PL226894B1

PL226894B1 - Polyphenolic compound of modulating the action vascular endothelium activity, its preparation, a pharmaceutical composition, nutritional supplement, and use of the polyphenolic compound of modulating the action vascular endothelium activity

Info

Publication number: PL226894B1
Application number: PL395898A
Authority: PL
Inventors: Bogusława Luzak; Magdalena Boncler; Cezary Watała; Magdalena Łabieniec; Maria Koziołkiewicz; Anna Podsędek; Anna Podsedek; Dorota Sosnowska; Małgorzata Redzynia
Original assignee: Politechnika Łódzka; Univ Łódzki; Univ Medyczny W Łodzi
Priority date: 2011-08-08
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2017-09-29
Also published as: PL395898A1

Description

Opis wynalazkuDescription of the invention

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie odtłuszczonego ekstraktu z wychmielin do leczenia lub profilaktyki chorób układu krążenia u ludzi lub zwierząt, przy czym wymienione leczenie lub profilaktyka związane są z modulowaniem aktywności śródbłonka naczyniowego. Przedmiotem wynalazku jest również środek farmaceutyczny to takiego zastosowania.The subject of the invention is the use of a defatted extract of leachelins for the treatment or prophylaxis of cardiovascular diseases in humans or animals, said treatment or prophylaxis being related to the modulation of vascular endothelial activity. The invention also relates to a pharmaceutical for such use.

Powszechnie wiadomo, że w modulowaniu funkcji płytek krwi uczestniczy śródbłonek naczyniowy (endothelium). Śródbłonek jest metabolicznie aktywną warstwą komórek wyściełających naczynia krwionośne i wyspecjalizowanych w regulowaniu przepuszczalności naczyń, napięcia naczyniowego, adhezji komórek prozapalnych, procesów krzepnięcia i agregacji płytek krwi. Zachowanie integralności funkcjonalnej śródbłonka naczyniowego chroni naczynia i zapobiega powstawaniu zmian miażdżycowych. Nowoczesne strategie terapeutyczne koncentrują się na ochronie funkcji śródbłonka naczyniowego, a szczególne na zachowaniu jego aktywności przeciwdziałającej zagrożeniu chorobami sercowo-naczyniowymi. W ten sposób, interferując z aktywnością biologiczną śródbłonka naczyniowego w wybranych stanach patofizjologicznych, można pośrednio niwelować niektóre z czynników ryzyka chorób sercowo-naczyniowych.It is well known that the vascular endothelium (endothelium) is involved in modulating the function of platelets. The endothelium is a metabolically active layer of cells that line blood vessels and specialize in regulating vascular permeability, vascular tone, pro-inflammatory cell adhesion, clotting and platelet aggregation. Maintaining the functional integrity of the vascular endothelium protects the vessels and prevents the formation of atherosclerotic lesions. Modern therapeutic strategies focus on protecting the function of the vascular endothelium, and in particular maintaining its activity against the risk of cardiovascular diseases. In this way, by interfering with the biological activity of the vascular endothelium in selected pathophysiological states, it is possible to indirectly eliminate some of the risk factors for cardiovascular diseases.

Śródbłonek naczyniowy dysponuje 3 mechanizmami chroniącymi płytki krwi przed aktywacją. Podstawowym mediatorem uwalnianym przez komórki śródbłonka naczyniowego jest tlenek azotu (NO), który ze względu na swoje znaczenie często jest uznawany za marker prawidłowej aktywności endothelium. Ten prosty związek chemiczny nie tylko osłabia reaktywność płytek krwi (adhezję i agregację), ale również zmniejsza adhezję leukocytów do powierzchni śródbłonka naczyniowego oraz hamuje proliferację naczyniowych komórek mięśniowych. Generowanie NO przez śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS) jest regulowane na drodze wielu mechanizmów molekularnych do których należy m.in. regulacja ekspresji genu eNOS oraz aktywności enzymatycznej eNOS. Aktywność eNOS oraz jego wewnątrzkomórkowa lokalizacja są ściśle regulowane przez ko- i potranslacyjne modyfikacje (fosforylacja licznych reszt aminokwasowych enzymu, głównie reszt serynowych, S-nitrozylacja, acylacja), jak również poprzez interakcje białko-białko. Fosforylacja seryny w pozycji 1177 (Ser1177) oraz defosforylacja treoniny w 495 (Thr495) są głównymi modyfikacjami regulującymi aktywność eNOS.The vascular endothelium has 3 mechanisms that prevent platelets from being activated. The main mediator released by vascular endothelial cells is nitric oxide (NO), which due to its importance is often considered a marker of normal endothelium activity. This simple chemical compound not only weakens the reactivity of platelets (adhesion and aggregation), but also reduces the adhesion of leukocytes to the surface of the vascular endothelium and inhibits the proliferation of vascular muscle cells. The generation of NO by endothelial nitric oxide synthase (eNOS) is regulated by many molecular mechanisms, including regulation of eNOS gene expression and eNOS enzymatic activity. The activity of eNOS and its intracellular localization are tightly regulated by co- and post-translational modifications (phosphorylation of numerous amino acid residues of the enzyme, mainly serine residues, S-nitrosylation, acylation), as well as by protein-protein interactions. Serine phosphorylation at position 1177 (Ser1177) and threonine dephosphorylation at 495 (Thr495) are the major modifications regulating eNOS activity.

