PL229042B1

PL229042B1 - Sposób dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym i układ do dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym

Info

Publication number: PL229042B1
Application number: PL396493A
Authority: PL
Inventors: Tomasz KAMIŃSKI; Tomasz Kamiński; Piotr Garstecki
Original assignee: Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2018-06-29
Also published as: GB2495182B; GB2495182A; PL396493A1; GB201215443D0

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym obejmujący etap doprowadzenia kropel do złącza mikroprzepływowego i rozerwania kropel w tym złączu. Wynalazek obejmuje także układ do dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym, umożliwiający stosowanie tego sposobu. Wynalazek znajduje zastosowanie w mikrofluidyce.

Rozwiązania będące przedmiotem wynalazku, w połączeniu z modułami mikroprzepływowymi znanymi w stanie techniki - na przykład opisanymi w poprzednich zgłoszeniach wynalazków zespołu doc. Piotra Garsteckiego (opublikowane zgłoszenia polskie nr P-390250, P-390251, P-393619 oraz zgłoszenie międzynarodowe nr PCT/PL2011/050002) mogą służyć do przeprowadzenie wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeprowadzonych w kroplach o pikolitrowych (subnanolitrowych) objętościach, w których mogą znajdować się pojedyncze komórki lub pojedyncze molekuły. Reakcje na pojedynczych komórkach mają olbrzymi potencjał w diagnostyce i badaniach nad heterogenicznymi populacjami jak np. tkanki nowotworowe czy środowiskowe próbki mikrobiologiczne. W ostatnich latach eksperymenty przeprowadzone na pojedynczych komórkach stają się podstawą badań w takich dziedzinach jak biologia systemowa, genomika czy metabolomika. Ponadto pikolitrowe krople uzyskane w naszych układach mogą służyć jako platforma do prowadzenia reakcji na pojedynczych cząsteczkach biologicznych takich jak enzymy czy sekwencje kwasów nukleinowych. Reakcje takie są podstawą prowadzenia ukierunkowanej ewolucji enzymów czy reakcji cyfrowego PCR (ang. Polimerase Chain Reaction - np. US RE41,780E).

Coraz liczniejsze doniesienia dotyczące zastosowania mikroprzepływowych układów w naukach biologicznych pozwalają przewidywać bardzo szybki rozwój w najbliższej przyszłości technologii nazywanej 'laboratorium w chipie' (z ang. Lab-on-a-chip). Szczególnie obiecujące jest wykorzystanie generowanych w mikrokanałach kropli jako zminiaturyzowanych reaktorów, ze względu na ich małą objętość od mikrolitrów, przez nanolitry po pikolitry.

Typowo, mikroukłady kropelkowe posiadają mnogość kanałów mikroprzepływowych, z ich wlotami i wylotami, które mogą się łączyć wewnątrz układu, w których tworzone są krople roztworów otoczonych niemieszającą się z nimi fazą ciągłą. Dalej, krople wewnątrz układów mogą być łączone, transportowane wzdłuż kanałów z wymieszaniem ich zawartości, przetrzymywane w ustalonych lub zmiennych warunkach i wreszcie sortowane lub dzielone na rozgałęzieniach kanałów i odzyskiwane z układu. Wykorzystanie mikrolaboratoriów do prowadzenia reakcji chemicznych i biochemicznych wewnątrz mikrokropli posiada następujące zalety [H. Song, D. L. Chen i R. F. Ismagilov, Ang. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7336-7356]: i) brak dyspersji czasu przebywania elementów płynu w kanale, ii) szybkie mieszanie, iii) możliwość łatwej kontroli kinetyki reakcji, iv) możliwość prowadzenia wielu reakcji równolegle oraz v) mała konsumpcja reagentów vi) przyspieszona detekcja wyników reakcji (mała objętość kropli powoduje, że produkty reakcji szybciej osiągają mierzalne stężenie).

Ze względu na te cechy mikroukłady kropelkowe mogą być cennym narzędziem dla chemii analitycznej, chemii syntetycznej, biochemii, mikrobiologii, diagnostyki medycznej czy też diagnostyki molekularnej.

Jednym z wyzwań związanych z mikroukładami kropelkowymi jest tworzenie kropel o znanym i zmiennym składzie. Pozwoliłoby to na przeprowadzanie wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Poprzez zmienny skład kropli rozumiemy stężenie aktywnych związków chemicznych takich jak np. leków, inhibitorów, hormonów, kofaktorów itp., jak również bardziej złożonych molekuł takich jak białka (enzymy, przeciwciała), kwasy nukleinowe oraz innego typu makrocząstek w szczególności makrocząstek paramagnetycznych. Z wielu względów pożądane jest aby krople miały objętość poniżej 10 nL, ze względu na i) minimalne zużycie reagentów iii) maksymalną przepustowość ii) możliwość wykonywania reakcji i testów biochemicznych na pojedynczych komórkach czy molekułach.

