat plazmidowy określony powyżej.Another object of the invention is a DNA vaccine containing the plasmid preparation as defined above.

Korzystnie, gdy dawka DNA wynosi co najmniej 10 μg DNA.Preferably, the dose of DNA is at least 10 µg of DNA.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest sposób otrzymywania zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego 3NF niosącego sekwencje rozpoznawane przez czynnik transkrypcyjny NFkB, charakteryzujący się tym, że do wektora ekspresyjnego (na przykład pCI, Promega) wprowadza się dodatkowe sekwencje o długości 56 par zasad (SEQ. ID No. 1) w dwóch pozycjach kasety ekspresyjnej: (i) przed promotorem zapewniającym ekspresję w komórkach zwierzęcych (np. w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BgIII w pCl, przed promotorem wirusa cylomegalii (CMV)) oraz (ii) za sygnałem poliadenylacji kasety ekspresyjnej np. w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny BamHI w wektorze pCI, przy czym każda z tych sekwencji złożona jest z trzykrotnie powtórzonego motywu kB, 5'-GGGACTTTCC-3', powtórzenia są rozdzielone zoptymalizowanymi sekwencjami łączącymi o długości 5 par zasad (5'-AGCTG-3'). Pomiędzy wystawione sekwencje wprowadza się sekwencję DNA kodującą antygen, na przykład sekwencję DNA kodującą hemaglutyninę wirusa grypy H5 HA z plazmidu K3, po czym otrzymany zrekombinowany plazmid używa do immunizacji ptaków lub ssaków.Another object of the invention is a method for the preparation of a modified 3NF expression vector carrying sequences recognized by the transcription factor NFkB, characterized in that additional sequences of 56 bp long (SEQ. ID No. 1) are inserted into the expression vector (e.g. pCI, Promega). ) at two positions in the expression cassette: (i) upstream of the promoter providing expression in animal cells (e.g. in place of the BgIII restriction enzyme recognition site in pCl, upstream of the Cilomegalovirus (CMV) promoter) and (ii) after the expression cassette polyadenylation signal e.g. in restriction enzyme recognition site BamHI in the pCI vector, where each sequence consists of a triple repetitive kB motif, 5'-GGGACTTTCC-3 ', the repeats are separated by optimized 5 bp link sequences (5'-AGCTG-3 '). A DNA sequence encoding an antigen is inserted between the exposed sequences, for example a DNA sequence encoding the hemagglutinin of H5 HA influenza virus from plasmid K3, and the resulting recombinant plasmid is used to immunize birds or mammals.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest zastosowanie sekwencji nukleotydowej rozpoznawanej przez NFkB określonej SEQ. ID No. 1 do zwiększania efektywności szczepionki DNA dla ptaków i ssaków skierowanej przeciwko wirusowi. Korzystnie, gdy sekwencję nukleotydową rozpoznawaną przez NFkB stosuje się jako czynnik zwiększający efektywność szczepionki DNA dla ptaków i ssaków.A further object of the invention is the use of a nucleotide sequence recognized by NFkB of a given SEQ. ID No. 1 to increase the effectiveness of a DNA vaccine for birds and mammals against the virus. Preferably, a nucleotide sequence recognized by NFkB is used as a factor increasing the effectiveness of a DNA vaccine for birds and mammals.

Kolejnym przedmiotem według wynalazku jest zastosowanie czynnika zwiększającego efektywność szczepionki DNA określonego powyżej do wytwarzania szczepionki DNA dla ptaków i ssaków.Another object of the invention is the use of a DNA vaccine efficacy-enhancing agent as defined above for the production of a DNA vaccine for avian and mammalian.

Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.The attached figures allow a better explanation of the essence of the invention.

Na Figurze 1 przedstawiono analizę odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kur typu nieśnego (nioski) rasy Rosa 1. Przedstawiono porównanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie przeciwciał anty-HA IgY u kurcząt immunizowanych przygotowanymi szczepionkami DNA: K3 i 3NF. Jedną dawką szczepionki było 62 μg plazmidowego DNA zmieszanego z nośnikiem do transfekcji komórek. Negatywną kontrolą (Vect) była grupa szczepiona mieszaniną pustego wektora (bez sekwencji kodującej hemaglutyninę) z nośnikiem. Poziom specyficznych przeciwciał w rozcieńczonych 1:200 surowicach oszacowano testem ELISA. Krew pobierano w 21,28 i 35 dobie życia (21d, 28d, 35d). Uzyskane wyniki testu ELISA dla poszczególnych osobników przedstawiono na panelu A, natomiast dane uzyskane w teście zahamowania hemaglutynacji (HI) dla tych samych kurcząt umieszczono na panelu B. W tym przypadku badano surowice z trzeciego pobrania (35 doba życia).Figure 1 shows the analysis of the immune response after vaccination of the Rosa 1 breed of laying hens. A comparison of the immune response at the level of anti-HA IgY antibodies in chickens immunized with the prepared DNA vaccines: K3 and 3NF is presented. One dose of vaccine was 62 µg of plasmid DNA mixed with vehicle for cell transfection. The negative control (Vect) was the group vaccinated with the empty vector mixture (no hemagglutinin coding sequence) with the vehicle. The level of specific antibodies in diluted 1: 200 sera was estimated by ELISA. Blood was collected on 21, 28 and 35 days of life (21d, 28d, 35d). The results of the ELISA test for individual animals are presented in panel A, while the data obtained in the haemagglutination inhibition (HI) test for the same chickens are presented in panel B. In this case, the sera from the third collection (35 days of age) were tested.

Przeprowadzone testy wskazują na wzrost efektywności szczepień po zastosowaniu szczepionki 3NF czyli preparatu plazmidowego DNA zawierającego dodatkowe sekwencje (kB) wiązania białka NFkB.The performed tests indicate an increase in the effectiveness of vaccination after the use of the 3NF vaccine, i.e. a plasmid DNA preparation containing additional sequences (kB) of NFkB protein binding.