W literaturze opisuje się zwiększoną generację NO pod wpływem polifenoli zawartych w czerwonym winie na drodze stymulacji ekspresji i aktywności eNOS W modulowaniu funkcji płytek krwi, obok uwalnianych przez śródbłonek tlenku azotu i prostacykliny (PGE1), wymienia się również śródbłonkową ektonukleotydazę typu 1 (CD39; NTPDaza1). CD39, podobnie jak CD73 (5'-nukleotydaza) jest białkiem transbłonowym, zlokalizowanym w kaweolach, czyli wpukleniach błony komórkowej różnych komórek. Poza śródbłonkiem, CD39 występuje na monocytach, komórkach mięśni gładkich naczyń, płytkach i erytrocytach. Analiza ekspresji CD39 w komórkach śródbłonka naczyniowego, płytkach i leukocytach wykazała korelację między ekspresją a aktywnością CD39. Mechanizm działania NO, PGE1 i CD39 związany jest z metabolizmem ATP/ADP. Dzięki NO i PGE1 dochodzi do wzrostu wewnątrzpłytkowego cAMP i cGMP, co skutkuje hamowaniem agregacji płytek. Działanie CD39 jest zależne od obecności jonów dwuwartościowych (Mg⁺⁺/ Ca⁺⁺) i polega na hydrolizowaniu uwalnianego z płytek ATP lub ADP do AMP, który następnie w obecności CD73 jest przekształcany w adenozynę. Adenozyna działa jako endogenny inhibitor płytkowy, który wiążąc się z płytkowym receptorem A2A obniża reaktywność płytek. Sądzi się, że ochronna funkcja CD39 sprowadza się zarówno do hamowania aktywacji płytek i neutrofili, jak i przeciwdziałania w powstawaniu zakrzepów poprzez utrzymywanie odpowiedniego stężenia nukleotydów adenozynowych.The literature describes an increased generation of NO under the influence of polyphenols contained in red wine by stimulating the expression and activity of eNOS. In modulating the function of platelets, apart from nitric oxide and prostacyclin (PGE1) released by endothelium, endothelial ectonucleotidase type 1 (CD39; NTPDaza1) is also mentioned. ). CD39, similarly to CD73 (5'-nucleotidase) is a transmembrane protein located in caveolae, i.e. in the cell membranes of various cells. In addition to the endothelium, CD39 is found on monocytes, vascular smooth muscle cells, platelets, and erythrocytes. Analysis of CD39 expression in vascular endothelial cells, platelets and leukocytes showed a correlation between expression and activity of CD39. The mechanism of action of NO, PGE1 and CD39 is related to the metabolism of ATP / ADP. Thanks to NO and PGE1, there is an increase in intraplatelet cAMP and cGMP, which results in the inhibition of platelet aggregation. The action of CD39 is dependent on the presence of divalent ions (Mg ⁺⁺ / Ca ⁺⁺ ) and relies on the hydrolysis of ATP or ADP released from the plates to AMP, which is then converted into adenosine in the presence of CD73. Adenosine acts as an endogenous platelet inhibitor which, by binding to the platelet A2A receptor, reduces platelet reactivity. It is believed that the protective function of CD39 comes down to both inhibiting the activation of platelets and neutrophils and preventing the formation of blood clots by maintaining the appropriate concentration of adenosine nucleotides.

W tej perspektywie nie dziwi fakt zainteresowania naukowców badaniami nad potencjalnym leczniczym zastosowaniem CD39 w terapii przeciwpłytkowej i przeciwzakrzepowej. W stanach zapalnych (aktywacja śródbłonka naczyniowego) obserwuje się spadek aktywności CD39. Podobnie, zmiany w homeostazie cholesterolu niekorzystnie wpływają na aktywność CD39. Uważa się, że trombina, która jest in vivo generowana w większej ilości u pacjentów z hipercholesterolemią, zmienia przeciwzakrzepowe właściwości śródbłonka naczyniowego (obniża aktywność śródbłonkowej CD39) na drodze mechanizmu aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kB za pośrednictwem śródbłonkowych receptorów PAR. Poza trombiną, również cytokiny (TNFa) mogą obniżać ekspresję i aktywację CD39. Dane literaturowe wskazują, że zarówno galusan epigalokatechiny zawarty w zielonej herbacie, jak również resweratrol i kwercetyna występujące w winogronach, aktywnie uczestniczą w obniżaniu potencjału prozapalnego i prozakrzepowego z udziałem mechanizmu zależnego od CD39.In this perspective, it is not surprising that scientists are interested in research into the potential therapeutic use of CD39 in antiplatelet and anticoagulant therapy. In inflammation (activation of the vascular endothelium) a decrease in CD39 activity is observed. Likewise, changes in cholesterol homeostasis adversely affect CD39 activity. Thrombin, which is generated in vivo in greater amounts in hypercholesterolaemic patients, is believed to alter the anticoagulant properties of the vascular endothelium (reduces endothelial CD39 activity) through a mechanism of NF-kB transcription factor activation via endothelial PAR receptors. In addition to thrombin, also cytokines (TNF?) Can reduce the expression and activation of CD39. Literature data indicate that both the epigallocatechin gallate contained in green tea, as well as resveratrol and quercetin found in grapes, actively participate in the reduction of pro-inflammatory and pro-thrombotic potential through a CD39-dependent mechanism.

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

W nurcie opracowywania nowoczesnych strategii terapeutycznych związanych z ochroną śródbłonka naczyniowego zwraca się uwagę na zastosowanie polifenoli roślinnych u pacjentów z chorobami układu krążenia i/lub cukrzycą (Vita i wsp., 2005: Gryglewski i wsp., 2007). W ostatnim czasie duże zainteresowanie znajduje stosowanie diety śródziemnomorskiej obfitej w polifenole roślinne. Wiadomo również, że bogatym źródłem polifenoli wykazujących bioaktywność są szyszki chmielu.In the trend of developing modern therapeutic strategies related to the protection of vascular endothelium, attention is paid to the use of plant polyphenols in patients with cardiovascular diseases and / or diabetes (Vita et al., 2005: Gryglewski et al., 2007). Recently, the use of a Mediterranean diet rich in plant polyphenols has been of great interest. Hop cones are also known to be a rich source of bioactive polyphenols.