W stanie techniki istnieje kilka rozwiązań dotyczących generowania kropli o objętości mniejszej niż 10 nL o zmiennej kompozycji. Dla przykładu H. Song and R. F. Ismagilov (J. Am. Chem. Soc. 2003 125: 14613-14619) generowali gradient stężenia od jednego do trzech reagentów wewnątrz kropli manipulując szybkością przepływu w każdym z trzech lub czterech kanałów doprowadzających fazę wodną. Rozwiązania takie ma jednak szereg wad: i) stężeń nie można zmieniać niezależnie od siebie ii) stężenia są zmieniane w sposób płynny, a nie skokowy (dyskretny), iii) zakres stężeń jest wąski i nie przekracza dwóch rzędu wielkości iv) stężenie wewnątrz kropli nie jest do końca znane ani kontrolowane. W innym rozwiązaniu A. B. Theaberge i wsp. (Analytical Chemistry, 2010, 82, 3449-3453) pokazał, że możliwa jest integracja kolumny chromatograficznej z układem mikroprzepływowym.

PL 229 042 B1

Mieszanina aktywnych związków chemicznych przed zamknięciem wewnątrz kropli ulega rozdziałowi, który generuje gradienty o rozpiętości kilku rzędów wielkości. Jednakże, podobnie jak we wcześniejszym przykładzie badacz ma bardzo małą kontrolę nad kompozycją kropli: i) charakterystyka rozdziału musi być znana dla każdej z substancji oraz dla każdego typu kolumny chromatograficznej, ii) nie jest możliwy jednoczesny przesiew po stężeniach dla mieszanin dwóch lub większej liczny związków aktywnych - np. w celu badania interakcji między nimi, iii) jest generowanych bardzo dużo kropel nadliczbowych, co znacznie zmniejsza przepustowość układu. Innym rozwiązaniem jest stosowanie bibliotek kropel [zgłoszenie patentowe US 2010/0022414]. Polega ono na tworzeniu populacji monodyspersyjnych mikrokropel, które tworzą stabilną emulsję. Populacja jest mieszaniną kropel o różnej kompozycji - każda z subpopulacji kropel o jednakowym składzie jest zakodowana znacznikiem lub mieszaniną znaczników. Znacznikami najczęściej są związki fluorescencyjne, ale mogą to być również związki zawierające radioizotopy, enzymy lub inne znaczniki np. sekwencje DNA. Reakcja polega na wysokoprzepustowym łączeniu kropel z biblioteki z kroplami zawierającymi komórki, enzymy lub inny rodzaj analitu. E. Brouzes i wsp. [Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106, 14195-14200] zaprezentował, że dzięki bibliotekom możliwa jest ocena cytotoksyczności leku na poziomie pojedynczych komórek ssaczych. W innym przykładzie N. K. Joensson i wsp. (Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 2518-2521) pokazali, że możliwe jest wykrywanie rzadkich biomarkerów na powierzchni pojedynczych komórek ssaczych. Wadą technologii bibliotek kropel na obecnym poziomie jest konieczność odrębnego generowania każdej z subpopulacji, co jest procesem żmudnym i kosztownym. Ponadto bardzo trudne jest wytworzenie biblioteki, przy jednoczesnym minimalnym zużyciu reagentów - napełnianie klasycznego układu i stabilizacja procesu tworzenia kropli wymaga zużycia przynajmniej kilku mikrolitów reagentów (co w przypadku wykorzystania znaczników fluorescencyjnych generuje znaczne koszty).

Alternatywnymi metodami tworzenia mikrokropel o znanej objętości, są systemy mające możliwość aspiracji płynów z zewnętrznych, źródeł takich jak np. wielodołkowe płytki titracyjne. Dla przykładu, J. Clausell-Tormos (Lab Chip, 2010, 10, 1302-1307) przestawił system do automatycznego pobierania próbek wykorzystujący wielokanałowy zawór używany w chromatografii. Próbki substancji były pobierane z płytki wielodołkowej, a następnie umieszczane w wężyku w postaci kropli oddzielonych olejem. Chen (PNAS, 2008, vol. 105, 44, 16843-16848) opracował system o nazwie „Chemistrode” pozwalający na pobieranie próbek bezpośrednio z hodowli komórkowej i tworzenie z nich kropelek. Liu (Lab on a Chip, 2009, 9, 2153-2162) zmodyfikował ten układ w sposób pozwalający na pobieranie próbek z małych objętości. Sun (Lab Chip, 2010, 10, 2864-2868) zaprezentował zautomatyzowany system umożliwiający pobieranie próbek z probówek. We wszystkich technikach deponowania lub zaciągania małych próbek płynu ważnym problemem jest ograniczenie, a korzystnie wyeliminowanie, wprowadzania do układu pęcherzyków gazu. Dużym ograniczeniem wyżej wymienionych metod jest ich powolność, możliwość wystąpienia kontaminacji krzyżowej, oraz potrzeba uprzedniego wygenerowania kompozycji reagentów np. za pomocą pipety lub zautomatyzowanej stacji pipetującej.

Jedynym rozwiązaniem pozwalającym nad precyzyjną kontrolę składu kropli jest zautomatyzowane urządzenie zaprezentowane przez K. Churski i wsp. (Lab on a Chip, 2010, 10, 816-818), w którym jednocześnie w kilku równoległych mikrokanałach produkowane są krople na żądanie o określonej objętości, które następnie są łączone w różnych proporcjach i tworzą dużą kroplę o znanym składzie chemicznym. Niestety, kropla ta posiada znaczną objętość (>500 nL), która nie może być zmniejszona z powodu objętości martwej zaworów. Tak duża objętość wyklucza zastosowanie układu mikrofluidycznego w wielu aplikacjach, takich jak testy na pojedynczych komórkach czy reakcje na pojedynczych molekułach. Nie jest możliwe również przyspieszenie wyników detekcji, które uzyskujemy w przypadku bardzo małych kropel [Boedicker JQ I wsp. Lab Chip, 2008, 8,1265-1272].