Na Figurze 2 przedstawiono analizę odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kurcząt typu mięsnego (brojlery) rasy Ross 308. Przedstawiono porównanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie przeciwciał anty-HA IgY u kurcząt immunizowanych przygotowanymi szczepionkami DNA - K3 i 3NF. Jedną dawką szczepionki było 62 μg DNA plazmidowego zmieszanego z nośnikiem do transfekcji komórek. Negatywną kontrolą (Vect) była grupa szczepiona mieszaniną pustego wektora (bez sekwencji kodującej hemaglutyninę) z nośnikiem. Poziom specyficznych przeciwciał w rozcieńczonych 1:200 surowicach oszacowano testem ELISA. Krew pobierano w 20 i 34 dobie życia (20d, 34d). Uzyskane wyniki dla poszczególnych osobników przedstawiono na panelu A, natomiast dane uzyskane w teście zahamowania hemaglutynacji (HI) dla tych samych kurcząt umieszczono na panelu B. W tym przypadkuFigure 2 shows the analysis of the immune response after vaccination of Ross 308 meat type (broiler) chickens. A comparison of the immune response with anti-HA IgY antibody levels in chickens immunized with the prepared DNA vaccines K3 and 3NF is presented. One dose of vaccine was 62 µg of plasmid DNA mixed with cell transfection vehicle. The negative control (Vect) was the group vaccinated with the empty vector mixture (no hemagglutinin coding sequence) with the vehicle. The level of specific antibodies in diluted 1: 200 sera was estimated by ELISA. Blood was collected on 20 and 34 days of life (20d, 34d). The results obtained for individual animals are presented in panel A, while the data obtained in the haemagglutination inhibition (HI) test for the same chickens is presented in panel B. In this case

PL 231 230 B1 badano surowice z drugiego pobrania (34 doba życia). Przeprowadzone testy wskazują na wzrost efektywności szczepień po zastosowaniu szczepionki 3NF preparatu plazmidowego DNA zawierającego dodatkowe sekwencje (kB) wiązania białka NFkB.Sera from the second collection (34th day of life) were tested. The tests carried out indicate an increase in the effectiveness of vaccination after the use of the 3NF vaccine of the plasmid DNA preparation containing additional sequences (kB) of NFkB protein binding.

Na Figurze 3 przedstawiono rozkład wartości końcowego miana surowic w badanych grupach szczepionych kurcząt. Brano pod uwagę końcowe miana surowic kurzych pobranych w 5 tygodniu życia od obu typów immunizowanych kur (niosek i brojlerów). Miano przeciwciał anty-HA IgY w serii kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń surowic oznaczano testem ELISA. Przedstawiono procentowy rozkład surowic o określonej wartości końcowego miana arbitralnie określonego jako wysokie (>10⁵). Średnie (10⁴-10⁵), niskie (10¹-10⁴) i bardzo niskie (<10³) w badanych grupach kurcząt immunizowanych preparatem K3 i 3NF. Wyniki wskazują na wyższą efektywność preparatu szczepionkowego 3NF w porównaniu z K3.Figure 3 shows the distribution of the final serum titer in the study groups of vaccinated chickens. The final titers of hen sera collected at 5 weeks of age from both types of immunized chickens (layers and broilers) were taken into account. The titer of anti-HA IgY antibodies in a series of two-fold serial dilutions of sera was determined by ELISA. The percentage distribution of sera with a defined end titer value arbitrarily determined as high (> 10 ⁵ ) is shown. Medium (10 ⁴ -10 ⁵ ), low (10 ¹ -10 ⁴ ) and very low (<10 ³ ) in the test groups of chickens immunized with K3 and 3NF. The results show a higher effectiveness of the 3NF vaccine preparation compared to K3.

Na Figurze 4 przedstawiono wyniki dwóch eksperymentów immunizacji myszy szczepionkami DNA - K3 i 3NF. Stosowano 10 ąg (Eksperyment 1) lub 20 ąg (Eksperyment 2) DNA zmieszanego z nośnikiem do transfekcji komórek. Grupę kontrolną (Vect) stanowiły myszy szczepione mieszaniną pustego wektora z nośnikiem. Odpowiedź immunologiczną typu humoralnego oszacowano testem ELISA pokazującym poziom przeciwciał anty-HA lgG. Krew do testów pobierano trzykrotnie w 49, 56 i 63 dobie życia (oznaczone jako 49d, 56d i 63d). Wyniki uzyskane dla indywidualnych osobników pokazano na panelu A, natomiast procentowy rozkład odczytów OD450 dla surowic pobranych w 49, 56 i 63 dniu podzielonych arbitralnie na wysokie (OD405 >0.5) i niskie (OD405 <0.5), pokazano na panelu B. Wyniki wskazują na wyższą efektywność preparatu szczepionkowego 3NF w porównaniu z K3.Figure 4 shows the results of two experiments immunizing mice with DNA vaccines K3 and 3NF. 10 [mu] g (Experiment 1) or 20 [mu] g (Experiment 2) of DNA mixed with vehicle for cell transfection were used. The control group (Vect) were mice vaccinated with the mixture of empty vector and vehicle. The humoral type immune response was assessed by ELISA showing the level of anti-HA IgG antibodies. Blood was collected for tests three times on 49, 56 and 63 days of life (marked as 49d, 56d and 63d). The results obtained for the individual subjects are shown in panel A, while the percentage distribution of the OD450 readings for the sera collected on day 49, 56 and 63, arbitrarily divided into high (OD405> 0.5) and low (OD405 <0.5), are shown in panel B. The results indicate higher efficiency of the 3NF vaccine preparation compared to K3.

W odniesieniu do listy sekwencji:Regarding the sequence list:

SEQ ID nr 1 stanowi sekwencję nukleotydową fragmentu DNA zawierającą trzy powtórzenia 10-cio nukleotydowego motywu rozpoznawanego przez białko NFkB rozdzielonego sekwencjami łącznikowymi o długości 5 nukleotydów.SEQ ID No. 1 is the nucleotide sequence of a DNA fragment containing three repeats of the 10-nucleotide motif recognized by the NFkB protein separated by 5 nucleotide-long linker sequences.

SEQ ID nr 2 stanowi sekwencję nukleotydową kodującą H5 HA (K3) z delecją (ARRRKKR) miejsca cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2. Jest to sekwencja zoptymalizowana do ekspresji w komórkach kur (Gallus gallus). Ten fragment DNA został sklonowany w wektorze pCI i używany jako preparat szczepionkowy oznaczony K3. Sekwencja ta jest opisana w zgłoszeniach patentowych PL396415 (A1) oraz PCT/PL2012/000095 i stanowi stan techniki. W przypadku tego zgłoszenia jest to sekwencja kontrolna.SEQ ID No. 2 is the nucleotide sequence encoding the H5 HA (K3) deletion (ARRRKKR) of the haemagglutinin cleavage site into HA1 and HA2 subunit. It is a sequence optimized for expression in chicken cells (Gallus gallus). This DNA fragment was cloned into the pCI vector and used as the vaccine preparation designated K3. This sequence is described in patent applications PL396415 (A1) and PCT / PL2012 / 000095 and is prior art. In the case of this application it is the check sequence.

W celu lepszego zrozumienia poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.For a better understanding, exemplary embodiments of the above-defined invention are presented below.

