PL229170B1 - Pochodna [C60]fulerenu i sposób jej wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno‑5’- trifosforanu (ATP) - Google Patents
Pochodna [C60]fulerenu i sposób jej wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno‑5’- trifosforanu (ATP)Info
- Publication number
- PL229170B1 PL229170B1 PL403789A PL40378913A PL229170B1 PL 229170 B1 PL229170 B1 PL 229170B1 PL 403789 A PL403789 A PL 403789A PL 40378913 A PL40378913 A PL 40378913A PL 229170 B1 PL229170 B1 PL 229170B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- atp
- fullerene
- layer
- fuleropyrrolidine
- imprinted
- Prior art date
Links
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 title claims abstract description 162
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 161
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 title claims abstract description 159
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical compound C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 44
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 8
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 53
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 17
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- GOUHYARYYWKXHS-UHFFFAOYSA-N 4-formylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 GOUHYARYYWKXHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 claims abstract description 8
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 claims abstract description 8
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 5
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 11
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 11
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N palladium Substances [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 claims description 10
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 9
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 7
- PXKPKGHXANCVMC-UHFFFAOYSA-N 3-butyl-1-methyl-1,2-dihydroimidazol-1-ium;trifluoromethanesulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F.CCCCN1CN(C)C=C1 PXKPKGHXANCVMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L palladium(ii) acetate Chemical class [Pd+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O YJVFFLUZDVXJQI-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 239000010453 quartz Substances 0.000 claims description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 claims description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 2
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 claims description 2
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 239000012454 non-polar solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims description 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims 1
- -1 compounds 2 Chemical class 0.000 abstract description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 18
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 8
- 101100202428 Neopyropia yezoensis atps gene Proteins 0.000 description 7
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229910001914 chlorine tetroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000003411 electrode reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M potassium fluoride Chemical compound [F-].[K+] NROKBHXJSPEDAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011698 potassium fluoride Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100037601 P2X purinoceptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010085249 Purinergic P2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003270 potassium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000002468 redox effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Inorganic materials [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000013024 sodium fluoride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011775 sodium fluoride Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- KBLZDCFTQSIIOH-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC KBLZDCFTQSIIOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku są pochodne [C60]fulerenu obejmujące 4-(fuleropirolidyno) amidofenylobenzen (związek nr 2) i kwas 4-(fuleropirolidyno) benzoesowy (związek nr 3), jak również sposób wytwarzania tych pochodnych, polegający na przygotowaniu roztworu wyjściowego kwasu 4-formylobenzoesowego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w toluenie, poddaniu go reakcji, odpowiednio albo z chlorkiem tionylu i pirydyną z wytworzeniem 4-(amidofenylo)benzaldehydu, a następnie tak wytworzony 4-(amidofenylo)benzaldehyd poddaniu reakcji z sarkozyną i [C60]fulerenem z wytworzeniem związku nr 2, albo poddaniu kwasu 4-formylobenzoesowego reakcji z sarkozyną i [C60]fulerenem z wytworzeniem związku nr 3. Ponadto wynalazek obejmuje sposób wytwarzania warstwy polimeru fulerenowego molekularnie wdrukowanego za pomocą adenozyno-5'-trifosforanu (ATP). Sposób ten polega na wytworzeniu w roztworze kompleksu prepolimeryzacyjnego składającego się z monomerów funkcyjnych, którymi są pochodne i [C60]fulereny, a więc związki nr 2, 3 i 4-(fuleropirolidyno)uracyl, z ATP, następnie podaniu tego kompleksu elektropolimeryzacji, w trakcie której wytworzony polimer fulerenowy z molekularnie wdrukowanym szablonem ATP jest osadzany na elektrodzie w postaci sztywnej warstwy, po czym wyekstrahowaniu ATP z tej warstwy z wytworzeniem warstwy molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego z nieobsadzonymi wdrukowanymi wnękami molekularnymi. Wynalazek obejmuje również zastosowanie warstwy wdrukowanego polimeru fulerenowego, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania ATP, zwłaszcza za pomocą impedimetrii pojemnościowej lub mikrograwimetrii piezoelektrycznej, korzystnie w warunkach stacjonarnych lub w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej.
Description
Przedmiotem wynalazku są pochodne [C6o]fulerenu i sposób ich wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno-5'-trifosforanu (ATP). Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy wytwarzania nowych amidowych i karboksylowych pochodnych [C60]fulerenu i ich wykorzystania do wytwarzania warstwy molekularnie wdrukowanego za pomocą ATP polimeru fulerenowego, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego wykrywania i oznaczania ATP.
Komplementarne wiązanie receptora z analitem jest warunkiem skutecznego rozpoznawania supramolekularnego. Dlatego projektowanie i syntetyzowanie m.in. polimerów zdolnych do selektywnego wykrywania analitów, to w ostatnich latach bardzo aktywna dziedzina badań chemii analitycznej [Fuchs Y., Soppera O. and Haupt K., Anal. Chim. Acta 2012, 717, 7-20; Whitcombe M. J., Chianella I., Larcombe L., Piletsky S. A., Noble J., Porter R. and Horgan A., Chem. Soc. Rev. 2011,40, 1547-1571; Suriyanarayanan S., Cywiński P. J., Moro A. J., Mohr G. J. and Kutner W., Top. Curr. Chem. 2012, 325, 165-265; Pietrzyk-Le A., D'Souza F. and Kutner W., in Supramolecular Chemistry for 21st Century Technology, Chapter 5, H. J. Schneider Ed., Taylor & Francis/CRC Press, London 2012, 105-128]. Wdrukowanie molekularne jest jedną z najczęściej stosowanych w tej dziedzinie procedur. Polega ono na „odciśnięciu” wnęk molekularnych w matrycy polimeru za pomocą cząsteczek szablonu. Pod względem wielkości i kształtu wnęki te odpowiadają cząsteczkom szablonu. Co więcej, orientacja przestrzenna wytworzonych w nich miejsc rozpoznających jest wymuszona przez orientację miejsc wiążących cząsteczek szablonu. Jako szablony stosowane są albo same anality, albo też ich bliskie odpowiedniki strukturalne. Pokrótce, procedura ta obejmuje wstępną samoorganizację cząsteczki szablonu i cząsteczek monomerów funkcyjnych w roztworze, która prowadzi do wytworzenia tzw. kompleksu prepolimeryzacyjnego, a następnie polimeryzację tego kompleksu w obecności monomeru sieciującego. Po usunięciu cząsteczek szablonu z otrzymanego w ten sposób polimeru pozostają w nim komplementarne do nich wnęki molekularne.
Do przygotowania zarówno przewodzących jak i nieprzewodzących polimerów wdrukowanych molekularnie (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs) w postaci warstw bezpośrednio osadzanych na powierzchni przewodzących lub półprzewodzących przetworników coraz częściej stosowane są elektroaktywne monomery funkcyjne [Sharma P. S., Pietrzyk-Le A., D'Souza R and Kutner W., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177-3204; Malitesta C., Mazzotta E., Picca R. A., Poma A., Chianella I., and Piletsky S. A., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1827-1846]. Najbardziej eleganckim sposobem ich polimeryzacji jest polimeryzacja elektrochemiczna. Co więcej, wdrukowanie molekularne z zastosowaniem elektroaktywnego monomeru funkcyjnego jest korzystne w porównaniu do polimeryzacji z wykorzystaniem monomeru elektronieaktywnego z uwagi na możliwość osadzenia warstwy MIP bezpośrednio na powierzchni przetwornika w celu wytworzenia czujnika chemicznego. Każdy czujnik chemiczny łączy w sobie element chemicznie rozpoznający analit i element przetwarzający ten sygnał rozpoznawania na mierzalny analityczny sygnał elektryczny [Janata J., in Principles of chemical sensors, 2nd ed., Plenum Press, New York, 1989]. Warstwa MIP znakomicie sprawdza się jako element rozpoznający chemoczujnika [Sharma P. S., Pietrzyk-Le A., D'Souza R. and Kutner N., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177-3204].
