PL229542B1 - Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receiving - Google Patents
Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receivingInfo
- Publication number
- PL229542B1 PL229542B1 PL411370A PL41137015A PL229542B1 PL 229542 B1 PL229542 B1 PL 229542B1 PL 411370 A PL411370 A PL 411370A PL 41137015 A PL41137015 A PL 41137015A PL 229542 B1 PL229542 B1 PL 229542B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteriocin
- bacterial
- strain
- polypeptide
- peptide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/44—Staphylococcus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Opis wynalazkuDescription of the invention
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd o działaniu bakteriobójczym lub litycznym wobec komórek bakteryjnych lub działaniu litycznym lub cytotoksycznym wobec komórek eukariotycznych, kodujący go polinukleotyd lub wektor ekspresyjny, nowy szczep Staphylococcus pseudintermedius oraz ich zastosowania i sposób otrzymywania wspomnianego polipeptydu.The subject of the invention is a polypeptide having a bactericidal or lytic activity towards bacterial cells or a lytic or cytotoxic activity towards eukaryotic cells, a polynucleotide or expression vector encoding it, a new Staphylococcus pseudintermedius strain, and their uses and a method for obtaining said polypeptide.
Bakterie mają zdolność do produkowania wielu związków zdolnych do zabijania innych mikroorganizmów. Jedną z takich grup biologicznie aktywnych cząsteczek są bakteriocyny - peptydy lub białka produkowane przez bakterie na rybosomach, zdolne w niskich stężeniach do zabijania szczepów blisko spokrewnionych ze szczepem producenta. Zarówno szczepy bakterii produkujące bakteriocyny jak i też same bakteriocyny są współcześnie szeroko wykorzystywane do konserwacji żywności oraz pasz, a także do wybranych zastosowań medycznych, weterynaryjnych oraz w naukach przyrodniczych.Bacteria have the ability to produce many compounds that are capable of killing other microorganisms. One such group of biologically active molecules are bacteriocins - peptides or proteins produced by bacteria on the ribosomes, capable of killing strains closely related to the manufacturer's strain at low concentrations. Both bacterial strains producing bacteriocins and the bacteriocins themselves are nowadays widely used for the preservation of food and feed, as well as for selected medical, veterinary and life sciences applications.
Gatunek bakterii właściwych Staphylococcus pseudintermedius jest powszechnym oportunistycznym patogenem zwierząt domowych - szczególnie psów i koni, ale izolowanym także z innych gatunków zwierząt wyższych. Niedawno stwierdzono jednakże pierwszy przypadek zakażenia tym gatunkiem bakterii także u człowieka (Bannoehr i Guardabassi, 2012, Garbacz i wsp., 2013, van Hoovels i wsp., 2006). Opisano również przypadek zakażenia zakończony śmiercią pacjenta [Savini i wsp., 2013).The species of bacteria Staphylococcus pseudintermedius is a common opportunistic pathogen of domestic animals - especially dogs and horses, but also isolated from other species of higher animals. Recently, however, the first case of infection with this bacterial species was also found in humans (Bannoehr and Guardabassi, 2012, Garbacz et al., 2013, van Hoovels et al., 2006). A case of infection ended with the patient's death has also been described [Savini et al., 2013).
Bakteriocyny to ważna grupa cząsteczek produkowanych i wydzielanych przez wiele bakterii. Są one syntetyzowanymi na rybosomach peptydami lub białkami, zdolnymi w bardzo niskich stężeniach (nanomole/litr) do zabijania bakterii blisko spokrewnionych z producentem tych związków. Aktywność ta sprawia, że bakteriocyny są jednym z podstawowych efektorów, dzięki którym szczep producenta uzyskuje przewagę nad innymi mikroorganizmami, konkurującymi z nim w tym samym siedlisku ekologicznym lub w tej samej niszy fizjologicznej. Bakteriocyny służą także jako rodzaj regulatorów metabolicznych, zależnych od gęstości populacji komórek producenta, a także od obecności innych bakterii. Ze względu na brak lub też względny brak działania toksycznego na organizmy wyższe są bezpieczne w stosowaniu i współcześnie są szeroko wykorzystywane jako konserwanty w wielu produktach spożywczych oraz w paszach. Bezpieczeństwo stosowania bakteriocyn jest związane głównie z ich powszechnością, a ściślej z powszechnością bakterii je produkujących, obecnych najczęściej w przetworach mlecznych oraz w kiszonkach i w przetworach mięsnych, będących składnikami ludzkiej diety od wielu tysięcy lat. Trzeba przy tym pamiętać, że cząsteczki bakteriocyn nie są antybiotykami. Bakteriocyny i antybiotyki to dwie różne grupy związków. Antybiotyki są bowiem produktami metabolizmu wtórnego mikroorganizmów, syntetyzowane są poza rybosomami, mają zazwyczaj szerokie spektrum działania, a ich aktywność jest ogólnie niższa od bakteriocyn (antybiotyk do wywarcia efektu letalnego przeciętnie wymaga stężeń o rzędy wielkości wyższych od analogicznych stężeń bakteriocyn). W odróżnieniu od bakteriocyn, stosowanie antybiotyków powoduje często wiele skutków ubocznych, szkodliwych dla ludzi, zwierząt i środowiska, zarówno w aspekcie krótko- jak i długofalowym. Stąd też ich stosowanie jest ograniczone głównie do celów medycznych i weterynaryjnych, i musi się odbywać pod ścisłą kontrolą (Riley i Chavan, 2007, Drider i Rebuffat, 2011).Bacteriocins are an important group of molecules that are produced and secreted by many bacteria. They are peptides or proteins synthesized on ribosomes, able at very low concentrations (nanomoles / liter) to kill bacteria closely related to the producer of these compounds. This activity makes bacteriocins one of the basic effectors thanks to which the producer strain gains an advantage over other microorganisms competing with it in the same ecological habitat or in the same physiological niche. Bacteriocins also serve as a kind of metabolic regulators, depending on the density of the producer's cell population, as well as the presence of other bacteria. Due to the lack or relative lack of toxic effects on higher organisms, they are safe to use and are now widely used as preservatives in many food products and fodder. The safety of the use of bacteriocins is related mainly to their universality, and more precisely to the prevalence of the bacteria that produce them, most often present in dairy products as well as in silage and meat products, which have been components of the human diet for many thousands of years. It should be remembered that bacteriocin particles are not antibiotics. Bacteriocins and antibiotics are two different groups of compounds. Antibiotics are products of the secondary metabolism of microorganisms, they are synthesized outside the ribosomes, they usually have a broad spectrum of activity, and their activity is generally lower than that of bacteriocins (an antibiotic, on average, requires concentrations of orders of magnitude higher than the analogous concentrations of bacteriocins to exert a lethal effect). Unlike bacteriocins, the use of antibiotics often causes many side effects, harmful to humans, animals and the environment, both in the short and long term. Hence, their use is mainly restricted to medical and veterinary purposes and must be strictly controlled (Riley and Chavan, 2007, Drider and Rebuffat, 2011).
Bakteriocyny są niezwykle zróżnicowanymi cząsteczkami. Mają różne wielkości, struktury, mechanizmy działania oraz organizacje kodujących je genów. To zróżnicowanie mocno utrudnia i komplikuje ich klasyfikację, która często różni się u poszczególnych autorów. Są produkowane zarówno przez bakterie Gram-ujemne jak i bakterie Gram-dodatnie, przy czym bakteriocyny bakterii Gram-ujemnych są znacznie mniej zróżnicowaną grupą białek i peptydów niż bakteriocyny z bakterii Gram-dodatnich, mają zazwyczaj węższe spektrum działania, i w większości wiążą się z określonym receptorem na wrażliwych komórkach, którego większość bakteriocyn bakterii Gram-dodatnich nie posiada.Bacteriocins are extremely diverse molecules. They have different sizes, structures, mechanisms of action, and the organization of the genes that code for them. This differentiation makes their classification very difficult and complicated, which often differs between authors. They are produced by both gram-negative and gram-positive bacteria, while gram-negative bacteriocins are a much less diverse group of proteins and peptides than gram-positive bacteriocins, they usually have a narrower spectrum of activity, and are mostly associated with a specific group of proteins and peptides. receptor on sensitive cells, which most gram-positive bacteriocins do not have.
Bakteriocyny bakterii Gram-ujemnych obejmują 3 grupy białek i peptydów: kolicyny (produkowane przez większość tzw. enterobakterii, dominujących w jelitach człowieka), mikrocyny, oraz bakteriocyny podobne do ogonka faga.Gram-negative bacteriocins include 3 groups of proteins and peptides: colicins (produced by most of the so-called enterobacteria that dominate the human intestines), microcins, and phage tail-like bacteriocins.
Natomiast bakteriocyny bakterii Gram dodatnich (do których należy szczep będący przedmiotem niniejszego wynalazku) dzielą się na cztery klasy: klasa I zawiera potranslacyjnie modyfikowane peptydy, klasa II obejmuje termostabilne peptydy niemodyfikowane, o masie poniżej 10 kDa, klasa III zawiera duże, wrażliwe na temperaturę białka, zaś klasa IV obejmuje słabo poznane, białka o dużej masie cząsteczkowej, związane kowalencyjnie z węglowodanami lub lipidami. Klasy te dzielą się dalej na podklasy oraz grupy, w zależności od bardziej szczegółowych kryteriów (Riley i Chavan, 2007).On the other hand, the bacteriocins of gram-positive bacteria (to which the strain being the subject of the present invention belongs) are divided into four classes: class I contains post-translationally modified peptides, class II includes thermostable unmodified peptides with a mass below 10 kDa, class III contains large, temperature-sensitive proteins and class IV includes poorly understood, high molecular weight proteins covalently linked to carbohydrates or lipids. These classes are further divided into subclasses and groups depending on more specific criteria (Riley and Chavan, 2007).
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Bakteriocyny produkowane przez rodzaj Staphylococcus są określane mianem stafylokokcyn, i są wydzielane zarówno przez tzw. szczepy koagulazo-ujemne jak i koagulazo-dodatnie. Stafylokokcyny należą do czterech grup bakteriocyn: podklasy la, określanej mianem lantybiotyków (poznano dotychczas dziewięć ich przedstawicieli), podklasy llb oraz lid (czterech znanych przedstawicieli), oraz klasy III (dwóch przedstawicieli)( Bastos i wsp., 2009).The bacteriocins produced by the genus Staphylococcus are referred to as staphylococcins, and are secreted both by the so-called coagulase-negative and coagulase-positive strains. Staphylococcins belong to four groups of bacteriocins: the la subclass, known as lantibiotics (nine of them have been known so far), the llb subclass and the lid (four known representatives), and class III (two representatives) (Bastos et al., 2009).
W kontekście niniejszego wynalazku należy zwrócić uwagę na dwie grupy stafylokokcyn. Pierwsza to stosunkowo niedawno opisana i mało jeszcze liczebna grupa podobnych do siebie bakteriocyn podklasy llb bakterii Gram-dodatnich, do których należy aureocyna A53 wyizolowana ze szczepu do Staphylococcus aureus A53 oraz epidermicyna NI01, uzyskana ze szczepu Staphylococcus epidermidis 224. Oba te peptydy liczą 51 reszt aminokwasowych, są liniowe, niemodyfikowane potranslacyjnie, bogate w tryptofan oraz aminokwasy kationowe, mają wysoki punkt izoelektryczny. Są kodowane plazmidowo, ich operony kodują także białka zaangażowane w wydzielanie oraz warunkujące odporność na ich działanie. Nie jest znany ich mechanizm działania, postuluje się jednak, że indukują tworzenie porów w błonach komórkowych bakterii, powodując wypływ metabolitów i śmierć komórki. Jednak do tej pory nie ma znanych przykładów komercyjnego zastosowania wymienionych stafylokokcyn peptydowych (Netz i wsp., 2002, Sandiford i Upton, 2012).Two groups of staphylococcins should be noted in the context of the present invention. The first is a relatively recently described and still not very numerous group of gram-positive bacteria of gram-positive bacteria subclass IIb, which is aureocin A53, isolated from the Staphylococcus aureus strain A53, and epidermicin NI01, obtained from the Staphylococcus epidermidis 224 strain. Both peptides have 51 residues. They are linear, unmodified post-translationally, rich in tryptophan and cationic amino acids, have a high isoelectric point. They are plasmid-encoded, their operons also encode proteins involved in secretion and immunity to their action. Their mechanism of action is unknown, but it is postulated that they induce pore formation in bacterial cell membranes, causing the efflux of metabolites and cell death. However, so far there are no known examples of commercial use of the peptide staphylococcins (Netz et al., 2002, Sandiford and Upton, 2012).
Druga warta podkreślenia w kontekście niniejszego wynalazku grupa stafylokokcyn to lizostafiny. Należą one do podklasy lila bakteriocyn bakterii Gram-dodatnich, zawierającej enzymy muraminolityczne powodujące u bakterii na nie wrażliwych rozpuszczanie/lizę komórek, a w konsekwencji ich śmierć. Pod względem funkcjonalnym lizostafiny są podobne do lizozymów - powszechnie występujących w świecie zwierząt enzymów hydrolitycznych, hydrolizujących peptydoglikany ścian komórkowych bakterii. Podklasa lila stafylokokcyn obejmuje dwa podobne do siebie enzymy, lizostafinę, produkowaną przez Staphylococcus simulans biowar simulans oraz endopeptydazę ALE-1, produkowaną przez Staphylococcus capitis EPK1. Najwcześniej odkryta i najlepiej opisana jest lizostafina, będąca w postaci dojrzałej białkiem o masie 25 kDa, posiadającym dwie domeny: N-końcową peptydazę zdolną do trawienia wiązań peptydowych glicyna-glicyna, oraz C-końcową, zdolną do wiązania się z peptydoglikanami ścian komórkowych bakterii. Lizostafina jest stosunkowo rzadkim przykładem bakteriocyny wykorzystywanej komercyjne w naukach przyrodniczych. Enzym ten w postaci rekombinowanej jest bowiem sprzedawany przez wiele firm jako skuteczny czynnik lizujący/rozpuszczający bakterie z rodzaju Staphylococcus, bardzo użyteczny w biologii molekularnej (Kumar, 1997, Sugai i wsp., 1997).The second group of staphylococcins worth emphasizing in the context of the present invention is lysostaphins. They belong to the lila bacteriocin subclass of gram-positive bacteria, containing muraminolytic enzymes that cause cell dissolution / lysis in bacteria, and consequently their death. Functionally, lysostaphins are similar to lysozymes - hydrolytic enzymes commonly found in the animal world, hydrolyzing peptidoglycans of bacterial cell walls. The lila staphylococcin subclass includes two similar enzymes, lysostafin, produced by Staphylococcus simulans biovar simulans, and endopeptidase ALE-1, produced by Staphylococcus capitis EPK1. The earliest discovered and best described is lysostafin, which is a mature 25 kDa protein with two domains: an N-terminal peptidase capable of digesting glycine-glycine peptide bonds and a C-terminal peptidase capable of binding to bacterial cell wall peptidoglycans. Lizostafin is a relatively rare example of a commercial bacteriocin used in life sciences. This enzyme in recombinant form is sold by many companies as an effective lysing / dissolving factor for bacteria of the Staphylococcus genus, very useful in molecular biology (Kumar, 1997, Sugai et al., 1997).