W stanie techniki nie ma układu mikroprzepływowoego lub metody umożliwiającej szybkie dzielenie dużych kropel o znanym składzie, na populacje małych monodyspersyjnych kropel o objętości poniżej 10 nL. Natomiast w stanie techniki istnieje kilka metod rozdziału kropli w złączu typu T w układzie mikroprzepływowym, gdzie fazą ciągłą (zwilżającą ścianki kanałów) jest ciecz [ D. R. Link, S. L. Anna, D. A. Weitz, i H. A. Stone. Phys. Rev. Lett. 2004, 92, 4] [ J. Nie i R. T. Kennedy, Anal. Chem. 2010, 82, 7852-7856]. Za pomocą odpowiedniej geometrii możliwe jest rozerwanie kropli w stosunku odwrotnie proporcjonalnym do oporów przepływu w każdym z dwóch rozgałęzień złącza typu „T”. Jednakże, niekorzystną cechą tego rozwiązania jest fakt, iż początkowa kropla jest dzielona tylko na dwie jednakowe krople. Aby podzielić dużą kroplę na większą ilość kropel, należy zwielokrotnić liczbę złącz typu „T”. Takie rozwiązanie jest kłopotliwe w mikrofabrykacji i ma ograniczoną stabilność działania. Dla przykładu

PL 229 042 B1 podział kropli na 1000 mniejszych kropel wymaga stworzenia układu złożonego z 1000 równoległych kanałów, a wadliwe wykonanie lub zatamowanie przepływu w jednym z nich zaburza działanie całego urządzenia. Jak opisuje J. Clausell-Tormos i wsp. (Lab Chip, 2010, 10, 1302-1307) problematyczny jest już podział dużej kropli na osiem monodyspersyjnych kropel i operacja taka wymaga dodatkowych rozwiązań w celu stabilizacji ciśnień wewnątrz kanałów. Zastosowanie tego rozwiązania w celu podziału kropli na większą liczbę małych kropel, wydaje się być technologicznie niekorzystne.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym obejmujący etap:

a) doprowadzenia kropli przeznaczonej do podziału zawieszonej w cieczy nośnej do złącza mikroprzepływowego kanałem mikroprzepływowym oraz etap

b) rozerwania kropli przeznaczonej do podziału w złączu mikroprzepływowym na mniejsze krople za pomocą strugi cieczy rozcinającej, nie mieszającej się z cieczą, z której wykonana jest kropla przeznaczona do podziału, charakteryzuje się tym, że wspomniany etap a) doprowadzenia kropli przeznaczonej do podziału zawieszonej w cieczy nośnej do złącza mikroprzepływowego będącego złączem typu flow focusing kanałem mikroprzepływowym obejmuje przeprowadzenie kropli przeznaczonej do podziału przez zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego, przy czym:

i) długość zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego jest co najmniej równa najdłuższemu wymiarowi przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem, korzystnie co najmniej równa stukrotności tego wymiaru, a najkorzystniej co najmniej równa tysiąckrotności i tego wymiaru oraz ii) najdłuższy wymiar przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego jest od 2 do 5 razy mniejszy od najdłuższego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem, korzystnie od 2 do 3 razy mniejszy od tego wymiaru.

Korzystnie, iii) pole powierzchni przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego jest od 1 do 25 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem, korzystniej od 4 do 10 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem.

Korzystnie, iv) stosunek zmiany maksymalnego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego w związku z jego przewężeniem do długości kanału mikroprzepływowego, na której ta zmiana następuje, jest nie mniejszy niż 1,15, a nie większy niż 3,46, a korzystniej wynosi 2.

Szczególnie korzystnie, wspomniany zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego składa się z serii coraz węższych pododcinków, korzystnie od dwóch do dziesięciu pododcinków, przy czym dla każdych dwóch kolejnych pododcinków spełnione są warunki i) i ii) wskazane powyżej, a korzystniej także warunek iii) i/lub warunek iv) wskazane powyżej.

Korzystnie, wspomniane kanały mikroprzepływowe są kanałami o przekroju poprzecznym prostokątnym, kwadratowym lub okrągłym.

Korzystnie, wspomniana kropla przeznaczona do podziału ma objętość od 100 nL do 100 gL.

W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku, wspomniana kropla przeznaczona do podziału zostaje podzielona na co najmniej 100, korzystniej co najmniej 1000, jeszcze korzystniej co najmniej 10000, jeszcze korzystniej co najmniej 100000, a najkorzystniej co najmniej 1000000 mniejszych kropli.

W dalszym preferowanym przykładzie realizacji wynalazku, tworzy się sekwencję kropli przeznaczonych do podziału i powtarza się etapy a) i b) dla każdej kropli w takiej sekwencji.

Szczególnie korzystnie, zbiory mniejszych kropli otrzymane w wyniku podziału każdej kropli przeznaczonej do podziału we wspomnianej sekwencji odprowadza się do kanału odprowadzającego położonego za złączem mikroprzepływowym będącym złączem typu flow focusing i poszczególne zbiory mniejszych kropli oddziela się od siebie kroplami rozdzielającymi, wykonanymi z trzeciego płynu, nie mieszającego się z płynem, z którego wykonane są mniejsze krople, ani z cieczą nośną.