Jeżeli wdrukowywanym szablonem jest substancja o właściwościach utleniająco-redukujących, to mogą się pojawić trudności związane z jej wdrukowaniem, jeżeli jest ona elektroaktywna w warunkach elektropolimeryzacji. Wówczas wdrukowaniu mogą ulec produkty reakcji elektrodowej tej substancji a nie sama ta substancja. Co więcej, produkty te mogą adsorbować się na elektrodzie w ten sposób np. blokując jej powierzchnię. Dlatego reakcję elektrodową takiego szablonu należy wyeliminować. Służy temu kilka procedur. Najprostsza z nich polega na zastosowaniu szablonu zastępczego, np. strukturalnego odpowiednika szablonu, który jest elektronieaktywny w warunkach elektropolimeryzacji. Niestety, tylko nieliczne anality elektroaktywne mają swoje elektronieaktywne odpowiedniki. Inna procedura sprowadza się do tzw. „samobarierowania”, które za pomocą warstwy MIP o znacznej oporności zapobiega procesom elektrodowym elektroaktywnych szablonów [Huynh T.-P., Chandra K. C. B., Lisowski W., D'Souza F. and Kutner W., Bioelectrochemistry, DOI: 10.1016/j.bioelechem.2012.07.003, 2012]. Jeszcze inna procedura polega na wstępnym osadzeniu warstwy podkładowej innego polimeru przewodzącego. Polimer ten z jednej strony wyhamowuje procesy elektrochemiczne szablonu, a z drugiej umożliwia osadzenie, za pomocą elektropolimeryzacji, warstwy MIP na tej warstwie podkładowej
PL 229 170 B1
[Pietrzyk A., Suriyanarayanan S., Kutner W., Maligaspe E., Zandler M. E. and D'Souza F., Bioelectrochemistry 2010, 80, 62-72]. Ale najbardziej elegancka procedura polega na zastosowaniu redukującej elektropolimeryzacji monomeru funkcyjnego i sieciującego do wdrukowania szablonu ulegającego elektroutlenieniu i vice versa. Jak dotychczas do wdrukowania molekularnego za pomocą elektropolimeryzacji stosowane byty jedynie monomery ulegające elektroutlenieniu [Sharma P. S., Pietrzyk-Le A., D'Souza F. and Kutner W., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177-3204].
W niniejszym zgłoszeniu, które weryfikuje pomysł zastosowania monomerów elektroredukowalnych do wdrukowania szablonów elektroutlenialnych, jako monomery funkcyjne ulegające elektroredukcji zastosowane zostały wybrane pochodne [C60]fulerenu do wdrukowania szablonu ulegającego elektroutlenianiu, takiego jak ATP, 1.
ATP odgrywa istotną rolę w przetwarzaniu energii w żywej komórce [Knowles J. R., Annu. Rev. Biochem. 1980, 49, 877-919]. Przenosi on energię generowaną w procesach metabolitycznych i często jest traktowany jako biologiczna „jednostka energii”. ATP jest nietrwały i w żywych organizmach jest wytwarzany na bieżąco, aby zaspokoić aktualne potrzeby energetyczne komórki. Dlatego jego obecność pozwala wykryć każdą formę życia, na przykład zakażenie mikroorganizmami produktów żywnościowych w trakcie ich przygotowywania, przetwarzania i przechowywania. Ponadto ATP uczestniczy w replikacji i transkrypcji DNA. Co więcej, oznaczanie ATP może być przydatne do określania szybkości metabolizmu przed i po podaniu testowanego leku. W ten sposób można przekonać się jak pacjent lek ten toleruje [Plewa A., Yusa S.-l., Szuwarzynski M., Szczubialka K., Morishima Y. and Nowakowska M., J. Med. Chem. 2012, 55, 8712-8720]. Zastosowanie w tych badaniach oznaczania ATP może obniżyć liczbę bezskutecznego podawania źle dobranych leków. Selektywne rozpoznawanie ATP w wodnyc h układach biologicznych stało się ważnym obszarem analitycznych badań mikrobiologicznych i biochemicznych. W literaturze można znaleźć szereg doniesień na temat syntetycznych receptorów ATP, w których zastosowano molekularnie wdrukowane polimery [Plewa A., Yusa S.-l., Szuwarzynski M., Szczubialka K., Morishima Y. and Nowakowska M., J. Med. Chem. 2012, 55, 8712-8720; Matsui J., Nagano J., Miyoshi D., Tamaki K. and Sugimoto N., Biosens. Bioelectron. 2009, 25, 563-567; Spurlock L. D., Jaramillo A., Praserthdam A., Lewis J. and Brajter-Toth A., Anal. Chim. Acta 1996, 336, 37-46; Sreenivasan K., J. Mater. Sci. 2007, 42, 7575-7578; Huynh T.-P., Pietrzyk-Le A., Chandra K. C. B., Noworyta K. R., Sobczak J. W., Sharma P. S., D'Souza F. and Kutner W., Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 634-641]. Jednakże zastosowanie tych polimerów jako elementów rozpoznających ATP nie było zbyt szeroko badane [Matsui J., Nagano J., Miyoshi D., Tamaki K. and Sugimoto N., Biosens. Bioelectron. 2009, 25, 563-567; Huynh T.-P., Pietrzyk-Le A., Chandra K. C. B., Noworyta K. R., Sobczak J. W., Sharma P. S., D'Souza F. and Kutner W., Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 634-641].
Jeden z najprostszych sposobów elektropolimeryzacji fulerenów polega na przygotowaniu polimerów dwuskładnikowych, w których cząsteczki fulerenów są przełożone (ang. sandwiched) cząsteczkami kompleksu palladu [Winkler K., Balch A. L. and Kutner W., J. Solid State Electrochem. 2006, 10, 761-784; Pieta P., Grodzka E., Winkler K., Warczak M., Sadkowski A., Żukowska G. Z., Venukadasula G. M., D'Souza R. and Kutner W., J. Phys. Chem. B 2009, 113, 6682-6691; Winkler K., Noworyta K., Kutner W. and Balch A. L, J. Electrochem. Soc. 2000,147, 2597-2603]. Polimery te osadzane są w postaci cienkich warstw na powierzchni elektrody za pomocą elektropolimeryzacji redukującej w roztworach niewodnych. Przewodnictwo typu redoks i elektryczna pojemność specyficzna tych warstw są wysokie [Pieta P., Grodzka E., Winkler K., Warczak M., Sadkowski A., Zukowska G. Z., Venukadasula G. M., D'Souza F. and Kutner W., J. Phys. Chem. B 2009, 113, 6682-6691]. Warunki tej elektropolimeryzacji można tak zoptymalizować, aby jej produktem był albo polimer, -(Pd-C60)n- o krótkich łańcuchach albo znacznie usieciowany.
Dlatego też przedmiotem obecnego wynalazku są nowe pochodne [C60]fulerenu, nadające się do wytworzenia, z zastosowaniem elektropolimeryzacji, warstwy molekularnie wdrukowanego za pomocą ATP polimeru fulerenowego jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego oznaczania lub wykrywania ATP.
Zatem, niniejszy wynalazek obejmuje pochodne [C60]fulerenu, którymi są 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzen 2 i kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3.
Wynalazek ponadto obejmuje sposób wytwarzania pochodnych [C60]fulerenu 2 i 3, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
a) przygotowuje się roztwór wyjściowy kwasu 4-formylobenzoesowego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w toluenie; oraz
PL 229 170 B1
b) na otrzymany w etapie (a) roztwór działa się chlorkiem tionylu i pirydyną z wytworzeniem 4-(amidofenylo)benzaldehydu, po czym
c) na otrzymany w etapie (b) 4-(amidofenylo)benzaldehyd działa się sarkozyną i [C60]fulerenem, z wytworzeniem pochodnej [C60]fulerenu 2, tj. 4-(fuleropirydyno)amidofenylobenzenu, lub
d) na otrzymany w etapie (a) roztwór działa się sarkozyną i [C60]fulerenem, z wytworzeniem pochodnej [C60]fulerenu 3, tj. kwas 4-(fuleropirolidyno)-benzoesowy.