P r z y k ł a d yExamples

P r z y k ł a d I. Otrzymanie zmodyfikowanego wektora ekspresyjnego 3NF niosącego sekwencje rozpoznawane przez czynnik transkrypcyjny NFkBExample I. Obtaining a modified 3NF expression vector carrying sequences recognized by the transcription factor NFkB

Zmodyfikowaną kasetę ekspresyjną z genem kodującym hemaglutyninę (HA) wirusa grypy uzyskano w trzech etapach. Etap 1: Zaprojektowano syntetyczny fragment DNA o długości 1446 par zasad (pz) zawierający sekwencję identyczną z 1342-pz sekwencją zlokalizowaną pomiędzy Bglll i BamHI wektora pCI (Promega) (obejmującą m.in. promotor wirusa cytomegalii CMV i terminator SV40 (ang. simian virus late polyadenylatian signal) z miejscem poliadenylacji) oraz dwie sekwencje SEQ ID No. 1, każda o długości 56 pz, zlokalizowane na obu końcach wyżej wspomnianej sekwencji. Fragment ten uzupełniono zewnętrznie zlokalizowanymi sekwencjami rozpoznawanymi przez Bglll (na jednym końcu) oraz BamHI (na drugim końcu), w taki sposób aby orientacja fragmentu zawierającego promotor CMV oraz terminator SV40 z miejscem poliadenylacji była identyczna z orientacją pierwotną po wligowaniu całego syntetycznego fragmentu do wektora pCI. Etap 2: Sklonowano powyższy fragment w miejsca BglII/BamHI wektora pCI, zastępując pierwotny fragment o długości 1342 pz fragmentem syntetycznym. Każda z sekwencji SEQ 1 złożona jest z trzykrotnie powtórzonego motywu kB, 5'-GGGACTTTCC-3', będącego miejscem wiązania czynnika NFkB. Powtórzenia są rozdzielone zoptymalizowanymi sekwencjami łączącymi o długości 5 par zasad (5'-AGCTG-3). Rozdzielenie 10-nukleotydowych miejsc wiązania sekwencjami łączącymi ułatwia jednoczesne przyłączenie kilku czynników NI-kB, co powinno skutecznie zwiększać transport do jądra oraz poziom ekspresji wprowadzanego genu (Gonęalves et al.. 2009). Etap 3: Do plazmidu uzyskanego powyżej wklonowano w miejsca Mlul i SalI sekwencje DNA kodującą hemaglutyninę wirusa grypy H5 HA z plazmidu K3 w orientacji umożliwiającej jego prawidłową ekspresję z promotora CMV. Plazmid K3 opisany jest w zgłoszeniach patentowych PL396415 (A1) oraz PCT/PL2012/000095 i stanowi stan techniki. Sekwencja nukleotydową kodująca białko H5 HA obecnaThe modified expression cassette with the gene encoding the hemagglutinin (HA) of influenza virus was obtained in three steps. Stage 1: A synthetic DNA fragment 1446 bp long was designed containing a sequence identical to the 1342-bp sequence located between the BglII and BamHI of the pCI vector (Promega) (including the CMV cytomegalovirus promoter and the SV40 terminator (simian virus late polyadenylatian signal) with a polyadenylation site) and two sequences of SEQ ID No. 1, each 56 bp in length, located at both ends of the above-mentioned sequence. This fragment was supplemented with externally localized sequences recognized by BglII (at one end) and BamHI (at the other end), so that the orientation of the fragment containing the CMV promoter and the SV40 polyadenylation terminator with the polyadenylation site was identical to the original orientation after ligating the entire synthetic fragment into the pCI vector . Step 2: The above fragment was cloned into the BglII / BamHI sites of the pCI vector, replacing the original 1342 bp fragment with the synthetic fragment. Each of the sequences of SEQ 1 is composed of a triplicate kB motif, 5'-GGGACTTTCC-3 ', which is the NFkB binding site. The repeats are separated by optimized 5 bp linker sequences (5'-AGCTG-3). The separation of 10-nucleotide binding sites with linking sequences facilitates the simultaneous attachment of several NI-kB factors, which should effectively increase transport to the nucleus and the level of expression of the introduced gene (Gonęalves et al. 2009). Step 3: DNA sequences encoding H5 HA influenza virus haemagglutinin from the K3 plasmid in an orientation allowing for its correct expression from the CMV promoter were cloned into the plasmid obtained above into the Mlu and SalI sites. The K3 plasmid is described in patent applications PL396415 (A1) and PCT / PL2012 / 000095 and is prior art. H5 HA protein coding nucleotide sequence present

PL 231 230 B1 zarówno w plazmidzie K3, jak i 3NF jest przedstawiona jako SEQ ID No. 2. Jest to sekwencja hemaglutyniny typu H5 wirusa grypy ptaków H5N1 A/swan/Poland/305-135V08/2006 zmodyfikowana poprzez zmianę kodonów na optymalne dla kury (Gallus gallus) oraz pozbawiona sekwencji kodującej 6 aminokwasów (AARRRKKR) w pozycji 341-346 w obrębie miejsca proteolitycznego cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2.PL 231 230 B1 in both the K3 and 3NF plasmids is shown as SEQ ID No. 2. This is the H5-type hemagglutinin sequence of the avian influenza virus H5N1 A / swan / Poland / 305-135V08 / 2006 modified by changing the codons to optimal for chickens (Gallus gallus) and lacking the coding sequence of 6 amino acids (AARRRKKR) at position 341-346 in within the proteolytic site of hemagglutinin cleavage into the HA1 and HA2 subunit.

Otrzymany zrekombinowany plazmid 3NF został zsekwencjonowany i użyty do immunizacji zwierząt. Klonowanie i namnażanie plazmidu przeprowadzono w komórkach bakterii Escherichia coli szczepu DH5a. Plazmidowe DNA przeznaczone do immunizacji zwierząt było izolowane i oczyszczane przy użyciu zestawu do izolacji plazmidowego DNA (NucleoBond® PC EF, Macherey-Nagel), gwarantującego bardzo niski poziom bakteryjnych endotoksyn w preparacie (<0,1 EU^g).The resulting 3NF recombinant plasmid was sequenced and used to immunize the animals. Cloning and multiplication of the plasmid were performed in Escherichia coli strain DH5a cells. Plasmid DNA for immunization of animals was isolated and purified using a plasmid DNA isolation kit (NucleoBond® PC EF, Macherey-Nagel), guaranteeing very low levels of bacterial endotoxins in the preparation (<0.1 EU µg).