Wśród polifenoli wykazujących bioaktywność wymienia się prenyloflawonoidy, obecne w ekstraktach z szyszek chmielu, a w szczególności chalkony, np. ksantohumol i desmetyloksantohumol. Desmetyloksantohumol jest prekursorem 8-prenylonaringeniny, wykazującej działanie estrogenne silniejsze od innych znanych fitoestrogenów (Milligen et al., 1999). Ksantohumol jest natomiast prekursorem izoksantohumolu, który wykazuje działanie antyproliferacyjne o niezwykle szerokim spektrum mechanizmów inhibicji na etapie inicjacji, promocji i progresji karcynogenezy (Gerhauser et al. 2002).Among the polyphenols showing bioactivity, mention may be made of the prenylflavonoids present in extracts of hops, in particular chalcones, e.g. xanthohumol and desmethylxanthohumol. Desmethylxanthohumol is a precursor of 8-prenylnaringenin, which is more estrogenic than other known phytoestrogens (Milligen et al., 1999). Xanthohumol, on the other hand, is a precursor of isoxanthohumol, which shows an antiproliferative effect with an extremely wide spectrum of inhibition mechanisms at the stage of initiation, promotion and progression of carcinogenesis (Gerhauser et al. 2002).

Wykorzystanie aktywności biologicznej chalkonów zawartych w szyszkach chmielu stało się przedmiotem badań, przy czym badania te nakierowane są na pozyskanie sposobów umożliwiających zwiększenie ilości prenyloflawonoidów zawartych w ekstraktach z chmielu lub opracowanie metod pozwalających na uzyskiwanie określonych kompozycji określonych prenyloflawonoidów wykazujących pożądane właściwości.The use of the biological activity of chalcones contained in hops cones has become the subject of research, and these studies are aimed at obtaining methods to increase the amount of prenylflavonoids contained in hop extracts or developing methods to obtain specific compositions of specific prenylflavonoids showing the desired properties.

Zgłoszenie patentowe EP1543834 ujawnia sposób wytwarzania ekstraktów z chmielu o zwiększonej ilości prenyloflawonoidów lub ich pochodnych posiadających aktywność estrogenną oraz antyproliferacyjną. W ujawnionym sposobie produkt z chmielu poddaje się reakcji izomeryzacji w obecności zasady, co sprzyja zwiększeniu ilości 8-prenylonaringeniny w produkcie, zapewniając wielokrotne zwiększenie aktywności estrogennej preparatu. Jednocześnie, ze względu na proliferacyjne właściwości 8-prenylonaringeniny, zgłaszający podkreślili znaczenie odpowiedniego nadmiaru ksantohumolu w kompozycji uzyskanej ujawnionym sposobem.Patent application EP1543834 discloses a method of producing hop extracts with an increased amount of prenylflavonoids or their derivatives having estrogenic and antiproliferative activity. In the disclosed process, the hops product is subjected to an isomerization reaction in the presence of a base, which helps to increase the amount of 8-prenylnaringenin in the product, providing a multiple increase in the estrogenic activity of the preparation. At the same time, due to the proliferative properties of 8-prenylnaringenin, the applicants have emphasized the importance of an adequate excess of xanthohumol in the composition obtained by the disclosed process.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe US2005/0042318 ujawnia ekstrakt z chmielu zawierający zwiększoną ilość prenylochalkonów, znajdujący zastosowanie w leczeniu lub profilaktyce chorób związanych z deficytem estrogenu.US patent application US2005 / 0042318 discloses a hops extract containing an increased amount of prenylchalcones for the treatment or prophylaxis of diseases related to estrogen deficiency.

Sposób uzyskiwania związków aktywnych o właściwościach estrogennych z szyszek chmielu został ujawniony w WO83.00701 A1. Ekstrakt z użyciem dwutlenku węgla z szyszek chmielu traktuje się wodą jako czynnikiem azeotropującym, a następnie estrogenne związki aktywne uzyskuje się poprzez ekstrakcję z użyciem eteru lub metod chromatograficznych.A method for obtaining active compounds with estrogenic properties from hops is disclosed in WO83.00701 A1. The carbon dioxide extract of hops is treated with water as an azeotroping agent, and then estrogenic active compounds are obtained by extraction with ether or chromatographic methods.

Niemieckie zgłoszenie patentowe DE 199 39 350 A1 ujawnia ekstrakt z chmielu cechujący się zwiększoną zawartością ksantohumolu, ilość w ekstrakcie prenylonaringeniny jest nieokreślona. Wskazane zastosowanie ujawnionego ekstraktu to dodatek do piwa i soków owocowych.German patent application DE 199 39 350 A1 discloses a hop extract characterized by an increased content of xanthohumol, the amount of prenylnaringenin in the extract is undefined. The indicated use of the disclosed extract is in addition to beer and fruit juices.

Sposoby ekstrakcji wychmielin, jak również główne składniki uzyskane w tych ekstraktach znane są również z opisów patentowych WO 2009/023710, US2009/291071, WO 2005/058336 oraz publikacji GUO-QING HE ET ALL: „Optimisation of conditions of supercritical fluid extraction of flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) oraz Mirosława Anioła et al.: „Extraction of Spent Hops Using Organic Solvents”. Wymienione publikacje nakierowane są na sposoby zapewniające ekstrakty wzbogacone w związki lipofilne w postaci prenylowanych flawonoidów.The methods of extraction of leachielins, as well as the main components obtained in these extracts, are also known from the patent descriptions WO 2009/023710, US2009 / 291071, WO 2005/058336 and the publication GUO-QING HE ET ALL: "Optimization of conditions of supercritical fluid extraction of flavonoids from hops (Humulus lupulus L.) and Mirosława Anioła et al .: "Extraction of Spent Hops Using Organic Solvents". The publications mentioned are aimed at methods providing extracts enriched with lipophilic compounds in the form of prenylated flavonoids.

Zgłoszenie międzynarodowe WO2009/023710 ujawnia ekstrakt z chmielu wzbogacony w ksantohumol i izoksantohumol do leczenia miażdżycy i choroby niedokrwiennej serca. W kontekście leczenia miażdżycy również publikacja US 2009/291071 wskazuje na korzystne działanie kompozycji zawierających znaczące ilości prenylowanych flawonoidów. Obie publikacje wyraźnie wskazują na korzyści wynikające ze stosowania ekstraktów bogatych w lipofilne związki w postaci prenylowanych flawonoidów.International application WO2009 / 023710 discloses a hops extract enriched in xanthohumol and isoxanthohumol for the treatment of atherosclerosis and ischemic heart disease. In the context of the treatment of atherosclerosis, also US 2009/291071 indicates the beneficial effects of compositions containing significant amounts of prenylated flavonoids. Both publications clearly show the benefits of using extracts rich in lipophilic compounds in the form of prenylated flavonoids.

