PL227134B1 - Zastosowanie pinafide i chaetochromin - Google Patents

Zastosowanie pinafide i chaetochromin

Info

Publication number
PL227134B1
PL227134B1 PL404948A PL40494813A PL227134B1 PL 227134 B1 PL227134 B1 PL 227134B1 PL 404948 A PL404948 A PL 404948A PL 40494813 A PL40494813 A PL 40494813A PL 227134 B1 PL227134 B1 PL 227134B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
tuberculosis
ligase
compound
compounds
dependent
Prior art date
Application number
PL404948A
Other languages
English (en)
Other versions
PL404948A1 (pl
Inventor
Małgorzata Korycka-Machała
Aneta Kuroń
Aneta Kuron
Marcin Nowosielski
Anna Rumijowska-Galewicz
Jarosław Dziadek
Original Assignee
Inst Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk filed Critical Inst Biologii Medycznej Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL404948A priority Critical patent/PL227134B1/pl
Publication of PL404948A1 publication Critical patent/PL404948A1/pl
Publication of PL227134B1 publication Critical patent/PL227134B1/pl

Links

Classifications

    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie pinafide i chaetochromin w leczeniu zakażeń bakteryjnych, w szczególności wywołanych przez szczepy z rodzaju Mycobacterium oraz E. coli.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie pinafide i chaetochromin w leczeniu zakażeń bakteryjnych.
Gruźlica (TB) towarzyszy ludzkości już od tysięcy lat i stanowi poważny ogólnoświatowy problem zdrowotny. Pomimo że znane są już skuteczne metody leczenia gruźlicy, wykorzystujące strategię opartą o leczenie za pomocą krótkich kursów chemioterapii, to w dalszym ciągu obserwuje się wzrost zachorowań na tę chorobę. Związane jest to między innymi z pojawieniem się w latach 90-tych gruźlicy opornej na stosowane leki, a zwłaszcza gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB, ang. multidrag resistant tuberculosis) oraz zjawisko występowania koinfekcji HIV-TB, co znacznie zwiększa śmiertelność i utrudnia leczenie. Dodatkowo, w ostatnich latach pojawił się kolejny problem związany z rozszerzoną opornością prątków wielolekoopornych, czyli tzw. XDR-TB (ang. extensively drug resistant tuberculosis) (Faustini A. i wsp., Risk factors for multidrug resistant tuberculosis in Europe: a systematic review. Thorax, 2006; 61: 158-163; Kołaczkowska M., Standardy leczenia gruźlicy. Przewodnik lekarza, 2006; 4: 68-77; Augustynowicz-Kopeć E. i Zwolska Z., Gruźlica wywołana prątkami o oporności XDR w Polsce. Badania mikrobiologiczne i molekularne. Pneumonologia i Alergologia Polska, 2007; 75: 32-39). Szacuje się, że jedna trzecia populacji ludzkiej zakażona jest prątkiem gruźlicy (M. tuberculosis). Dane Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) pokazują, że każdego roku 10 milionów ludzi zostaje zakażonych gruźlicą, a 3 miliony na nią umiera. WHO przewiduje, że do 2015 roku niemal miliard ludzi zakazi się prątkiem gruźlicy, około 200 milionów zachoruje, a 35 milionów umrze z powodu gruźlicy (Augustynowicz-Kopeć E., Zwolska Z., Gruźlica wywołana prątkami o oporności XDR w Polsce. Badania mikrobiologiczne i molekularne. Pneumonologia i Alergologia Polska, 2007; 75: 32-39; Augustynowicz-Kopeć E., Zwolska Z., Gruźlica w Europie i w Polsce - nowe rodziny molekularne i nowe wzory oporności. Przegląd epidemiologiczny, 2008; 62: 113-121; World Health Organization. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report. WHO report Geneva 2009. WHO/HTM/TB/ 2009.426; World Health Organization. Multidrug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB): 2010 global report on surveillance and response. WHO report Geneva 2010. WHO/HTM/TB/ 2010.3).