Potencjał użytkowy bakteriocyn wiąże się z wysokim bezpieczeństwem ich stosowania, oraz zaliczeniem bakeriocyn do tzw. „naturalnych” konserwantów. Według różnych źródeł, szacuje się, że w najbliższych kilku latach roczna wartość światowego rynku sprzedaży takich naturalnych konserwantów osiągnie wartość 2,5-2,7 mld dolarów. W przemyśle spożywczym oraz przetwórstwie pasz bakteriocyny stosuje się zarówno w postaci oczyszczonej, bezpośrednio jako dodatki do produktów, jak również praktykuje się inokulację produktów szczepami bakterii, które te bakteriocyny produkują. Przykładem bakteriocyny bezpośrednio dodawanej do produktów jest przede wszystkim nizyna, bakteriocyna peptydowa z podklasy lantybiotyków, produkowana głównie przez szczepy Lactococcus lactis i zaaprobowana oficjalnie jako tzw. związek GRAS (ang. generally recognized as safe) do użytku jako konserwant żywności w ponad 50 krajach. Zabija ona mikroorganizmy wrażliwe przy dawkach MIC [ang. minimal inhibitory concentration) rzędu nanomoli na litr, jest konserwantem bezpiecznym oraz przede wszystkim stabilnym, wytrzymałym na wysokie temperatury oraz niskie wartości pH, powszechnie stosowanym podczas obróbki produktów żywnościowych (serów, przetworów mlecznych, konserw, mięsa, napoi alkoholowych) i pasz dla zwierząt. Do chwili obecnej nizyna oraz szczepy bakteryjne ją produkujące są jedynymi przykładami zastosowania tak powszechnego i na tak szeroką komercyjną skalę. Inne bakteriocyny są stosowane znacznie rzadziej a ich aplikacja dotyczy głównie aplikacji bakterii je produkujących. Dotyczy to w szczególności szczepów produkujących mikrocyny i kolicyny, stosowanych jako ochronne probiotyki w hodowli drobiu oraz bydła. Ich podawanie wraz z paszami redukuje poziom szkodliwych patogenów w przewodach pokarmowych zwierząt, znacząco podnosząc odporność na infekcje bakteryjne. Natomiast przykładem bakteriocyny wykorzystywanej komercyjne w naukach przyrodniczych jest wspomniana wyżej lizostafina, sprzedawana przez wiele firm jako czynnik lizujący/rozpuszczający bakterie z rodzaju Staphylococcus, bardzo użyteczny w biologii molekularnej. Lizostafina ma również zastosowanie w typowaniu gronkowców, jest także w fazie badań klinicznych jako lek przeciwgronkowcowy (Riley i Gillor, 2007).The functional potential of bacteriocins is related to the high safety of their use, and the classification of bakeriocins to the so-called "Natural" preservatives. According to various sources, it is estimated that in the next few years, the annual value of the global market for the sale of such natural preservatives will reach the value of USD 2.5-2.7 billion. In the food industry and feed processing, bacteriocins are used both in a purified form, directly as additives to products, as well as inoculation of products with strains of bacteria that these bacteriocins produce. An example of a bacteriocin directly added to products is mainly nisin, a peptide bacteriocin from the subclass of lantibiotics, mainly produced by strains of Lactococcus lactis and officially approved as so-called GRAS (generally recognized as safe) compound for use as a food preservative in over 50 countries. It kills microorganisms sensitive to MIC doses. minimal inhibitory concentration) in the range of nanomoles per liter, is a safe and, above all, stable preservative, resistant to high temperatures and low pH values, commonly used in the processing of food products (cheese, dairy products, canned food, meat, alcoholic beverages) and animal feed. To date, nisin and the bacterial strains producing it are the only examples of such widespread use on such a large commercial scale. Other bacteriocins are used much less frequently and their application mainly concerns the application of the bacteria that produce them. This applies in particular to microcin and colicin producing strains used as protective probiotics in poultry and cattle farming. Their administration with feed reduces the level of harmful pathogens in the digestive tracts of animals, significantly increasing the resistance to bacterial infections. On the other hand, an example of a bacteriocin used commercially in life sciences is the aforementioned lysostafin, sold by many companies as a lysing / dissolving factor for bacteria of the genus Staphylococcus, very useful in molecular biology. Lizostafin is also used in typing staphylococci, and is also in clinical trials as an anti-staphylococcal drug (Riley and Gillor, 2007).
Szczególnie pożądane jest zatem dostarczenie nowych bakteriocyn i sposobów ich wytwarzania oraz szczepów bakteryjnych nadających się do stosowania w takich sposobach.It is therefore particularly desirable to provide novel bacteriocins and methods for their production, and bacterial strains suitable for use in such methods.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.Unexpectedly, the above stated object was achieved with the present invention.
Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną spośród Sekw. Nr 1 albo Sekw. Nr 3 lub jej fragment o działaniu bakteriobójczym lub litycznym wobec komórek bakteryjnych lub działaniu litycznym lub cytotoksycznym wobec komórek eukariotycznych.The invention relates to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ. No. 1 or Seq. No. 3 or its fragment with bactericidal or lytic activity towards bacterial cells or lytic or cytotoxic activity towards eukaryotic cells.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd zawierający sekwencję kodującą polipeptyd określony powyżej wybraną spośród Sekw. Nr 2 albo Sekw. Nr 4.Another object of the invention is a polynucleotide containing a sequence encoding a polypeptide as defined above selected from SEQ. No. 2 or Seq. No. 4.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest polipeptyd według wynalazku określony powyżej albo polinukleotyd według wynalazku określony powyżej do stosowania w terapii.Another object of the invention is a polypeptide according to the invention as defined above or a polynucleotide according to the invention as defined above for use in therapy.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmidowy wektor ekspresyjny zawierający polinukleotyd według wynalazku określony powyżej, zawierający sekwencję przedstawioną na Fig. 4 A.Another object of the invention is a plasmid expression vector containing the polynucleotide according to the invention as defined above, containing the sequence shown in Fig. 4A.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep Staphylococcus pseudintermedius 222 zdeponowany w PCM pod numerem dostępu B/00084.Another object of the invention is the Staphylococcus pseudintermedius 222 strain deposited with the PCM under the accession number B / 00084.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu według wynalazku albo polinukleotydu według wynalazku albo szczepu bakteryjnego według wynalazku do wytwarzania preparatu o działaniu bakteriobójczym lub litycznym wobec komórek bakteryjnych lub działaniu litycznym lub cytotoksycznym wobec komórek eukariotycznych.A further object of the invention is the use of a polypeptide according to the invention or a polynucleotide according to the invention or a bacterial strain according to the invention for the preparation of a preparation having a bactericidal or lytic activity towards bacterial cells or a lytic or cytotoxic activity towards eukaryotic cells.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania polipeptydu według wynalazku określonego powyżej charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę gospodarza bakteryjnego zawierającego wektor ekspresyjny określony powyżej, a następnie izoluje się uzyskane białko z płynu pohodowlanego.Another object of the invention is a method for the preparation of the polypeptide according to the invention as defined above, characterized in that a bacterial host containing the expression vector as defined above is cultivated, and then the obtained protein is isolated from the culture fluid.
Korzystnie, izolowanie białka prowadzi się znaną metodą wybraną spośród: wysalania solami, dializy, zagęszczania na membranach półprzepuszczalnych lub chromatografii z odwróconymi fazami.Preferably, the isolation of the protein is carried out by a known method selected from: salting-out, dialysis, concentration on semipermeable membranes or reversed-phase chromatography.
Korzystnie, jako gospodarza bakteryjnego stosuje się szczep Staphylococcus pseudintermedius 222 zdeponowany w PCM pod numerem dostępu B/00084.Preferably, the Staphylococcus pseudintermedius 222 strain deposited with PCM under accession number B / 00084 is used as the bacterial host.
Nowy szczep bakteryjny według wynalazku, należy do gatunku Staphylococcus pseudintermedius, posiada zdolność do produkcji bakteriocyn peptydowych i białkowych o szerokim zakresie działania biologicznego: bakteriobójczych lub litycznych wobec bakterii Gram-dodatnich, a także cytotoksycznych lub litycznych wobec komórek eukariotycznych. Dodatkowo, istotnymi cechami jednej z bakteriocyn produkowanych przez przedmiotowy szczep jest wysoka odporność jej cząsteczki na rozkład przez enzymy proteolityczne, odporność na działanie wysokiej temperatury, oraz zachowanie aktywności biologicznej po częściowej fragmentacji cząsteczki czynnikami chemicznymi.The new bacterial strain according to the invention, belonging to the species Staphylococcus pseudintermedius, has the ability to produce peptide and protein bacteriocins with a wide range of biological activity: bactericidal or lytic against gram-positive bacteria, as well as cytotoxic or lytic against eukaryotic cells. Additionally, significant features of one of the bacteriocins produced by the strain in question are the high resistance of its molecule to degradation by proteolytic enzymes, resistance to high temperatures, and the preservation of biological activity after partial fragmentation of the molecule with chemical agents.
Nowy szczep Staphylococcus pseudintermedius według wynalazku, o roboczej nazwie Sp222, został wyizolowany z patologicznych zmian skórnych psa i zdeponowany 14 stycznia 2015 roku w depozycie patentowym Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu pod numerem PCM B/00084.A new strain of Staphylococcus pseudintermedius according to the invention, with the working name Sp222, was isolated from pathological skin lesions of the dog and deposited on January 14, 2015 in the patent deposit of the Polish Microbial Collection at the Institute of Immunology and Experimental Therapy of the Polish Academy of Sciences in Wrocław under the number PCM B / 00084.
Wyniki badań autorów niniejszego wynalazku wykazały, że Sp222 produkuje i wydziela do otoczenia między innymi dwie nowe bakteriocyny. Pierwsza to liniowy, bogaty w tryptofan i kationowe aminokwasy peptyd bakteriobójczy o roboczej nazwie BacSp222. Peptyd ten posiada także własności hemolityczne i cytotoksyczne wobec komórek eukariotycznych, a także manifestuje wyjątkową odporność na rozkład przez enzymy proteolityczne. Druga bakteriocyna wyizolowana z Sp222 to nowy enzym zdolny do lizy a w konsekwencji także do zabijania komórek bakteryjnych, o roboczej nazwie lizostafina Sp222 (Mak i Władyka, wyniki nieopublikowane).The results of the research of the authors of the present invention showed that Sp222 produces and secretes into the environment, inter alia, two new bacteriocins. The first is a linear bactericidal peptide rich in tryptophan and cationic amino acids with the working name BacSp222. This peptide also has haemolytic and cytotoxic properties towards eukaryotic cells and demonstrates exceptional resistance to degradation by proteolytic enzymes. The second bacteriocin isolated from Sp222 is a new enzyme capable of lysing and, consequently, killing bacterial cells, with the working name of lysostafin Sp222 (Mak and Władyka, unpublished results).
Kolejny aspekt wynalazku dotyczy nowego, trzeciego przedstawiciela opisanych wyżej stafylokokcyn, którym jest bakteriocyna peptydowa o roboczej nazwie BacSp22, produkowana przez zastrzegany szczep bakteryjny Sp222. Ma ona sekwencję aminokwasową unikatową i bez statystycznie istotnych podobieństw do żadnej ze znanych obecnie bakteriocyn, tym niemniej jej własności fizykochemiczne (masa cząsteczki, bogactwo w reszty tryptofanu, lizyny i argininy) oraz aktywność przeciwbakteryjna pozwalają zaliczyć ją do grupy peptydów podobnych do ww. aureocyny A53 i epidermicyny NI01. Bakteriocyna BacSp222 jest zdolna do zabijania komórek bakterii Gram-dodatnich w stężeniach mikromolowych i sub-mikromolowych, a także demonstruje własności biologiczne wykraczające poza cechy typowych bakteriocyn. Jest bowiem zdolna do hemolizy krwinek czerwonych a także posiada aktywność cytotoksyczną wobec komórek eukariotycznych. Pozwala to domniemywać, że peptyd ten posiada zdolności do modyfikowania odpowiedzi immunologicznej organizmu gospodarza. Niezależnie od tych aktywności, cząsteczka bakteriocyny BacSp222 wyróżnia się spośród wielu innych bakteriocyn wysokim stopniem odporności na rozkład przez enzymy proteolityczne - zarówno eukariotyczne jak i prokariotyczne. Jest także stabilna w podwyższonej temperaturze, udowodniono także, że zachowuje istotnąA further aspect of the invention relates to a new, third representative of the staphylococcins described above, which is a peptide bacteriocin with the working name BacSp22, produced by the claimed bacterial strain Sp222. It has a unique amino acid sequence and no statistically significant similarities to any of the currently known bacteriocins, nevertheless its physicochemical properties (molecular mass, rich in tryptophan, lysine and arginine residues) and antibacterial activity allow it to be classified as a peptide similar to the above-mentioned. aureocin A53 and epidermicin NI01. BacSp222 bacteriocin is capable of killing gram-positive bacterial cells at micromolar and sub-micromolar concentrations, and demonstrates biological properties beyond those of typical bacteriocins. It is capable of haemolysis of red blood cells and also has cytotoxic activity against eukaryotic cells. This allows the presumption that this peptide has the ability to modify the immune response of the host organism. Regardless of these activities, the BacSp222 bacteriocin molecule distinguishes itself from many other bacteriocins by a high degree of resistance to degradation by proteolytic enzymes - both eukaryotic and prokaryotic. It is also stable at elevated temperatures and has been proven to be significant
PL 229 542 Β1 aktywność bakteriobójczą po ograniczonej fragmentacji chemicznej cząsteczki. Wszystkie te cechy - odporność na proteolizę, stabilność temperaturowa, oraz zachowanie aktywności biologicznej po ograniczonym chemicznym rozkładzie - są bardzo istotne z punktu widzenia zastosowań aplikacyjnych (Moreno i wsp. 2000).PL 229 542 Β1 bactericidal activity after limited chemical fragmentation of the molecule. All these features - resistance to proteolysis, temperature stability, and preservation of biological activity after limited chemical decomposition - are very important from the point of view of application applications (Moreno et al. 2000).
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy nowego przedstawiciela lizostafin, posiadającego roboczą nazwę lizostafina Sp222, produkowanego przez szczep bakteryjny Sp222 według wynalazku. Sekwencja tego enzymu jest nowa lecz posiada ona statystycznie istotne podobieństwa do znanych już lizostafin z innych bakterii, podobna do nich jest także aktywność nowego enzymu.In a further aspect, the invention relates to a novel member of lysostafins, having the working name lysostafin Sp222, produced by the bacterial strain Sp222 of the invention. The sequence of this enzyme is new, but it has statistically significant similarities to the already known lysostaphins from other bacteria, and the activity of the new enzyme is also similar to them.
Opis wynalazku uzupełniono następującymi tabelami i rysunkami.The description of the invention is supplemented by the following tables and figures.
W tabeli 1 zostały przedstawione dawki MIC bakteriocyny BacSp222 skuteczne wobec różnych mikroorganizmów. Wyznaczone dawki są średnią z trzech niezależnych pomiarów.Table 1 shows the MIC doses of BacSp222 bacteriocin effective against various microorganisms. The doses determined are the average of three independent measurements.
W tabeli 2 zaprezentowana została aktywność resztkowa bakteriocyny peptydowej BacSp222 trawionej różnymi enzymami proteolitycznymi. Aktywność ta została przedstawiona jako średnica stref zahamowania wzrostu bakterii (w mm) w teście dyfuzji radialnej. Próbki badane oznaczają bakteriocynę inkubowaną z peptydazą, próbki kontrolne oznaczają bakteriocynę inkubowaną bez peptydazy.Table 2 shows the residual activity of the BacSp222 peptide bacteriocin digested with various proteolytic enzymes. This activity was presented as the diameter of the zones of inhibition of bacterial growth (in mm) in the radial diffusion test. Test samples are bacteriocin incubated with peptidase, control samples are bacteriocin incubated without peptidase.