Korzystnie, wspomnianym trzecim płynem jest powietrze lub olej silikonowy, olej fluorowany, olej na bazie węglowodorów lub olej mineralny.

PL 229 042 B1

Korzystnie, stosunek prędkości przepływu strugi rozcinającej i prędkości przepływu kropel przeznaczonych do podziału wynosi od 1,5:1 do 3:1.

Korzystnie, krople przeznaczone do podziału zawierają surfaktant w ilości poniżej 1% wag., korzystnie poniżej 0,1% wag., zaś struga rozcinająca zawiera surfaktant w ilości powyżej 2% wag.

Wynalazek obejmuje także układ do dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym obejmujący złącze mikroprzepływowe oraz kanał mikroprzepływowy do doprowadzania kropli przeznaczonych do podziału do złącza mikroprzepływowego, charakteryzujący się tym, że wspomniany kanał mikroprzepływowy do doprowadzania kropli przeznaczonych do podziału do złącza mikroprzepływowego będącego złączem typu flow focusing obejmuje zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego, przy czym:

i) długość zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest co najmniej równa najdłuższemu wymiarowi przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem, korzystnie co najmniej równa stukrotności tego wymiaru, a najkorzystniej co najmniej równa tysiąckrotności tego wymiaru oraz ii) najdłuższy wymiar przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego jest od 2 do 5 razy mniejszy od najdłuższego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego przed przewężeniem, korzystnie od 2 do 3 razy mniejszy od tego wymiaru.

Szczególnie korzystnie, wspomniany zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego składa się z serii coraz węższych pododcinków, korzystnie od dwóch do dziesięciu pod- odcinków, przy czym dla każdych dwóch kolejnych pododcinków spełnione są warunki i) i ii) wskazane powyżej, a korzystnie także warunek iii) i/lub warunek iv) wskazane powyżej.

Szczególnie korzystnie, dodatkowo za wspomnianym złączem mikroprzepływowym będącym złączem typu flow focusing posiada kanał odprowadzający oraz boczny kanał łączący się ze wspomnianym kanałem odprowadzającym w złączu typu T, przy czym wspomniany boczny kanał służy do doprowadzania do wspomnianego złącza typu T, trzeciego płynu.

Rozwiązanie przedstawione w niniejszym zgłoszeniu umożliwia dzielenie kropel w złączu mikroprzepływowym, zwłaszcza w złączu typu flow focusing oraz grupowanie i separację nowopostałych kropel o objętości poniżej 10 mnl w odrębne populacje, tzw. „biblioteki kropel”. Zastosowanie modułu synchronicznie produkującego krople na żądanie złożone z trzeciego płynu niemieszającego się zarówno z fazą ciągłą jak i fazą kropelkową zapewnia fizyczne zabezpieczenie populacji małych kropel, przed wzajemnym wymieszaniem. Wykluczy to konieczność stosowania znaczników fluorescencyjnych lub innego typu. Alternatywnie urządzenie może służyć do kodowania istniejących bibliotek za pomocą związków fluorescencyjnych czy innych znaczników.

Urządzenie mikroprzepływowe umożliwiające dzielenie dużej (>100 nL) kropli na populację małych kropelek o objętości (<10 μL) zawiera co najmniej jedno przewężenie kanału oraz zwężony kanał o odpowiedniej długości w której mieści się cała duża kropla. Ponadto układ zawiera co najmniej jedno złącze mikroprzepływowe, korzystnie złącze typu flow focusing w którym następuje podział kropli, oraz - korzystnie - co najmniej jedno złącze typu T, w którym generowane są krople tzw. 'spacery' oddzielające populację małych kropelek i uniemożliwiające mieszanie się kropelek pochodzących z różnych subpopulacji i różniących się składem chemicznym. Krople te muszą być wykonane z płynu niemieszającego się ani z fazą kropelkową, ani z fazą ciągłą. Takim płynem może być gaz (np. powietrze, azot czy inny neutralny dla przebiegu reakcji gaz) lub ciecz np. olej silikonowy w układzie woda/olej perfluorowany.

PL 229 042 B1

Twórcom wynalazku udało się dzielić krople wytworzone wewnątrz układu mikroprzepływowego na liczne populacje monodyspersyjnych kropli o objętościach poniżej 10 nL. W metodzie według wynalazku, synchronizacja podziału kropli przy minimalnym zużyciu fazy ciągłej oraz tworzenie kropli oddzielające „biblioteki kropel” może zostać osiągnięta albo wyłącznie za pomocą ustalenia odpowiednich przesunięć między elektrycznymi sygnałami wywołującymi tworzenie kropli oraz ich dzielenie, albo poprzez sprzęgnięcie kontroli nad zaworami regulującymi przepływ przez układ z sygnałami informującymi o położeniu kropli w układzie.