Chociaż ujawnienia ze stanu techniki wskazują na korzystne właściwości prenyloflawonoidów zawartych w ekstraktach z chmielu, to jednocześnie uważa się, że znane ekstrakty z chmielu, ze względu na proliferacyjne właściwości 8-prenylonargeniny, muszą posiadać także odpowiedni składnik antyproliferacyjny, np. nadmiar ksantohumolu. Jednocześnie zawartość w ekstrakcie związków lipofilnych utrudnia liofilizację preparatów tego typu.Although the disclosures of the prior art indicate the beneficial properties of the prenylflavonoids contained in hop extracts, it is also believed that known hops extracts, due to the proliferative properties of 8-prenylnargenine, must also have a suitable antiproliferative component, e.g. an excess of xanthohumol. At the same time, the content of lipophilic compounds in the extract makes it difficult to lyophilize preparations of this type.

Brak jest doniesień w stanie techniki o korzystnym działaniu polifenoli zawartych w ekstraktach z chmielu na aktywność śródbłonka naczyniowego.There are no reports in the prior art about the beneficial effect of polyphenols contained in hop extracts on the activity of the vascular endothelium.

Celem wynalazku jest opracowanie nowego preparatu polifenolowego znajdującego zastosowanie w leczeniu i profilaktyce chorób sercowo-naczyniowych.The aim of the invention is to develop a new polyphenol preparation for the treatment and prevention of cardiovascular diseases.

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

W wyniku badań, twórcy wynalazku stwierdzili, iż odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, tj. odpadów chmielowych, wykazuje nieoczekiwane działanie modulujące aktywność śródbłonka naczyniowego.As a result of the research, the inventors found that the defatted extract of hop waste, ie hop waste, has an unexpected modulating effect on the activity of the vascular endothelium.

Przedmiotem wynalazku jest odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy, do zastosowania do leczenia lub profilaktyki chorób układu krążenia u ludzi lub zwierząt, przy czym wymienione leczenie lub profilaktyka związane są z modulowaniem aktywności śródbłonka naczyniowego.The present invention relates to a defatted extract of leachelin from which lipophilic compounds, including prenylflavonids, have been removed, for use in the treatment or prophylaxis of cardiovascular diseases in humans or animals, said treatment or prophylaxis being related to the modulation of vascular endothelial activity.

Korzystnie w zastosowaniu ekstraktu według wynalazku wymienioną chorobą jest miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, choroby aorty i naczyń obwodowych, choroby żył obwodowych, żylna choroba zakrzepowo-zatorowa. Przedmiotem wynalazku jest również środek farmaceutyczny do zastosowania do leczenia lub profilaktyki chorób układu krążenia u ludzi lub zwierząt, przy czym wymienione leczenie lub profilaktyka związane są z modulowaniem aktywności śródbłonka naczyniowego, zawierający substancję czynną oraz ewentualnie środki pomocnicze, charakteryzujący się według wynalazku tym, że jako substancję czynną zawiera odtłuszczony ekstrakt z wychmielin, z którego zostały usunięte związki lipofilne, w tym prenyloflawonidy.Preferably, in the use of the extract according to the invention, said disease is atherosclerosis, ischemic heart disease, aortic and peripheral vascular diseases, peripheral vein diseases, venous thromboembolism. The invention also relates to a pharmaceutical composition for use in the treatment or prophylaxis of cardiovascular diseases in humans or animals, said treatment or prophylaxis being related to the modulation of vascular endothelial activity, comprising an active ingredient and, optionally, auxiliaries, characterized according to the invention as the active substance contains a defatted extract of leachelins from which lipophilic compounds, including prenylflavonids, have been removed.

Przez wychmieliny rozumie się stały odpad poprodukcyjny, powstający podczas produkcji olejku chmielowego używanego w piwowarstwie w wyniku ekstrakcji szyszek chmielowych. Wychmieliny są uciążliwym, pylistym odpadem, którego utylizacja jest ważnym problemem ze względu na zanieczyszczenie środowiska. Są to odpady, które nie mogą być odprowadzane do systemów kanalizacyjnych jako ścieki, ponieważ powodują ich blokowanie.The leachates are defined as the solid post-production waste generated during the production of hop oil used in brewing as a result of the extraction of hop cones. Leachelins are a nuisance, dusty waste, the disposal of which is an important problem due to environmental pollution. These are wastes that cannot be discharged into sewage systems as wastewater because they block them.

Przez odtłuszczony ekstrakt z wychmielin rozumie się ekstrakt z którego usunięte zostały związki lipofilne, w tym prenyloflawonoidy.By defatted extract of leachelins is meant an extract from which lipophilic compounds, including prenylflavonoids, have been removed.

Preparat o działaniu modulującym aktywność śródbłonka naczyniowego oznacza preparat wywierający korzystny wpływ na funkcjonowanie komórek śródbłonka naczyniowego, przyczyniając się do zwiększonego eksponowania CD39/NTPDazy1 i wydzielania substancji chemicznych, takich jak tlenek azotu (NO). Korzystne działanie modulujące aktywność komórek śródbłonka naczyniowego można wykorzystać w leczeniu i profilaktyce chorób takich jak miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, choroby aorty i naczyń obwodowych, choroby żył obwodowych, żylna choroba zakrzepowo-zatorowa.Vascular endothelial modulating preparation is a preparation that has a beneficial effect on the functioning of vascular endothelial cells by contributing to increased CD39 / NTPDase1 exposure and the secretion of chemicals such as nitric oxide (NO). The beneficial effect modulating the activity of vascular endothelial cells can be used in the treatment and prophylaxis of diseases such as atherosclerosis, ischemic heart disease, aortic and peripheral diseases, diseases of peripheral veins, and venous thromboembolism.