Na Fig. 1 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność przeciwbakteryjną szczepu Sp222. Na lewą krawędź płytki ze stałym podłożem odżywczym pionowo posiano szeroką smugę kolonii Sp222, natomiast obok tej smugi, po prawej stronie, punktowo posiano cztery bakterie wskaźnikowe. Po inkubacji płytki przez 24 godziny w 37°C można zaobserwować, że wyrosłe kolonie wszystkich czterech badanych bakterii są asymetryczne - mają kształt półksiężyca. Ich wzrost został zahamowany z lewej strony przez substancje przeciwbakteryjne wydzielane do podłoża przez szczep Sp222.Fig. 1 shows the results of an experiment demonstrating the antibacterial activity of the Sp222 strain. A wide streak of Sp222 colonies was vertically streaked onto the left edge of the solid nutrient plate, while next to this streak, on the right side, four indicator bacteria were streaked. After incubating the plate for 24 hours at 37 ° C, it can be observed that the grown colonies of all four tested bacteria are asymmetrical - they have the shape of a crescent. Their growth was inhibited on the left side by antibacterial substances secreted into the medium by the Sp222 strain.
Na Fig. 2 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność lityczną szczepu Sp222 wobec komórek bakteryjnych. W dwóch studzienkach mikropłytki 96-dołkowej umieszczono zawiesinę komórek bakterii Staphylococcus aureus RN4220, w jednej bez dodatków (kontrola) oraz w drugiej z dodatkiem 10 μΙ pożywki pohodowlanej Sp222. Płytkę następnie inkubowano w temperaturze 37°C mierząc równocześnie spadek gęstości optycznej spowodowany lizą bakterii. W studzience zawierającej pożywkę pohodowlaną Sp222 spadek ten jest znacznie większy niż w studzience kontrolnej i dowodzi obecności w pożywce pohodowlanej Sp222 czynnika powodującego lizę komórek bakteryjnych.Fig. 2 shows the results of an experiment demonstrating the lytic activity of the Sp222 strain against bacterial cells. A suspension of Staphylococcus aureus RN4220 bacterial cells was placed in two wells of a 96-well microplate, one without additives (control) and the other with 10 μΙ of Sp222 culture medium. The plate was then incubated at 37 ° C while measuring the decrease in optical density due to the lysis of the bacteria. In a well containing Sp222 culture medium, this decrease is significantly greater than in a control well and demonstrates the presence of a bacterial cell lysis factor in the Sp222 culture medium.
Na Fig. 3 przedstawiono wyniki kolejnych etapów oczyszczania bakteriocyny peptydowej BacSp222. Na wszystkich panelach pik lub prążek bakteriocyny zaznaczono strzałką. A) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-HPLC) na kolumnie Nucleosil C18. B) Chromatografia RP-HPLC na kolumnie Kromasil C4. C) Elektroforeza denaturująca SDS-PAGE frakcji zbieranych na każdym etapie oczyszczania (wyjściowa pożywka, po wysalaniu, po kolumnie C18 i końcowy preparat po kolumnie C4). Na obrazie tym widać, że końcowy roztwór oczyszczonej bakteriocyny zawiera pojedynczy i homogenny prążek peptydu o masie cząsteczkowej ok. 5 kDa.Fig. 3 shows the results of the sequential steps in the purification of the BacSp222 peptide bacteriocin. In all panels, the bacteriocin peak or band is marked with an arrow. A) Reverse-phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) on a Nucleosil C18 column. B) RP-HPLC chromatography on a Kromasil C4 column. C) SDS-PAGE denaturing electrophoresis of the fractions collected at each purification step (starting medium, after salting out, after C18 column and final preparation after C4 column). This image shows that the final purified bacteriocin solution contains a single and homogeneous peptide band with a molecular weight of approx. 5 kDa.
Na Fig. 4 zaprezentowana została sekwencja plazmidu p222. W panelu A znajduje się sekwencja nukleotydowa całego plazmidu, przy czym fragment kodujący bakteriocynę peptydową BacSp222 został podkreślony. W panelu B znajduje się fragment sekwencji nukleotydów kodujący bakteriocynę peptydową BacSp222, wraz z odpowiednimi resztami aminokwasowymi.In Fig. 4 the sequence of the plasmid p222 is shown. Panel A shows the nucleotide sequence of the entire plasmid, with the fragment encoding the BacSp222 peptide bacteriocin being underlined. In panel B there is a fragment of the nucleotide sequence encoding the BacSp222 peptide bacteriocin, together with the corresponding amino acid residues.
Na Fig. 5 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność hemolityczną bakteriocyny peptydowej BacSp222. Aktywność wyznaczano jako procent hemolizy zawiesiny ludzkich erytrocytów i obliczano jako średnią z trzech niezależnych pomiarów.Fig. 5 shows the results of an experiment demonstrating the haemolytic activity of the BacSp222 peptide bacteriocin. Activity was determined as the percentage of haemolysis of human erythrocyte suspension and calculated as the mean of three independent measurements.
Na Fig. 6 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność cytotoksyczną bakteriocyny peptydowej BacSp222. Aktywność cytotoksyczną bakteriocyny badano przy stężeniach od 0,195 do 100 mikromoli/litr wobec ludzkich fibroblastów skóry oraz wobec ludzkich tłuszczopochodnych komórek macierzystych. Oznaczenie wykonano za pomocą dwóch różnych testów biologicznych - LDH i MTT.Fig. 6 shows the results of an experiment demonstrating the cytotoxic activity of the BacSp222 peptide bacteriocin. The cytotoxic activity of bacteriocin was tested at concentrations ranging from 0.195 to 100 micromol / liter against human skin fibroblasts and against human lipogenic stem cells. The determination was performed using two different biological tests - LDH and MTT.
Na Fig. 7 przedstawiono wyniki badania zmian konformacji cząsteczki bakteriocyny peptydowej BacSp222 w różnych temperaturach. Zmiany w konformacji obserwowano poprzez badanie eliptyczności przy 220 nm w widmie dichroizmu kołowego peptydu inkubowanego w temperaturach od 20 do 90°C.Fig. 7 shows the results of the study of conformational changes of the BacSp222 peptide bacteriocin molecule at different temperatures. Conformation changes were observed by examining the ellipticity at 220 nm in a circular dichroism spectrum of a peptide incubated at temperatures from 20 to 90 ° C.
Na Fig. 8 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność bakteriobójczą fragmentu cząsteczki bakteriocyny peptydowej BacSp222 pozbawionego formylowanej metioniny na N-końcu. Aktywność bakteriobójczą roztworów bakteriocyny wyjściowej (oznaczonej na rysunku jako „+fm”) oraz obciętej (oznaczonej na rysunku jako , ,,-fm”), w ilościach 190, 380 i 760 pikomoli na studzienkę, badano techniką dyfuzji radialnej w stałej pożywce odżywczej z zawiesiną wrażliwych bakterii.Fig. 8 shows the results of an experiment demonstrating the bactericidal activity of a fragment of the BacSp222 peptide bacteriocin molecule lacking a formylated methionine at the N-terminus. The bactericidal activity of the starting bacteriocin solutions (marked in the figure as "+ fm") and truncated (marked as "- fm" in the figure), in the amounts of 190, 380 and 760 picomoles per well, was tested by radial diffusion in a solid nutrient medium with susceptible bacteria suspension.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Otrzymane średnice stref zahamowania wzrostu bakterii wskazują, że bakteriocyna w postaci pozbawionej N-końcowej formylowanej metioniny wymaga średnio dwukrotnie wyższych stężeń by osiągnąć średnicę strefy zahamowania wzrostu charakterystyczną dla bakteriocyny wyjściowej.The obtained diameters of the zones of inhibition of bacterial growth indicate that bacteriocin in the form lacking the N-terminal formylated methionine requires, on average, two times higher concentrations to reach the diameter of the inhibition zone characteristic for the original bacteriocin.
Na Fig. 9 przedstawiono wyniki kolejnych etapów oczyszczania lizostafiny Sp222. Na wszystkich panelach pik lub prążek enzymu zaznaczono strzałką. A) Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (RP-HPLC) na kolumnie Nucleosil C18. B) Chromatografia RP-HPLC na kolumnie Discovery C5. C) Chromatografia RP-HPLC na kolumnie Discovery C18. D) Elektroforeza denaturująca SDS-PAGE frakcji zbieranych na każdym etapie oczyszczania (wyjściowa pożywka, dializat, po wysalaniu, po kolumnie Nucleosil C18, po kolumnie Discovery C5 i końcowy preparat po kolumnie Discovery C18). Na obrazie tym widać, że końcowy roztwór oczyszczonej lizostafiny zawiera pojedynczy i homogenny prążek białka o masie cząsteczkowej ok. 30 kDa.Fig. 9 shows the results of the sequential steps in the purification of Sp222 lysostaphin. In all panels, the enzyme peak or band is indicated by an arrow. A) Reverse-phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC) on a Nucleosil C18 column. B) RP-HPLC chromatography on a Discovery C5 column. C) RP-HPLC chromatography on a Discovery C18 column. D) SDS-PAGE denaturing electrophoresis of the fractions collected at each purification step (starting medium, dialysate, after salting out, after Nucleosil C18 column, after Discovery C5 column and final preparation after Discovery C18 column). This image shows that the final purified lysostafin solution contains a single and homogeneous protein band with a molecular weight of approx. 30 kDa.
Na Fig. 10 przedstawiona została sekwencja kodująca lizostafinę Sp222. W panelu A znajduje się sekwencja nukleotydowa, natomiast w panelu B znajduje się ta sama sekwencja nukleotydowa wraz z nałożonymi odpowiednimi resztami aminokwasowymi cząsteczki lizostafiny Sp222.Fig. 10 shows the Sp222 lysostaphin coding sequence. Panel A has the nucleotide sequence, while panel B has the same nucleotide sequence with the appropriate amino acid residues of the Sp222 lysostafin molecule overlayed.
Na Fig. 11 przedstawiono wyniki eksperymentu wykazującego aktywność lityczną oczyszczonej lizostafiny Sp222 wobec komórek bakteryjnych oraz porównanie jej z aktywnością lizostafiny komercyjnej. W trzech studzienkach mikropłytki 96-dołkowej umieszczono zawiesinę komórek bakterii Staphylococcus aureus RN4220, w jednej bez dodatków (kontrola), w drugiej z dodatkiem 1 μο lizostafiny Sp222 i w trzeciej z dodatkiem 1 μg lizostafiny komercyjnej. Płytkę następnie inkubowano w temperaturze 37°C mierząc równocześnie spadek gęstości optycznej spowodowany lizą bakterii. W studzience zawierającej lizostafinę Sp222 spadek ten jest znacznie większy niż w studzience kontrolnej oraz w studzience zawierającej lizostafinę komercyjną, co dowodzi dużej aktywności litycznej lizostafiny Sp222.Fig. 11 shows the results of an experiment demonstrating the lytic activity of purified Sp222 lysostafin on bacterial cells and its comparison with that of commercial lysostafin. A suspension of Staphylococcus aureus RN4220 bacterial cells was placed in three wells of a 96-well microplate, one without additives (control), the other with 1 μο of Lysostafin Sp222 and the third with 1 μg of commercial lysostafin. The plate was then incubated at 37 ° C while measuring the decrease in optical density due to the lysis of the bacteria. In the well containing Sp222 lysostafin, the decrease is significantly greater than in the control well and in the well containing commercial lysostafin, demonstrating the high lytic activity of Sp222 lysostafin.
Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami. Przykłady te zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania oraz objaśnienia wynalazku, a nie w celu jego ograniczenia i nie mogą być utożsamiane z całym jego zakresem, który określono w zastrzeżeniach patentowych.For a better understanding of the essence of the invention, it has been illustrated by the following examples. These examples are provided merely for the purpose of illustration and elucidation of the invention, not for limiting purposes, and should not be equated with the entire scope of the invention, as defined in the claims.
Przykład 1Example 1
Demonstracja aktywności przeciwbakteryjnej substancji wydzielanych do otoczenia przez szczep Sp222Demonstration of the antibacterial activity of substances secreted into the environment by the Sp222 strain
Celem zademonstrowania hamującego wpływu szczepu Sp222 na wzrost innych bakterii dokonano posiewu na podłożu stałym szczepu Sp222 obok innych bakterii i obserwowano wpływ szczepu Sp222 na wzrost innych bakterii. W tym celu sporządzono płytkę zawierającą sterylne stałe podłoże odżywcze dla bakterii (Tryptic Soy Agar, Sigma). Na jednej skrajnej stronie tej płytki pionowo posiano bakterie Sp222 w postaci szerokiej smugi, następnie płytkę inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 37°C. Po tym czasie obok tej smugi punktowo posiano kolonie czterech bakterii badanych: Staphylococcus aureus RN4220, Staphylococcus pseudintermedius 223 (z kolekcji Zakładu Mikrobiologii Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego), Bacillus subtilis LOCK 0816 (z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej) oraz Staphylococcus epidermidis ATCC 35547 (American Type Celi Culture Collection, USA). Płytkę następnie inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po inkubacji otrzymano obraz przedstawiony na Fig. 1. Widać na nim, że wyrosłe kolonie wszystkich czterech badanych bakterii są asymetryczne - mają kształt półksiężyca. Ich wzrost został bowiem z jednej strony zahamowany przez substancje przeciwbakteryjne wydzielanie do podłoża przez bakterie szczepu Sp222.In order to demonstrate the inhibitory effect of the Sp222 strain on the growth of other bacteria, the Sp222 strain was inoculated on solid medium alongside other bacteria, and the effect of the Sp222 strain on the growth of other bacteria was observed. For this purpose, a plate was prepared containing sterile solid bacterial nutrient medium (Tryptic Soy Agar, Sigma). Sp222 bacteria were vertically inoculated on one end side of this plate as a wide streak, then the plate was incubated for 18 hours at 37 ° C. After this time, next to this streak, colonies of four test bacteria were sown in spots: Staphylococcus aureus RN4220, Staphylococcus pseudintermedius 223 (from the collection of the Department of Microbiology of the Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University), Bacillus subtilis LOCK 0816 (from the collection of the Institute of Microbiology and Fermentation Technology in Łódź). and Staphylococcus epidermidis ATCC 35547 (American Type Cell Culture Collection, USA). The plate was then incubated for 24 hours at 37 ° C. After incubation, the image shown in Fig. 1 was obtained. It can be seen that the grown colonies of all four tested bacteria are asymmetrical - they have the shape of a crescent. On the one hand, their growth was inhibited by antibacterial substances secreted into the medium by bacteria of the Sp222 strain.
P rzy kład 2Example 2
Demonstracja aktywności litycznej substancji wydzielanych do otoczenia przez szczep Sp222 wobec innych komórek bakteryjnychDemonstration of the lytic activity of substances secreted into the environment by the Sp222 strain against other bacterial cells
Celem zademonstrowania aktywności litycznej (czyli zdolności do upłynniania ścian komórkowych, a przez to do dezintegracji komórki bakteryjnej) substancji produkowanych przez szczep Sp222 wobec innych komórek bakteryjnych, ich zawiesinę inkubowano w obecności płynnej pożywki pohodowlanej Sp222 i obserwowano spadek zmętnienia tej zawiesiny, który jest proporcjonalny do stopnia lizy bakterii. W tym celu porcję sterylnej ciekłej pożywki dla bakterii (Trypticase Soy Broth, Sigma) zainokulowano bakteriami szczepu Sp222 a następnie hodowano przez 15 godzin w temperaturze 37°C na wytrząsarce orbitalnej przy 180 obrotach/min. Uzyskaną zawiesinę bakterii żwirowano w temperaturze 4°C przy 4 000 g po czym zebrano klarowny nadsącz zawierający pożywkę pohodowlaną. Pożywka ta zawierała substancje wydzielane do otoczenia przez szczep Sp222. Objętość 10 μΙ takiej pożywki pohodowlanej dodano do studzienki 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej, zawierającej 150 μΙ zawiesinyIn order to demonstrate the lytic activity (i.e. the ability to liquefy the cell walls and thus to disintegrate the bacterial cell) of substances produced by the Sp222 strain against other bacterial cells, their suspension was incubated in the presence of the liquid Sp222 culture medium and the decrease in turbidity of this suspension was observed, which is proportional to the degree of bacterial lysis. For this purpose, an aliquot of sterile liquid growth medium for bacteria (Trypticase Soy Broth, Sigma) was inoculated with bacteria of the Sp222 strain and then cultured for 15 hours at 37 ° C on an orbital shaker at 180 rpm. The obtained bacterial suspension was centrifuged at 4 ° C at 4,000 g and the clear supernatant containing the culture medium was collected. This medium contained substances secreted into the environment by the Sp222 strain. A volume of 10 μΙ of this culture medium was added to the well of a 96-well polystyrene microplate containing 150 μΙ of the suspension.