Dalej, nieoczekiwanie okazało się, że układ wykonany zgodnie z wynalazkiem umożliwia przeprowadzenie enkapsulacji pojedynczych komórek, mikrokulek oraz innych makroobiektów mających znaczenie analityczne. Populacje kropel (<10 nL) oddzielone dużymi kroplami niemieszającego się płynu mogą zostać poddane inkubacji o czasie kontrolowanym od ułamków sekund do godzin. Co więcej, układ wykonany zgodnie z wynalazkiem umożliwia przeprowadzenie sekwencji pomiarów (np. fluorescencyjnych) na pojedynczej kropli, lub n a wybranej podgrupie kropli znajdujących się w układzie. Sekwencje pomiarów przesuniętych w czasie umożliwiają określenie kinetyki reakcji lub procesów zachodzących wewnątrz kropli. Alternatywnie populacje kropel mogą być poddane elektrokoalescencji w celu przywrócenia pierwotnej kropli o dużej objętości, w celu wykonania na niej złożonych operacji asymetrycznego podziału, koalescencji z innymi kroplami, pomiaru spektrofotometrycznego czy też innej operacji, która z przyczyn technicznych nie może być wykona na na kroplach o objętościach poniżej 10 μL.

Korzystne przykłady realizacji wynalazku

Korzystne przykłady realizacji wynalazku zostaną obecnie omówione w odniesieniu do załączonego rysunku, na którym:

Fig. 1 (A, B) przedstawia fotografię dwóch istotnych fragmentów przykładowego złącza typu flow focusing służącego do wysokowydajnego dzielenia kropel, zgodnie z przykładem 1, fig. 2 przedstawia fotografię innego przykładowego złącza typu flow focusing służącego do wysokowydajnego dzielenia kropel, zgodnie z przykładem 2, fig. 3 przedstawia fotografię złącza typu flow focusing nieodpowiedniego do wysokowydajnego dzielenia kropel (przykład porównawczy 3), fig. 4 przedstawia wykres ukazujący rozkłady wielkości kropel powstałych w złączach z fig. 1,2 i 3, fig. 5 przedstawia wykres ukazujący rozkład wielkości kropel powstałych w złączu z fig. 1 w zależności od stężenia surfaktantu, fig. 6 przedstawia wykres ukazujący rozkład wielkości kropel powstałych w złączu z fig. 1 w zależności od prędkości przepływu strugi oleju rozcinającej kroplę, fig. 7 przedstawia schemat mikroukładu według wynalazku wykorzystywanego do wysokowydajnego dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym typu flow focusing oraz separacji nowopowstałych kropel i tworzenia bibliotek kropel, fig. 8 przedstawia biblioteki kropel znajdujące się w wężyku, fig. 9 przedstawia schemat przykładowego układu służącego do generacji bibliotek kropel według wynalazku, zgodnie z przykładem 9, zaś fig. 10 przedstawia schemat przykładowego układu służącego do generacji bibliotek kropel według wynalazku, zgodnie z przykładem 10.

P r z y k ł a d 1

W korzystnym przykładzie realizacji, kropla znajdująca się w mikrokanale podlega podziałowi w złączu typu flow focusing po uprzednim wydłużeniu całej kropli. W przykładzie zobrazowanym schematycznie na fig. 1A kropla 1 znajdująca się w szerokim kanale 2 jest wprowadzana do zwężenia 3 i ulega wydłużeniu w wąskim kanale 4. Korzystnie cała kropla zostaje wydłużona w kanale 3 zanim osiągnie złącze flow focusing 7 przedstawione na schemacie 1B. Korzystnie wąski kanał 4 jest zbliżony wymiarami do złącza 7, ale jednocześnie jest on na tyle szeroki, że kropla 1 podczas wydłużania nie rozrywa się na dwie lub więcej kropel. Korzystnie wymiary wąskiego kanału 4 są od 2 do 5 razy mniejsze niż wymiary szerokiego kanału 1. Korzystnie, przekrój poprzeczny kanałów 2, 4 jest prostokątny, kwadratowy lub okrągły, przy czym najbardziej korzystny jest przekrój okrągły. Następnie zwężona kropla wpływa do kolejnego zwężenia 5, które jest zakończone złączem typu flow focusing 7. W złączu 7 kropla jest rozrywana za pomocą prostopadłych strug cieczy niemieszającej się 6 (np. olej parafinowy) zasilanych z jednego źródła. Znamienne jest, że nowopowstałe krople 8 są monodyspersyjne (CV <2%), mają objętość poniżej 10 nL i nie ulegają wzajemnej koalescencji. Krople są gromadzone w rozszerzającym się kanale 9. W korzystnym przykładzie zobrazowanym schematycznie na fig. 2 kropla 11 znajdująca

PL 229 042 B1 się w szerokim kanale 10 jest wprowadzana do zwężenia 12 i ulega podziałowi w złączu 14 bez uprzedniego wydłużania całej kropli. Korzystnie, przekrój poprzeczny kanałów 10, 12 jest prostokątny, kwadratowy lub okrągły, przy czym najbardziej korzystny jest przekrój okrągły. W złączu 14 kropla jest rozrywana za pomocą prostopadłych strug cieczy niemieszającej się 13 (np. olej parafinowy) zasilanych z jednego źródła. Znamienne jest, że nowopowstałe krople 15 są monodyspersyjne (CV <2,5%), mają objętość poniżej 10 nL i nie ulegają wzajemnej koalescencji. Krople są gromadzone w rozszerzającym się kanale 16.