Wszystko to skłania badaczy do prowadzenia wielokierunkowych badań genetycznych i molekularnych bakterii z rodzaju Mycobacterium, w tym również badań mechanizmów oporności. Celem prowadzenia takich badań jest poszukiwanie nowych, skutecznych leków, nowych, udoskonalonych szczepionek, czy nowych, kojarzonych sposobów leczenia, ale także nowych, miejsc docelowych dla tuberkulostatyków (Sharbati-Tehrani S. i wsp., The porin MspA from Mycobacterium smegmatis improves growth of Mycobacterium bovis BCG. International J. Med. Microbiol., 2004; 294: 235-245).
Obecnie wykorzystuje się terapię opartą o skojarzone stosowanie czterech leków przeciwprątkowych o różnych mechanizmach działania.
Do powszechnie stosowanych tuberkulostatyków, w leczeniu gruźlicy lekowrażliwej, zalicza się leki takie jak:
• Rifampicyna (RMP) to półsyntetyczny antybiotyk z grupy rifamycyn, działający na wszystkie populacje prątków, zarówno komórki rosnące, jak i w fazie latencji. Ma szerokie spektrum działania.
• Izoniazyd (INH) jest pochodną kwasu izonikotynowego, podawany jest w postaci proleku, który ulega aktywacji w komórkach mykobakterii. Jest bakteriobójczy głównie dla komórek rosnących, działa wybiórczo.
• Pirazynamid (PZA) to pochodna nikotynamidu, podawana w postaci proleku, aktywowanego w wątrobie. Działa przede wszystkim wyjaławiająco na prątki nierosnące, znajdujące się w makrofagach.
• Etambutol (EMB) to syntetyczny lek o działaniu bakteriostatycznym. Rzadko występuje pierwotna oporność na ten lek, dlatego często stosuje się go z innymi w celu zapobieżenia powstawania oporności.
• Streptomycyna (SM) to antybiotyk aminoglikozydowy o działaniu bakteriobójczym w stosunku do bakteri Gram-ujemnych, wyjątkowo działa na namnażające się Gram-dodatnie komórki prątków.
Jednak leczenie gruźlicy jest długotrwałe, a zarazem kosztowne i obarczone efektami ubocznymi, szczególnie w przypadku gruźlicy wielolekoopornej, dlatego też istnieje pilna potrzeba poszukiwania nowych miejsc docelowych dla tuberkulostatyków, oraz nowych, efektywnych leków przeciwgruPL 227 134 B1 źliczych, których mechanizm działania na komórki prątków będzie inny niż dotychczas stosowanych (Matsumoto M. i wsp. OPC-67683, a nitro-dihydroimidazooxazole derivative with promising action against tuberculosis in vitro and in mice. Public Library of Science Medicine, 2006; 3: 2131-2144).
Nowych potencjalnych leków poszukuje się wśród związków chemicznych, będących inhibitorami metabolitów uczestniczących w biosyntezie ściany komórkowej, metabolizmie lipidów i węglowodanów lub też hamujących działanie enzymów biorących udział w podstawowych, zapewniających przeżycie procesach komórkowych. Wszystkie enzymy specyficzne dla bakterii i niezbędne dla ich funkcjonowania mogą być rozważane jako tarcze dla leków. Obiecującym celem stają się więc NAD+zależne ligazy DNA.