Wynalazek również obejmuje sposób wytwarzania warstwy molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego, charakteryzujący się tym, że zawiera następujące etapy:
a) przygotowuje się roztwór zawierający organiczny rozpuszczalnik niepolarny, korzystnie toluen, aprotyczny organiczny rozpuszczalnik polarny, korzystnie acetonitryl, ciecz jonową (ang. ionic liquid, IL), korzystnie trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy i protyczny rozpuszczalnik organiczny, korzystnie 2-propanol w stosunku objętościowym w zakresach, odpowiednio, jak (od 5 do 10):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0), w którym rozpuszcza się ATP jako szablon, 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzen, kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy i 4-(fuleropirolidyno)uracyl jako monomery funkcyjne, w obecności dimeru octanu palladu(II) jako czynnika sieciującego, w stosunku molowym w zakresach, odpowiednio, jak (od 0,5 do 5,0):(od 1,0 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 50 do 100), w wyniku czego w roztworze powstaje kompleks pre-polimeryzacyjny monomerów funkcyjnych z, odpowiednio, resztami fosforanowymi, fragmentem rybozowym i adeninowym ATP, a następnie
b) po odtlenieniu tego roztworu, otrzymany powyżej kompleks pre-polimeryzacyjny poddaje się elektropolimeryzacji, korzystnie w warunkach potencjodynamicznych obejmujących cykliczne liniowe zmiany potencjału, osadzając go na elektrodzie z powyżej podanego roztworu, który jest 0,1 M względem (TBA]CIO4, jako sztywną warstwę molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego z wdrukowanym ATP, to jest warstwę C60-Pd(ac)2 zawierającą ATP, po czym
c) ten wdrukowany ATP jako szablon wyekstrahowuje się z tej warstwy, w wyniku czego powstaje warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego z nieobsadzonymi wdrukowanymi wnękami molekularnymi.
Korzystnie, w etapie (a) stosuje się roztwór rozpuszczalników obejmujący toluen, acetonitryl, trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy i 2-propanol zmieszanych w stosunku objętościowym, odpowiednio, jak 8:1:1:1.
Korzystnie, w etapie (a) stosuje się ATP, 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzen, kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy, 4-(fuleropirolidyno)uracyl i dimer octanu palladu(II) w stosunku molowym, odpowiednio, jak 1:3:1:1:80.
Korzystnie, w etapie (b) elektropolimeryzacja potencjodynamiczna obejmuje 12 cykli liniowych zmian potencjału w zakresie od 0 do -1,3 V, względem Ag/AgCI, z szybkością 0,05 V/s.
Korzystnie, w etapie (b) jako elektrodę stosuje się elektrodę z metalu lub węgla, korzystnie platynową elektrodę dyskową lub złotą elektrodę krystalicznego rezonatora kwarcowego (ang. quartz crystal resonator, QCR).
Wynalazek ponadto obejmuje warstwę, charakteryzującą się tym, że stanowi ją molekularnie wdrukowany za pomocą ATP polimer fulerenowy, wytworzony sposobem opisanym powyżej.
Wynalazek również obejmuje zastosowanie warstwy wdrukowanego polimeru fulerenowego według wynalazku, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego wykrywania ATP, zwłaszcza za pomocą impedimetrii pojemnościowej lub mikrograwimetrii piezoelektrycznej, korzystnie w warunkach stacjonarnych lub w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej.
Wynalazek także obejmuje zastosowanie warstwy wdrukowanego polimeru fulerenowego według wynalazku, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego oznaczania ATP, zwłaszcza za pomocą impedymetrii pojemnościowej lub mikrograwimetrii piezoelektrycznej, korzystnie w warunkach stacjonarnych lub w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej (ang. flow injection analysis, FIA).
Wynalazek jest bliżej przedstawiony poniżej, w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:
fig. 1 - przedstawia krzywe potencjodynamiczne dla 0,1 mM 1, 0,3 mM 2, 0,1 mM 3, 0,1 mM 4 i 8 mM Pd(ac)2 w 0,1 M (TBA)CIO4, w roztworze toluenu, ACN, cieczy jonowej (ang. ionic liquid, IL),
PL 229 170 B1 którą był trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy, i 2-propanolu o stosunku objętościowym, odpowiednio, jak 8:1:1:1, zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej o średnicy 1 mm dla 12 cykli zmian potencjału pomiędzy 0,0 i -1,3 V vs Ag/AgCI z szybkością 50 mV/s;
fig. 2 - przedstawia równocześnie zarejestrowane krzywe potencjałowej zależności (a) prądu jak również zmian (b) częstotliwości rezonansowej i (c) rezystancji dynamicznej towarzyszących osadzaniu warstwy MIP-ATP na złotej elektrodzie QCR o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz; skład roztworu był taki sam jak skład podany w opisie do figury 1;
fig. 3 - przedstawia krzywe różniczkowej woltamperometrii pulsowej dla 10 mM K4Fe(CN)6 w 0,1 M KCI zarejestrowane za pomocą (1) platynowej elektrody dyskowej o średnicy 1 mm pokrytej warstwą MIP-ATP zawierającą szablon ATP oraz po ekstrakcji tego szablonu za pomocą 0,01 M HCI w 50°C przez (2) 1 godz. i (3) 2 godz.;
fig. 4 - przedstawia krzywe zależności zmian pojemności od czasu po kolejnych zastrzykach, w warunkach FIA, roztworów ATP o stężeniach podanych przy krzywych, zarejestrowane za pomocą platynowej elektrody dyskowej o średnicy 1 mm pokrytej warstwą MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP [za wyjątkiem krzywej (2) we wstawce], przy 0,30 V vs Ag/AgCI i 20 Hz a wstawka przedstawia krzywe kalibracyjne dla (1) ATP i MIP-ATP, (2) ATP na elektrodzie pokrytej warstwą polimeru niewdrukowanego (ang. non-imprinted polymer, NIP), (3) GTP i MIP-ATP, (4) ADP i MIP-ATP oraz (6) CTP i MIP-ATP;
fig. 5 - przedstawia krzywe zmian częstotliwości rezonansowej w czasie po kolejnych zastrzykach, w warunkach FIA, roztworów ATP o stężeniach podanych przy krzywych, zarejestrowanych za pomocą elektrody złotej QCR (10 MHz) pokrytej warstwą MIP-ATP z wyekstrahowanym ATP [za wyjątkiem krzywej (2) we wstawce], a wstawka przedstawia krzywe kalibracyjne dla (1) ATP i MIP-ATP, (2) ATP i NIP, (3) GTP i MIP-ATP, (4) ADP i MIP-ATP oraz (6) CTP i MIP-ATP;
fig. 6 - przedstawia doświadczalne izotermy sorpcji ATP przez warstwę MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP (a) zmiana częstotliwości rezonansowej ze zmianą stężenia ATP w roztworze, (b) liniowe dopasowanie izotermy Langmuira, (c) dopasowanie izotermy Freundlicha i (d) dopasowanie izotermy Langmuira-Freundlicha, gdzie cATPs i cATPf to, odpowiednio, stężenie ATP w roztworze i w warstwie MIP-ATP, zaś fig. 7 - przedstawia zależność obserwowanej stałej szybkości tworzenia kompleksu ATP i wnęki molekularnej warstwy MIP-ATP, kobs, od stężenia ATP w roztworze; stałą tę wyznaczono z nieliniowego dopasowania części krzywych zmian częstotliwości rezonansowej w czasie, zarejestrowanych w warunkach FIA, odpowiadających tworzeniu ww. kompleksu po kolejnym zastrzyku roztworu ATP; krzywe te zmierzono za pomocą QCR (10 MHz) z elektrodą złotą pokrytą warstwą MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP.
Korzystne przykłady wykonania wynalazku
Część doświadczalna - reagenty i odczynniki
Acetonitryl (ACN), 2-propanol, toluen do syntez, adenozyno-5'-trifosforan (ATP) 1 i ciecz jonową, którą był trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy, zakupiono w Sigma-Aldrich.
Nadchloran cztero-n-butyloamoniowy, (TBA)CIO4, dostarczyła firma Fluka.
Fluorek sodu i potasu oraz K4Fe(CN)6 pochodził z firmy CHEMPUR.
Pd(ac)2 zakupiono w firmie Alfa-Aesar.
Monomer 4, 4-(fuleropirolidyno)uracyl, zsyntetyzowano według znanej procedury [Marczak R., Hoang V. T, Noworyta K., Zandler M. E., Kutner W. and D'Souza F., J. Mater. Chem. 2002, 12, 2123-2129].
Monomery funkcyjne 2 i 3, odpowiednio kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 2 i kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3, zsyntetyzowano według procedur opracowanych w ramach niniejszego zgłoszenia. Są one opisane poniżej.