Sposób otrzymywania preparatu polega na ekstrakcji polifenoli z wychmielin poprzez co najmniej jednokrotną ekstrakcję przy użyciu rozpuszczalnika organicznego. Odpowiedni rozpuszczalnik wybiera się z grupy alkoholi oraz ich wodnych roztworów, ketonów oraz ich wodnych roztworów bez lub z dodatkiem kwasów nieorganicznych lub organicznych, oraz mieszanin wymienionych rozpuszczalników. Rozpuszczalnikiem korzystnym w sposobie jest rozpuszczalnik o średniej polarności, jakim jest np. aceton. W przypadku ekstrakcji wychmielin, korzystne z punktu widzenia wydajności procesu okazało się zastosowanie trzykrotnej ekstrakcji 70% wodnym roztworem acetonu w temperaturze pokojowej, przy zastosowaniu 10-krotnego nadmiaru ekstrahenta w stosunku do ilości substratu. Ekstrakcję prowadzono z zastosowaniem mieszania, po czym ekstrakty odsączano oraz zatężano aż do usunięcia rozpuszczalnika organicznego. Z tak uzyskanego ekstraktu usuwa się związki lipofilne. Można to osiągnąć na przykład poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem takim jak chloroform, przy czym odtłuszczony ekstrakt wodny zatęża się następnie w celu usunięcia pozostałości chloroformu. Dobre efekty osiągnąć można również stosując w miejsce chloroformu inne rozpuszczalniki niepolarne, takie jak heksan. Tak otrzymany preparat ewentualnie poddaje się liofilizacji i przechowuje bez dostępu światła w temperaturze 4°C, w szczelnych opakowaniach. Zawartość polifenoli ogółem wynosi średnio 240 mg/g preparatu w przeliczeniu na kwas galusowy. Przez zawartość polifenoli ogółem w przeliczeniu na kwas galusowy rozumie się zawartość oznaczoną zgodnie z metodą oznaczania zawartości związków polifenolowych Folina-Ciocalteu (Bordonaba i Terry 2008).The preparation method is based on the extraction of polyphenols from leachates by at least one extraction with an organic solvent. A suitable solvent is selected from the group of alcohols and their aqueous solutions, ketones and their aqueous solutions without or with addition of inorganic or organic acids and mixtures of the solvents mentioned. The preferred solvent for the process is a medium polar solvent such as acetone, for example. In the case of extraction of leachates, it turned out to be advantageous from the point of view of the efficiency of the process to use triple extraction with 70% aqueous acetone solution at room temperature, using a 10-fold excess of the extractant in relation to the amount of substrate. Extraction was performed with stirring, then the extracts were filtered and concentrated until the organic solvent was removed. The lipophilic compounds are removed from the extract thus obtained. This can be achieved, for example, by extraction with a solvent such as chloroform, the defatted aqueous extract then concentrated to remove residual chloroform. Good effects can also be achieved by using other non-polar solvents, such as hexane, in place of chloroform. The preparation obtained in this way is optionally lyophilized and stored protected from light at a temperature of 4 ° C, in sealed packages. The total polyphenol content averages 240 mg / g of the preparation as gallic acid. The total polyphenol content in terms of gallic acid is understood to mean the content determined in accordance with the method for determining the content of polyphenolic compounds of Folina-Ciocalteu (Bordonaba and Terry 2008).

Przeprowadzone badania preparatu w zakresie wpływu na ekspresję CD39 na powierzchni komórek ludzkiego śródbłonka naczyniowego wykazały, iż preparat według wynalazku zwiększa poziom ekspresji CD39 na powierzchni komórek, przy czym efekt ten zależy od stężenia preparatu. Istotne zwiększenie ekspresji stwierdzono dla stężenia 6 pg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy, przy czym efekt działania preparatu utrzymuje się przez kolejne 24 godziny pomimo usunięcia preparatu z medium komórkowego.The studies performed on the preparation in terms of the effect on the expression of CD39 on the surface of human vascular endothelial cells showed that the preparation according to the invention increases the level of CD39 expression on the surface of cells, the effect of which is concentration dependent. Significant increase in expression was found for the concentration of 6 pg / ml expressed as gallic acid, and the effect of the preparation was maintained for the next 24 hours despite the removal of the preparation from the cellular medium.

Również badania aktywności syntazy tlenku azotu (eNOS) potwierdzają wpływ preparatu według wynalazku na aktywność śródbłonka naczyniowego. Uzyskane wyniki badania poziomu fosforylacji eNOS wskazują na istotny wpływ preparatu według wynalazku na modulowanie fosforylacji amiPL 226 894 B1 nokwasów w białku co wskazuje na zwiększenie aktywności syntazy tlenku azotu i w konsekwencji zwiększenie produkcji NO przez komórki śródbłonka naczyniowego.Also studies on the activity of nitric oxide synthase (eNOS) confirm the influence of the preparation according to the invention on the activity of the vascular endothelium. The obtained results of the study of the level of eNOS phosphorylation indicate a significant effect of the preparation according to the invention on the modulation of phosphorylation of amino acids in the protein, which indicates an increase in the activity of nitric oxide synthase and, consequently, an increase in the production of NO by vascular endothelial cells.

Uzyskane wyniki dodatkowo potwierdzają badania oddziaływania płytek krwi z komórkami śródbłonka naczyniowego poddanymi ekspozycji na preparat według wynalazku. Ocena ekspresji powierzchniowych markerów aktywacji płytek krwi (CD62 i PAC1) wskazuje na obniżenie ekspresji PAC-1 (aktywnej formy receptora dla fibrynogenu GPIIb-llla) na powierzchni płytek inkubowanych ze śródbłonkiem poddanym działaniu preparatu według wynalazku, co potwierdza działanie preparatu według wynalazku na ekspresję CD39 i na aktywność eNOS. Uzyskane wyniki potwierdzają korzystny wpływ preparatu według wynalazku na aktywność śródbłonka naczyniowego.The obtained results additionally confirm the study of the interaction of platelets with vascular endothelial cells exposed to the preparation according to the invention. The evaluation of the expression of the platelet surface activation markers (CD62 and PAC1) indicates a decrease in the expression of PAC-1 (the active form of the GPIIb-IIIa fibrinogen receptor) on the surface of the plates incubated with the endothelium treated with the preparation according to the invention, which confirms the effect of the preparation according to the invention on CD39 expression and on eNOS activity. The obtained results confirm the beneficial effect of the preparation according to the invention on the activity of the vascular endothelium.