PL 229 542 Β1 bakterii Staphylococcus aureus RN4220 (z kolekcji Zakładu Mikrobiologii Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego) w 20 mM buforze Tris-HCI pH 7,5 zawierającym 150 mM NaCI. W sąsiedniej studzience znajdowało się 160 μΙ zawiesiny bakterii Staphylococcus aureus RN4220 w powyższym buforze. Zawiesina ta nie zawierała żadnych innych dodatków i stanowiła studzienkę kontrolną. Płytkę umieszczono następnie w czytniku mikropłytek (Synergy H1 Hybrid MultiMode Microplate Reader, BioTek, USA) i mierzono w nim spadek zmętnienia przy 600 nm co 2 min przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Spadek tego zmętnienia jest proporcjonalny do stopnia lizy komórek bakteryjnych. Wyniki pomiaru zamieszczono na Fig. 2. Można na nim zaobserwować, że w studzience zawierającej pożywkę pohodowlaną spadek zmętnienia jest znacznie większy niż w studzience kontrolnej, co dowodzi obecności w pożywce pohodowlanej czynnika wydzielanego przez szczep Sp222 i powodującego lizę komórek bakteryjnych.PL 229 542 Β1 Staphylococcus aureus RN4220 bacteria (from the collection of the Department of Microbiology of the Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University) in 20 mM Tris-HCI pH 7.5 buffer containing 150 mM NaCI. In an adjacent well there was 160 µΙ of a suspension of Staphylococcus aureus RN4220 in the above buffer. This suspension did not contain any other additives and served as the control well. The plate was then placed in a microplate reader (Synergy H1 Hybrid MultiMode Microplate Reader, BioTek, USA) and the drop in turbidity was measured at 600 nm every 2 min for 1 hour at 37 ° C. The decrease in this turbidity is proportional to the degree of lysis of the bacterial cells. The results of the measurement are presented in Fig. 2. It can be seen that in the well containing the culture medium the decrease in turbidity is much greater than in the control well, which proves the presence of the factor secreted by the Sp222 strain and causing the lysis of bacterial cells in the culture medium.
P rzy kład 3Example 3
Procedura oczyszczania bakteriocyny peptydowej BacSp222Procedure for the purification of BacSp222 peptide bacteriocin
Procedura oczyszczania bakteriocyny peptydowej BacSp222 obecnej w płynnej pożywce pohodowlanej Sp222 obejmuje wysalanie peptydu wysokimi stężeniami soli, a następnie dwa etapy chromatografii z odwróconymi fazami. Porcję sterylnej ciekłej pożywki dla bakterii (Trypticase Soy Broth, Sigma) zainokulowano bakteriami szczepu Sp222 a następnie hodowano przez 15 godzin w temperaturze 37°C na wytrząsarce orbitalnej przy 180 obrotach/min. Uzyskaną zawiesinę bakterii wirowano przez 20 min w temperaturze 4°C przy 5 000 g, po czym zebrano klarowny nadsącz zawierający pożywkę pohodowlaną. Pożywka ta zawierała substancje wydzielane do otoczenia przez szczep Sp222, w tym substancję o aktywności litycznej jak pokazano w przykładzie 2. Pożywkę tę schłodzono do temperatury 4°C a następnie, celem wytrącenia osadu białek i peptydów, przy ciągłym mieszaniu dodawano siarczanu amonu w postaci stałej do momentu osiągnięcia 60% (wagowo) nasycenia roztworu. Po dodaniu soli pożywkę mieszano jeszcze przez 30 min, a następnie pozostawiono ją na łaźni lodowej bez mieszania na 2 godziny. Powstały osad białek wirowano przez 30 min w temperaturze 4°C przy 21000 g. Nadsącz odrzucono, natomiast osad rozpuszczono w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo) kwasu trifluorooctowego (TFA) i 60% (objętościowo) acetonitrylu. Roztwór ten wirowano przez 5 min w temperaturze 4°C przy 16 000 g, zebrany nadsącz przesączono przez filtr 0,45 μm a następnie poddano go rozdziałowi za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Rozdział prowadzono na zestawie chromatograficznym Ultimate 3000 (Dionex/Thermo, USA) oraz na kolumnie Nucleosil C18 300A 250 x 8 mm (Macherey-Nagel, Niemcy). Stosowano elucję gradientową z użyciem dwóch buforów, A: 0,1% (objętościowo) TFA w wodzie, B: 80% (objętościowo) acetonitryl w wodzie, z dodatkiem 0,07% (objętościowo) TFA. Stosowano przepływ 1,5 ml/min i detekcję spektrofotometryczną przy 220 nm. Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 60% buforu B, po nastrzyknięciu próbki przez 5 min nadal kolumnę równoważono przy 60% buforu B, a następnie prowadzono elucję gradientem liniowym od 60 do 100% buforu B w czasie 20 min. Frakcję bakteriocyny wymywającą się na chromatogramie jako pik o czasie retencji w granicach 18-20 min. zbierano do probówki, liofilizowano, rozpuszczano w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo) TFA i 30% (objętościowo) acetonitrylu i poddano ponownemu rozdzieleniu na kolumnie Kromasil C4 100A 250 x 4,6 mm (Sigma, USA). Stosowano przepływ 1 ml/min i detekcję spektrofotometryczną przy 220 nm. Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 68% buforu B a następnie prowadzono elucję gradientem liniowym od 68 do 75% buforu B w czasie 20 min. Frakcję bakteriocyny wymywającą się jako pik o czasie retencji w granicach 11-14,5 min. zbierano do probówki, liofilizowano a następnie rozpuszczano w wodzie, otrzymując końcowy roztwór oczyszczonej bakteriocyny Sp222. Stężenie tego peptydu w roztworze wyznaczano za pomocą analizy składu aminokwasowego. Etapy oczyszczania chromatograficznego przedstawiono na Fig. 3. Rysunek ten zawiera także obraz elektroforetyczny frakcji zbieranych na poszczególnych etapach oczyszczania. Widać na tym obrazie, że końcowy roztwór oczyszczonej bakteriocyny zawiera pojedynczy i homogenny prążek peptydu o masie cząsteczkowej ok. 5 kDa.The purification procedure for BacSp222 peptide bacteriocin present in the Sp222 liquid culture medium involves salting out the peptide with high salt concentrations, followed by two reverse phase chromatography steps. A sterile liquid medium for bacteria (Trypticase Soy Broth, Sigma) was inoculated with bacteria of the Sp222 strain and then cultured for 15 hours at 37 ° C on an orbital shaker at 180 rpm. The obtained bacterial suspension was centrifuged for 20 min at 4 ° C at 5,000 g, after which the clear supernatant containing the culture medium was collected. This medium contained substances secreted into the environment by the Sp222 strain, including the substance with lytic activity as shown in Example 2. This medium was cooled to 4 ° C and then solid ammonium sulphate was added with constant stirring to precipitate the proteins and peptides. until the solution is 60% (by weight) saturated. After the salt was added, the medium was stirred for an additional 30 min and then left in the ice bath without stirring for 2 hours. The resulting protein pellet was centrifuged for 30 min at 4 ° C at 21,000 g. The supernatant was discarded and the pellet was dissolved in water containing 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA) and 60% (v / v) acetonitrile. This solution was centrifuged for 5 min at 4 ° C at 16,000 g, the collected supernatant was filtered through a 0.45 µm filter and then separated by reversed-phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC). The separation was carried out on an Ultimate 3000 chromatography system (Dionex / Thermo, USA) and on a Nucleosil C18 300A 250 x 8 mm column (Macherey-Nagel, Germany). A gradient elution was used with two buffers, A: 0.1% (v / v) TFA in water, B: 80% (v / v) acetonitrile in water, containing 0.07% (v / v) TFA. A flow of 1.5 ml / min and spectrophotometric detection at 220 nm were used. Separation was started on a column equilibrated with 60% buffer B, after the sample was injected for 5 min, the column was still equilibrated with 60% buffer B, followed by linear gradient elution from 60 to 100% buffer B over 20 min. The bacteriocin fraction eluting on the chromatogram as a peak with a retention time within 18-20 min. collected in a tube, lyophilized, dissolved in water containing 0.1% (v / v) TFA and 30% (v / v) acetonitrile and resolved on a Kromasil C4 100A 250 x 4.6 mm column (Sigma, USA). A flow of 1 ml / min and spectrophotometric detection at 220 nm were used. Separation was started on a column equilibrated at 68% B buffer followed by linear gradient elution from 68 to 75% B buffer in 20 min. The bacteriocin fraction eluting as a peak with a retention time of 11-14.5 min. collected into a tube, lyophilized and then dissolved in water to give the final purified Sp222 bacteriocin solution. The concentration of this peptide in the solution was determined by amino acid composition analysis. The steps of the chromatographic purification are shown in Fig. 3. This figure also shows an electrophoretic image of the fractions collected at the individual purification steps. It can be seen in this picture that the final purified bacteriocin solution contains a single and homogeneous peptide band with a molecular weight of approx. 5 kDa.
Przykład 4Example 4
Wyznaczanie sekwencji aminokwasowej bakteriocyny peptydowej BacSp222Determination of the amino acid sequence of the BacSp222 peptide bacteriocin
Sekwencję aminokwasową peptydu oczyszczonego według procedury opisanej w przykładzie 3 oznaczono na automatycznym sekwenatorze Procise 491 (Applied Biosystems, USA) realizującym degradację Edmana łańcuchów polipeptydowych. Przed oznaczeniem tej sekwencji dokonano chemicznego usunięcia grupy formylowej na N-końcu poprzez inkubację peptydu w 0,6 M kwasie solnym przez 24 godziny. Otrzymana sekwencja aminokwasowa bakteriocyny BacSp222 posiada następującą kolejność reszt: fMAGLLRFLLSKGRALYNWAKSHVGKVWEWLKSGATYEQIKEWIENALGWR.The amino acid sequence of the peptide purified according to the procedure described in Example 3 was determined on the Procise 491 automatic sequencer (Applied Biosystems, USA) realizing Edman degradation of the polypeptide chains. Prior to determining this sequence, the N-terminal formyl was chemically removed by incubating the peptide in 0.6 M hydrochloric acid for 24 hours. The resulting BacSp222 bacteriocin amino acid sequence has the following sequence of residues: fMAGLLRFLLSKGRALYNWAKSHVGKVWEWLKSGATYEQIKEWIENALGWR.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Sekwencję tą przedstawiono w postaci jednoliterowych skrótów reszt aminokwasowych, przy czym mała litera „f” na początku sekwencji oznacza, że alfa-aminowa grupa N-końcowej reszty metioniny jest formylowana. Masę cząsteczkową bakteriocyny BacSp222 oznaczono na spektrometrze mas typu MALDI-ToF, model ultrafleXtreme (Bruker, Niemcy). Wynosiła ona 5921,917 Da i odpowiadała teoretycznej masie peptydu, wynoszącej 5921,888 Da, wyliczonej w oparciu o podwyższą sekwencję aminokwasową. Zgodność ta dowodzi, że powyższa sekwencja aminokwasowa peptydu została oznaczona rzetelnie.This sequence is shown as single letter abbreviations of amino acid residues, with the lowercase "f" in front of the sequence indicating that the alpha-amino group of the N-terminal methionine residue is formylated. The molecular weight of BacSp222 bacteriocin was determined on a MALDI-ToF mass spectrometer, model ultrafleXtreme (Bruker, Germany). It was 5921.917 Da and corresponded to the theoretical peptide mass of 5921.888 Da, calculated based on the higher amino acid sequence. This consistency proves that the above peptide amino acid sequence was determined reliably.
Przykład 5Example 5
Wyznaczanie sekwencji kodującej bakteriocynę peptydową BacSp222.Determination of the coding sequence for the BacSp222 peptide bacteriocin.
Sekwencję kodującą BacSp222 uzyskano poprzez bioinformatyczną analizę sekwencji typu shot-gun genomu Sp222. Całkowite DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) wyizolowane z bakterii Sp222 standardowymi technikami znanymi specjalistom z dziedziny poddano sekwencjonowaniu typu shot-gun przy użyciu instrumentu MiSeq (lllumina), stosując dedykowany do aparatu zestaw odczynników i procedur. Otrzymane krótkie odczyty sekwencji zostały złożone w dłuższe całości (tzw. kontigi) z wykorzystaniem programów MIRA (http://mira-assembler.sourceforge.net/) i CLC Main Workbench (CLC bio). W jednym z kontigów zawierającym sekwencję plazmidu (p222) zidentyfikowano sekwencję kodującą bakteriocynę peptydową BacSp222. Dokonano tego poprzez translację sekwencji DNA plazmidu w oparciu o kod genetyczny na sekwencje zawierające tzw. otwarte ramki odczytu, czyli sekwencje reszt aminokwasowych występujących w białkach i peptydach. Jedna z otrzymanych sekwencji była identyczna z sekwencją BacSp222 wyznaczoną za pomocą sekwencjonowania przy użyciu degradacji Edmana (patrz Przykład 4). Sekwencja kodująca bakteriocynę jest następująca:The BacSp222 coding sequence was obtained by bioinformatic shot-gun sequence analysis of the Sp222 genome. Total DNA (deoxyribonucleic acid) isolated from Sp222 bacteria by standard techniques known to those skilled in the art was shot-gun sequenced using the MiSeq (Illumina) instrument using an instrument-specific kit of reagents and procedures. The obtained short sequence reads were assembled into longer whole (so-called contigs) using the MIRA (http://mira-assembler.sourceforge.net/) and CLC Main Workbench (CLC bio) programs. In one of the contigs containing the plasmid sequence (p222), the sequence encoding the BacSp222 peptide bacteriocin was identified. This was done by translating the plasmid DNA sequence based on the genetic code into sequences containing the so-called open reading frames, i.e. the sequences of amino acid residues found in proteins and peptides. One of the sequences obtained was identical to the BacSp222 sequence determined by sequencing using Edman degradation (see Example 4). The bacteriocin coding sequence is as follows:
ATGGCAGGATTACTACGTTTTCTTTTAAGTAAAGGTCGCGCCTTATACAATTGGGCAAAG 60 AGTCATGTTGGAAAAGTTTGGGAGTGGCTTAAATCAGGAGCTACATATGAACAAATTAAA 120 GAATGGATTG AAAACGCATTAGGTTGGAGATAA 153 i znajduje się pomiędzy kodonem ATG (nukleotydy 8590-8592) dla metioniny a kodonem TAA (nukleotydy 8740-8742), oznaczającym kodon stop w sekwencji całego plazmidu p222, którą podano na Fig. 4. Poprawność sekwencji kodującej BacSp222 potwierdzono poprzez amplifikację fragmentu DNA kodującego BacSp222 za pomocą reakcji PCR z użyciem starterów oligonukleotydowych komplementarnych do fragmentów flankujących sekwencję kodującą a następnie sekwencjonowaniu produktu reakcji za pomocą sekwencjonowania metodą Sangera.ATGGCAGGATTACTACGTTTTCTTTTAAGTAAAGGTCGCGCCTTATACAATTGGGCAAAG 60 AGTCATGTTGGAAAAGTTTGGGAGTGGCTTAAATCAGGAGCTACATATGAACAAATTAAA 120 GAATGGATTG AAAACGCATTAGGTTGGAGATAA 153 and is located between the ATG codon (nucleotides 8590-8592) for a methionine codon, TAA (nucleotides 8740-8742), meaning a stop codon in the sequence of the entire plasmid P222, which is given in Fig. 4. The correctness of the coding sequence BacSp222 was confirmed by amplifying a DNA fragment encoding BacSp222 by PCR using oligonucleotide primers complementary to the fragments flanking the coding sequence followed by sequencing the reaction product using Sanger sequencing.