P r z y k ł a d 1
4-(Amidofenylo)benzaldehyd. Kwas 4-formylobenzoesowy (500 mg, 3,33 mmole) mieszano w 100 ml kolbie okrągłodennej zawierającej toluen (30 ml), w atmosferze azotu, przez 20 min. Następnie dodano chlorek tionylu (5,9 ml, 83,26 mmole) i pirydynę (6,7 ml, 83,6 mmole) a otrzymaną mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 3 godz., aby otrzymać chlorek 4-formyloacylowy. Po ochłodzeniu tej mieszaniny w temperaturze pokojowej rozpuszczalnik odparowano a zielonkawą stałą pozostałość rozpuszczono w 30 ml toluenu i mieszano przez 20 min. Następnie dodano pirydynę (14,98 ml,
PL 229 170 B1
185,5 mmole) i anilinę (0,304 ml, 3,33 mmole), i otrzymaną mieszaninę mieszano przez noc. Po odparowaniu rozpuszczalnika, surowy produkt w postaci białego amorficznego proszku oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie silikażelowej. Produkt wymyto z kolumny za pomocą chloroformu. Wydajność 240 mg (32%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz): δ (w ppm) 7,20 (t, 1H, Ar-H), 7,40 (t, 2H, Ar-H), 7,65 (d, 2H, Ar-H), 8,05 (m, 4H, Ar-H), 10,10 (s, 1H, CHO). ESI-MS [M+H]+, masa cząsteczkowa obliczona: 225,24, wyznaczona: 226,60.
4-(Fuleropirolidyno)amidofenylobenzen 2. 4-(Amidofenylo)benzaldehyd (70 mg, 0,310 mmole), sarkozynę (56 mg, 0,620 mmole), i [C60]fuleren (446 mg, 0,620 mmole) umieszczono w 250 ml kolbie okrągłodennej zawierającej suchy toluen (100 ml). Otrzymaną mieszaninę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Po ochłodzeniu w temperaturze pokojowej odparowano rozpuszczalnik a surową brązową stałą pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie silikażelowej. Pożądany produkt wymyto z kolumny za pomocą roztworu toluenu i octanu etylu o stosunku objętościowym jak 80:20. Wydajność 95 mg (31%). 1H NMR (CDCI3 z dodatkiem kilku kropel CS2, 400 MHz): δ (w ppm) 2,90 (s, 3H, -CH3), 3,50 (s, 1H, -CH), 4,30 (d, 1H, -CH), 5,05 (m, 3H, -CH), 7,15 (m, 2H, Ar-H), 7,35 (t, 2H, Ar-H), 7,62 (d, 2H, Ar-H), 7,810 (m, 1H, Ar-H), 7,98 (m, 2H, Ar-H). ESI-MS [M+H]+, masa cząsteczkowa obliczona: 972,60, wyznaczona: 973,85.
P r z y k ł a d 2
Kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3. Kwas 4-formylobenzoesowy (100 mg, 0,666 mmole), sarkozynę (75 mg, 0,842 mmole) i [C60]fuleren (600 mg, 0,833 mmole) umieszczono w 250 ml kolbie okrągłodennej zawierającej suchy toluen (120 ml). Następnie mieszaninę tę ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 16 godz. Po ochłodzeniu w temperaturze pokojowej, rozpuszczalnik odparowano a surową brązową stałą pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie silikażelowej jako eluent stosując roztwór toluenu i octanu etylu o stosunku objętościowym jak 70 : 30. Wydajność 75 mg (25%). 1H NMR (CDCI3 z kilkoma kroplami CS2, 400 MHz): δ (w ppm) 2,81 (s, 3H, -CH3), 4,05 (s, 1H, -CH), 4,13 (d, 1H, -CH), 5,00 (m, H, -CH), 6,95 (t, 2H, Ar-H), 7,08 (d, 2H, Ar-H). ESIMS [M+H]+, masa cząsteczkowa obliczona: 897,8, wyznaczona: 897,0.
W niniejszym zgłoszeniu wykorzystano zdolność pochodnych C60 [fulerenu] do elektropolimeryzacji, w warunkach redukujących, w celu przygotowania warstwy przewodzącej MIP jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego oznaczania ATP.
W tym celu szablon ATP wdrukowano za pomocą kopolimeryzacji, w obecności dimeru octanu palladu(II), Pd(ac)2, 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzenu 2, kwasu 4-(fuleropirolidyno)benzoesowego 3 i 4-(fuleropirolidyno)uracylu 4. Powyższe trzy addukty fulerenowe zastosowano jako monomery funkcyjne do przygotowania elementu rozpoznającego, tj. warstwy polimeru molekularnie wdrukowanego za pomocą ATP, dalej oznaczaną jako MIP-ATP, dwóch różnych czujników chemicznych do selektywnego wykrywania i oznaczania ATP. W celu przygotowania warstwy MIP-ATP, najpierw w roztworze wytworzono kompleks pre-polimeryzacyjny, w którym powyższy fulerenowy addukt amidowy, karboksylowy i uracylowy oddziaływał, odpowiednio, z resztami fosforanowymi oraz fragmentem rybozowym i adeninowym ATP (Schemat 1).
Następnie kompleks ten poddano elektropolimeryzacji. Doprowadziła ona do osadzenia warstwy MIP-ATP albo na platynowej elektrodzie dyskowej, albo na elektrodzie złotej QCR w celu oznaczania ATP, odpowiednio, albo za pomocą impedimetrii pojemnościowej (ang. capacitive impedimetry, Cl), albo mikrograwimetrii piezoelektrycznej (ang. piezoelectric microgravimetry, PM) w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej (ang. flow-injection analysis, FIA).
Przed oznaczaniem analitu ATP, szablon ATP usunięto z warstwy MIP-ATP opróżniając w ten sposób wdrukowane wnęki molekularne.
Zastosowanie fulerenów zmodyfikowanych addendami o właściwościach rozpoznających jako monomerów funkcyjnych jest bardzo obiecujące w zastosowaniu do rozpoznawania chemicznego. Częściowo wynika to stąd, że obecność tych addendów w polimerze obniża jego oporność a przez to poprawia jego charakterystykę elektrochemiczną. W tym celu zsyntetyzowano trzy różne pochodne C60, tj. 2, 3, i 4, aby je wykorzystać w charakterze tych monomerów.
PL229 170 Β1
\ C^facyt \ Monomer 5 funkcyjny4
Schemat 1.
Proponowany schematyczny wzór strukturalny kompleksu pre-polimeryzacyjnego szablonu ATP (1) z monomerami funkcyjnymi 2, 3, i 4 oraz czynnikiem sieciującym Pd(ac)2.
Syntetyczne receptory amidowe są szeroko stosowane do selektywnego rozpoznawania fosforanów w roztworze [Warwick C., Guerreiro A. and Soares A., Biosens. Bioelectron. 2013, 41, 1-11; Callegari A., Marcaccio M., Paolucci D., Paolucci R., Tagmatarchis N., Tasis D., Vazquez E. and Prato M., Chem. Commun., 2003, 2576-2577], Dlatego, aby skompleksować fragment trifosforanowy ATP, zsyntetyzowaliśmy pochodną amidową Οθο 2.
Obecność wicynalnego diolu we fragmencie rybozowym ATP zachęciła nas do zastosowania karboksylowego adduktu Οθο, 3, jako kolejnego monomeru funkcyjnego do wdrukowania ATP.
W biologicznym rozpoznawaniu molekularnym, które odgrywa kluczową rolę np. w replikacji kwasów nukleinowych, zachowaniu trzeciorzędowej struktury białek, czy oddziaływaniu enzymu z jego substratem, zaangażowane są wiązania wodorowe. Za pomocą tych wiązań, monomer funkcyjny 4 jest zdolny do komplementarnego parowania adeniny, adenozyny i ATP [Marczak R., Hoang V. T., Noworyta K., Zandler Μ. E., Kutner W. and D'Souza F., J. Mater. Chem. 2002, 12, 2123-2129], Dlatego zastosowaliśmy go do kompleksowania fragmentu adeninowego ATP.
Zgodnie z wymaganą stechiometrią polimeryzowanego kompleksu, przygotowano roztwór zawierający 1,2, 3, 4 i Pd(ac)2 o stosunku molowym, odpowiednio, jak 1:3:1:1:80. Aby rozpuścić wszystkie te reagenty, przygotowano roztwór toluenu, ACN, IL i 2-propanolu. Jednakże toluen nie miesza się z roztworem IL w ACN. Aby więc wszystkie te składniki rozpuścić, do roztworu do elektropolimeryzacji dodano 2-propanol.