P r z y k ł a d II. Immunizacja kurcząt plazmidem 3NFP r z x l a d II. Immunization of chickens with the 3NF plasmid

Dawki szczepionki (100 μΊ) zawierające 62 μg plazmidu K3 lub 3NF z dodatkiem odczynnika do transfekcji Lipofectin® (Invitrogen) były przygotowywane zgodnie z procedurą opisaną uprzednio (Stachyra i wsp. 2014a, 2014b, zgłoszenia patentowe PL396415 (A1), PCT/PL2012/000095 oraz zgłoszenie patentowe P-410063 zgłoszone 4.11.2014). Przeprowadzono dwa eksperymenty, w pierwszym immunizowano kury typu nieśnego (nioski) rasy Rosa 1, w drugim typu mięsnego (brojlery) rasy Ross 308. Ptaki szczepiono domięśniowo (w mięsień piersiowy) dwukrotnie, w 7 i 21 dobie życia. W eksperymencie nr 1 (przykład III) próbki krwi do badań pobierano z żyły skrzydłowej w 21, 28 i 35 dobie życia, natomiast w eksperymencie nr 2 (przykład IV) w 20 i 34 dobie życia.The vaccine doses (100 μΊ) containing 62 μg of the K3 or 3NF plasmid with the addition of Lipofectin® transfection reagent (Invitrogen) were prepared according to the procedure described previously (Stachyra et al. 2014a, 2014b, patent applications PL396415 (A1), PCT / PL2012 / 000095 and patent application P-410063 filed on 4.11.2014). Two experiments were carried out, in the first one immunized laying hens of the Rosa 1 breed, in the second the meat type (broilers) of the Ross 308 breed. The birds were vaccinated intramuscularly (into the pectoral muscle) twice, on 7 and 21 days of life. In experiment no. 1 (example 3), blood samples for testing were taken from the wing vein at 21, 28 and 35 days of life, while in experiment no. 2 (example 4) on 20 and 34 days of life.

P r z y k ł a d III. Analiza odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kurcząt typu nieśnego testem ELISA i testem HIP r x l a d III. Analysis of the immune response after vaccination of laying chickens with the ELISA test and the HI test

Szczepienie kurcząt oraz pobrania krwi wykonano tak jak opisano w przykładzie II. Do oceny poziomu odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu zastosowano dwa testy: (i) test ELISA (test immunoenzymatyczny) pośredni oraz (ii) test HI (zahamowania hemaglutynacji).The vaccination of the chickens and the blood collection were performed as described in Example 2. Two tests were used to assess the level of immune response after vaccination: (i) an indirect ELISA (enzyme immunoassay) and (ii) an HI test (inhibition of hemagglutination).

Test ELISAELISA test

Obecność specyficznych przeciwciał anty-HA w badanych surowicach kur wykrywano pośrednim testem ELISA. Płytki opłaszczano homologicznym antygenem - rekombinowane białko H5 HA otrzymane w systemie baculowirusowym, w ilości 300 ng/dołek (50 μl z roztworu o stężeniu 6 μg/ml PBS) i inkubowano przez noc w 2-8°C. Następnie płukano czterokrotnie buforem PBS z 0,05% Tween 20 i blokowano 2% BSA w buforze PBS przez 90 minut w 37°C. Po dwukrotnym płukaniu nakładano rozcieńczone surowice i inkubowano przez noc w 2-8°C. Do standardowych testów badane surowice były rozcieńczane w buforze PBS w stosunku 1:200. Następnego dnia, po pięciu płukaniach związane IgY były wykrywane kozimi przeciwciałami drugorzędowymi anti- chicken IgY (Fc-specific)-HRP (Pierce/Thermo Scientific. IL, USA). Jako substrat reakcji barwnej stosowany był TMB (3,3',5,5' tetrametylobenzydyna, Sigma). Odczyt wartości przy OD450 po około 30 minutach inkubacji był przeprowadzany po zatrzymaniu reakcji 0,5 M H2SO4.The presence of specific anti-HA antibodies in the tested hen sera was detected by indirect ELISA test. The plates were coated with the homologous antigen - H5 HA recombinant protein obtained in a baculovirus system at 300 ng / well (50 µl of a 6 µg / ml PBS solution) and incubated overnight at 2-8 ° C. It was then washed four times with PBS buffer with 0.05% Tween 20 and blocked with 2% BSA in PBS buffer for 90 minutes at 37 ° C. After washing twice, the diluted sera were applied and incubated overnight at 2-8 ° C. For standard tests, test sera were diluted 1: 200 in PBS buffer. The next day, after five washes, bound IgY was detected with goat anti-chicken IgY (Fc-specific) -HRP secondary antibodies (Pierce / Thermo Scientific. IL, USA). TMB (3,3 ', 5.5' tetramethylbenzidine, Sigma) was used as the substrate for the color reaction. Reading of the value at OD450 after approximately 30 minutes of incubation was made after stopping the reaction with 0.5M H2SO4.

Uzyskane wyniki dla pobranych surowic rozcieńczonych 1:200 przedstawiono na Figurze 1A. Wszystkie zamieszczone wyniki dotyczą pobrań krwi w 21, 28 i 35 dobie życia co odpowiednio zaznaczono na prezentowanych wykresach (21d, 28d, 35d).The results obtained for the sampled sera diluted 1: 200 are shown in Figure 1A. All the results are related to blood samples taken on 21, 28 and 35 days of life, which are appropriately marked in the presented graphs (21d, 28d, 35d).

Przeprowadzone testy ELISA wskazują na istotny wpływ zastosowanej sekwencji kB rozpoznawanej przez czynnik NFkB na poziom odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego. Jak przedstawiono na Figurze 1A poziom przeciwciał specyficznie rozpoznających antygen HA jest znacząco wyższy dla preparatu 3NF zarówno po podaniu pierwszej dawki jak i po dawce przypominającej. Na szczególne podkreślenie zasługuje tu wyższy poziom przeciwciał po pierwszej dawce, prawdopodobnie na poziomie zapewniającym już w tym okresie ochronę przed zakażeniem wirusem H5N1. Wyraźnie widać również, że poziom odpowiedzi humoralnej jest bardziej wyrównany.The conducted ELISA tests indicate a significant influence of the applied kB sequence recognized by the NFkB factor on the level of the humoral immune response. As shown in Figure 1A, the level of antibodies specifically recognizing the HA antigen is significantly higher with the 3NF preparation after both the first dose and the booster dose. Particularly noteworthy here is the higher level of antibodies after the first dose, probably at a level ensuring protection against H5N1 virus infection already at that time. It is also clear that the level of the humoral response is more even.