Ligazy DNA są enzymami katalizującymi powstawanie wiązań fosfodiestrowych w czasie łączenia jedno- lub dwuniciowych pęknięć w DNA, powstających na drodze fizjologicznej, lub na skutek działania czynnika mutagennego. Do przeprowadzenia reakcji ligacji niezbędna jest adenylacja enzymu przy wykorzystaniu NAD+ lub ATP jako donora grupy adenylowej. Komórki eukariotyczne posiadają tylko ligazy zależne od ATP (m.in. ligaza I, która jest odpowiedzialna za łączenie fragmentów Okazaki podczas replikacji DNA). W komórkach bakteryjnych odpowiednikiem eukariotycznej ligazy I jest ligaza zależna od NAD+ (LigA). Jest ona unikatowa dla bakterii, wymaga specyficznego kofaktora oraz odgrywa fundamentalną rolę w licznych procesach metabolizmu DNA, włączając proces replikacji, rekombinacji, czy naprawy DNA. Z danych literaturowych wynika, że jest ona podstawową ligazą, niezbędną dla prawidłowego funkcjonowania i przeżywalności komórek bakteryjnych (Wilkinson A. i wsp., Bacterial DNA ligases. Mol. Microbiol., 2001, 40:1241-1281; Sassetti C.M. i wsp., Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol., 2003, 48:77-84; Gong C. i wsp., Biochemical and genetic analysis of the four DNA ligases of Mycobacteria. J. Biol. Chem. 2004, 279:20594-20606). Genom człowieka nie koduje ligazy zależnej od NAD+, można zatem przypuszczać, że enzym ten może być tarczą dla leków przeciwbakteryjnych, specyficznie eliminujących bakterie z organizmu, w tym zakażeń spowodowanych przez najgroźniejsze bakteryjne patogeny człowieka, np. M. tuberculosis.
Otrzymane przez Twórców niniejszego wynalazku wyniki potwierdziły użyteczność ligazy A jako miejsca docelowego dla nowych leków przeciwgruźliczych, gdyż jest ona niezbędna dla przeżycia komórek, a ligazy ATP-zależne nie są w stanie zastąpić jej nadrzędnej funkcji w komórce (KoryckaMachała M. i wsp., Evaluation of NAD+-dependent DNA ligase of mycobacteria as a potential target for antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother., 2007; 51: 2888-2897).
W badaniach nad ligazami opisano wiele inhibitorów hamujących ATP-zależne ligazy eukariotyczne, stanowiące potencjalną tarczę w hamowaniu nowotworów. W przypadku ligaz prokariotycznych, związków oddziałujących z nimi specyficznie jest niewiele (Dwivedi N. i wsp., NAD+-dependent DNA ligases: a novel target waiting for the right inhibitor. Med. Res. Rev. 2008, 28:545-568). Scharakteryzowane inhibitory podzielono ogólnie na 3 grupy:
1. Alkaloidy i ich pochodne: do tej grupy zaliczyć można analogi quinoliny (w tym chlorokinę [lek przeciwmalaryczny] i jej pochodne) oraz kinakrinę. Jednak badania Ciarrocchi i wsp. (Specific inhibition of the eubacterial DNA ligases by arylamino compounds, Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 43:2766-2772), wykazały oddziaływania tych związków również na ligazy eukariotyczne.
2. Pirydochromanony i ich pochodne: Brotz-Oesterhelt H. i wsp., (Specific and potent inhibition of NAD+-dependent ligase by pyridochromanones. J. Biol. Chem., 2003, 278:39435-39442), scharakteryzowali tę grupę związków jako inhibitory działające zarówno na Gram-ujemne (E. coli), jak i Gramdodatnie (S. pneumoniae) bakterie i nie wpływające na ATP-zależne ligazy eukariotyczne (na przykładzie ludzkiej ligazy I). Związki te wykazują również specyficzność w stosunku do ligaz prokariotycznych, gdyż ich mechanizm opiera się na współzawodnictwie z bakteryjnym kofaktorem NAD+ o miejsce wiązania w obrębie enzymu.
3. Związki typu ureidy glikozylowe zidentyfikowane na podstawie struktury krystalicznej domeny adenylacyjnej ligazy A M. tuberculosis (Srivastava S.K., i wsp., NAD+-dependent DNA ligase (Rv3014c) from Mycobacterium tuberculosis. Crystal structure of the adenylation domain and identification of novel inhibitors. J. Biol. Chem., 2005, 280:30273-30281). Pochodne tych związków naśladują oddziaływanie NAD+ z enzymem.
W 2011 r. grupa Mills i wsp. (Mills S.D. i wsp., Novel bacterial NAD+-dependent DNA ligase inhibitors with broad-spectrum activity and antibacterial efficacy in vivo. Antimicrob. Agents Chemother., Mar. 2011, 1088-1096) scharakteryzowała nową grupę związków - analogi adenozyny jako inhibitory
PL 227 134 B1 ligazy A E. coli, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, S. pneumoniae oraz Staphylococcus aureus.
Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie związków wybranych z grupy zawierającej związek o wzorze 1 (K-2; pinafide):
oraz związek o wzorze 2 (M-2; chaetochromin):
OH OH O
OH OH O do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania zakażeniom Mycobacterium tuberculosis.
Wirtualny screening na modelu NAD+-zależnej ligazy A pozwolił na zidentyfikowanie grupy związków, które stanowią potencjalne inhibitory tego enzymu.
Przedmiot wynalazku w przykładzie wykonania uwidoczniono na rysunku, na którym na fig. 1 przedstawiono wpływ związku K-2 na ligazy, na fig. 2 przedstawiono wpływ związku M-2 na ligazy, na fig. 3 przedstawiono wyniki testu z użyciem AlamarBlue (AB) in vivo obrazujące wpływ różnych związków na przeżywalność szczepów bakteryjnych.
Procedura selekcji związków
Selekcji związków do badań in vitro dokonano w oparciu o wirtualne wysokoprzepustowe badania przesiewowe (ang. virtual High Throughput Screening vHTS). Procedura składała się z czterech etapów, przy czym priorytetem było wytypowanie związku aktywnego o szkielecie nowym, odmiennym od inhibitorów LigA M. tuberculosis już opisanych w literaturze. Ze względu na potencjalne wykorzystanie na szeroką skalę, drugim z przyjętych kryteriów była dostępność związku.
W pierwszym etapie, z ogólnodostępnej bazy National Health Institute (USA), zawierającej około 250 000 substancji pochodzenia organicznego, jak i syntetycznego, wyselekcjonowano podbazę około 12000 związków. Filtrowanie przeprowadzono na podstawie kryterium podobieństwa strukturalnego (Tanimoto index = 70%) do znanych związków aktywnych, a także samego kofaktora NAD+. Przyjęcie kryterium podobieństwa na poziomie 70% w swoim założeniu miało na celu wyłonienie zupełnie nowych substancji aktywnych przy częściowym wykorzystaniu informacji już istniejących. Podkreślić należy, iż dwie substancje chemiczne o współczynniku podobieństwa strukturalnego rzędu 90% i wyższym mogą przejawiać diametralnie odmienne właściwości chemiczne i fizyczne. W przypadku aktywności biologicznej różnice rzędu 1% mogą stanowić o skuteczności związku lub jej braku.
Wyłonioną podbazę 12 000 związków uzupełniono o związki z podbazy NCI Diversity Set II. W etapie drugim wybrano strukturę receptora.
W przypadku LigA M. tuberculosis brak jest kompletnej struktury krystalograficznej. Pod numerem 1ZAU w największej ogólnodostępnej bazie krystalograficznej białek (Protein Data Bank - PDB) można znaleźć strukturę domeny adenylacyjnej Lig A M. tuberculosis. Z uwagi jednak na dodatkowe
PL 227 134 B1 zaangażowanie domeny I w proces wiązania kofaktora, a także obszerne zmiany konformacyjne jakim podlega LigA (Gajiwala K.S. i Pinko, C., Structural rearrangement accompanying NAD+ synthesis within a bacterial DNA ligase crystal. Structure, 2004, 12:1449-59), zadecydowano, iż dostępna struktura może nie być wystarczająca. Dlatego też, podjęto decyzję o dodatkowej konstrukcji modelu homologicznego LigA M. tuberculosis w oparciu o znacznie lepiej scharakteryzowaną strukturę LigA z T. filiformis. Procedurę powtórzono dla białka w konformacji „otwartej” (kod PDB: 1TAE) jak i białka w konformacji „zamkniętej” (kod PDB: 1TA8). Daje to łącznie 3 różne struktury do jakich dokowano. Tak dobrana strategia w ocenie autorów zwiększała szanse wyłonienia nowej substancji aktywnej.