Preparat można stosować według wynalazku jako substancję czynną środków farmaceutycznych o działaniu modulującym aktywność śródbłonka naczyniowego, w połączeniu z konwencjonalnie stosowanymi w praktyce farmaceutycznej dopuszczalnymi dodatkami znanymi ze stanu techniki, przy czym preparat można poddawać znanym sposobom pozwalającym na nadanie postaci stałych lub płynnych kompozycji farmaceutycznych, które można podawać drogą doustną lub pozajelitową. Stężenie preparatu wykazujące pożądane właściwości preparatu, przy zachowaniu braku cytotoksyczności w stosunku do komórek śródbłonka naczyniowego to 6 pg/ml w przeliczeniu na kwas galusowy. W poszczególnych przypadkach dawka może być jednak dostosowana przez fachowca w dziedzinie do wielkości odpowiadającej szczególnemu zastosowaniu. Wykonane badania cytotoksyczności preparatu wskazują, iż preparaty według wynalazku zawierające ilość polifenoli ogółem mniejszą niż 30 pg/ml przygotowanego roztworu nie wykazują cytotoksyczności. Ze względu na swoje działanie preparat może również znaleźć zastosowanie przy wytwarzaniu dodatków żywieniowych (suplementów diety). W przypadku zastosowania preparatu według wynalazku do wytwarzania dodatku żywieniowego, możliwy jest dodatek znanych w przemyśle spożywczym materiałów pomocniczych, a ich właściwości i ewentualny dobór w celu wytworzenia odpowiedniej kompozycji jest dobrze opisany w literaturze i nie wykracza poza rutynowe działanie fachowca w danej dziedzinie.The preparation can be used according to the invention as an active ingredient of pharmaceutical compositions modulating the activity of the vascular endothelium, in combination with conventional pharmaceutical acceptable additives known from the state of the art, whereby the preparation can be subjected to known methods allowing for the preparation of solid or liquid pharmaceutical compositions, which can be administered by the oral or parenteral route. The concentration of the preparation showing the desired properties of the preparation, while maintaining the lack of cytotoxicity in relation to vascular endothelial cells, is 6 pg / ml expressed as gallic acid. In individual cases, the dose may, however, be adjusted by a person skilled in the art to suit the particular application. The cytotoxicity tests performed on the preparation show that the preparations according to the invention containing the total amount of polyphenols lower than 30 pg / ml of the prepared solution do not show cytotoxicity. Due to its action, the preparation can also be used in the production of nutritional supplements (dietary supplements). When the preparation according to the invention is used for the production of a nutritional supplement, it is possible to add auxiliary materials known in the food industry, and their properties and possible selection to produce a suitable composition are well described in the literature and do not exceed the routine operation of a person skilled in the art.

Obok korzystnych właściwości jakie wykazuje preparat, dodatkowo dzięki odtłuszczeniu pozbawiony wykazującej proliferacyjne i estrogenne właściwości prenyloargeniny, zaletą rozwiązań według wynalazku jest również prostota procesu otrzymywania preparatu, łatwa dostępność oraz niski koszt surowca podstawowego, stanowiącego w istocie uciążliwy materiał odpadowy.In addition to the beneficial properties of the preparation, additionally, thanks to the degreasing, it is devoid of proliferative and estrogenic properties of prenyloargenine, the advantage of the solutions according to the invention is also the simplicity of the preparation process, easy availability and low cost of the basic raw material, which is actually a troublesome waste material.

Poniżej przedstawiono opis załączonych figur:The following is a description of the attached figures:

Fig. 1. przedstawia krzywą kalibracyjną do oznaczania polifenoli metodą Folina-Ciocalteu'aFig. 1 shows a calibration curve for the determination of polyphenols by the Folin-Ciocalteu method

Fig. 2 przedstawia krzywą kalibracyjną do oznaczania zawartości katechinyFig. 2 shows a calibration curve for determining the catechin content

Rozwiązanie według wynalazku zostało przedstawione w sposób bardziej szczegółowy w przykładach realizacji wynalazku zamieszczonych poniżej. Poniższe przykłady w żaden sposób nie ograniczają zakresu wynalazku.The solution according to the invention is presented in more detail in the embodiments of the invention which follow. The following examples are not intended to limit the scope of the invention in any way.

PrzykładyExamples

P r z y k ł a d 1P r z k ł a d 1

1. Otrzymywanie preparatu polifenolowego z wychmielin1. Obtaining polyphenol preparation from leachelins

Naważkę rozdrobnionych wychmielin, poddano procesowi trzykrotnej ekstrakcji 70% roztworem acetonu w temperaturze pokojowej w czasie 30 minut (I ekstrakcja) oraz 15 minut (II i III ekstrakcja). Stosowano każdorazowo 10-krotny nadmiar ekstrahenta w stosunku do masy surowca (v/w). Ekstrakcję prowadzono z zastosowaniem mieszadła magnetycznego. Uzyskane ekstrakty sączono. W kolejnym etapie, połączone ekstrakty, zatężono 6-krotnie na wyparce próżniowej w temperaturze <40°C w celu usunięcia rozpuszczalnika organicznego. Uzyskany wodny ekstrakt następnie 4-krotnie ekstrahowano chloroformem (1:1, v/v) celem usunięcia związków lipofilnych. Odtłuszczony ekstrakt wodny następnie około 2-krotnie zatężano w celu usunięcia pozostałości chloroformu i liofilizowano. Rozdrobniony stały preparat polifenolowy do czasu analizy przechowywano w zamkniętych szklanych naczyniach w temperaturze 4°C bez dostępu światła.The mass of ground leachates was extracted three times with 70% acetone solution at room temperature for 30 minutes (1st extraction) and 15 minutes (2nd and 3rd extraction). A 10-fold excess of the extractant in relation to the weight of the raw material was used each time (v / w). Extraction was performed using a magnetic stirrer. The obtained extracts were filtered. In the next step, the combined extracts were concentrated 6 times on a vacuum evaporator at <40 ° C in order to remove the organic solvent. The obtained aqueous extract was then extracted 4 times with chloroform (1: 1, v / v) to remove lipophilic compounds. The degreased aqueous extract was then concentrated about 2 times to remove residual chloroform and lyophilized. The ground solid polyphenol preparation was stored in closed glass vessels at 4 ° C protected from light until analysis.