Przykład 6Example 6
Oznaczenia aktywności przeciwbakteryjnej bakteriocyny peptydowej BacSp222Determination of the antibacterial activity of BacSp222 peptide bacteriocin
Aktywność przeciwbakteryjną bakteriocyny peptydowej BacSp222 oczyszczonej wg procedury z przykładu 3 udokumentowano poprzez wyznaczanie dawek MIC (zdefiniowanych jako najmniejsze stężenie bakteriocyny powodujące zahamowanie wzrostu badanego mikroorganizmu) wobec przedstawicieli bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i grzybów. Procedury oznaczeń dawek MIC przeprowadzono ściśle wg wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006), lub, w przypadku komórek grzyba, The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST-AFST, 2012). Listę użytych do badań mikroorganizmów, wraz z dokładnymi oznaczeniami ich szczepów, zamieszczono w Tabeli 1. Do oznaczeń stosowano procedurę mikrorozcieńczeń, polegającą na inkubacji w studzienkach mikropłytki 96-dołkowej porcji po 100 μΙ zawiesin badanego mikroorganizmu zawierających 5 x 104 jednostek formujących kolonie (ang. colony forming unit, CFU) wraz z seryjnymi rozcieńczeniami bakteriocyny. Zawiesiny badanych mikroorganizmów były wykonywane w sterylnej pożywce Mueller-Hinton Broth normalizowanej dla kationów (Cation-adjusted MHB, Sigma) lub, w przypadku Streptococcus pyogenes i Streptococcus sanguinis, w sterylnej pożywce MHB wzbogaconej w 5% (objętościowo) lizat krwi końskiej (Graso). Natomiast w przypadku grzybów drożdżopodobnych Candida albicans, zawiesiny komórek wykonywano w sterylnej pożywce RPMI 1640 (Sigma) wzbogaconej w 0,3 g/litr L-glutaminy, 34,53 g kwasu morfolinopropanosiarczanowego (MOPS)/litr, 18 g/litr glukozy, pH 7,0. Po inkubacji mikropłytek przez 24 godziny w temperaturze 37°C dokonywano wizualnej oceny stopnia zmętnienia zawartości studzienek i za dawkę MIC przyjmowano najmniejsze stężenie bakteriocyny, które całkowicie hamowało wzrost badanego mikroorganizmu (brak zmętnienia). Ostateczną dawkę MIC wyliczano jako średnią arytmetyczną z trzech niezależnych pomiarów. Wyniki oznaczeń zamieszczono w Tabeli 1. Wyniki te wskazują, że bakteriocynaThe antibacterial activity of the BacSp222 peptide bacteriocin purified according to the procedure of Example 3 was documented by determining the MIC doses (defined as the lowest concentration of bacteriocin causing growth inhibition of the tested microorganism) against representatives of Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi. MIC dose determination procedures were performed strictly according to the guidelines of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2006), or, in the case of fungal cells, The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST-AFST, 2012). The list of microorganisms used for the tests, together with the exact determinations of their strains, is presented in Table 1. The microdilution procedure was used for the determinations, which consisted in incubating in the wells of a microplate a 96-well portion of 100 μΙ suspensions of the tested microorganism containing 5 x 10 4 colony forming units ( colony forming unit (CFU) with serial dilutions of bacteriocin. The suspensions of the tested microorganisms were made in sterile Mueller-Hinton Broth medium normalized for cations (Cation-adjusted MHB, Sigma) or, in the case of Streptococcus pyogenes and Streptococcus sanguinis, in sterile MHB medium enriched with 5% (by volume) horse blood lysate (Graso) . However, in the case of Candida albicans yeast-like fungi, cell suspensions were made in sterile RPMI 1640 medium (Sigma) enriched with 0.3 g / liter of L-glutamine, 34.53 g of morpholinopropane sulfate acid (MOPS) / liter, 18 g / liter of glucose, pH 7.0. After incubating the microplates for 24 hours at 37 ° C, a visual assessment of the degree of turbidity of the contents of the wells was made and the lowest concentration of bacteriocin which completely inhibited the growth of the tested microorganism (no turbidity) was taken as the MIC dose. The final MIC dose was calculated as the arithmetic mean of three independent measurements. The results of the determinations are shown in Table 1. These results indicate that bacteriocin
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
BacSp222 zabija wiele bakterii Gram-dodatnich przy dawkach MIC rzędu od 0,1 do ok. kilku mikromoli/litr. Nie jest natomiast zdolna do zabijania badanych bakterii Gram-ujemnych oraz grzybów w testowanych stężeniach (do 100 mikromoli na litr).BacSp222 kills many gram-positive bacteria at MIC doses of 0.1 to about a few micromol / liter. However, it is not able to kill the tested gram-negative bacteria and fungi in the tested concentrations (up to 100 micromoles per liter).
Przykład 7Example 7
Oznaczenie aktywności hemolitycznej bakteriocyny peptydowej BacSp222Determination of the haemolytic activity of the BacSp222 peptide bacteriocin
Aktywność hemolityczną (zdolność do lizy krwinek czerwonych) bakteriocyny peptydowej BacSp222 oczyszczonej wg procedury z przykładu 3 udokumentowano poprzez inkubację 5% (objętościowo) zawiesiny ludzkich erytrocytów z seryjnymi rozcieńczeniami bakteriocyny. Inkubacja prowadzona była w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej, przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po inkubacji erytrocyty żwirowano (5 min przy 2 000 g), nadsącz przenoszono do studzienek mikropłytki 96-dołkowej i mierzono ilość uwolnionej hemoglobiny poprzez pomiar absorbancji przy 540 nm. Jako kontrolę 100% lizy komórek stosowano zawiesinę erytrocytów poddaną lizie w obecności 1% (wagowo) detergentu, siarczanu dodecylu sodu. Wyniki oznaczeń przedstawiono na Fig. 4 w postaci procentu lizy krwinek dla każdego badanego stężenia bakteriocyny, uśrednionego z trzech niezależnych pomiarów. Wyniki te wskazują, że bakteriocyna BacSp222 posiada umiarkowaną aktywność hemolityczną - w najwyższym badanym stężeniu peptydu, 100 μΜ, powoduje liżę 40% erytrocytów. Z drugiej strony, w stężeniach poniżej 10 μΜ aktywność hemolityczną peptydu jest bardzo niska (poniżej 2% hemolizy).The haemolytic activity (red blood cell lysis capacity) of the BacSp222 peptide bacteriocin purified according to the procedure of Example 3 was documented by incubating a 5% (v / v) suspension of human erythrocytes with serial dilutions of the bacteriocin. Incubation was in phosphate buffered saline for 1 hour at 37 ° C. After incubation, the erythrocytes were centrifuged (5 min at 2,000 g), the supernatant was transferred to the wells of a 96-well microplate, and the amount of released hemoglobin was measured by measuring absorbance at 540 nm. A suspension of erythrocytes lysed in the presence of 1% (w / w) sodium dodecyl sulfate detergent was used as a 100% cell lysis control. The results of the determinations are shown in Fig. 4 as the percentage of blood cell lysis for each tested bacteriocin concentration, averaged over three independent measurements. These results indicate that BacSp222 bacteriocin has a moderate haemolytic activity - in the highest peptide concentration tested, 100 μΜ, it lyses 40% of erythrocytes. On the other hand, at concentrations below 10 μΜ the haemolytic activity of the peptide is very low (less than 2% haemolysis).
Przykład 8Example 8
Oznaczenie aktywności cytotoksycznej bakteriocyny peptydowej BacSp222Determination of the cytotoxic activity of the BacSp222 peptide bacteriocin
Aktywność cytotoksyczną bakteriocyny peptydowej BacSp222, otrzymanej jak w przykładzie 3, badano na dwóch typach ludzkich komórek, równolegle i niezależnie za pomocą dwóch różnych testów przeżywalności. Komórki fibroblastów z ludzkiej skóry (HSF) oraz ludzkie tłuszczopochodne komórki macierzyste (ASC) hodowano w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 w znormalizowanych butelkach plastikowych typu T25. Komórki hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) z dodatkiem czerwieni fenolowej, 10% (objętościowo) surowicy cielęcej (FBS), 0,1 mg/ml streptomycyny i 0,15 U/ml penicyliny. Pożywkę zmieniano na świeżą co trzy dni. Po trzecim pasażu komórki w liczbie 7000 przeniesiono do studzienek mikropłytki 96-dołkowej i inkubowano przez 24 godziny celem osadzenia się na podłożu. Po tym czasie pożywkę wymieniono na porcje 50 μΙ pożywki zawierającej seryjne rozcieńczenia bakteriocyny w zakresie 0,195 do 100 mikromoli na litr. Kontrolę negatywną stanowiły komórki w pożywce bez bakteriocyny, natomiast kontrolę pozytywną (100% śmiertelności) komórki traktowane 0,9% (objętościowo) detergentem Triton Χ-100. Po 4 godzinach inkubacji oznaczono stopień przeżywalności komórek oddzielnie i niezależnie za pomocą testu aktywności dehydrogenazy mleczanowej (LHD, zestaw CytoTox 96 firmy Promega) oraz za pomocą testu redukcji soli tetrazolinowej MTT (Sigma). Test LDH przeprowadzono na porcjach 30 μΙ pożywki pobranej ze studzienek z komórkami przeniesionymi do nowej mikropłytki 96-dołkowej i zmieszanymi z porcjami 30 μΙ substratu LDH. Reakcję z substratem przerwano po 30 min poprzez dodanie 30 μΙ 0,33 M kwasu octowego. Pomiar absorbancji powstałego barwnego produktu mierzono za pomocą czytnika mikropłytek PowerWave X (Bio-Tek) przy długości fali 490 nm z odjęciem absorbancji tła przy 690 nm. Natomiast test MTT przeprowadzono na komórkach osadzonych w studzienkach, zamieniając pożywkę z bakteriocyną na porcje 55 μΙ pożywki zawierającej 0,5 mg/ml MTT. Po 3 godzinach inkubacji reakcję zatrzymano poprzez dodatek 100 μΙ mieszaniny izopropanol/HCI i mierzono absorbancję powstałego barwnika za pomocą czytnika mikropłytek PowerWave X (Bio-Tek) przy długości fali 540 nm z odjęciem absorbancji tła przy 690 nm. Uzyskane wartości absorbancji uśredniano z trzech niezależnych pomiarów i przeliczono na wartości procentowe śmiertelności komórek, za 0% przyjmując wartości absorbancji dla komórek ze studzienek kontroli negatywnej a za 100% śmiertelności przyjmując wartości absorbancji dla komórek ze studzienek kontroli pozytywnej (komórki uśmiercone detergentem). Zebrane wyniki przedstawiono na Fig. 6. Wyniki te wskazują, że bakteriocyna peptydową BacSp222 posiada rzeczywistą i mierzalną aktywność cytotoksyczną w stężeniach powyżej kilku mikromoli na litr, wobec obu rodzajów badanych komórek, i dokumentowaną za pomocą dwóch różnych testów aktywności cytotoksycznej.The cytotoxic activity of the BacSp222 peptide bacteriocin, obtained as in Example 3, was tested on two types of human cells, in parallel and independently, by means of two different survival tests. Human skin fibroblast cells (HSF) and human fat-derived stem cells (ASC) were cultured at 37 ° C under 5% CO2 in standard T25 plastic bottles. Cells were grown in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with phenol red, 10% (v / v) calf serum (FBS), 0.1 mg / ml streptomycin and 0.15 U / ml penicillin. The medium was changed to fresh every three days. After the third passage, 7,000 cells were transferred to the wells of a 96-well microplate and incubated for 24 hours to be pelleted to the media. After this time, the medium was replaced with 50 μ aliquots of medium containing serial dilutions of bacteriocin in the range of 0.195 to 100 micromoles per liter. The negative control was cells in the medium without bacteriocin, while the positive control (100% mortality) were cells treated with 0.9% (v / v) Triton Χ-100 detergent. After 4 hours of incubation, the cell survival rate was determined separately and independently with the lactate dehydrogenase activity assay (LHD, CytoTox 96 kit from Promega) and with the MTT tetrazoline salt reduction assay (Sigma). The LDH assay was performed on 30 μ aliquots of medium taken from the cells with cells transferred to a new 96-well microplate and mixed with 30 μΙ aliquots of LDH substrate. The substrate reaction was stopped after 30 min by adding 30 µΙ 0.33 M acetic acid. Measurement of the absorbance of the resulting colored product was measured with a PowerWave X microplate reader (Bio-Tek) at 490 nm with subtraction of background absorbance at 690 nm. In contrast, the MTT test was performed on cells embedded in the wells, replacing the medium with bacteriocin for 55 µΙ aliquots of medium containing 0.5 mg / ml of MTT. After 3 hours of incubation, the reaction was stopped by the addition of 100 µl of isopropanol / HCl mixture and the absorbance of the resulting dye was measured with a PowerWave X microplate reader (Bio-Tek) at 540 nm with subtraction of background absorbance at 690 nm. The obtained absorbance values were averaged from three independent measurements and converted into percent cell death values, 0% taking the absorbance values for cells from the negative control wells and 100% mortality using the absorbance values for cells from the positive control wells (cells killed with detergent). The pooled results are shown in Fig. 6. These results show that the BacSp222 peptide bacteriocin has a real and measurable cytotoxic activity at concentrations above a few micromoles per liter for both cell types tested and documented with two different cytotoxic activity assays.