W etapie trzecim przeprowadzono dokowania.
W tym celu wykorzystane zostało oprogramowanie AutoDock ver. 4.2, (Morris, G.M. i wsp., Autodock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexiblity. J. Comp. Chem., 2009, 16, 2785-2791, licencja GPL), a także zestaw autorskich skryptów do automatyzacji całej procedury.
W etapie czwartym dokonano oceny uzyskanych wyników oraz wytypowano substancje do badań in vitro. Ocena wyników dokowań jest zazwyczaj procesem trudnym oraz czasochłonnym, jako że funkcje oceniające (ang. scoring functions) zaimplementowane w programie cechuje niska dokładność. Zmusza to do poszukiwań rozwiązań alternatywnych. Jednocześnie, pomimo istniejącego szeregu opracowań literaturowych, brak jest konkretnej metodologii uznanej za wiodącą. W opisywanym przypadku selekcji dokonano w dwóch etapach.
W etapie pierwszym wyselekcjonowano 10% wyników o najwyższych wartościach przypisanych przez program. Następnie, porównano listy otrzymane z różnych serii dokowań. Związki powtarzające się na każdej z list poddano ocenie wizualnej. Jako kryteria wyboru przyjęto: ulokowanie w kieszeni aktywnej, adekwatność kontaktów ligand-białko zaproponowanych przez program.
Łącznie wyselekcjonowano 20 związków do badań in vitro.
W kontekście zgłoszenia patentowego na szczególną uwagę zasługuje fakt, iż wyłonione substancje aktywne posiadają szkielet diametralnie odmienny od inhibitorów LigA M. tuberculosis opisanych w literaturze i nie są ich prostymi modyfikacjami.
Do badania skuteczności potencjalnych inhibitorów dla NAD+-zależnej ligazy DNA w leczeniu zakażeń bakteryjnych prątkami M. tuberculosis zastosowano opracowany w Pracowni Genetyki i Fizjologii Mycobacterium sposób przedstawiony w zgłoszeniu patentowym P 401634.
Powyższy sposób oparty jest o rekombinowane białko NAD+-zależnej ligazy M. tuberculosis, komercyjnie dostępne białko ATP-zależnej Ligazy T4 oraz urządzenie firmy Applied Biosystems Genetic Analyzer 3500, co stwarza możliwość szybkiej selekcji specyficznych inhibitorów NAD+-zależnych, lecz nie ATP-zależnych ligaz, będących potencjalnie związkami o aktywności przeciwbakteryjnej.
Do testu wykorzystuje się komercyjnie dostępny enzym NAD+-zależną ligazę LigA z E. coli (Invitrogen), ATP-zależną ligazę faga T4 (Fermentas), oraz oczyszczone rekombinowane białko NAD+zależnej ligazy LigA M. tuberculosis.
Białko LigA z M. tuberculosis poddano ekspresji w komórkach E. coli i oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa na kolumnie ze złożem niklowym, a następnie zatężano do określonego stężenia.
W reakcji ligacji wykorzystano znakowaną fluorescencyjnie (TAMRA) na 5' końcu sondę DNA o wielkości 40 par zasad z pęknięciem pomiędzy 18 a 19 nukleotydem na jednej nici DNA. Ligaza powoduje łączenie pęknięcia, co w efekcie daje produkt ligacji o wielkości 40 par zasad. Przebieg reakcji przedstawiono na poniższym schemacie.
Tamra \
OH P 3’
5’
- 18 bp
................ 40 bp (Ligacja i analiza na sekwenatorze
Produkt ligacji
PL 227 134 B1
Reakcję ligacji prowadzi się w obecności badanego związku w różnym zakresie stężeń, w objętości 10 μ|. Do mieszaniny ligacyjnej dodaje się sondę i bufor do reakcji w ilości po 1 μΐ oraz oczyszczone, rekombinowane białko LigA z Mtb w stężeniu 8,7 ng/pl. Reakcję prowadzi się przez godzinę w temperaturze 16°C.
Jako kontrolę stosuje się białko LigA E. coli (1 U/μΐ) oraz Lig T4 (2,5 U/μΐ).