Dodatkowo określono końcowe miana surowic pobranych w 35 dobie życia. Końcowe miano surowicy jest to jej najwyższe rozcieńczenie, przy którym wykrywa się jeszcze specyficzne oddziaływanie przeciwciał zawartych w tej surowicy z antygenem. Badane surowice rozcieńczano w zakresie od 10³do 5 x 10⁵. Następnie zastosowano arbitralny podział końcowych mian surowic na cztery zakresy: wysokie (>10⁵), średnie (10⁴-10⁵), niskie (10³-10⁴) i bardzo niskie (<10³). Na Figurze 3 pokazano procentowy rozkład wydzielonych czterech zakresów mian surowic w szczepionych grupach. Wyniki wskazują na znacząco wyższy procent surowic o wysokim mianie w grupie szczepionej 3NF, np. najwyższe miano czyli ponad 10⁵ stwierdzono u 66% niosek szczepionych preparatem 3NF, natomiast w grupie szczepionej K3 nie zaobserwowano surowic o tak wysokim mianie. Co więcej w grupie szczepionej K3 aż 33% badanych surowic miało miano końcowe sklasyfikowane jako bardzo niskie.Additionally, the final titers of sera collected at 35 days of age were determined. The final serum titer is its highest dilution at which the specific interaction of the antibodies contained in this serum with the antigen is still detected. Test sera were diluted in the range of from 10 ³ to 5 x 10 ^5. The final serum titers were then arbitrarily divided into four ranges: high (> 10 ⁵ ), medium (10 ⁴ -10 ⁵ ), low (10 ³ -10 ⁴ ) and very low (<10 ³ ). Figure 3 shows the percentage distribution of the separated four serum titre ranges in the vaccinated groups. The results show a significantly higher percentage of sera with a high titer in the group vaccinated with 3NF, e.g. the highest titer, i.e. more than 10 ^{5, was} found in 66% of layers vaccinated with the 3NF preparation, while in the group vaccinated with K3 no such high titer was observed. Moreover, in the group vaccinated with K3, as much as 33% of the tested sera had the final titer classified as very low.

PL 231 230 B1PL 231 230 B1

Test HIHI test

Serologiczny test inhibicji hemaglutynacji (HI) jest wykonywany w celu wykrycia przeciwciał zdolnych do hamowania hemaglutynacji. Przeprowadzony test oparty był o powinowactwo przeciwciał obecnych w surowicach immunizowanych kurcząt do antygenu H5 z niskop atogennego szczepu H5N2. Test został wykonany zgodnie z obecnie obowiązującymi zaleceniami (Minta. 2008; Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2010). Badane surowice rozcieńczano dwukrotnie w zakresie od 1:8 do 1:512. Następnie 25 μl próbki rozcieńczonych surowic inkubowano przez 25 minut (temperatura pokojowa) z 4 jednostkami HA inaktywowanego antygenu AIV szczepu A/chicken/Belgium/150/1999 (H5N2) (DG Denver) w 96-dołkowej, V-kształtnej płytce do miareczkowania. Inkubację kontynuowano przez następne 25 minut po dodaniu 25 μl 1% kurzych erytrocytów. Odwrotność najwyższego rozcieńczenia, które hamowało aglutynację kurzych erytrocytów określało miano HI badanych surowic. Surowice o mianie co najmniej 8 uznawano za pozytywne.The haemagglutination inhibition (HI) serological test is performed to detect antibodies capable of inhibiting haemagglutination. The performed test was based on the affinity of the antibodies present in the sera of immunized chickens to the H5 antigen from the low atogenic H5N2 strain. The test was performed in accordance with current recommendations (Minta. 2008; Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2010). The test sera were diluted twice in the range from 1: 8 to 1: 512. Subsequently, 25 μl of a sample of the diluted sera were incubated for 25 minutes (room temperature) with 4 HA units of the AIV inactivated AIV antigen strain A / chicken / Belgium / 150/1999 (H5N2) (DG Denver) in a 96-well, V-shaped titration plate. Incubation was continued for a further 25 minutes after the addition of 25 µl of 1% chicken erythrocytes. The reciprocal of the highest dilution that inhibited the agglutination of chick erythrocytes determined the HI titer of the tested sera. Sera with a titer of 8 or more were considered positive.

Test HI pokazuje obecność przeciwciał wiążących się specyficznie z miejscem RBS (ang. receptor binding site) co blokuje wejście wirusa do komórki. W teście HI badano surowice pobrane od immunizowanych kur w 35 dobie życia czyli po dwóch tygodniach od podania daw ki przypominającej. Wyniki testów HI potwierdzają korzystne działanie zastosowanej sekwencji do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, co przedstawiono na Figurze 1B.The HI test shows the presence of antibodies that bind specifically to the receptor binding site (RBS), which blocks the virus from entering the cell. In the HI test, sera collected from immunized chickens on 35 days of life, i.e. two weeks after the booster dose, were examined. The results of the HI tests confirm the beneficial effect of the used sequence to enhance the immune response as shown in Figure 1B.

P r z y k ł a d IV. Analiza odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kurcząt typu mięsnego testem ELISA i testem HIP r x l a d IV. Analysis of the immune response after vaccination of meat-type chickens with the ELISA test and the HI test

Szczepienie kurcząt typu mięsnego oraz pobrania krwi po szczepieniach wykonano tak jak opisano w przykładzie II. Poziom odpowiedzi immunologicznej określano testami ELISA i HI, które wykonano według procedur opisanych w przykładzie III.Vaccination of meat-type chickens and post-vaccination blood collection were performed as described in Example 2. The level of the immune response was determined by ELISA and HI tests which were performed according to the procedures described in Example III.

Testom ELISA poddano surowice pobrane od kurcząt w 20 i 34 dobie życia. Tak jak przedstawiono na Figurze 2A, testy ELISA wskazały na wyższy poziom odpowiedzi immunologicznej po pierwszej dawce szczepienia preparatem 3NF w porównaniu z preparatem K3. Wyniki testów HI (Figura 2B) również wskazują na wyższe miana HI po szczepieniu preparatem 3NF. Dodatkowo na Figurze 3 zamieszczono rozkład wartości końcowego miana surowic w badanych grupach szczepionych kur w 5 tygodniu życia. W grupie szczepionej preparatem 3NF stwierdzono najwyższe miana w przypadku 60% badanych surowic, pozostałe 40% należało do grupy tzw. średniej. W grupie szczepionej K3, surowice o wysokim i średnim mianie stanowiły po 40%, natomiast niskie miano potwierdzono dla 20% badanych surowic.Sera collected from chickens at 20 and 34 days of age were subjected to ELISA tests. As shown in Figure 2A, ELISA tests showed a higher level of immune response after the first vaccination dose with the 3NF preparation compared to the K3 preparation. The results of HI tests (Figure 2B) also indicated higher HI titers after vaccination with the 3NF preparation. In addition, Figure 3 shows the distribution of the final serum titer in the tested groups of vaccinated chickens at 5 weeks of age. In the group vaccinated with the 3NF preparation, the highest titers were found in 60% of the tested sera, the remaining 40% belonged to the group of the so-called average. In the group vaccinated with K3, sera with high and medium titer accounted for 40%, while the low titer was confirmed for 20% of the tested sera.