Przykład 9Example 9
Oznaczenie wrażliwości bakteriocyny peptydowej BacSp222 na rozkład przez enzymy proteolityczneDetermination of the susceptibility of the BacSp222 peptide bacteriocin to degradation by proteolytic enzymes
Wrażliwość bakteriocyny peptydowej BacSp222 oczyszczonej wg procedury z przykładu 3 na rozkład przez enzymy proteolityczne badano poprzez inkubację peptydu z różnymi peptydazami,The sensitivity of the BacSp222 peptide bacteriocin purified according to the procedure from example 3 to degradation by proteolytic enzymes was tested by incubating the peptide with various peptidases,
PL 229 542 Β1 a następnie poprzez oznaczenie resztkowej aktywności przeciwbakteryjnej bakteriocyny techniką dyfuzji radialnej. Stosowano następujące peptydazy produkowane przez organizmy wyższe: katepsyna G i elastaza z neutrofili ludzkich (Biocentrum), trypsyna z trzustki wołowej (Sigma) oraz pepsyna wieprzowa (Sigma), a także następujące peptydazy bakteryjne: proteinaza K (A&A Biotechnology), proteinaza StpC (enzym otrzymany we własnym zakresie) i proteinaza V8 (Sigma). Do inkubacji z katepsyną G stosowano bufor 0,1 M Tris-HCI, 0,5 M NaCI, pH 8,0, do inkubacji z elastazą, trypsyną i proteinazą K 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, do inkubacji z pepsyną 0,1 M octan amonu pH 4,0, do inkubacji z proteinazą StpC 0,1 M Tris-HCI, 5 mM soli sodowej kwasu etylenodiaminooctowego (EDTA), 5 mM chlorowodorku cysteiny, pH 7,5, i do inkubacji z proteinazą V8 0,1 M bufor fosforanowy pH 7,8. Bakteriocynę inkubowano przez 1 oraz 3 godziny w temperaturze 37°C w powyższych buforach z enzymami przy stosunkach wagowych peptyd:enzym wynoszących 50:1 i 10:1. Po inkubacji porcje mieszanin reakcyjnych dozowano do studzienek wyciętych w sterylnym podłożu odżywczym (Trypticase Soy Broth, Sigma) zawierającym 1% (wagowo) agaru oraz zawiesinę bakterii gatunku Bacillus subtilis LOCK 0816 (z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej). Do osobnych studzienek kontrolnych dozowano bakteriocyny inkubowane w odpowiednich buforach bez dodatku peptydaz. Płytkę ze studzienkami inkubowano następnie w temperaturze 37°C przez 24 godziny, po czym mierzono średnice stref zahamowania wzrostu bakterii jakie powstały wokół każdej studzienki. Uzyskane wyniki zamieszczono w Tabeli 2. Analiza tych wyników wskazuje, że bez względu na czas inkubacji jak i na stosunek wagowy peptydu do enzymu użyte peptydazy nie powodują obniżenia aktywności bakteriobójczej bakteriocyny.PL 229 542 Β1 and then by determining the residual antibacterial activity of bacteriocin by radial diffusion technique. The following peptidases produced by higher organisms were used: cathepsin G and elastase from human neutrophils (Biocentrum), trypsin from bovine pancreas (Sigma) and pork pepsin (Sigma), as well as the following bacterial peptidases: proteinase K (A&A Biotechnology), StpC proteinase (enzyme obtained in-house) and proteinase V8 (Sigma). For incubation with cathepsin G, 0.1 M Tris-HCl buffer, 0.5 M NaCl, pH 8.0 was used for incubation with elastase, trypsin and K proteinase 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, for incubation with pepsin 0.1 M ammonium acetate pH 4.0, for incubation with StpC proteinase 0.1 M Tris-HCl, 5 mM sodium ethylenediamine acetic acid (EDTA), 5 mM cysteine hydrochloride, pH 7.5, and for incubation with V8 proteinase 0.1 M phosphate buffer pH 7.8. Bacteriocin was incubated for 1 and 3 hours at 37 ° C in the above enzyme buffers at peptide: enzyme weight ratios of 50: 1 and 10: 1. After incubation, portions of the reaction mixtures were dispensed into wells cut in a sterile nutrient medium (Trypticase Soy Broth, Sigma) containing 1% (by weight) of agar and a bacterial suspension of the species Bacillus subtilis LOCK 0816 (from the collection of the Institute of Fermentation Technology and Microbiology of the Lodz University of Technology). Bacteriocins incubated in appropriate buffers without the addition of peptidases were dispensed into separate control wells. The well plate was then incubated at 37 ° C for 24 hours and the diameters of the zones of inhibition of bacterial growth that developed around each well were measured. The obtained results are presented in Table 2. The analysis of these results shows that regardless of the incubation time and the weight ratio of peptide to enzyme, the peptidases used do not reduce the bactericidal activity of bacteriocin.
Przykład 10Example 10
Oznaczenie wrażliwości bakteriocyny peptydowej BacSp222 na wysoką temperaturęHigh temperature susceptibility determination of BacSp222 peptide bacteriocin
Wrażliwość bakteriocyny peptydowej BacSp222 oczyszczonej wg procedury z przykładu 3 na działanie podwyższonej temperatury badano poprzez inkubację peptydu w temperaturze 100°C a następnie weryfikację resztkowej aktywności bakteriobójczej techniką dyfuzji radialnej, a także, niezależnie, poprzez obserwację zmian konformacji cząsteczki w podwyższonych temperaturach za pomocą pomiarów widma dichroizmu kołowego. Celem określenia resztkowej aktywności bakteriobójczej roztwór bakteriocyny peptydowej BacSp222 inkubowano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w temperaturze pokojowej (kontrola) oraz w temperaturze 100°C przez 30 i 60 min. Po inkubacji porcje inkubowanych roztworów dozowano do studzienek wyciętych w sterylnym podłożu odżywczym (Trypticase Soy Broth, Sigma) zawierającym 1% (wagowo) agaru oraz zawiesinę bakterii gatunku Bacillus subtilis LOCK 0816 (z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej). Płytkę ze studzienkami inkubowano następnie w temperaturze 37°C przez 24 godziny, po czym mierzono średnice stref zahamowania wzrostu bakterii jakie powstały wokół każdej studzienki. Otrzymane średnice stref zahamowania wzrostu bakterii były takie same dla próbek kontrolnych jak i też dla próbek inkubowanych w temperaturze 100°C. Celem określenia zmian konformacji cząsteczki bakteriocyny peptydowej BacSp222 w podwyższonych temperaturach sporządzono roztwór bakteriocyny w 50 mM fosforanie sodu pH 7,4 zawierającym 100 mM NaF. Roztwór ten umieszczono w termostatowanej kuwecie kwarcowej zamontowanej w spektropolarymetrze J-715 (Jasco). Następnie dokonywano ciągłego pomiaru eliptyczności przy długości fali 220 nm w zakresie temperatur od 20 do 90°C. Stosowane tempo zmian temperatury wynosiło 1°C/min. Uzyskany wykres zmian eliptyczności zamieszczono na Fig. 7. Na wykresie tym nie zaobserwowano żadnych zasadniczych zmian eliptyczności, co świadczy w tym, że w badanym zakresie temperatur konformacja przestrzenna bakteriocyny nie ulega zmianom.The sensitivity of the BacSp222 peptide bacteriocin purified according to the procedure in Example 3 to elevated temperature was tested by incubating the peptide at 100 ° C and then verifying the residual bactericidal activity by radial diffusion technique, and also, independently, by observing changes in the conformation of the molecule at elevated temperatures by means of spectral measurements circular dichroism. To determine the residual bactericidal activity, the BacSp222 peptide bacteriocin solution was incubated in phosphate buffered saline (PBS) at room temperature (control) and 100 ° C for 30 and 60 min. After incubation, portions of the incubated solutions were dispensed into wells cut in a sterile nutrient medium (Trypticase Soy Broth, Sigma) containing 1% (by weight) of agar and a bacterial suspension of the species Bacillus subtilis LOCK 0816 (from the collection of the Institute of Fermentation Technology and Microbiology of the Lodz University of Technology). The well plate was then incubated at 37 ° C for 24 hours and the diameters of the zones of inhibition of bacterial growth that developed around each well were measured. The obtained diameters of the zones of inhibition of bacterial growth were the same for the control samples as well as for the samples incubated at 100 ° C. To determine the conformation changes of the BacSp222 peptide bacteriocin molecule at elevated temperatures, a bacteriocin solution was prepared in 50 mM sodium phosphate pH 7.4 containing 100 mM NaF. This solution was placed in a thermostated quartz cuvette mounted in a J-715 spectropolarimeter (Jasco). Then, the ellipticity was continuously measured at a wavelength of 220 nm in the temperature range from 20 to 90 ° C. The temperature change rate used was 1 ° C / min. The obtained graph of changes in ellipticity is presented in Fig. 7. In this graph, no significant changes in ellipticity were observed, which proves that in the studied temperature range, the spatial conformation of bacteriocin did not change.
Przykład 11Example 11
Oznaczenie aktywności bakteriobójczej fragmentu cząsteczki bakteriocyny peptydowej BacSp222Determination of the bactericidal activity of a fragment of the BacSp222 peptide bacteriocin molecule
Celem określenia aktywności bakteriobójczej fragmentu cząsteczki bakteriocyny peptydowej BacSp222 oczyszczonej wg procedury z przykładu 3 poddano ją odcięciu N-końcowej formylowanej reszty metioniny za pomocą czynnika chemicznego a następnie pomiarowi resztkowej aktywności bakteriobójczej techniką dyfuzji radialnej. Odcięcie N-końcowej formylowanej reszty metioniny od cząsteczki bakteriocyny BacSp222 zrealizowano poprzez rozpuszczenie peptydu w 70% (objętościowo) roztworze kwasu trifluorooctowego (TFA), dodanie jednego kryształka bromocyjanu (CNBr) i inkubację takiej mieszaniny w ciemności przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji mieszaninę odparowano do sucha na wirówce próżniowej, rozpuszczono w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo)In order to determine the bactericidal activity of a fragment of the BacSp222 peptide bacteriocin molecule purified according to the procedure of Example 3, it was subjected to cleavage of the N-terminal formylated methionine residue with a chemical agent and then measurement of the residual bactericidal activity by radial diffusion technique. Cleavage of the N-terminal formylated methionine residue from the BacSp222 bacteriocin molecule was accomplished by dissolving the peptide in 70% (v / v) trifluoroacetic acid (TFA) solution, adding one crystal of cyanogen bromide (CNBr) and incubating the mixture in the dark for 24 hours at room temperature. After incubation, the mixture was evaporated to dryness in a vacuum centrifuge, dissolved in water containing 0.1% (v / v)
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
TFA i 65% (objętościowo) acetonitrylu. Roztwór ten poddano rozdziałowi za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Rozdział prowadzono na zestawie chromatograficznym Ultimate 3000 (Dionex/Thermo, USA) oraz na kolumnie Kromasil C4 250 x 4,6 mm (Sigma). Stosowano elucję gradientową z użyciem dwóch buforów, A: 0,1% (objętościowo) TFA w wodzie, B: 80% (objętościowo) acetonitryl w wodzie, z dodatkiem 0,07% (objętościowo) TFA. Stosowano przepływ 1 ml/min. i detekcję spektrofotometryczną przy długości fali 220 nm. Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 65% buforu B i prowadzono elucję gradientem liniowym od 65 do 72% buforu B w czasie 20 min. Frakcję zawierającą bakteriocynę BacSp222 obciętą, pozbawioną N-końcowej formylowanej metioniny, wymywającą się jako pik o czasie retencji w granicach od 9 do 10,5 min zbierano do probówki, liofilizowano i rozpuszczano w wodzie. Aktywność antybakteryjną bakteriocyny obciętej oraz bakteriocyny wyjściowej oznaczano metodą dyfuzji radialnej w agarze odżywczym zawierającym wrażliwe bakterie. W tym celu porcje seryjnie rozcieńczonej bakteriocyny obciętej oraz bakteriocyny wyjściowej dozowano do studzienek wyciętych w sterylnym podłożu odżywczym (Trypticase Soy Broth, Sigma) zawierającym 1% (wagowo) agaru oraz zawiesinę bakterii gatunku Bacillus subtilis LOCK 0816 (z kolekcji Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej). Płytkę ze studzienkami inkubowano następnie w temperaturze 37°C przez 24 godziny, po czym mierzono średnice stref zahamowania wzrostu bakterii jakie powstały wokół każdej studzienki. Wyniki tych pomiarów wykazały, że fragment bakteriocyny BacSp222 pozbawiony N-końcowej formylowanej metioniny, wymaga średnio dwukrotnie wyższych stężeń do osiągnięcia średnicy strefy zahamowania wzrostu identycznej jak dla bakteriocyny wyjściowej. Należy więc stwierdzić, że ograniczona fragmentacja chemiczna w pewnym stopniu osłabia aktywność bakteriobójczą peptydu, lecz jej nie znosi.TFA and 65% (v / v) acetonitrile. This solution was separated by reversed-phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC). The separation was carried out on an Ultimate 3000 chromatography set (Dionex / Thermo, USA) and on a Kromasil C4 250 x 4.6 mm column (Sigma). A gradient elution was used with two buffers, A: 0.1% (v / v) TFA in water, B: 80% (v / v) acetonitrile in water, containing 0.07% (v / v) TFA. A flow of 1 ml / min was used. and spectrophotometric detection at 220 nm. Separation was started on a column equilibrated at 65% buffer B and elution was carried out with a linear gradient from 65 to 72% buffer B in 20 min. The fraction containing BacSp222 bacteriocin truncated, lacking the N-terminal formylated methionine, eluting as a peak with a retention time ranging from 9 to 10.5 min, was collected in a tube, lyophilized and dissolved in water. The antibacterial activity of the truncated bacteriocin and the starting bacteriocin was determined by radial diffusion in nutrient agar containing sensitive bacteria. For this purpose, portions of serially diluted trimmed bacteriocin and starting bacteriocin were dosed into wells cut in a sterile nutrient medium (Trypticase Soy Broth, Sigma) containing 1% (by weight) agar and a bacterial suspension of Bacillus subtilis LOCK 0816 (from the collection of the Institute of Fermentation Technology and Microbiology of the Polytechnic University of Technology). Łódzka). The well plate was then incubated at 37 ° C for 24 hours and the diameters of the zones of inhibition of bacterial growth that developed around each well were measured. The results of these measurements showed that the fragment of BacSp222 bacteriocin, devoid of the N-terminal formylated methionine, requires on average twice the concentration to reach the diameter of the zone of inhibition identical to that of the starting bacteriocin. It should therefore be concluded that the limited chemical fragmentation to some extent weakens the bactericidal activity of the peptide, but does not cancel it.