P r z y k ł a d 3 (przykład porównawczy)

W niekorzystnym przykładzie zobrazowanym schematycznie na fig. 3 kropla 18 znajdująca się w szerokim kanale 17 jest i bezpośrednio ulega podziałowi w złączu 21 bez uprzedniego wydłużania całej kropli lub jej części 19. W złączu kropla jest rozrywana za pomocą prostopadłych strug cieczy niemieszającej się 20 (np. olej parafinowy) zasilanych z jednego źródła. Znamienne jest, że nowopowstałe krople 22 nie są monodyspersyjne (CV> 5%), mają objętość poniżej 10 nL i nie ulegają wzajemnej koalescencji. Krople są gromadzone w rozszerzającym się kanale 23.

P r z y k ł a d 4

W korzystnym przykładzie realizacji dzielenia kropel w złączu możliwe jest uzyskanie wysoce monodyspersyjnych kropel o objętościach poniżej 10 nL. Fig. 4 przedstawia wykres rozkładu wielkości kropel w zależności od użytej geometrii złącza. Korzystnie, kropla ulega całkowitemu (fig. 1) lub częściowemu (fig. 2) zwężeniu, zanim ulegnie podziałowi w złączu. Zastosowanie zwężenie powoduje zbliżenie warunków podziału kropli do podziału strugi ciągłej cieczy w złączu typu flow focusing. Zwężenie minimalizuje przepływ fazy ciągłej w przestrzeniach pomiędzy kroplą i kanałem - w szczególności w rogach kanału o przekroju kwadratowym, których przestrzeń nie jest zajęta przez kroplę. Najbardziej korzystne jest zastosowanie układu, w którym cała kropla ulega wydłużeniu - pozwala to na otrzymanie monodyspersyjnej populacji kropel o współczynniku zmienności (CV) objętości poniżej 2%. W układzie gdzie cała kropla jest wydłużona i zachowuje podobną krzywiznę niezależnie od stopnia zaawansowania podziału, ciśnienie Laplace'a pozostaje na stałym poziomie co skutkuje stabilnym procesem generacji kropel o małej objętości. Równie korzystne jest zastosowanie geometrii z krótkim przewężeniem w której tylko część kropli ulega wydłużeniu - CV dla takie geometrii wynosi mniej niż 2,5%. Niekorzystne natomiast jest stosowanie geometrii bez przewężenia (fig. 3) - populacja otrzymanych kropel jest polidyspersyjna i charakteryzuje się CV objętości większym niż 10%.

P r z y k ł a d 5

W korzystnym przykładzie realizacji dzielenia kropel w złączu możliwe jest uzyskanie wysoce monodyspersyjnych kropel o objętościach poniżej 10 nL. Fig. 5 przedstawia wykres rozkładu wielkości kropel w zależności od stężenia surfaktantu w fazie kropelkowej. Nieoczekiwanie okazało się, że korzystne rozkłady wielkości kropel uzyskuje się dla niskich stężeń surfaktantu, znacznie poniżej 1%, najkorzystniej poniżej 0,1%. Duże stężenie surfaktantu powoduje niestabilny podział kropli w jej początkowej i końcowej części. Jednakże, aby zapobiec koalescencji nowopowstałych kropel stężenie surfaktantu powinno być wysokie (powyżej 2%) - korzystnie jest to realizowane przez zwiększenie stężenia surfaktantu w strudze rozcinającej kroplę.

P r z y k ł a d 6

W korzystnym przykładzie realizacji dzielenia kropel w złączu z długim przewężeniem (fig. 1B) możliwe jest uzyskanie wysoce monodyspersyjnych kropel o objętościach poniżej 10 nL. Fig. 6 przedstawia wykres zależności średniej wielkości kropel powstałych w wyniku podziału w zależności od prędkości przepływu strugi rozcinającej. Najbardziej korzystny podział zachodzi, jeżeli zależność pomiędzy prędkością przepływu strugi rozcinającej 6 a prędkością przepływu dużych kropel 1 wynosi od 1,5:1 do 3:1. W ukazanym przykładzie prędkość fazy kroplowej wynosiła 2 ml/h. Stosowanie niskich prędkości przepływu strugi rozcinającej skutkuje małą liczebnością populacji i stosunkowo dużą objętością nowo powstałych kropel. Stosowanie dużych prędkości przepływu skutkuje nadmierną ilością fazy ciągłej oraz niższą częstotliwością generacji kropel.

P r z y k ł a d 7

W korzystnym przykładzie realizacji możliwe jest dzielenie kropel w złączu mikroprzepływowym typu flow focusing oraz grupowanie i separacja nowopostałych kropel o objętości poniżej 10 nl w odrębne populacje, tzw. „biblioteki kropel”. Zgodnie z fig. 7, duża kropla 24 jest dzielona w złączu 25 typu flow focusing i następnie nowopowstałe krople są transportowane do wężyka 26 o przekroju okrągłym. W układzie znajduję się boczny kanał 27, z którego produkowana jest kropla „na żądanie” 28 złożona

PL 229 042 B1 z trzeciego płynu, np. powietrza, niemieszającego się zarówno z fazą ciągłą jak i fazą kropelkową, co zapewnia fizyczne zabezpieczenie populacji małych kropel przed wzajemnym wymieszaniem. Zautomatyzowanie procesu produkcji kropel rozdzielających biblioteki kropli pozwala na uniknięcie mieszania się elementów sąsiednich bibliotek. Dodatkowo, kanały poprzeczne w tym złączu zasilane są olejem, którego przepływ jest kontrolowany przez zewnętrzny zawór. Pozwala to na włączanie i przepływu oleju w czasie podziału kropli 24 i wyłączanie go, gdy kropla nie przepływa przez złącze. Pozwala to na uniknięcie nadmiaru fazy ciągłej w bibliotece kropel, co jest korzystne ze względu na jej dalszą inkubację, transport czy detekcję wyników ewentualnej reakcji. Zautomatyzowany proces generacji jednej biblioteki trwa 5 sek., po czym dzielona jest kolejna kropla 29, która może mieć inną kompozycję.