P r z y k ł a d V. Immunizacja myszy oraz ocena odpowiedzi immunologicznej na szczepienieExample V. Immunization of mice and evaluation of the immune response to vaccination

Przeprowadzono dwa niezależne eksperymenty immunizacji myszy. W obu samice myszy BALB/c były szczepione domięśniowo dwukrotnie w 35 i 49 dobie życia. Krew pobierano w 49, 56 i 63 dobie życia. Jedna dawka szczepionki zawierała 10 μg (Eksperyment 1) lub 20 μg (Eksperyment 2) DNA plazmidu K3 lub plazmidu 3NF zmieszanego z odczynnikiem do transfekcji Lipofectin®. Grupę kontrolną stanowiły myszy szczepione pustym wektorem zmieszanym z nośnikiem Lipofectin. Procedura przygotowania preparatu szczepionki DNA była analogiczna do opisanej uprzednio (Stachyra i wsp. 2014a, 2014b). Odpowiedź immunologiczna była badana za pomocą testu ELISA według procedury opisanej w przykładzie 111. Surow ice rozcieńczano 1:100, używano przeciwciał II rzędowych anti-mouse IgG (wdiole molecule)-alkaline phosphatase antibody (cat Nr A3562. Sigma). Jako substrat stosowano pNPP (p-nitrophenyl phosphate P7998, Sigma). Po zastosowaniu reakcji za pomocą 3M NaOH przeprowadzano odczyt absorbancji przy długości fali 405 nm używając czytnika Synergy/HT firmy BioTech.Two independent experiments to immunize mice were performed. In both, female BALB / c mice were vaccinated intramuscularly twice at 35 and 49 days of age. Blood was collected on 49, 56 and 63 days of age. One dose of vaccine contained 10 μg (Experiment 1) or 20 μg (Experiment 2) of K3 plasmid DNA or 3NF plasmid mixed with Lipofectin® transfection reagent. The control group consisted of mice vaccinated with the empty vector mixed with Lipofectin vehicle. The procedure for preparing the DNA vaccine preparation was analogous to that described previously (Stachyra et al. 2014a, 2014b). The immune response was tested by ELISA according to the procedure described in Example 111. Crude ice was diluted 1: 100 using anti-mouse IgG-alkaline phosphatase antibody (cat No. A3562. Sigma). PNPP (p-nitrophenyl phosphate P7998, Sigma) was used as the substrate. After using the reaction with 3M NaOH, the absorbance was read at 405 nm using a Synergy / HT reader from BioTech.

Na Figurze 4A przedstawiono wyniki uzyskane dla surowic pochodzących od poszczególnych myszy z dwóch eksperymentów. Uzyskane wyniki testów EL ISA dla indywidualnych osobników wskazują na znaczący wpływ sekwencji rozpoznawanej przez NF kB na poziom indukowanych przeciwciał. W celu lepszego zobrazowania wyników testu ELISA na Figurze 4B przedstawiono procentowy rozkład uzyskanych odczytów OD z pogrupowaniem surowic na dwie kategorie odpowiedzi immunologicznej. Pierwsza, oznaczona jako silna obejmuje wartości OD 450 powyżej 0,5. Druga, oznaczona jako słaba obejmuje wartości OD450 poniżej 0,5. Porównanie odpowiedzi immunologicznej wskazuje wyraźnie, że zastosowanie sekwencji kB wpływa korzystnie na poziom indukowanych przeciwciał anty-HA IgG. W większości analizowanych surowic wykazano procentowo większy udział myszy z silną odpowiedzią immunologiczną w grupach szczepionych preparatem 3NF niż K3Figure 4A shows the results obtained with sera from individual mice from two experiments. The results of ISA EL tests for individual individuals indicate a significant influence of the sequence recognized by NF kB on the level of induced antibodies. To better visualize the ELISA results, Figure 4B shows the percentage distribution of the obtained OD readings with the grouping of the sera into two categories of immune response. The first one, marked as strong, includes OD 450 values above 0.5. The second, labeled weak, includes OD450 values less than 0.5. The comparison of the immune response clearly shows that the use of the kB sequence has a positive effect on the level of induced anti-HA IgG antibodies. Most of the analyzed sera showed a greater percentage of mice with a strong immune response in the groups vaccinated with the 3NF preparation than with K3

PL 231 230 Β1 (Figura 4B). Wyjątkiem jest wynik eksperymentu 1 w 63 dniu, co wskazuje na obniżenie poziomu specyficznych przeciwciał anty-HA we krwi immunizowanych zwierząt w grupie 3NF dwa tygodnie po drugiej immunizacji. Takiego efektu jednak nie zauważono w Eksperymencie 2, w którym także w 63 dniu grupa szczepiona preparatem 3NF wykazywała silniejszą odpowiedź immunologiczną niż grupa K3.PL 231 230 Β1 (Figure 4B). The exception is the result of experiment 1 on day 63, which indicates a decrease in the level of specific anti-HA antibodies in the blood of immunized animals in the 3NF group two weeks after the second immunization. However, such an effect was not noticed in Experiment 2, in which also on day 63 the group vaccinated with the 3NF preparation showed a stronger immune response than the group K3.

ReferencjeReference

Gonęalves C. Ardourel MY. Decoville M. Breuzard G. Midoux P. Hartmann B. Pichon C 2009. An optimized extended DNA kappa B site that enhances plasmid DNA nuclear import and gene expression. Gene Med. (5):401-11. doi: 10.1002/jgm.1312.Gonęalves C. Ardourel MY. Decoville M. Breuzard G. Midoux P. Hartmann B. Pichon C 2009. An optimized extended DNA kappa B site that enhances plasmid DNA nuclear import and gene expression. Gene Med. (5): 401-11. doi: 10.1002 / jgm.1312.