Warstwę C6o-Pd(ac)2 zawierającą ATP osadzono z 0,1 M (TBAjCICU roztworu toluenu, acetonitrylu, IL i 2-propanolu o stosunku objętościowym, odpowiednio, jak 8:1:1:1 zawierającego 2, 3, 4 i Pd(ac)2 w obecności ATP jako, odpowiednio, monomery funkcyjne, czynnik sieciujący i szablon. Przed elektropolimeryzacją roztwór ten odtleniono przepuszczając przez niego argon. Korzystnie, zastosowano elektropolimeryzację potencjodynamiczną. Obejmowała ona 12 cykli liniowych zmian potencjału w zakresie pomiędzy 0 i -1,3 V vs Ag/AgCI z szybkością 0,05 V s1. Wzrost prądu w każdym kolejnym cyklu i odpowiadający mu wzrost czarnego osadu na elektrodzie wskazywał na osadzanie warstwy elektroaktywnej (fig. 1). Kontrolny polimer niewdrukowany (ang. non-imprinted polymer, NIP) osadzono w takich samych warunkach, ale w nieobecności szablonu ATP. Warstwy polimerów osadzono albo na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm, albo na złotej elektrodzie QCR
PL229 170 Β1 (10 ΜΗζ) ο średnicy 5 mm do oznaczania ATP za pomocą, odpowiednio, Cl i PM. Po osadzeniu, warstwy te przemyto roztworem ACN i wody, o stosunku objętościowym jak 1:1, w celu usunięcia z warstw elektrolitu podstawowego.
Obrazowanie za pomocą AFM wykazało, że grubość warstwy MIP-ATP zawierającej szablon ATP, osadzonej na złoconym szkiełku mikroskopowym, wynosi ~400 nm a warstwa ta wykazuje znaczną porowatość. Dzięki tej porowatości cząsteczki analitu ATP mogły łatwo dyfundować przez tę warstwę do jej wdrukowanych wnęk molekularnych.
W trakcie osadzania warstwy MIP-ATP na elektrodzie złotej QCR, rejestrowano jednocześnie prąd, zmiany częstotliwości rezonansowej i zmiany rezystancji dynamicznej względem liniowo zmienianego w sposób cykliczny potencjału (fig. 2). Spadek częstotliwości rezonansowej QCR, który odpowiada wzrostowi masy rezonatora, wskazywał na osadzanie warstwy. Równoczesny wzrost rezystancji dynamicznej sugerował wzrost jej lepkości w trakcie osadzania.
Po elektropolimeryzacji, z warstwy MIP-ATP wyekstrahowano szablon ATP za pomocą 0,1 M HCI przez 2 godz. w 50°C. Usunięcie szablonu potwierdzono za pomocą pomiaru prądu piku różniczkowej woltamperometrii pulsowej (ang. differential pulse voltammetry, DPV) elektroutleniania K4Fe(CN)6, który służył jako próbnik redoks (fig. 3). Wielkość tego piku była ograniczona szybkością dyfuzji próbnika przez warstwę MIP-ATP do powierzchni elektrody. W doświadczeniu tym piku DPV dla tego próbnika praktycznie nie obserwowano, jeżeli szablon ATP nie był wcześniej wyekstrahowany z warstwy MIP-ATP (krzywa 1 na fig. 3). Oznaczało to, że dyfuzja próbnika była skutecznie zablokowana, ponieważ wnęki molekularne warstwy MIP-ATP były w pełni obsadzone przez cząsteczki ATP [Sharma P. S., Pietrzyk-Le A., D'Souza F., Kutner W., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177-3204; Malitesta C., Mazzotta E., Pieca R. A., Poma A., Chianella I., Piletsky S. A., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1827-1846], Jednakże po ekstrakcji ATP, w różnych przedziałach czasu, zarejestrowano całkiem dobrze wykształcone piki DPV (krzywe 2 i 3 na fig. 3). Jak widać, K4Fe(CN)6 mógł być w tych warunkach elektroutleniony, ponieważ mógł dyfundować przez warstwę MIP-ATP z opróżnionymi wnękami molekularnymi.
Oznaczanie ATP za pomocą chemosensora impedimetrii pojemnościowej (Cl) w warunkach przepływowej analizy wstrzykowej (FIA)
Przy oznaczaniu ATP za pomocą Cl mierzono zmiany pojemności elektrycznej warstwy podwójnej, Cdi, towarzyszące zmianom stężenia ATP w roztworze. Przy stałej i dostatecznie niskiej częstotliwości (f= 20 Hz), pojemność tę łatwo wyznaczyć dla elektrody o powierzchni A ze zmierzonej składowej urojonej impedancji, Z, za pomocą Równania (1).
Z ?^fCdl
Wyznaczona wartość Cdi była tym wyższa, im wyższe było stężenie ATP w kolejno zastrzykiwanych roztworach ATP (fig. 4). Ten wzrost pojemności był najprawdopodobniej związany z zatrzymywaniem cząsteczek ATP we wnękach molekularnych MIP-ATP [Sanchez L., Martin N., Guldi D. M., Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5374-5382], Przy zastosowanym w niniejszych pomiarach stosunkowo wysokim stężeniu elektrolitu podstawowego o nie adsorbujących się specyficznie na elektrodzie jonach (0,1 M KF) nie należało oczekiwać wkładu pojemności części rozmytej warstwy podwójnej do mierzonej pojemności. Dlatego w niniejszych badaniach można było przyjąć model Helmholtza sztywnej warstwy podwójnej.
W modelu tym pojemność tej warstwy zależy jedynie od jej przenikalności elektrycznej, ε, i grubości, d, zgodnie z Równaniem (2) gdzie εο to przenikalność elektryczna próżni. Najwidoczniej wzrost przenikalności związanej z wnikaniem ATP do MIP-ATP byt głównie odpowiedzialny za mierzony wzrost pojemności (fig. 4). Z kolei późniejsze wymywanie ATP za pomocą nadmiaru roztworu nośnego obniżał pojemność do poziomu tła. Liniowy dynamiczny zakres stężenia ATP w roztworze, cATPs, rozciągał się w zakresie 0,06 < cATPs < 1,0 mM z krzywą kalibracyjną opisaną za pomocą równania regresji liniowej w postaci Cdi/(mF cm 2) = 0,069(± 0,003) c,,;.„,/mM - 0,002(± 0,002) ze współczynnikiem korelacji 0,98. Wykrywalność czułość wynosiła, odpowiednio, LOD = 31 μΜ ATP i 0,069(± 0,003) mF cnr2 mM1.
Aby potwierdzić wdrukowanie, do oznaczania ATP w doświadczeniu kontrolnym zastosowano NIP. Zgodnie z oczekiwaniem, wiązanie ATP przez warstwę NIP było znacznie słabsze niż przez
PL229 170 Β1 warstwę ΜΙΡ-ΑΤΡ z wyekstrahowanym szablonem ATP. Dla NIP, Cdi była proporcjonalna do cATPs w zakresie 0,06 < cArPs < 1,0 mM spełniając równanie regresji liniowej w postaci Cdi/(mF cm 2) = 0,0169(± 0,004) cxrPs/mM - 0,002(± 0,002). Natomiast czułość warstwy NIP względem ATP była bardzo niska, wynosiła bowiem 0,0169(± 0,004) mF cnr2 mM1.
Warstwy MIP-ATP wykazywały znaczną selektywność względem analogów strukturalnych ATP (wstawka na fig. 4). Mianowicie, czułość względem ATP była czterokrotnie wyższa niż względem trifosforanu tymidyny (TTP) 0,016(±0,002) mF cnr2 mM1 i trifosforanu guanozyny (GTP) 0,016(± 0,002) mF cm 2 mM’1 oraz prawie dwa i pół raza wyższa niż względem difosforanu adenozyny (ADP) 0,028 (± 0,004) mF cm 2 mM1. Jednakże czułość ta była zaledwie dwukrotnie wyższa niż czułość względem trifosforanu cytydyny (CTP) 0,033(± 0,003) mF cm2 mM1. Ta ostatnia zależność wynika ze strukturalnego podobieństwa CTP i ATP, jako że wszystkie miejsca w ATP, które tworzą wiązania wodorowe, również występują w CTP.