2. Przygotowanie roztworu podstawowego2. Preparation of the stock solution

W celu dokonania analizy otrzymanego preparatu polifenolowego, roztwór podstawowy do analizy przygotowano w następujący sposób: odważono 20 mg preparatu polifenolowego i rozpuszczono ₃ w 10 cm³ 10% wodnego roztworu dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie próbki wstawiano na 5 minut do łaźni ultradźwiękowej. Tak przygotowany roztwór poddano analizie na oznaczenie zawartości związków polifenolowych.To analyze the obtained polyphenol preparation, the stock solution for analysis was prepared as follows: 20 mg of the polyphenol preparation was weighed and _{3 was} dissolved in 10 cm ^{3 of} 10% aqueous dimethylsulfoxide (DMSO) solution, then the samples were placed in an ultrasonic bath for 5 minutes. The solution prepared in this way was analyzed to determine the content of polyphenolic compounds.

3. Oznaczanie zawartości związków polifenolowych metodą Folina-Ciocalteu'a [Bordonaba i Terry, 2008]3. Determination of the content of polyphenolic compounds by the Folin-Ciocalteu method [Bordonaba and Terry, 2008]

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

Metoda ta oparta jest na właściwościach redukujących związków polifenolowych. Odczynnik Folina—Ciocalteu’a zawiera kompleks związków wolframowo-molibdenowych (H₃PW₁₂O₄₀ i H₃PMo₁₂O₄₀), które przy utlenianiu polifenoli przechodzą w niebiesko zabarwione formy tlenowe (W8O23 i Mo8O23), posiadające maksimum absorbancji przy 760 nm.This method is based on the reducing properties of polyphenolic compounds. Folin-Ciocalteu's reagent contains a complex of tungsten-molybdenum compounds (H ₃ PW ₁₂ O ₄₀ and H ₃ PMo ₁₂ O ₄₀ ), which transform into blue-colored oxygen species (W8O23 and Mo8O23) during the oxidation of polyphenols (W8O23 and Mo8O23), having maximum absorbance at 760 nm .

Intensywność barwy jest proporcjonalna do ilości występujących w roztworze substancji fenolowych.The color intensity is proportional to the amount of phenolic substances present in the solution.

Na₂WO₄/Na₂MoO₄ —> ((polifenol) - MoW₁₁O₄₀)^-4Mo(VI) (żółty) + e —> Mo(V) (niebieski)Na ₂ WO ₄ / Na ₂ MoO ₄ -> ((polyphenol) - MoW ₁₁ O ₄₀ ) ^-4 Mo (VI) (yellow) + e -> Mo (V) (blue)

Oznaczenie wykonano w następujący sposób:The determination was made as follows:

₃₃

Próba właściwa: 10 cm³ wody destylowanej, ₃ Specific test: 10 cm ³ of distilled water, ₃

0,2 - 2 cm³ roztworu próby badanej, ₃ 0.2 - 2 cm ³ of the test sample solution, ₃

0,5 cm³ odczynnika Folina-Ciocalteu'a, cm³ 20% Na2CO3.0.5 cm ³ of Folin-Ciocalteu's reagent, cm ³ 20% Na2CO3.

₃₃

Całość uzupełniano wodą do 50 cm³.The whole was made up with water to 50 cm ³ .

Próba odniesienia nie zawierała próby badanej. Po 20 min mierzono absorbancję próby właściwej wobec próby odniesienia przy długości fali 760 nm. Zawartość polifenoli wyznaczono na podstawie krzywej wzorcowej przedstawionej na fig. 1, do sporządzenia której użyto metanolowego roztworu ₃ kwasu galusowego o stężeniu 0,2 mg/cm³.The reference sample did not include the test sample. After 20 min, the absorbance of the sample proper against the reference sample was measured at a wavelength of 760 nm. The content of polyphenols was determined on the basis of the standard curve shown in Fig. 1, for the preparation of which a methanolic solution ₃ of gallic acid with a concentration of 0.2 mg / cm ^{3 was used} .

4. Oznaczanie zawartości flawanoli metodą wanilinową [Swain-Hillis, 1959]4. Determination of flavanols content by the vanillin method [Swain-Hillis, 1959]

Preparat podstawowy otrzymany zgodnie z pkt. 2 Przykładu 1 przebadano na zawartość flawanoli zgodnie z poniżej przedstawioną metodyką.Basic preparation obtained in accordance with point 2 of Example 1 was tested for flavanols according to the methodology set out below.

Metoda wanilinowa oparta jest na reakcji waniliny z monomerami i polimerami katechin. Charakterystyczna czerwona barwa jest stabilna w środowisku 70% H2SO4 i posiada maksimum absorpcji przy λ = 500 nm.The vanillin method is based on the reaction of vanillin with catechin monomers and polymers. The characteristic red color is stable in the environment of 70% H2SO4 and has an absorption maximum at λ = 500 nm.