P rzy kład 12Example 12
Procedura oczyszczania lizostafiny Sp222Lysostafin Sp222 purification procedure
Procedura oczyszczania enzymu litycznego obecnego w płynnej pożywce pohodowlanej Sp222 obejmuje dializę pożywki, wysalanie białka wysokimi stężeniami soli, a następnie trzy etapy chromatografii z odwróconymi fazami. Porcję sterylnej ciekłej pożywki dla bakterii (Trypticase Soy Broth, Sigma) zainokulowano bakteriami szczepu Sp222 a następnie hodowano przez 15 godzin w temperaturze 37°C na wytrząsarce orbitalnej przy 180 obrotach/min. Uzyskaną zawiesinę bakterii wirowano przez 20 min w temperaturze 4°C przy 5 000 g, po czym zebrano klarowny nadsącz zawierający pożywkę pohodowlaną. Pożywka ta zawierała substancje wydzielane do otoczenia przez szczep Sp222. Pożywkę tę dializowano względem wody destylowanej w temperaturze 4°C z użyciem woreczka dializacyjnego o masie odcięcia 14 kDa lub też zagęszczano na membranie półprzepuszczalnej o masie odcięcia 10 kDa. Dializat zamrożono, po czym zliofilizowano. Otrzymany liofilizat rozpuszczono w niewielkiej ilości wody a następnie obecne w nim białka wysolono z użyciem siarczanu amonu do 60% (wagowo) nasycenia. Po dodaniu soli roztwór mieszano przez 30 min, a następnie pozostawiono ją na łaźni lodowej bez mieszania na 2 godziny. Powstały osad białek wirowano przez 30 min w temperaturze 4°C przy 21 000 g. Nadsącz odrzucono, natomiast osad rozpuszczono w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo) kwasu trifluorooctowego (TFA). Tak otrzymany roztwór wirowano przez 5 min w temperaturze 4°C przy 16 000 g, zebrany nadsącz przesączono przez filtr 0,45 μm a następnie poddano rozdziałowi za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RP-HPLC). Rozdział prowadzono na zestawie chromatograficznym Ultimate 3000 (Dionex/Thermo, USA) oraz na kolumnie Nucleosil C18 300A 250 x 8 mm (Macherey-Nagel, Niemcy). Stosowano elucję gradientową z użyciem dwóch buforów, A: 0,1% (objętościowo) TFA w wodzie, B: 80% (objętościowo) acetonitryl w wodzie, z dodatkiem 0,07% (objętościowo) TFA. Stosowano przepływ 1,5 ml/min i detekcję spektrofotometryczną przy długości fali 220 nm. Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 38% buforu B a następnie prowadzono elucję gradientem liniowym od 38 do 53% buforu B w czasie 15 min. Frakcję bakteriocyny wymywającą się jako pik o czasie retencji w granicach od 23,5 do 24,5 min zbierano do probówki, liofilizowano, rozpuszczano w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo) TFA i 36% (objętościowo) acetonitrylu i poddano ponownemu rozdzieleniu na kolumnie Discovery Bio Wide Porę C5 300A 250 x 4.6 mm (Sigma, USA). Stosowano przepływ 1 ml/min i detekcję spektrofotometryczną przy 220 nm. Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 30% buforu B a następnie prowadzono elucję gradientem liniowym od 36 do 50% buforu B w czasie 30 min. Frakcję bakteriocyny wymywającą się jako pik o czasie retencji w granicach od 17 do 18 min zbierano do probówki, liofilizowano a następnie rozpuszczano w wodzie zawierającej 0,1% (objętościowo) TFA i 37% (objętościowo) acetonitrylu i poddano ponownemu rozdzieleniu na kolumnie Discovery Bio Wide Porę C18 300A 250 x 4,6 mm (Sigma, USA). Stosowano przepływ 1 ml/min i detekcję spektrofotometryczną przy długości fali 220 nm.The purification procedure for the lytic enzyme present in the liquid Sp222 culture medium involves dialysis of the medium, plating the protein with high salt concentrations, followed by three steps of reverse phase chromatography. A sterile liquid medium for bacteria (Trypticase Soy Broth, Sigma) was inoculated with bacteria of the Sp222 strain and then cultured for 15 hours at 37 ° C on an orbital shaker at 180 rpm. The obtained bacterial suspension was centrifuged for 20 min at 4 ° C at 5,000 g, after which the clear supernatant containing the culture medium was collected. This medium contained substances secreted into the environment by the Sp222 strain. This medium was dialyzed against distilled water at 4 ° C using a dialysis bag with a cut-off of 14 kDa or concentrated on a semipermeable membrane with a cut-off of 10 kDa. The dialysate was frozen and then lyophilized. The obtained lyophilisate was dissolved in a little water and then the proteins present in it were salted out with ammonium sulphate to 60% (by weight) of saturation. After the salt was added, the solution was stirred for 30 min, then it was left in the ice bath without stirring for 2 hours. The resulting protein pellet was centrifuged for 30 min at 4 ° C at 21,000 g. The supernatant was discarded and the pellet was dissolved in water containing 0.1% (v / v) of trifluoroacetic acid (TFA). The solution thus obtained was centrifuged for 5 min at 4 ° C at 16,000 g, the collected supernatant was filtered through a 0.45 µm filter and then separated by reversed-phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC). The separation was carried out on an Ultimate 3000 chromatography system (Dionex / Thermo, USA) and on a Nucleosil C18 300A 250 x 8 mm column (Macherey-Nagel, Germany). A gradient elution was used with two buffers, A: 0.1% (v / v) TFA in water, B: 80% (v / v) acetonitrile in water, containing 0.07% (v / v) TFA. A flow of 1.5 ml / min and spectrophotometric detection at 220 nm were used. Separation was started on a column equilibrated at 38% B buffer followed by linear gradient elution from 38 to 53% B buffer in 15 min. The bacteriocin fraction eluting as a peak with a retention time ranging from 23.5 to 24.5 min was collected in a tube, lyophilized, dissolved in water containing 0.1% (v / v) TFA and 36% (v / v) acetonitrile, and re-separated on Discovery Bio Wide Pore C5 300A 250 x 4.6 mm column (Sigma, USA). A flow of 1 ml / min and spectrophotometric detection at 220 nm were used. Separation was started on a column equilibrated at 30% B buffer followed by linear gradient elution from 36 to 50% B buffer in 30 min. The bacteriocin fraction eluting as a peak with a retention time ranging from 17 to 18 min was collected in a test tube, lyophilized and then dissolved in water containing 0.1% (v / v) TFA and 37% (v / v) acetonitrile and re-separated on the Discovery Bio column Wide Pore C18 300A 250 x 4.6 mm (Sigma, USA). A flow of 1 ml / min and spectrophotometric detection at 220 nm were used.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Rozdział rozpoczynano na kolumnie zrównoważonej przy 37% buforu B a następnie prowadzono elucję gradientem liniowym od 37 do 45% buforu B w czasie 20 min. Frakcję bakteriocyny wymywającą się jako piko czasie retencji w granicach od 15 do 16,5 min. zbierano do probówki, dodawano porcję 50 mM octanu sodu pH 5,5 zawierającym 1 M NaCI (celem minimalizacji strat podczas liofilizacji), a następnie liofilizowano. Końcowy roztwór oczyszczonej lizostafiny Sp222, oprócz białka, zawierał 10 mM octan sodu pH 5,5 i 200 mM NaCI. Stężenie enzymu w końcowym preparacie wyznaczano za pomocą zestawu opartego o reakcję z kwasem bicynchoninowym (BCA, Sigma). Opisane etapy oczyszczania lizostafiny Sp222 zilustrowano na Fig. 9. Rysunek zawiera także obraz elektroforetyczny frakcji zbieranych na poszczególnych etapach oczyszczania. Widać na nim, że końcowy roztwór oczyszczonego enzymu zawiera pojedynczy i homogenny prążek białka o masie cząsteczkowej ok. 30 kDa.Separation was started on a column equilibrated at 37% B buffer followed by linear gradient elution from 37 to 45% B buffer in 20 min. The bacteriocin fraction eluting as pico with retention time ranging from 15 to 16.5 min. collected into a tube, 50 mM sodium acetate, pH 5.5, containing 1 M NaCl was added (to minimize loss during lyophilization), and then lyophilized. The final purified lysostaphin Sp222 solution contained, in addition to the protein, 10 mM sodium acetate pH 5.5 and 200 mM NaCl. The concentration of the enzyme in the final preparation was determined with a kit based on the reaction with bicinchoninic acid (BCA, Sigma). The described steps in the purification of Sp222 lysostaphin are illustrated in Fig. 9. The figure also shows an electrophoretic image of the fractions collected at the individual purification steps. It shows that the final solution of the purified enzyme contains a single and homogeneous protein band with a molecular weight of approx. 30 kDa.
P rzy kład 13Example 13
Wyznaczanie sekwencji aminokwasowej N-końca lizostafiny Sp222Determination of the amino acid sequence of the N-terminus of Lysostaphin Sp222
Sekwencję aminokwasową lizostafiny Sp222 oczyszczonej wg procedury opisanej w przykładzie 12 oznaczono na automatycznym sekwenatorze Procise 491 (Applied Biosystems, USA) realizującym degradację Edmana łańcuchów polipeptydowych. Dokonano identyfikacji 20 reszt od N-końca: AATSTSGSAAWLNOYPLNNG. Sekwencję przedstawiono w postaci jednoliterowych skrótów reszt aminokwasowych.The amino acid sequence of Lysostafin Sp222 purified according to the procedure described in Example 12 was determined on the Procise 491 automatic sequencer (Applied Biosystems, USA) realizing Edman degradation of the polypeptide chains. 20 residues from the N-terminus were identified: AATSTSGSAAWLNOYPLNNG. The sequence is shown as single letter abbreviations of the amino acid residues.
Przykład 14Example 14
Wyznaczanie sekwencji kodującej lizostafinę Sp222Determination of the Sp222 Lysostaphin Coding Sequence
Sekwencję kodującą lizostafinę Sp222 uzyskano poprzez bioinformatyczną analizę sekwencji typu shot-gun genomu Sp222. Całkowite DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) wyizolowane z bakterii Sp222 standardowymi technikami znanymi specjalistom z dziedziny poddano sekwencjonowaniu typu shot-gun przy użyciu instrumentu MiSeq (lllumina) z zastosowaniem dedykowanego dla aparatu zestawu odczynników. Otrzymane krótkie odczyty sekwencji zostały złożone w dłuższe całości (tzw. kontigi) z wykorzystaniem programu MIRA (http://mira-assembler.sourceforge.net/) i CLC Main Workbench (CLC bio). W jednym z kontigów zidentyfikowano sekwencję kodującą lizostafinę Sp222. Dokonano tego poprzez translację sekwencji DNA plazmidu w oparciu o kod genetyczny na sekwencje zawierające tzw. otwarte ramki odczytu, czyli sekwencje reszt aminokwasowych występujących w białkach i peptydach. Jedna z otrzymanych sekwencji zawierała sekwencję identyczną z sekwencją fragmentu lizostafiny Sp222 wyznaczoną za pomocą sekwencjonowania przy użyciu degradacji Edmana (patrz przykład 13). Wyznaczoną sekwencję kodującą lizostafinę Sp222 oraz sekwencję całego białka lizostafiny Sp222 przedstawiono na Fig. 10.The Sp222 lysostafin coding sequence was obtained by bioinformatic shot-gun sequence analysis of the Sp222 genome. Total DNA (deoxyribonucleic acid) isolated from Sp222 bacteria by standard techniques known to those skilled in the art was shot-gun sequenced using the MiSeq (Illumina) instrument using an instrument-specific reagent kit. The obtained short sequence readings were assembled into longer whole (so-called contigs) using MIRA (http://mira-assembler.sourceforge.net/) and CLC Main Workbench (CLC bio). In one of the contigs, the Sp222 lysostaphin coding sequence was identified. This was done by translating the plasmid DNA sequence based on the genetic code into sequences containing the so-called open reading frames, i.e. the sequences of amino acid residues found in proteins and peptides. One of the sequences obtained contained a sequence identical to the sequence of the Sp222 lysostaphine fragment determined by sequencing using Edman degradation (see example 13). The designated Sp222 lysostafin coding sequence and the sequence of the entire Sp222 lysostaphin protein are shown in Figure 10.
Przykład 15Example 15
Wyznaczanie aktywności litycznej lizostafiny Sp222 wobec komórek bakteryjnychDetermination of Lysostaphin Sp222 Lytic Activity Against Bacterial Cells
Celem zademonstrowania aktywności litycznej (czyli zdolności do upłynniania ścian komórkowych bakterii) lizostafiny otrzymanej według procedury opisanej w przykładzie 12, zawiesinę badanego szczepu inkubowano w obecności lizostafiny Sp222 i obserwowano spadek zmętnienia tej zawiesiny, proporcjonalny do stopnia lizy bakterii. Dla celów porównawczych oznaczono także aktywność lityczną innej lizostafiny, dostępnej komercyjnie. W tym celu do studzienek 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej, zawierającej 150 μΙ zawiesiny bakterii gatunku Staphylococcus aureus RN4220 (z kolekcji Zakładu Mikrobiologii Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego) w 20 mM buforze Tris-HCI pH 7,5 zawierającym 150 mM NaCI. Do pierwszej studzienki dodano następnie 1 mikrogram lizostafiny Sp222 otrzymanej wg przykładu 12, do drugiej studzienki 1 mikrogram lizostafiny komercyjnej (A&A Biotechnology), w trzeciej studzience, kontrolnej, była natomiast zawiesina bakterii badanych bez dodatków. Płytkę umieszczono następnie w czytniku mikropłytek (Synergy H1 Hybrid MultiMode Microplate Reader, BioTek, USA) i mierzono w nim spadek zmętnienia przy długości fali 600 nm co 2 min przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Spadek zmętnienia jest proporcjonalny do stopnia lizy komórek bakteryjnych. Wyniki pomiaru zamieszczono na Fig. 11. Można na nim zaobserwować, że w studzience zawierającej dodatek oczyszczonej lizostafiny Sp222 spadek zmętnienia jest znacznie większy niż w studzience kontrolnej, co dowodzi obecności w pożywce pohodowlanej czynnika wydzielanego przez szczep Sp222 i powodującego lizę komórek bakteryjnych.In order to demonstrate the lytic activity (i.e. the ability to liquefy bacterial cell walls) of the lysostafin obtained according to the procedure described in Example 12, the suspension of the tested strain was incubated in the presence of Sp222 lysostafin and a decrease in the turbidity of this suspension was observed, proportional to the degree of bacterial lysis. For comparative purposes, the lytic activity of another commercially available lysostaphine was also determined. For this purpose, into the wells of a 96-well polystyrene microplate containing 150 μΙ of the suspension of Staphylococcus aureus RN4220 bacteria (from the collection of the Department of Microbiology of the Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University) in 20 mM Tris-HCI buffer pH 7.5 containing 150 mM NaCI. Then 1 microgram of Lysostafin Sp222 obtained according to Example 12 was added to the first well, 1 microgram of commercial Lysostafin (A&A Biotechnology) was added to the second well, and the test bacteria suspension was in the third well, without additives. The plate was then placed in a microplate reader (Synergy H1 Hybrid MultiMode Microplate Reader, BioTek, USA) and the decrease in turbidity was measured at 600 nm every 2 min for 1 hour at 37 ° C. The decrease in turbidity is proportional to the degree of bacterial cell lysis. The results of the measurement are presented in Fig. 11. It can be seen that in the well containing the addition of purified Sp222 lysostaphin, the decrease in turbidity is much greater than in the control well, which proves the presence of the factor secreted by the Sp222 strain and causing the lysis of bacterial cells in the culture medium.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Wykaz sekwencjiSequence Listing
Sekwencja nr 1 ibakteriocyna) m'agllrfllskgralynwakshvgkvwewlksgatyeqikewienalgwr 50 ^Metionina na N-końcu jest forrnylowanaSequence No. 1 ibacteriocin) m'agllrfllskgralynwakshvgkvwewlksgatyeqikewienalgwr 50 ^ Methionine at the N-terminus is forrnylated
Sekwencja nr 2Sequence number 2
ATGGCAGGATTACTACGTTTTCTTTTAAGTAAAGGTCGCGCCTTATACAATTGGGCAAAG 60ATGGCAGGATTACTACGTTTTCTTTTAAGTAAAGGTCGCGCCTTATACAATTGGGCAAAG 60
AGT CAT G T T GGAAAAGT T T GG GAGTGGCT TAAATCAG GAGC TA.C AT AT GAAC AAAT T AAAAGT CAT G T T GGAAAAGT T T GG GAGTGGCT TAAATCAG GAGC TA.C AT AT GAAC AAAT T AAA
120120
GAATGGATTGAAAACGCATTAGGTTGGAGATAA153GAATGGATTGAAAACGCATTAGGTTGGAGATAA153
Sekwencja nr 3 (lizostafina)Sequence # 3 (Lysostaphine)
ΜΚΝ5ΚΚΙΟΙ5ΕΑΤΣΑΒ6.3Μ5νν30νΝΑΚΕ30νΚΡΑΡΚΤΥΤΣΑΑΤ3Τ3β3ΆΑΜΕΝΟΥΡΣΝΥ60ΜΚΝ5ΚΚΙΟΙ5ΕΑΤΣΑΒ6.3Μ5νν30νΝΑΚΕ30νΚΡΑΡΚΤΥΤΣΑΑΤ3Τ3β3ΆΑΜΕΝΟΥΡΣΝΥ60
GFGSYNLPNNGGMHYGVDFGM.SVGTPVKAITGGTVLNTAWDPYGGGNTITIKETDGVHTQ120GFGSYNLPNNGGMHYGVDFGM.SVGTPVKAITGGTVLNTAWDPYGGGNTITIKETDGVHTQ120
WYMHL SKFNVQKGQKIKVGQVIGY SGNTGQS SGPHLH FQRMNGNP SNANAQDPLPFLKSI180WYMHL SKFNVQKGQKIKVGQVIGY SGNTGQS SGPHLH FQRMNGNP SNANAQDPLPFLKSI180
GYGKSSGGSSNTKPSTSGGFKVNQYGTLYKAESATFTANTTIITRYTGPFRSMPKAGTLK240GYGKSSGGSSNTKPSTSGGFKVNQYGTLYKAESATFTANTTIITRYTGPFRSMPKAGTLK240
SGQSIKYDEVMKQDGHVWGYTNSAKKRVYVPVRTWNKNNNSLGSLWGTIK2 91SGQSIKYDEVMKQDGHVWGYTNSAKKRVYVPVRTWNKNNNNSLGSLWGTIK2 91
Sekwencjći nr 4Sequence No. 4
ATGAAAAATAGTAAAAAAATAGGTATCAGTTTAGCAACATTAGCTTTAGGTAGTATGTTA60ATGAAAAATAGTAAAAAAATAGGTATCAGTTTAGCAACATTAGCTTTAGGTAGTATGTTA60
GTAGTAGGACAAGTCAATGCGAAAGAATTACAAGTGAAGCCCGCTCCTAAAACTTATACT120GTAGTAGGACAAGTCAATGCGAAAGAATTACAAGTGAAGCCCGCTCCTAAAACTTATACT120
CTTGCTGCTACTAGCACTAGTGGTTCTGCTGCTTGGTTAAATCAATATCCATTAAATTAT180CTTGCTGCTACTAGCACTAGTGGTTCTGCTGCTTGGTTAAATCAATATCCATTAAATTAT180
GGTTTCGGGAGTTATAACCTACCTAATAATGGTGGTATGCACTATGGGGTGGATTTTGGC240GGTTTCGGGAGTTATAACCTACCTAATAATGGTGGTATGCACTATGGGGTGGATTTTGGC240
ATGAGTGTCGGAACTCCCGTGAAAGCAATAACTGGTGGGACAGTTCTTAATACCGCTTGG300ATGAGTGTCGGAACTCCCGTGAAAGCAATAACTGGTGGGACAGTTCTTAATACCGCTTGG300
GACCCTTATGGTGGTGGTAATACTATCACAATTAAAGAAACAGATGGCGTACATACACAA360GACCCTTATGGTGGTGGTAATACTATCACAATTAAAGAAACAGATGGCGTACATACACAA360
TGGTATATGCACTTGAGTAAATTTAATGTACAAAAAGGTCAAAAAATAAAGGTAGGACAA420TGGTATATGCACTTGAGTAAATTTAATGTACAAAAAGGTCAAAAAATAAAGGTAGGACAA420
GTAATTGGATATTCAGGTAACACTGGTCAATCAAGTGGTCCACACCTTCA.TTTCCAAAGA480GTAATTGGATATTCAGGTAACACTGGTCAATCAAGTGGTCCACACCTTCA.TTTCCAAAGA480
ATGAATGGAAATCCTAGTAACGCAAATGCTCAAGATCCTCTACCATTCTTAAAATCTATT540ATGAATGGAAATCCTAGTAACGCAAATGCTCAAGATCCTCTACCATTCTTAAAATCTATT540
GGTTATGGAAAATCAAGTGGTGGTTCTTCAAATACAAAACCATCAACATCTGGTGGTTTT600GGTTATGGAAAATCAAGTGGTGGTTCTTCAAATACAAAACCATCAACATCTGGTGGTTTT600
AAAGTAAACCAATATGGTACTTTATATAAAGCAGAATCTGCAACATTTACAGCAAATACT660AAAGTAAACCAATATGGTACTTTATATAAAGCAGAATCTGCAACATTTACAGCAAATACT660
ACAATCATAACTCGATATACAGGCCCATTTAGATCAATGCCAAAAGCTGGTACGTTAAAA720ACAATCATAACTCGATATACAGGCCCATTTAGATCAATGCCAAAAGCTGGTACGTTAAAA720
TCTGGTCAATCAATTAAATATGATGAAGTCATGAAACAAGATGGTCATGTTTGGGTTGGT780TCTGGTCAATCAATTAAATATGATGAAGTCATGAAACAAGATGGTCATGTTTGGGTTGGT780
TATACTAATTCAGCAAAGAAAAGAGTTTATGTTCCAGTTAGAACATGGAATAAGAATAAT840TATACTAATTCAGCAAAGAAAAGAGTTTATGTTCCAGTTAGAACATGGAATAAGAATAAT840
AACTCCCTGGGAAGTTTATGGGGAACAATAAAATAG8 7 6AACTCCCTGGGAAGTTTATGGGGAACAATAAAATAG8 7 6
LiteraturaLiterature
Bannoehr J., Guardabassi L. (2012) Staphylococcus pseudintermedius in the dog: taxonomy, diagnostics, ecology, epidemiology and pathogenicity. Vet Dermatol. 23, 253-66.Bannoehr J., Guardabassi L. (2012) Staphylococcus pseudintermedius in the dog: taxonomy, diagnostics, ecology, epidemiology and pathogenicity. Vet Dermatol. 23, 253-66.