Oznaczanie ATP za pomocą chemosensora piezomikrograwimetrycznego (PM) w warunkach przepływowej analizy wstrzykowej (FIA)
Do oznaczania ATP w warunkach FIA za pomocą PM zastosowano QCR z elektrodą złotą pokrytą warstwą MIP-ATP z wyekstrahowanym ATP. Po obciążeniu masą, podstawowa częstotliwość rezonansowa QCR obniża się (Fig. 2b). Dla sztywnych osadów ta zmiana częstotliwości jest przeciwna do zmian masy zgodnie z zależnością Sauerbrey'a [Marczak R., Hoang V. T., Noworyta K., Zandler Μ. E., Kutner W., D'Souza F., J. Mater. Chem. 2002, 12, 2123-2129], Równanie (3),
Δ/ = (3) w którym fo to podstawowa częstotliwość rezonansowa drgań QCR (10 MHz), Aac to akustycznie czynna powierzchnia QCR (0,1963 cm2), /a, to moduł ścinający kwarcu (2,947 χ 1011 g s 2 cnr 1) a p, to gęstość kwarcu (2,648 g cm 3). Rejestrowane w trakcie pomiarów zmiany rezystancji dynamicznej (Fig. 2c) wskazują, że zmiany lepkości towarzyszące wnikaniu i uwalnianiu analitu z warstwy są zaniedbywanie małe [Kochman A., Krupka A., Grissbach J., Kutner W., Gniewinska B., Nafalski L., Electroanalysis 2006, 18, 2168-2163],
Po wstrzyknięciu każdej nowej porcji roztworu ATP o innym stężeniu, Δ/ obniżała się (fig. 5) wskazując na wzrost masy warstwy MIP-ATP. Ta masa rosła wskutek wnikania ATP do tej warstwy. Następnie nadmiar roztworu nośnego wypłukiwał ATP z warstwy i Δ/ wzrastała powracając do poziomu tła. Maksymalna wartość Δ/ była proporcjonalna do stężenia ATP w roztworze przynajmniej w zakresie 0,6 < cATP,s< 10 mM, zgodnie z równaniem regresji liniowej w postaci Δ//Ηζ = -9,05 (± 1,10) cxrPs/mM -2,91(± 5,7). Czułość i współczynnik korelacji wynosiły, odpowiednio, -9,05(± 1,10) Hz mM1 (krzywa 1 we wstawce na fig. 5) i 0,95. Wykrywalność chemosensora PM wynosiła 0,31 mM ATP. Ze stosunku czułości MIP-ATP (krzywa 1 we wstawce na fig. 5) i NIP (krzywa 2 we wstawce na fig. 5) względem ATP wyznaczono pozorny współczynnik wdrukowania; wynosił on ~4.
Podobnie jak dla chemosensora Cl, również dla chemosensora PM wyznaczono selektywność (wstawka na fig. 5). Czułość względem ATP wynosiła -9,05 (± 1,10) Hz mM1 będąc prawie pięć i pół raza wyższa niż względem GTP, która wynosiła -1,63 (± 0,20) Hz mM1, trzy i pół razy wyższa niż względem TTP, która wynosiła -2,57 (± 0,20) Hz mM1, prawie trzy razy wyższa niż względem ADP wynoszącej -3,30 (± 1,33) Hz mM1 i zaledwie półtora raza wyższa niż względem CTP wynoszącej -6,60 (± 0,48) Hz mM1. Jak widać, kierunek zmian czułości jest bardzo podobny dla obu chemosensorów.
Charakterystyka sorpcji ATP w warstwie MIP-ATP
Aby scharakteryzować sorpcję ATP w warstwie MIP-ATP, wyznaczono stałe trwałości kompleksów ATP z komplementarnymi wnękami molekularnymi wdrukowanymi w polimer zarówno w warunkach stacjonarnych jak i przepływowych. W warunkach stacjonarnych przetestowano trzy izotermy najczęściej stosowane w badaniach MIPs. Natomiast w warunkach przepływowych wyznaczono stałe szybkości tworzenia i dysocjacji kompleksów, a następnie zastosowano je do wyznaczenia stałych trwałości tych kompleksów.
Do testowania izoterm w warunkach stacjonarnych zastosowano QCR ze złotą elektrodą pokrytą warstwą MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP. Po każdorazowym dodaniu roztworu ATP o różnym stężeniu do roztworu badanego, częstotliwość rezonansowa malała co świadczyło o wiązaniu ATP w warstwie MIP-ATP. Sygnał PM osiągnął plateau przy stężeniu ATP wynoszącym ~4,5 mM
PL229 170 Β1 wskazując na nasycenie polimeru tym analitem. Następnie do doświadczalnych danych sorpcji dopasowano parametry izotermy Langmuira, Freundlicha lub Langmuira-Freundlicha (fig. 6).
Zastosowanie izotermy Langmuira wymaga przyjęcia założenia, m.in. że cząsteczki ulegające sorpcji zajmują z góry określone homogeniczne miejsca sorpcji i tylko jedna cząsteczka zajmuje jedno takie miejsce. Co więcej, cząsteczki te nie oddziałują wzajemnie. Dla badanych układów, powyższe założenia są spełnione, ponieważ wdrukowane wnęki molekularne są homogeniczne i tylko jedna cząsteczka ATP zajmuje jedną taką wnękę. Ponadto zajmujące te wnęki cząsteczki ATP nie oddziałują wzajemnie. Stężenie unieruchomionego w polimerze analitu ATP, cATPf, jest za pomocą izotermy Langmuira związane ze stężeniem ATP w roztworze, cATPs, w postaci Równania (4), _ nksCATP s CATP,f ΛΑ.Κ „ r+KscATPs gdzie N to gęstość wnęk molekularnych wdrukowanych w polimer a Ks to stała równowagi sorpcji związana ze zmianą entalpii swobodnej analitu w wyniku sorpcji, AGS = -RT In Ks.
Izotermę Langmuira łatwo zlinearyzować na potrzeby analizy regresji liniowej z graficznym wyznaczaniem parametrów dobieralnych. Przekształcając w ten sposób Równanie (4) otrzymujemy Równanie (5), CATP,S cATP,f (5) za pomocą, którego wyznaczyliśmy stałe Λ/ i Ks wykreślając cATP slcATP f vs cATP,s (fig. 6b). Izoterma Freundlicha opisuje cATPf jako funkcję potęgową cATPs, za pomocą Równania (6), CATP,f 0 CATP,S (6) gdzie a to parametr Freundlicha związany z powinowactwem polimeru do analitu a m to indeks heterogeniczności sorbentu. Indeks ten zawiera się w zakresie 0 < m < 1; m jest ~1, gdy heterogenicznośćta zmniejsza się i osiąga 1 dla układu homogenicznego (fig. 6c). Izotermę Freundlicha zapisaną w postaci Równania (6) można przekształcić do postaci liniowej, Równanie (7).
log cATP,f = m loS CATP,S + loS 0 (7)
Wykreślenie log cATPf względem log cATP,s umożliwia wyznaczenie parametrów a i m za pomocą regresji liniowej. Te dwa dobieralne parametry określają zdolność wiązania analitu przez polimer. Czynnik przedwykładniczy a jest miarą N i Ks. Jednakże wkładu każdego z tych parametrów z osobna do tego czynnika nie można bezpośrednio wyznaczyć bez przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów lub przyjęcia dodatkowych założeń. Co więcej, izoterma Freundlicha nie nadaje się do modelowania stanu nasycenia przez co ogranicza rodzaje parametrów wiązania analitu, które można z niej wyznaczyć.
Dokładne wyznaczenie wartości N, Ks i m dla układów heterogenicznych wymaga przyjęcia hybrydowego modelu sorpcji. Łączy on domeny stanu nasycenia i bliskie nasycenia. Model ten jest wykorzystany m.in. w izotermie Langmuira-Freundlicha. Izoterma ta opisuje zależność cATPf od cATP,s za pomocą Równania (8).
CATP,f —
JV K™ cjyrp.s
I IZTM 1_|·λ5 cATP,S (8)
Parametr dopasowania mtej izotermy to indeks heterogeniczności izotermy Freundlicha (fig. 6d).