P r z y k ł a d 8

W korzystnym przykładzie realizacji, zgodnie z fig. 8, możliwa jest inkubacja i transport bibliotek kropel 31 w wężyku 30 o przekroju poprzecznym okrągłym (alternatywnie w kanale o przekroju okrągłym). Korzystnie, biblioteki 31 są rozseparowane za pomocą pęcherzyków powietrza 32 lub kropli innego płynu ,niemieszającego się zarówno z fazą ciągłą jak i fazą kroplową.

P r z y k ł a d 9

Fig. 9: kaseta mikroprzepływowa 101 integrująca zestaw złącz T 102, do których doprowadzona jest ciecz ciągła portami 103 oraz zestaw płynów dostarczanych portami 104, 105, 106, z których będą tworzone krople, złącze 107 umożliwiające połączenie kropli wytworzonych w złączach T, odcinek mieszający 108, oraz kanał doprowadzający 110 do drugiego złącza mikroprzepływowego 113, w którym krople rozrywane są na mniejsze, wpadają do kanału wylotowego 111, na którym umieszczone jest dodatkowe złącze 115. Złącze 115 umożliwia tworzenie kropli (lub pęcherzy) dodatkowego płynu dostarczonego przez port 114, w sposób, który umożliwia rozdzielenie rodzin (bibliotek) małych kropelek.

P r z y k ł a d 10

Fig. 10: kanał doprowadzający krople 209 do złącza mikroprzepływowego 204 podzielony jest na sekcje 201, 202, 203 w taki sposób, aby stosunek szerokości (i wysokości) przed przewężeniem (np. 207) i po przewężeniu był nie większy niż 3. Korzystnie kąt 206 tworzony przez ścianę (lub podłogę/sufit) kanału w przewężeniu z osią kanału jest większy niż 30°, korzystnie wynosi 45°, oraz jest mniejszy niż 60°. Korzystnie, ostatni segment 203 kanału doprowadzającego mieści całą kroplę 209. Korzystnie, ostatni segment jest szerszy od złącza mikroprzepływowego 204 najwyżej trójkrotnie, a przewężenie 208 ma ściany tworzące z osią sekcji 203 kąt mniejszy niż 60°. Złącze 204 umożliwia rozerwanie kropli 209 na bibliotekę małych kropelek 210 wpadających do kanału wylotowego 205.

We wskazanych wyżej korzystnych przykładach wykonania wynalazku jako złącze mikroprzepływowe zastosowano złącze typu flow focusing. Alterantywnie można jednak zastosować inne znane w stanie techniki złącza mikroprzepływowe, jak na przykład złącze typu T, lub dowolne inne złącze łączące przepływ kropli 209 i nie mieszającego się z nią płynu ciągłego.

Claims

1. Sposób dzielenia kropel (1) w złączu mikroprzepływowym (7) obejmujący etap:

a) doprowadzenia kropli (1) przeznaczonej do podziału zawieszonej w cieczy nośnej do złącza mikroprzepływowego (7) kanałem mikroprzepływowym (2, 4,5) oraz etap

b) rozerwania kropli (1) przeznaczonej do podziału w złączu mikroprzepływowym (7) na mniejsze krople (8) za pomocą strugi cieczy rozcinającej (6), nie mieszającej się z cieczą, z której wykonana jest kropla (1) przeznaczona do podziału, znamienny tym, że wspomniany etap a) doprowadzenia kropli (1) przeznaczonej do podziału zawieszonej w cieczy nośnej do złącza mikroprzepływowego (7) będącego złączem typu flow focusing kanałem mikroprzepływowym (2, 4, 5) obejmuje przeprowadzenie kropli (1) przeznaczonej do podziału przez zwężony odcinek (4, 5) kanału mikroprzepływowego, przy czym:

i. długość zwężonego odcinka (4, 5) kanału mikroprzepływowego (2, 4, 5) jest co najmniej równa najdłuższemu wymiarowi przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie co najmniej równa stukrotności tego wymiaru, a najkorzystniej co najmniej równa tysiąckrotności tego wymiaru oraz

PL 229 042 B1 ii. najdłuższy wymiar przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest od 2 do 5 razy mniejszy od najdłuższego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie od 2 do 3 razy mniejszy od tego wymiaru.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że:

iii. pole powierzchni przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest od 1 do 25 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie od 4 do 10 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że:

iv. stosunek zmiany maksymalnego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2, 4, 5) w związku z jego przewężeniem do długości kanału mikroprzepływowego, na której ta zmiana następuje, jest nie mniejszy niż 1,15, a nie większy niż 3,46, a korzystnie wynosi 2.