Po reakcji ligacji pobiera się 1 μl mieszaniny ligacyjnej, dodaje się 1 μΐ markera wielkości LIZ120 (Applied Biosystems) oraz 18 μΐ formamidu (Applied Biosystems). Całość denaturuje się przez 5 min w temp. 95°C, a następnie szybko schładza się na lodzie. Próby nanosi się na płytkę titracyjną, 96-studzienkową i analizuje się na sekwenatorze z wykorzystaniem metody SNaP-Shot.
Wyżej opisaną metodą przebadano 20 związków, które zostały wyselekcjonowane w badaniach przesiewowych. Wśród wspomnianych 20 związków przy zastosowaniu opisanej wyżej procedury wyselekcjonowano dwa o wysokiej aktywności przeciwko NAD+-zależnej ligazie bakteryjnej. Związki te to związek o wzorze 1: K-2 (pinafide) oraz związek o wzorze 2: M-2 (chaetochromin).
Nazwa systematyczna (IUPAC): 5-nitro-2-(2-pirolidyn-1-yletyl)benzo[de]izochinolino-1,3-dion; nazwa zwyczajowa: Pinafide
Numer CAS: 54824-20-3
Wzór sumaryczny: C18H17N3O4
Masa molowa: 339.34 [g/mol]
Temperatura topnienia: 145-146 [°C].
Otrzymywanie:
W publikacji Brafia, M.F. i wsp.; (Synthesis and mode(s) of action of a new series of imide derivatives of 3-nitro-1,8 naphthalic acid. Cancer Chemother. Pharmacol., 1980, 4, 61-66) opisano następujący sposób syntezy związku:
0,01 ml N-etylopirolidyny rozpuszczono w 10 ml etanolu absolutnego. Następnie, stale mieszając, do roztworu wkraplano zawiesinę 0.01 mola bezwodnika 3-nitro-1,8-naftoesowego w 50 ml etanolu absolutnego. Mieszanie kontynuowano przez okres 2 godzin. Wytrącone ciało stałe przefiltrowano, rozpuszczono i krystalizowano z etanolu.
Nazwa systematyczna (IUPAC): 6,8-trihydroksy-2,3-dimetylo-9-(5,6,8-trihydroksy-2,3-dimetylo-4-okso-2,3-dihydrobenzo [g] chromen-9-yl)-2,3-dihydrobenzo [g] chromen-4-on
PL 227 134 B1
Nazwa zwyczajowa: Chaetochromin
Numer CAS: 75514-37-3
Wzór sumaryczny: C30H26O10
Masa molowa: 546.52 [g/mol]
Temperatura topnienia: 222-224 [°C]
Skręcalność właściwa: [a]D = +634° (1.0 mol/dm3, CHCI3)
Otrzymywanie:
Chaetochromin jest związkiem pochodzenia naturalnego, produkowanym przez grzyby rodzaju Chaetomium. W literaturze (Sekita, S. i wsp. Chaetochromin, a bis(naphthodihydropyran-4-one)-myco13 1 toxin from Chaetomium thielavioideum: Application of 13C-1H long-range coupling to the structure elucidation. Chem. Pharm. Bull., 1980, 28, 2428-2435) opisano następujący sposób izolacji związku.
Szczep NHL 2829 Chaetomium thielavioideum inkubowano na pożywce z ryżu sterylizowanego (10 kg) w temperaturze 30°C przez okres 14 dni. Ekstrakcje ze spleśniałego ryżu przeprowadzono dwukrotnie używając w tym celu dichlorometanu (201), za każdym razem pozostawiając roztwór na 24h w temperaturze pokojowej. Po odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości 50 ml, odfiltrowano wytrącający się osad. Pozostały po odfiltrowaniu roztwór przepuszczano przez kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym, używając jako eluentu benzenu oraz mieszaniny benzen-dichlorometan. Frakcja otrzymana przy użyciu mieszaniny benzen-dichlorometan (w stosunku 1:1) zawierała 4.6 g substancji. Związek rekrystalizowano z benzenu otrzymując żółte igły.