Wyniki zebrane w Tabeli 1 wskazują, że wartości stałej równowagi sorpcji ATP przez MIP-ATP są zbliżone, a przez to niezależne od przyjętego modelu sorpcji. Co więcej, wyznaczone wartości gęstości wnęk molekularnych są również zbliżone (Tabela 1). Izoterma Freundlicha wykazuje odchylenie od punktów doświadczalnych dla wysokich stężeń ATP (fig. 6c). Nie nadaje się więc do modelowania stanu nasycenia. Dlatego indeks heterogeniczności wyznaczony z izotermy Freundlicha różni się od indeksu wyznaczonego z izotermy Langmura-Freunlicha (Tabela 1).
PL229 170 Β1
Tabela 1
Parametry dopasowania izoterm obliczone dla sorpcji analitu ATP przez warstwę MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP
| Izoterma | Parameter dobieralny | |||
| W (pmol/g) | o m | Ks (M'1) | Współczynnik korelacji | |
| Langmuira | 17,85+0.32 | - | 530±13 | 0,991 |
| Freundlicha | - | 5,67±0.16 0,56+0.02 | - | 0,990 |
| Langmuira-Freund licha | 18,53+1.32 | 1,00+0.06 | 476+57 | 0,997 |
N - gęstość wnęk molekularnych wdrukowanych w polimerze, K$ - stała równowagi sorpcji, o - parameter Freundlicha, m - indeks heterogeniczności.
Parametry kinetyczne charakteryzujące oddziaływanie ATP i warstwy MIP-ATP z wyekstrahowanym ATP wyznaczono za pomocą PM w warunkach FIA. Szybkość tworzenia i dysocjacji kompleksu molekuły analitu ATP (1) z wnęką molekularną warstwy MIP-ATP opisuje stała szybkości, odpowiednio, jego tworzenia, fe, i dysocjacji, ka. Równowagę kompleksowania można opisać za pomocą Równania (9).
k3
MIP-ATP + ATP (MIP-ATP)-ATP (9)
Dla równowagi tej Ks przyjmuje postać Równania (10), = [(MIP—ATP)—ATP] s [(MIP-ATP)] [ATP] ' ' a zależność stężenia analitu ATP w polierze, [(MIP-ATP)-ATPj, od czasu jest wyrażona w postaci Równania (11) [Składał P., J. Brąz. Chem. Soc. 2003,74, 491-502], d[(MIP — ATP)-ATP]/dt = -B(df/dt) = ka [ATP](11) w którym B = -[Aac (;/qpq)1/2 / 2 Mw V/o2] to współczynnik proporcjonalności wyznaczony z Równania (3). /14« to masa cząsteczkowa kompleksu (MIP-ATP)-ATP, Vto objętość warstwy MIP-ATP a /max to maksymalna zmiana częstotliwości rezonansowej dla danego stężenia równowagowego ATP w roztworze, [ATP], które w przybliżeniu jest równe jego stężeniu analitycznemu w roztworze, cATPs. Stała Ks jest zdefiniowana za pomocą Równania (12) jako /ćs = — (12) s *d
Scałkowanie Równania (11) względem czasu i podstawienie , = feacATr,S/max (13) ka CATP.s+^d
Prowadzi do równania (14),
7eq /max[l θΧρ( —^obs /)] r (14) w którym ^obs — ^-ćicATP,s “P (15)
PL 229 170 B1 a feq to rezonansowa częstotliwość równowagowa w czasie t, natomiast kobs to pozorna stała szybkości tworzenia kompleksu (MIP-ATP)-ATP. Wartości kobs wyznaczono z Równania (14) przez dopasowanie go do danych doświadczalnych. Wartości ka i kd wyznaczono, odpowiednio, z nachylenia i odciętej liniowej zależności kobs od stężenia analitu ATP w roztworze (fig. 7), zgodnie z Równaniem (15). Efekt transportu masy w tym postępowaniu uwzględniono przeprowadzając eksperyment kontrolny, w którym zastosowano próbnik redoks, jak opisano w pracy [Pietrzyk A., Suriyanarayanan S., Kutner W., Maligaspe E., Zandler M. E. and D'Souza F., Bioelectrochemistry 2010, 80, 62-72]. Wyznaczona dla kompleksu MIP-ATP i ATP wartość stałej trwałości wynosiła, Ks = 645 ± 196 M-1. Jak się okazuje, stała ta jest bliska stałym równowagi sorpcji wyznaczonym w warunkach nieprzepływowych dla różnych modeli sorpcji (Tabela 1).
Wnioski
Ulegający elektroutlenieniu szablon, taki jak ATP, z powodzeniem molekularnie wdrukowano w polimer przygotowany za pomocą reduktywnej elektropolimeryzacji redukujących się monomerów funkcyjnych, takich jak wybrane addukty fulerenowe. Obecność cieczy jonowej w roztworze do elektropolimeryzacji umożliwiła rozpuszczenie wszystkich składników, w tym zjonizowanego szablonu ATP. Obecność szablonu ATP w warstwie MIP-ATP po elektropolimeryzacji a następnie jego usunięcie z warstwy pośrednio potwierdziło, że w roztworze do tej elektropolimeryzacji tworzył się kompleks ATP z monomerami funkcyjnymi. W wyniku elektropolimeryzacji kompleks ten został unieruchomiony w polimerze. W ten sposób, przygotowaną ze spolimeryzowanych fulerenów warstwę MIP-ATP scalono z dwoma różnymi przetwornikami. Jednym z nich był rezonator kwarcowy chemosensora PM, a drugim - elektroda Pt chemosensora Cl.
Przybierające kształt pików, sygnały detekcji zarejestrowane w trakcie oznaczania ATP w warunkach FIA potwierdziły odwracalność wiązania ATP w warstwie MIP-ATP. To znaczy, zastrzyknięty analit ATP najpierw ulegał zatężeniu w tej warstwie za pomocą wiązań niekowalencyjnych utworzonych pomiędzy miejscami wiążącymi ATP a miejscami rozpoznającymi wnęk molekularnych polimeru. Następnie był on całkowicie wymywany z tej warstwy za pomocą nadmiaru roztworu nośnego. Najwyższą wykrywalność osiągnięto za pomocą chemosensora Cl. Była ona o rząd wielkości wyższa niż wykrywalność chemosensora PM. Tę różnicę wykrywalności można przypisać różnej czułości tych chemosensorów. Za wyjątkiem CTP, wdrukowane wnęki molekularne z powodzeniem rozróżniały analit ATP od typowych substancji, o podobnej budowie, przeszkadzających w jego oznaczaniu, takich jak ADP, GTP i TTP.
Aby scharakteryzować sorpcję ATP przez warstwę MIP-ATP z wyekstrahowanym szablonem ATP w warunkach stacjonarnych, do doświadczalnych danych sorpcji dopasowano parametry izotermy Langmuira, Freundlicha lub Langmuira-Freundlicha. Okazało się, że ani wyznaczona gęstość wnęk molekularnych wdrukowanych w polimerze, ani stała równowagi sorpcji praktycznie nie zależy od przyjętego modelu sorpcji. Co więcej, stała ta, wyznaczona w warunkach stacjonarnych, była porównywalna do wyznaczonej w warunkach przepływowych stałej trwałości kompleksu ATP z wdrukowaną wnęką molekularną.
Claims (10)
1. Pochodne [C60]fulerenu, którymi są 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzen 2 i kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3.
2. Sposób wytwarzania pochodnych [C60]fulerenu 2 i 3, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) przygotowuje się roztwór wyjściowy kwasu 4-formylobenzoesowego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w toluenie; oraz
b) na otrzymany w etapie (a) roztwór działa się chlorkiem tionylu i pirydyną z wytworzeniem 4-(amidofenylo)benzaldehydu, po czym
c) na otrzymany w etapie (b) 4-(amidofenylo)benzaldehyd działa się sarkozyną i [C60]fulerenem, z wytworzeniem pochodnej [C60]fulerenu 2, tj. 4-(fuleropirydyno)amidofenylobenzenu, lub
d) na otrzymany w etapie (a) roztwór działa się sarkozyną i [C60]fulerenem, z wytworzeniem pochodnej [C60]fulerenu 3, tj. kwas 4-(fuleropirolidyno)-benzoesowy.