4. Sposób według zastrz. 1,2 albo 3, znamienny tym, że wspomniany zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego składa się z serii coraz węższych pododcinków, korzystnie od dwóch do dziesięciu pododcinków, przy czym dla każdych dwóch kolejnych pododcinków spełnione są warunki i) i ii) wskazane w zastrzeżeniu 1, a korzystnie także warunek iii) wskazany w zastrzeżeniu 2 i/lub warunek iv) wskazany w zastrzeżeniu 3.

5. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-4, znamienny tym, że wspomniane kanały mikroprzepływowe (2, 4, 5) są kanałami o przekroju poprzecznym prostokątnym, kwadratowym lub okrągłym.

6. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-5, znamienny tym, że wspomniana kropla (1) przeznaczona do podziału ma objętość od 100 nL do 100 pl.

7. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-6, znamienny tym, że wspomniana kropla (1) przeznaczona do podziału zostaje podzielona na co najmniej 100, korzystniej co najmniej 1000, jeszcze korzystniej co najmniej 10000, jeszcze korzystniej co najmniej 100000, a najkorzystniej co najmniej 1000000 mniejszych kropli (8).

8. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-7, znamienny tym, że tworzy się sekwencję kropli (1) przeznaczonych do podziału i powtarza się etapy a) i b) dla każdej kropli (1) w takiej sekwencji.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że zbiory mniejszych kropli (8) otrzymane w wyniku podziału każdej kropli (1) przeznaczonej do podziału we wspomnianej sekwencji odprowadza się do kanału odprowadzającego (26) położonego za złączem mikroprzepływowym (7) będącym złączem typu flow focusing i poszczególne zbiory mniejszych kropli (8) oddziela się od siebie kroplami rozdzielającymi (28), wykonanymi z trzeciego płynu, nie mieszającego się z płynem, z którego wykonane są mniejsze krople, ani z cieczą nośną.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomnianym trzecim płynem jest powietrze lub olej silikonowy, olej fluorowany, olej na bazie węglowodorów lub olej mineralny.

11. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-10, znamienny tym, że stosunek prędkości przepływu strugi rozcinającej (6) i prędkości przepływu kropel (1) przeznaczonych do podziału wynosi od 1,5:1 do 3:1.

12. Sposób według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń 1-11, znamienny tym, że krople (1) przeznaczone do podziału zawierają surfaktant w ilości poniżej 1% wag., korzystnie poniżej 0,1% wag, zaś struga rozcinająca (6) zawiera surfaktant w ilości powyżej 2% wag.

13. Układ do dzielenia kropel w złączu mikroprzepływowym obejmujący złącze mikroprzepływowe (7) oraz kanał mikroprzepływowy (2, 4, 5) do doprowadzania kropli (1) przeznaczonych do podziału do złącza mikroprzepływowego (7), znamienny tym, że wspomniany kanał mikroprzepływowy (2, 4, 5) do doprowadzania kropli (1) przeznaczonych do podziału do złącza mikroprzepływowego (7) będącego złączem typu flow focusing obejmuje zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego (4, 5), przy czym:

i) długość zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest co najmniej równa najdłuższemu wymiarowi przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie co najmniej równa stukrotności tego wymiaru, a najkorzystniej co najmniej równa tysiąckrotności tego wymiaru oraz

PL 229 042 B1 ii) najdłuższy wymiar przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest od 2 do 5 razy mniejszy od najdłuższego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie od 2 do 3 razy mniejszy od tego wymiaru.

14. Układ według zastrz. 13, znamienny tym, że:

iii) pole powierzchni przekroju poprzecznego zwężonego odcinka kanału mikroprzepływowego (4, 5) jest od 1 do 25 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem, korzystnie od 4 do 10 razy mniejsze od pola powierzchni przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2) przed przewężeniem.

15. Układ według zastrz. 14, znamienny tym, że:

iv) stosunek zmiany maksymalnego wymiaru przekroju poprzecznego kanału mikroprzepływowego (2, 4, 5) w związku z jego przewężeniem do długości kanału mikroprzepływowego, na której ta zmiana następuje, jest nie mniejszy niż 1,15, a nie większy niż 3,46, a korzystnie wynosi 2.

16. Układ według zastrz. 14 albo 15, znamienny tym, że wspomniany zwężony odcinek kanału mikroprzepływowego składa się z serii coraz węższych pododcinków, korzystnie od dwóch do dziesięciu pododcinków, przy czym dla każdych dwóch kolejnych pododcinków spełnione są warunki i) i ii) wskazane w zastrzeżeniu 14, a korzystnie także warunek iii) wskazany w zastrzeżeniu 14 i/lub warunek iv) wskazany w zastrzeżeniu 15.

17. Układ według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń od 13 do 16, znamienny tym, że wspomniane kanały mikroprzepływowe (2, 4, 5) są kanałami o przekroju poprzecznym prostokątnym, kwadratowym lub okrągłym.

18. Układ według dowolnego z poprzedzających zastrzeżeń od 13 do 17, znamienny tym, że dodatkowo za wspomnianym złączem mikroprzepływowym (7) będącym złączem typu flow focusing posiada kanał odprowadzający (26) oraz boczny kanał (27), łączący się ze wspomnianym kanałem odprowadzającym (26) w złączu typu T, przy czym wspomniany boczny kanał (27) służy do doprowadzania do wspomnianego złącza typu T, trzeciego płynu.