13
Strukturę i czystość badanych związków potwierdzono analizą 1H, 13C NMR.
Badanie aktywności związków K-2 i M-2 przeciwko NAD+-zależnej ligazie bakteryjnej (E. coli, M. tuberculosis) oraz ATP-zależnej ligazie T4.
Aktywność badano w oparciu o opracowany test in vitro, przedstawiony w zgłoszeniu patentowym P 401634. Aktywność ligazy M. tuberculosis była hamowana w około 80% (50 pM związku M-2 oraz K-2). Te same stężenia badanych związków nie hamowały aktywności ATP-zależnej ligazy T4 (fig. 1 i 2). ATP-zależna ligaza T4 nie wykazywała wrażliwości na związki K-2 i M-2 w stężeniu aż do 1000 pM.
Metoda in vivo testowania wpływu różnych związków na przeżywalność szczepów bakteryjnych - AlamarBlue (AB).
W trakcie eksperymentów in vitro z oczyszczonym białkiem LigA z M.tuberculosis i E. coli, wyselekcjonowano dwa związki : K-2 (300289) i M-2 (345647), które w stężeniu 50 pM w znaczący sposób hamowały działanie ligazy NAD+-zależnej nie wpływając na aktywność ATP-zależnej ligazy T4. Ze związkiem K-2 przeprowadzono testy in vivo, wykorzystując metodę oceny żywotności bakterii z zastosowaniem odczynnika AlamarBlue. Metoda z użyciem AlamarBlue polega na redukcji niebieskiej C12-rezazuryny do czerwonej C12-rezorufiny. Hodowla zawierająca żywe komórki po dodaniu odczynnika AB zmienia barwę na czerwono-różową. Hodowla, w której wzrost komórek został całkowicie zahamowany pozostaje niebieska.
Wzrost szczepu kontrolnego M. smegmatis oraz mutantów ligazy A (ligAPamiligAMt, ligAPamiT4, ligAPamiligAEc) w obecności różnych stężeń związku K-2 testowano na płytkach 96-studzienkowych z dodatkiem odczynnika AlamarBlue.
Związek K-2 rozpuszczano w DMSO tak, by końcowe stężenie DMSO nie hamowało wzrostu szczepów i było nie wyższe niż 5%. Stężenia DMSO na płytce %: (A-5; B-2,5; C-1,25; D-0,625; E-0,31; F-0,156; G-0,078; H-0,039)
Hodowle o gęstości OD600 =0,1 nanoszono na płytkę z różnymi stężeniami związku K-2. Płytki inkubowano 72 godz. w temp. 37°C, a następnie dodawano odczynnika AB i ponownie inkubowano 24 godz. w temp. 37°C. Po tym czasie dokonywano odczytu.
Wyniki testu przedstawiono na fig. 3. Wykazano, że badany związek K-2 w stężeniach 125, 250 i 500 pM hamuje wzrost badanych szczepów M. smegmatis.

Claims (1)

  1. Zastrzeżenie patentowe
    1. Zastosowanie związków wybranych z grupy zawierającej związek o wzorze 1:
    oraz związek o wzorze 2:
    do wytwarzania leku do leczenia i zapobiegania zakażeniom Mycobacterium tuberculosis.