Bastos M.C., Ceotto H., Coelho M.L., Nascimento J.S. (2009) Staphylococcal antimicrobial peptides: relevant properties and potential biotechnological applications. Curr Pharm Biotechnol 10, 38-61.Bastos M.C., Ceotto H., Coelho M.L., Nascimento J.S. (2009) Staphylococcal antimicrobial peptides: relevant properties and potential biotechnological applications. Curr Pharm Biotechnol 10, 38-61.
CLSI (2006) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-seventh edition, M7-A7. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA.CLSI (2006) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-seventh edition, M7-A7. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA.
Drider D., Rebuffat S. red. (2011) Prokaryotic antimicrobial peptides. New York, Springer.Drider D., Rebuffat S. eds. (2011) Prokaryotic antimicrobial peptides. New York, Springer.
EUCAST-AFST (2012) EUCAST technical notę on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2. Clin. Microbiol. Inf. 18, E246-E247.EUCAST-AFST (2012) EUCAST technical notę on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitors concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2. Clin. Microbiol. Inf. 18, E246-E247.
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Garbacz K., Żarnowska S., Piechowicz L., Haras K. (2013) Pathogenicity potential of Staphylococcus pseudintermedius strains isolated from canine carriers and from dogs with infection signs. Virulence 4, 255-259.Garbacz K., Żarnowska S., Piechowicz L., Haras K. (2013) Pathogenicity potential of Staphylococcus pseudintermedius strains isolated from canine carriers and from dogs with infection signs. Virulence 4, 255-259.
Kumar J.K. (1997) Lysostaphin: an antistaphylococcal agent. Appl Microbiol Biotechnol 80, 555-561.Kumar J.K. (1997) Lysostaphin: an antistaphylococcal agent. Appl Microbiol Biotechnol 80, 555-561.
Moreno I., Lerayer A.L.S., Baldini V.L.S., Leitao MFF (2000) Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains. Brąz. J. Microbiol. 31,183-191.Moreno I., Lerayer A.L.S., Baldini V.L.S., Leitao MFF (2000) Characterization of bacteriocins produced by Lactococcus lactis strains. Brown. J. Microbiol. 31, 183-191.
Netz D.J., Pohl R., Beck-Sickinger A.G., SelmerT., Pierik A.J., Bastos Mdo C. (2002) Biochemical characterisation and genetic analysis of aureocin A53, a new, atypical bacteriocin from Staphylococcus aureus. J Mol Biol 319, 745-756.Netz D.J., Pohl R., Beck-Sickinger A.G., SelmerT., Pierik A.J., Bastos Mdo C. (2002) Biochemical characterization and genetic analysis of aureocin A53, a new, atypical bacteriocin from Staphylococcus aureus. J Mol Biol 319,745-756.
Riley M.A., Chavan M.A. red. (2007) Bacteriocins ecology and evolution. Berlin, Springer.Riley M.A., Chavan M.A. ed. (2007) Bacteriocins ecology and evolution. Berlin, Springer.
Riley M.A., Gillor O. red. (2007) Research and Applications in Bacteriocins. Norfolk, Horizon Scientific Press.Riley M.A., Gillor O. eds. (2007) Research and Applications in Bacteriocins. Norfolk, Horizon Scientific Press.
Sandiford S., Upton M. (2012) Identification, characterization, and recombinant expression of epidermicin NI01, a novel unmodified bacteriocin produced by Staphylococcus epidermidis that displays potent activity against staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 56,1539-1547.Sandiford S., Upton M. (2012) Identification, characterization, and recombinant expression of epidermicin NI01, a novel unmodified bacteriocin produced by Staphylococcus epidermidis that displays potent activity against staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 56, 1539-1547.
Savini V., Barbarini D., Polakowska K., Gherardi G., Białecka A., Kasprowicz A., Polilli E., Marrollo R., DiBonaventura G., Fazii P., D’Antonio D., Miedzobrodzki J., Carretto E. (2013) Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius infection in a bonę marrow transplant recipient. J Clin Microbiol 51,1636-1638.Savini V., Barbarini D., Polakowska K., Gherardi G., Białecka A., Kasprowicz A., Polilli E., Marrollo R., DiBonaventura G., Fazii P., D'Antonio D., Miedzobrodzki J., Carretto E. (2013) Methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius infection in a bonę marrow transplant recipient. J Clin Microbiol 51, 1636-1638.
Sugai M., Fujiwara T., Akiyama T., Ohara M., Komatsuzawa H., Inoue S. (1997) Purification and molecular characterization of glycylglycine endopeptidase produced by Staphylococcus capitis EPK1. J Bacteriol 179,1193-1202.Sugai M., Fujiwara T., Akiyama T., Ohara M., Komatsuzawa H., Inoue S. (1997) Purification and molecular characterization of glycylglycine endopeptidase produced by Staphylococcus capitis EPK1. J Bacteriol 179, 1193-1202.
Van Hoovels L., Vankeerberghen A., Boel A., Van Vaerenbergh K., De Beenhouwer H. (2006) First case of Staphylococcus pseudintermedius infection in a human. J Clin Microbiol 44, 4609-4612.Van Hoovels L., Vankeerberghen A., Boel A., Van Vaerenbergh K., De Beenhouwer H. (2006) First case of Staphylococcus pseudintermedius infection in a human. J Clin Microbiol 44, 4609-4612.
Tabela 1Table 1
Dawki MIC bakteriocyny BacSp222 wobec różnych mikroorganizmów. Wyznaczone dawki są średnią z trzech niezależnych pomiarówBacSp222 bacteriocin MIC doses against various microorganisms. The doses determined are the average of three independent measurements
Źródła szczepów:Strain Sources:
* ATCC *’ Kolekcja Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej *** Polska Kolekcja Mikroorganizmów PAN, Wrocław **** Kolekcja Zakładu Mikrobiologii Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego* ATCC * 'Collection of the Institute of Fermentation Technology and Microbiology of the Lodz University of Technology *** Polish Collection of Microorganisms of the Polish Academy of Sciences, Wrocław **** Collection of the Department of Microbiology of the Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University
Beigjan Coordinated Collections of MicroorganismsBeigjan Coordinated Collections of Microorganisms
PL 229 542 Β1PL 229 542 Β1
Tabela 2Table 2
Aktywność resztkowa bakteriocyny peptydowej BacSp222 trawionej różnymi enzymami proteolitycznymi. Aktywność ta jest przedstawiona jako średnica stref zahamowania wzrostu bakterii (w mm) w teście dyfuzji radialnej. Próbki badane oznaczają bakteriocynę inkubowaną z peptydazą, próbki kontrolne oznaczają bakteriocynę inkubowaną bez peptydazyResidual activity of the BacSp222 peptide bacteriocin digested with various proteolytic enzymes. This activity is presented as the diameter of the zones of inhibition of bacterial growth (in mm) in the radial diffusion test. Test samples mean bacteriocin incubated with peptidase, control samples mean bacteriocin incubated without peptidase
Stosunek w ago wy e n zy m pep ty dThe ratio in ago ex e n zy m p ty d
Zastrzeżenia patentowePatent claims
Claims (9)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL411370A PL229542B1 (en) | 2015-02-25 | 2015-02-25 | Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receiving |
PCT/IB2015/056711 WO2016135540A1 (en) | 2015-02-25 | 2015-09-03 | Polypeptide, its encoding polynucleotide or expression vector, staphylococcus pseudintermedius strain and their applications and production methods |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PL411370A PL229542B1 (en) | 2015-02-25 | 2015-02-25 | Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receiving |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL411370A1 PL411370A1 (en) | 2016-08-29 |
PL229542B1 true PL229542B1 (en) | 2018-07-31 |
Family
ID=54293276
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL411370A PL229542B1 (en) | 2015-02-25 | 2015-02-25 | Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receiving |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
PL (1) | PL229542B1 (en) |
WO (1) | WO2016135540A1 (en) |
-
2015
- 2015-02-25 PL PL411370A patent/PL229542B1/en unknown
- 2015-09-03 WO PCT/IB2015/056711 patent/WO2016135540A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016135540A1 (en) | 2016-09-01 |
PL411370A1 (en) | 2016-08-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Characterization and antimicrobial mechanism of CF-14, a new antimicrobial peptide from the epidermal mucus of catfish | |
Field et al. | Developing bacteriocins of lactic acid bacteria into next generation biopreservatives | |
Rai et al. | Antimicrobial peptides as natural bio-preservative to enhance the shelf-life of food | |
Chen et al. | Comparison of biophysical and biologic properties of α‐helical enantiomeric antimicrobial peptides | |
Cheung et al. | Staphylococcus epidermidis strategies to avoid killing by human neutrophils | |
Batdorj et al. | Purification and characterization of two bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from Mongolian airag | |
Pata et al. | Characterization of the novel antibacterial peptide Leucrocin from crocodile (Crocodylus siamensis) white blood cell extracts | |
Wladyka et al. | A peptide factor secreted by Staphylococcus pseudintermedius exhibits properties of both bacteriocins and virulence factors | |
AU2013369042B2 (en) | Cyclic cationic peptides with antibmicrobial activity | |
Smits et al. | Pantocin A, a peptide-derived antibiotic involved in biological control by plant-associated Pantoea species | |
Pidutti et al. | Purification and characterization of ribosomal proteins L27 and L30 having antimicrobial activity produced by the Lactobacillus salivarius SGL 03 | |
Wladyka et al. | Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91 | |
Gupta et al. | Biochemical properties and mechanism of action of enterocin LD3 purified from Enterococcus hirae LD3 | |
CN111770687A (en) | Therapeutic bacteriocins | |
Hocquellet et al. | Structure–activity relationship of human liver-expressed antimicrobial peptide 2 | |
KR20190021126A (en) | Antimicrobial polypeptide from hetercephalus glaber with strong antimicrobial activity against gram negative bacteria and pharmaceutical composition containing the same | |
Di Girolamo et al. | Characterization of the housekeeping sortase from the human pathogen Propionibacterium acnes: first investigation of a class F sortase | |
Epparti et al. | Characterization of dual bacteriocins producing Bacillus subtilis SC3. 7 isolated from fermented food | |
Hadley et al. | Initial biochemical and functional evaluation of murine calprotectin reveals Ca (II)-dependence and its ability to chelate multiple nutrient transition metal ions | |
CN108026155A (en) | New antimicrobial peptide, their variation and purposes | |
Choi et al. | Antimicrobial peptides (bacteriocins) produced by Lactococcus lactis and Pediococcus pentosaceus strains with activity against clinical and food-borne pathogens | |
Naveed et al. | Expression of BSN314 lysozyme genes in Escherichia coli BL21: a study to demonstrate microbicidal and disintegarting potential of the cloned lysozyme | |
PL229542B1 (en) | Polypeptide, polynucleotide coding it, or expressive vector, Staphylococcus pseudintermedius strain and their application and method for receiving | |
Zalewska et al. | Isolation of Bacteriocin-producing spp. Strains from Human Skin Wounds, Soft Tissue Infections and Bovine Mastitis | |
Sarhadi et al. | Evaluation of antibacterial properties of chimeric bovine lactoferrin peptide for inhibition of food and plant pathogens |