3. Sposób wytwarzania warstwy molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
PL 229 170 B1
a) przygotowuje się roztwór zawierający organiczny rozpuszczalnik niepolarny, korzystnie toluen, aprotyczny organiczny rozpuszczalnik polarny, korzystnie acetonitryl, ciecz jonową, korzystnie trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy, i protyczny rozpuszczalnik organiczny, korzystnie 2-propanol, w stosunku objętościowym w zakresach, odpowiednio, jak (od 5 do 10):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0), w którym rozpuszcza się adenozyno-5'-trifosforan (ATP 1) jako szablon, 4-(fuleropirolidyno)amido-fenylobenzen 2, kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3 i 4-(fuleropirolidyno)uracyl 4 jako monomery funkcyjne, w obecności dimeru octanu palladu(II) jako czynnika sieciującego, w stosunku molowym w zakresach, odpowiednio, jak (od 0,5 do 5,0):(od 1,0 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 0,5 do 5,0):(od 50 do 100), w wyniku czego w roztworze powstaje kompleks pre-polimeryzacyjny monomerów funkcyjnych z, odpowiednio, resztami fosforanowymi, fragmentem rybozowym i adeninowym ATP, a następnie
b) po odtlenieniu tego roztworu, otrzymany w etapie (a) powyżej kompleks, prepolimeryzacyjny poddaje się elektropolimeryzacji, korzystnie w warunkach potencjodynamicznych obejmujących cykliczne liniowe zmiany potencjału, osadzając go na elektrodzie z powyżej podanego w etapie (a) roztworu, który jest 0,1 M względem (TBA)CIO4, jako sztywną warstwę molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego z wdrukowanym ATP, to jest warstwę C60-Pd(ac)2 zawierającą ATP, po czym
c) ten wdrukowany, w etapie (b) powyżej, jako szablon ATP wyekstrahowuje się z tej warstwy, w wyniku czego powstaje warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego z nieobsadzonymi wdrukowanymi wnękami molekularnymi.
4. Sposób, według zastrz. 3, znamienny tym, że etapie (a) stosuje się roztwór rozpuszczalników obejmujący toluen, acetonitryl, 2-propanol i trifluorometanosulfonian 1-butylo-3-metyloimidazolowy, zmieszanych w stosunku objętościowym, odpowiednio, jak 8:1:1:1.
5. Sposób, według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że w etapie (a) stosuje się adenozyno-5'-trifosforan (ATP), 4-(fuleropirolidyno)amidofenylobenzen 2, kwas 4-(fuleropirolidyno)benzoesowy 3, 4-(fuleropirolidyno)uracyl 4 i dimer octanu palladu(II) w stosunku molowym, odpowiednio, jak 1:3:1:1:80.
6. Sposób, według zastrz. od 3 do 5, znamienny tym, że w etapie (b) elektropolimeryzacja potencjodynamiczna obejmuje 12 cykli liniowych zmian potencjału w zakresie od 0 do -1,3 V, względem Ag/AgCI, z szybkością 0,05 V/s.
7. Sposób, według zastrz. od 3 do 6, znamienny tym, że w etapie (b) jako elektrodę stosuje się elektrodę z metalu lub węgla, korzystnie platynową elektrodę dyskową lub złotą elektrodę krystalicznego rezonatora kwarcowego.
8. Warstwa, znamienna tym, że stanowi ją molekularnie wdrukowany za pomocą ATP polimer fulerenowy, wytworzony sposobem opisanym w zastrz. od 3 do 7.
9. Zastosowanie warstwy wdrukowanego polimeru fulerenowego, zdefiniowanej w zastrz. 8, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego wykrywania ATP, zwłaszcza za pomocą impedimetrii pojemnościowej lub mikrograwimetrii piezoelektrycznej, korzystnie w warunkach stacjonarnych lub w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej.
10. Zastosowanie warstwy wdrukowanego polimeru fulerenowego, zdefiniowanej w zastrz. 8, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do selektywnego oznaczania ATP, zwłaszcza za pomocą impedimetrii pojemnościowej lub mikrograwimetrii piezoelektrycznej, korzystnie w warunkach stacjonarnych lub w warunkach wstrzykowej analizy przepływowej.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403789A PL229170B1 (pl) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Pochodna [C60]fulerenu i sposób jej wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno‑5’- trifosforanu (ATP) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL403789A PL229170B1 (pl) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Pochodna [C60]fulerenu i sposób jej wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno‑5’- trifosforanu (ATP) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL403789A1 PL403789A1 (pl) | 2014-11-10 |
| PL229170B1 true PL229170B1 (pl) | 2018-06-29 |
Family
ID=51866443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL403789A PL229170B1 (pl) | 2013-05-07 | 2013-05-07 | Pochodna [C60]fulerenu i sposób jej wytwarzania, warstwa molekularnie wdrukowanego polimeru fulerenowego i sposób jej wytwarzania oraz ich zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania adenozyno‑5’- trifosforanu (ATP) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229170B1 (pl) |
-
2013
- 2013-05-07 PL PL403789A patent/PL229170B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL403789A1 (pl) | 2014-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kor et al. | Development and characterization of an electrochemical sensor for furosemide detection based on electropolymerized molecularly imprinted polymer | |
| Pietrzyk et al. | Molecularly imprinted polymer (MIP) based piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of adenine | |
| Kan et al. | Molecularly imprinted polymers based electrochemical sensor for bovine hemoglobin recognition | |
| Xue et al. | Determination of methyl parathion by a molecularly imprinted sensor based on nitrogen doped graphene sheets | |
| Florea et al. | Anticancer drug detection using a highly sensitive molecularly imprinted electrochemical sensor based on an electropolymerized microporous metal organic framework | |
| Mintz Hemed et al. | On-demand, reversible, ultrasensitive polymer membrane based on molecular imprinting polymer | |
| Ayankojo et al. | Molecularly imprinted poly (meta-phenylenediamine) based QCM sensor for detecting Amoxicillin | |
| Liu et al. | Conductive imprinted electrochemical sensor for epinephrine sensitive detection and double recognition | |
| Malitesta et al. | MIP sensors–the electrochemical approach | |
| Wang et al. | Constructing a novel composite of molecularly imprinted polymer-coated AuNPs electrochemical sensor for the determination of 3-nitrotyrosine | |
| Mazzotta et al. | Development of a sensor prepared by entrapment of MIP particles in electrosynthesised polymer films for electrochemical detection of ephedrine | |
| Özcan et al. | Determination of paracetamol based on electropolymerized-molecularly imprinted polypyrrole modified pencil graphite electrode | |
| Kan et al. | Imprinted electrochemical sensor for dopamine recognition and determination based on a carbon nanotube/polypyrrole film | |
| Liu et al. | Electrochemical sensor for the determination of brucine in human serum based on molecularly imprinted poly-o-phenylenediamine/SWNTs composite film | |
| Fang et al. | Quartz crystal microbalance sensor based on molecularly imprinted polymer membrane and three-dimensional Au nanoparticles@ mesoporous carbon CMK-3 functional composite for ultrasensitive and specific determination of citrinin | |
| Arnaboldi et al. | Electroactive chiral oligo-and polymer layers for electrochemical enantiorecognition | |
| Huynh et al. | Cytosine derivatized bis (2, 2′-bithienyl) methane molecularly imprinted polymer for selective recognition of 6-thioguanine, an antitumor drug | |
| Maouche et al. | A surface acoustic wave sensor functionalized with a polypyrrole molecularly imprinted polymer for selective dopamine detection | |
| Zhao et al. | Layer-by-layer assembly of anionic-/cationic-pillar [5] arenes multilayer films as chiral interface for electrochemical recognition of tryptophan isomers | |
| Wang et al. | A highly sensitive and selective sensor based on a graphene-coated carbon paste electrode modified with a computationally designed boron-embedded duplex molecularly imprinted hybrid membrane for the sensing of lamotrigine | |
| Miodek et al. | Electrochemical functionalization of polypyrrole through amine oxidation of poly (amidoamine) dendrimers: Application to DNA biosensor | |
| Sharma et al. | Fullerene derived molecularly imprinted polymer for chemosensing of adenosine-5′-triphosphate (ATP) | |
| Li et al. | RGO LBL modified biomimetic electrochemical sensor for detection of Sildenafil in herbal sexual healthproducts | |
| Pietrzyk et al. | Molecularly imprinted poly [bis (2, 2′-bithienyl) methane] film with built-in molecular recognition sites for a piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of dopamine | |
| Liao et al. | Preparation of the molecularly imprinted polymers-based capacitive sensor specific for tegafur and its characterization by electrochemical impedance and piezoelectric quartz crystal microbalance |