    PL 227 134 B1
    Rysunki
    Wpływ związku fi/I-2 (345647) na ligazy
    Fig.2
    PL 227 134 B1
    Zaznaczenie w ramce odpowiada kolorowi niebieskiemu, który świadczy o braku wzrostu bakterii, pozostałe dołki w kolorze różowym wskazują na wzrost bakterii
    500
    250
    125
    62,5
    31,25
    15,62
    7.81
    3,9
    Kontrola szczepu M..smegmatis Kontrola szczepu AlIgAPami ligAMt Kontrola szczepu AligAPaml llgAEc Kontrola szczepu AlIgAPami T4
    Kontrola podłoża
    Kontrola AS
    Kontrola podłoża
PL404948A 2013-08-01 2013-08-01 Zastosowanie pinafide i chaetochromin PL227134B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL404948A PL227134B1 (pl) 2013-08-01 2013-08-01 Zastosowanie pinafide i chaetochromin

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL404948A PL227134B1 (pl) 2013-08-01 2013-08-01 Zastosowanie pinafide i chaetochromin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL404948A1 PL404948A1 (pl) 2015-02-02
PL227134B1 true PL227134B1 (pl) 2017-11-30

Family

ID=52397001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL404948A PL227134B1 (pl) 2013-08-01 2013-08-01 Zastosowanie pinafide i chaetochromin

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL227134B1 (pl)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023040090A1 (zh) * 2021-09-18 2023-03-23 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 双萘并r-吡喃酮类化合物及其在抗植物炭疽菌中的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023040090A1 (zh) * 2021-09-18 2023-03-23 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 双萘并r-吡喃酮类化合物及其在抗植物炭疽菌中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
PL404948A1 (pl) 2015-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rožman et al. A new ‘golden age’for the antitubercular target InhA
Njire et al. Pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis: Review and update
Phillips et al. Discovery of kibdelomycin, a potent new class of bacterial type II topoisomerase inhibitor by chemical-genetic profiling in Staphylococcus aureus
Kishore et al. Alkaloids as potential anti-tubercular agents
Morimoto et al. Apigenin as an anti-quinolone-resistance antibiotic
Campaniço et al. Azaaurones as potent antimycobacterial agents active against MDR‐and XDR‐TB
Liu et al. Synthesis, and antibacterial activity of novel 4, 5-dihydro-1 H-pyrazole derivatives as DNA gyrase inhibitors
Farha et al. Chemical probes of Escherichia coli uncovered through chemical-chemical interaction profiling with compounds of known biological activity
Olejníková et al. Antimicrobial activity of novel C2-substituted 1, 4-dihydropyridine analogues
Abdeen et al. Targeting the HSP60/10 chaperonin systems of Trypanosoma brucei as a strategy for treating African sleeping sickness
Wang et al. Discovery of novel bacterial FabH inhibitors (Pyrazol-Benzimidazole amide derivatives): Design, synthesis, bioassay, molecular docking and crystal structure determination
Gao et al. Identification of a pyrimidinetrione derivative as the potent DprE1 inhibitor by structure-based virtual ligand screening
Freundlich et al. The abyssomicin C family as in vitro inhibitors of Mycobacterium tuberculosis
Sereno et al. Meta-analysis and discussion on challenges to translate Leishmania drug resistance phenotyping into the clinic
Liu et al. Collateral sensitivity profiling in drug-resistant Escherichia coli identifies natural products suppressing cephalosporin resistance
Abo-Kadoum et al. Mycobacterium tuberculosis PE17 (Rv1646) promotes host cell apoptosis via host chromatin remodeling mediated by reduced H3K9me3 occupancy
Guo et al. Design, synthesis and molecular docking of salicylic acid derivatives containing metronidazole as a new class of antimicrobial agents
Coelho et al. Activity of β-lapachone derivatives against rifampicin-susceptible and-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis
de Iudicibus et al. Parallel discovery of selective and dual inhibitors of tryptophan dioxygenases IDO1 and TDO2 with a newly-modified enzymatic assay
Guiles et al. Quinazolin-2-ylamino-quinazolin-4-ols as novel non-nucleoside inhibitors of bacterial DNA polymerase III
Ajay et al. Synthesis and bio-evaluation of alkylaminoaryl phenyl cyclopropyl methanones as antitubercular and antimalarial agents
Bhaskar et al. A review on benzimidazole scaffolds as inhibitors of Mycobacterium tuberculosis mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan complex biosynthesis
Nurkanto et al. Exploring Indonesian actinomycete extracts for anti-tubercular compounds: Integrating inhibition assessment, genomic analysis, and prediction of its target by molecular docking
PL227134B1 (pl) Zastosowanie pinafide i chaetochromin
Anwar et al. Synthetic dihydropyridines as novel antiacanthamoebic agents