Breuzard G. Tertil M. Gonęalves C. Cheradame H. Geguan P. Pichon C. Midoux P. 2008. Nuclear delivery of NFKB-assisted DNA/polymer complexes: plasmid DNA quantitation by eonfocal laser scanning microscopy and evidence of nuclear polyplexes by FRET imaging. Nucleic Acids Res. 36(12): e71. doi: 10.1093/nar/gkn287Breuzard G. Tertil M. Gonęalves C. Cheradame H. Geguan P. Pichon C. Midoux P. 2008. Nuclear delivery of NFKB-assisted DNA / polymer complexes: plasmid DNA quantitation by eonfocal laser scanning microscopy and evidence of nuclear polyplexes by FRET imaging . Nucleic Acids Res. 36 (12): e71. doi: 10.1093 / nar / gkn287

Mesika A. Grigoreva I. Zohar M. Reich Z.2001. A regulated. NFKB-assisted import of plasmid DNA into mammalian celi nuclei. Mol. Therapy3:653-657Mesika A. Grigorev I. Zohar M. Reich Z. 2001. A regulated. NFKB-assisted import of plasmid DNA into mammalian celi nuclei. Moth. Therapy3: 653-657

Stachyra A. Góra-Sochacka A, Sawicka R. Florys K. Sączyńska V, Olszewska M, Pikula A. Śmietanka K. Minta Z, Szewczyk B, Zagórski W. Sirko A. 2014a. Highly immunogenic prime-boost DNA vaccination protects chickens against challenge with homologous and heterologous H5N1 virus. -Trials Vaccinol. 3: 40-46; http://dx.doi.Org/10.1016/i.trivac.2014.02.002Stachyra A. Góra-Sochacka A, Sawicka R. Florys K. Sączyńska V, Olszewska M, Pikula A. Śmietanka K. Minta Z, Szewczyk B, Zagórski W. Sirko A. 2014a. Highly immunogenic prime-boost DNA vaccination protects chickens against challenge with homologous and heterologous H5N1 virus. -Trials Vaccinol. 3: 40-46; http://dx.doi.Org/10.1016/i.trivac.2014.02.002

Stachyra A. Góra-Sochacka A, Zagórski W, Król E, and Sirko A. 2014b. Antibody response to DNA vaccine against H5N1 avian influenza virus in broilers immunized according to three schedules. Acta Biochim Polon 61: 593-596.Stachyra A. Góra-Sochacka A, Zagórski W, Król E, and Sirko A. 2014b. Antibody response to DNA vaccine against H5N1 avian influenza virus in broilers immunized according to three schedules. Acta Biochim Polon 61: 593-596.

PL 231 230 Β1PL 231 230 Β1

SEKWENCJESEQUENCES

SEQ 1.SEQ 1.

S -C rGCGGACl ITL CAGC I GCKiGAC ΓΤΊ CCAGCTGL.GGACTI lCCA(iG-3'S -C rGCGGACl ITL CAGC I GCKiGAC ΓΤΊ CCAGCTGL.GGACTI lCCA (iG-3 '

SEQ2.SEQ2.

ATGGAAAAGATTGTGCTGCTGTTTGCTATCGTGTCCCTGGTGAAAAGCGACCAGATTTG TATCGGGTATCATGCCAATAACTCAACCGAACAGGTGGATACTATTATGGAGAAAAACG TGACTGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAGACCCATAACGGCAAACTGTGCGAT CTGGACGGAGTGAAGCCCCTGATCCTGCGCGATTGCAGCGTGGCTGGCTGGCTGCTGGG AAACCCTATGTGCGACGAGTTCCTGAATGTGCCAGAATGGTCCTACATCGTGGAGAAAA TTAACCCAGCAAATGATCTGTGCTACCCCGGCAACTTCAATGACTATGAGGAACTGAAG CACCTGCTGTCTAGGATCAACCATTTCGAAAAGATCCAGATCATCCCTAAGAGCTCCTG GAGCGATCACGAGGCTTCTTCAGGCGTGAGTAGCGCATGTCCATACCAGGGACGCTCCT ctttctttcggaacgtggtgtggctgattaagaaagacaatgcttacccaactatcaaa CGCAGCTATAACAATACCAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCATCC CAACGACGCCGCTGAGCAGACACGGCTGTACCAGAATCCTACCACATATATTAGTGTGG GGACAAGCACTCTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCAACAAGGAGCAAAGTGAAT GGCCAGTCCGGAAGAATGGAGTTCTTTTGGACTATCCTGAAGCCAAACGATGCCATTAA TTTCGAATCTAACGGCAACTTCATCGCACCCGAGAACGCCTACAAGATTGTGAAGAAAG GAGACTCCACTATCATGAAATCTGAGCTGGAATATGGGAACTGCAATACCAAGTGTCAG ACACCTATCGGTGCAATTAACTCAAGTATGCCCTTTCACAATATCCATCCTCTGACCAT TGGGGAGTGCCCCAAGTACGTGAAAAGTAACCGCCTGGTGCTGGCCACAGGTCTGCGGA ATAGCCCTCAGGGGGAAGGTCTGTTCGGGGCTATCGCAGGTTTTATTGAGGGCGGATGG CAGGGAATGGTGGATGGGTGGTACGGTTATCACCATTCAAACGAACAGGGCAGTGGATA CGCAGCCGATAAGGAGTCAACACAGAAAGCCATTGACGGAGTGACTAACAAGGTGAACT CCATCATTAACAAAATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGGAGAGAGTTCAACAATCTG GAGAGAAGGATCGAAAACCTGAATAAGAAAATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGAC TTACAACGCTGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAATGAAAGGACCCTGGATTTTCACGACA GCAACGTGAAGAATCTGTATGATAAAGTGAGACTGCAGCTGAGGGACAACGCAAAGGAA CTGGGGAATGGTTGTTTCC^GTTTTACCATAGATGCGATAACGAGTGTATGGAATCCGT GAGGAATGGCACATACGACTATCCACAGTATTCTGAGGAAGCCCGCCTGAAGCGGGAGG AAATTTCTGGGGTGAAACTGGAGTCAATCGGTACCTACCAGATCCTGTCTATCTACTCA ACAGTGGCTAGCTCCCTGGCCCTGGCTATCATGGTGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTG CTCTAACGGTAGCCTGCAGTGTAGGATCTGTATTTGAATGGAAAAGATTGTGCTGCTGTTTGCTATCGTGTCCCTGGTGAAAAGCGACCAGATTTG TATCGGGTATCATGCCAATAACTCAACCGAACAGGTGGATACTATTATGGAGAAAAACG TGACTGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAGACCCATAACGGCAAACTGTGCGAT CTGGACGGAGTGAAGCCCCTGATCCTGCGCGATTGCAGCGTGGCTGGCTGGCTGCTGGG AAACCCTATGTGCGACGAGTTCCTGAATGTGCCAGAATGGTCCTACATCGTGGAGAAAA TTAACCCAGCAAATGATCTGTGCTACCCCGGCAACTTCAATGACTATGAGGAACTGAAG CACCTGCTGTCTAGGATCAACCATTTCGAAAAGATCCAGATCATCCCTAAGAGCTCCTG GAGCGATCACGAGGCTTCTTCAGGCGTGAGTAGCGCATGTCCATACCAGGGACGCTCCT ctttctttcggaacgtggtgtggctgattaagaaagacaatgcttacccaactatcaaa CGCAGCTATAACAATACCAACCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCATCC CAACGACGCCGCTGAGCAGACACGGCTGTACCAGAATCCTACCACATATATTAGTGTGG GGACAAGCACTCTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCAACAAGGAGCAAAGTGAAT GGCCAGTCCGGAAGAATGGAGTTCTTTTGGACTATCCTGAAGCCAAACGATGCCATTAA TTTCGAATCTAACGGCAACTTCATCGCACCCGAGAACGCCTACAAGATTGTGAAGAAAG GAGACTCCACTATCATGAAATCTGAGCTGGAATATGGGAACTGCAATACCAAGTGTCAG ACACCTATCGGTGCAATTAACTCAAGTATGCCCTTTCACAATATCCATCCTCTGACCAT TGGGGAGTGCCCCAAGTACGTGAAAAGTAACCGCCTGGTG CTGGCCACAGGTCTGCGGA ATAGCCCTCAGGGGGAAGGTCTGTTCGGGGCTATCGCAGGTTTTATTGAGGGCGGATGG CAGGGAATGGTGGATGGGTGGTACGGTTATCACCATTCAAACGAACAGGGCAGTGGATA CGCAGCCGATAAGGAGTCAACACAGAAAGCCATTGACGGAGTGACTAACAAGGTGAACT CCATCATTAACAAAATGAACACCCAGTTCGAGGCTGTGGGGAGAGAGTTCAACAATCTG GAGAGAAGGATCGAAAACCTGAATAAGAAAATGGAAGATGGCTTCCTGGACGTGTGGAC TTACAACGCTGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAATGAAAGGACCCTGGATTTTCACGACA GCAACGTGAAGAATCTGTATGATAAAGTGAGACTGCAGCTGAGGGACAACGCAAAGGAA CTGGGGAATGGTTGTTTCC ^ GTTTTACCATAGATGCGATAACGAGTGTATGGAATCCGT GAGGAATGGCACATACGACTATCCACAGTATTCTGAGGAAGCCCGCCTGAAGCGGGAGG AAATTTCTGGGGTGAAACTGGAGTCAATCGGTACCTACCAGATCCTGTCTATCTACTCA ACAGTGGCTAGCTCCCTGGCCCTGGCTATCATGGTGGCTGGCCTGAGCCTGTGGATGTG CTCTAACGGTAGCCTGCAGTGTAGGATCTGTATTTGA

Claims

Patent claims

A factor increasing the effectiveness of a DNA vaccine against a virus, characterized in that it contains a nucleotide sequence encoding an antigen and nucleotide sequences recognized by the nuclear transcription factor NF kappa B (NFkB), and that it contains at least one sequence described as SEQ. ID. Well. 1, with each sequence consisting of at least triplicate kB motif, 5'-GGGACTTTCC-3 ', which is the NFkB binding site, the repeats separated by optimized 5 bp link sequences (5'-AGCTG- 3 ') and that the separation of the 10 nucleotide binding sites from each other allows the simultaneous attachment of at least three Nb factors.

2. The factor according to claim The method of claim 1, characterized in that it provides efficient transport of the vaccine plasmid into the nucleus.

3. The factor according to claim The method of claim 1, characterized in that it increases the level of transcription of the introduced gene encoding the selected antigen.

4. The factor according to claim The method of claim 1, wherein the vaccine is directed against the influenza virus H5N1.

5. The factor according to claim The method of claim 1, wherein the vaccine is intended for birds and mammals.

6. A plasmid DNA preparation, characterized in that it comprises additional NFkB protein binding sequences (kB) and that it comprises at least one sequence described as SEQ. ID. Well. 1, with each sequence consisting of at least triplicate kB motif, 5'-GGGACTTTCC-3 ', which is the NFkB binding site, the repeats separated by optimized 5 bp link sequences (5'-AGCTG- 3 '), and that the separation of the 10 nucleotide binding sites from each other allows the simultaneous attachment of at least three Nb factors.

7. The DNA plasmid preparation according to claim 1 The method of claim 6, which ensures efficient transport of the vaccine plasmid into the nucleus.

8. The DNA plasmid preparation according to claim 1 6. The method of claim 6, characterized in that it increases the level of transcription of the inserted gene encoding the selected antigen.

9. The DNA plasmid preparation according to claim 1 The method of claim 6 which is directed against the influenza virus H5N1.

10. DNA plasmid preparation according to claim 1. 6. The method of claim 6, characterized in that it is used in a DNA vaccine.

11. DNA vaccine containing the plasmid preparation according to claims 6 to 10.

12. A vaccine according to claim 1 The method of claim 11, wherein the dose of DNA is at least 10 µg of DNA.

13. A vaccine according to claim 1 11. The apparatus of claim 11, which is for birds and mammals.

14. A method for the preparation of a modified 3NF expression vector carrying sequences recognized by the NFkB transcription factor, characterized in that additional sequences of 56 bp (SEQ. ID No. 1) are inserted into the expression vector (e.g. pCI, Promega) at two positions expression cassette; (i) upstream of a promoter expressing in animal cells (e.g., at the BglII restriction enzyme recognition site in pCI, upstream of the cytomegalovirus (CMV) promoter), and (ii) after the expression cassette polyadenylation signal, e.g., at the BamHI restriction enzyme recognition site in in the pCI vector, each sequence consisting of a triple repeating kB motif, 5'-GGGACTTTCC-3 ', the repeats are separated by optimized 5 base pair linkers (5-AGCTG-3'). A DNA sequence encoding an antigen is inserted between the inserted sequences, for example a DNA sequence encoding the haemagglutinin of H5 HA influenza virus from plasmid K3, and the resulting recombinant plasmid is used to immunize birds or mammals.

15. Use of a nucleotide sequence recognized by NFkB of the specified SEQ. ID No. 1 to increase the effectiveness of a DNA vaccine for birds and mammals against the virus.

16. Use of a nucleotide sequence recognized by NFkB according to claim 1, As a factor increasing the effectiveness of DNA vaccine for birds and mammals.

17. Use of a nucleotide sequence recognized by NFkB according to claim 1 The method of claim 16, wherein the vaccine is directed against the H5N1 influenza virus.

PL 231 230 Β1

18. Use of a DNA vaccine efficacy-enhancing agent according to claims 1 to 5 in the production of a DNA vaccine for avian and mammalian.

19. Use of a DNA vaccine efficacy enhancer according to claim 19 The method of claim 18, wherein the vaccine is directed against the H5N1 influenza virus.