Wykonanie oznaczenia:Performing the determination:

Przygotowano następujące próby:The following trials were prepared:

₃₃

a) - 0,2-0,4 cm³ badanego roztworu podstawowego rozcieńczonego 5 razy dopełniano wodąa) - 0.2-0.4 cm ^{3 of the} test stock solution diluted 5 times with water

3 3 destylowaną do 2 cm³ i dodawano 4 cm³ odczynnika wanilinowego (1 g waniliny w 100 cm³ 3 3 distilled to 2 cm ³ and 4 cm ³ of vanillin reagent (1 g of vanillin in 100 cm ^{3 of}

70% H2SO4), ₃ 70% H2SO4), ₃

b) - 0,2-0,4 cm³ badanego roztworu podstawowego rozcieńczonego 5 razy dopełniano wodą destylowaną do 2 cm³ i dodawano 4 cm³ 70% H2SO4,b) - 0.2-0.4 cm ^{3 of the} tested stock solution diluted 5 times with distilled water was made up to 2 cm ³ and 4 cm ^{3 of} 70% H2SO4 was added,

c) - do 2 cm³ wody destylowanej dodawano 4 cm³ odczynnika wanilinowego,c) - ^{4 cm 3} of vanillin reagent was ^{added to 2 cm 3} of distilled water,

d) - do 2 cm³ wody destylowanej dodawano 4 cm³ 70% H2SO4,d) - to 2 cm ³ of distilled water, 4 cm ^{3 of} 70% H2SO4 was added,

Próby umieszczano w zimnej łaźni wodnej, aby ich temperatura nie przekroczyła 35°C. Po 15 minutach mierzono absorbancję prób a, b, c względem próby d przy λ = 500 nm. Z krzywej wzorcowej odczytywano stężenie katechiny w próbce, odpowiadające absorbancji A = Aa - (Ab+Ac).The samples were placed in a cold water bath so that their temperature did not exceed 35 ° C. After 15 minutes, the absorbance of samples a, b, c was measured against test d at λ = 500 nm. The catechin concentration in the sample, corresponding to the absorbance of A = Aa - (Ab + Ac), was read from the standard curve.

₃₃

Do sporządzenia krzywej wzorcowej użyto wodnego roztworu (+)katechiny o stężeniu 0,05 mg/cm³. Krzywą zależności absorbancji A = Aa - (Ab+Ac) w funkcji stężenia (+) katechiny przedstawiono na fig. 2.An aqueous solution of (+) catechin with a concentration of 0.05 mg / cm ³ was used to prepare the standard curve. The absorbance curve of A = Aa - (Ab + Ac) versus the concentration of (+) catechin is shown in Figure 2.

5. Oznaczenie proantocyjanidyn [Rosch et al., 2003]5. Determination of proanthocyanidins [Rosch et al., 2003]

Preparat podstawowy otrzymany zgodnie z pkt. 2 Przykładu 1 przebadano na obecność proantocyjanidyn zgodnie z poniżej przedstawioną metodą. Procyjanidyny ogrzewane w temperaturze 100°C w środowisku zakwaszonego kwasem solnym butanolu ulegają depolimeryzacji i utlenieniu do odpowiednich barwnych antocyjanidyn:Basic preparation obtained in accordance with point 2 of Example 1 was tested for proanthocyanidins according to the method set out below. Procyanidins heated at 100 ° C in a medium acidified with hydrochloric acid butanol undergo depolymerization and oxidation to the corresponding colored anthocyanidins:

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

Wykonanie oznaczenia:Performing the determination:

3 33 3

Do 0,2-0,4 cm³ roztworu podstawowego uzupełnionego do 0,4 cm³ 10% DMSO dodano 9,6 cm³ mieszaniny zawierającej butanol i stężony kwas solny (9:1, v/v). Następnie próby ogrzewano 90 min ₃ we wrzącej łaźni wodnej. Po oziębieniu próby przesączono, uzupełniono do objętości 10 cm³ i zmierzono absorbancję (A) przy długości fali λ = 550 nm wobec mieszaniny butanol/HCl. Zawartość proan₃ tocyjanidyn przeliczono na cyjanidynę stosując molowy współczynnik absorpcji ε = 17360 dm /mol*cm.To 0.2-0.4 cm ³ of the stock solution made up to 0.4 cm ^{3 of} 10% DMSO was added 9.6 cm ^{3 of the} mixture containing butanol and concentrated hydrochloric acid (9: 1, v / v). Then the samples were heated for 90 min ₃ in a boiling water bath. After cooling, the samples were filtered, made up to a volume of 10 cm ³ and the absorbance (A) was measured at a wavelength λ = 550 nm against a butanol / HCl mixture. The content of proan ₃ tocyanidins was converted to cyanidine using the molar absorption coefficient ε = 17 360 dm / mol * cm.

Stężenie cyjanidyny w mieszaninie reakcyjnej obliczono z zależności:The concentration of cyanidine in the reaction mixture was calculated from the relationship:

₃₃

C_cyjanidyny = 0,0165 A [mg/cm ]C _cyanidins = 0.0165 A [mg / cm]

6. Charakterystyka polifenoli w otrzymanych preparatach z wychmielin6. Characteristics of polyphenols in the obtained leachyelin preparations

Poniżej przedstawiona tabela 1 zawiera dane pochodzące z oznaczeń zawartości 9 preparatów otrzymanych z wychmielin sposobem według wynalazku. W tabeli przedstawiono zawartość polifenoli ogółem (oznaczoną zgodnie z pkt. 3 niniejszego przykładu), flawanoli (oznaczonych zgodnie z pkt. 4 niniejszego przykładu) oraz proantocyjanidyn oznaczonych zgodnie z pkt. 5 niniejszego przykładu).Table 1 below shows the data obtained from the determination of the content of 9 preparations obtained from leachates by the method of the invention. The table shows the content of total polyphenols (determined according to item 3 of this example), flavanols (determined according to item 4 of this example) and proanthocyanidins determined according to item 5 of this example).

T a b e l a 1T a b e l a 1

Zawartość polifenoli w preparacie wychmielinThe content of polyphenols in the preparation of leachelins

Nr preparatu No preparation Zawartość (mg/g preparatu) Content (mg / g of preparation) Polifenole ogółem Total polyphenols Flawanole Flavanols Proantocyjanidyny Proanthocyanidins 1 1 232,99 ± 21,62 232.99 ± 21.62 119,83 ± 5,78 119.83 ± 5.78 93,40 ± 4,37 93.40 ± 4.37 2 2 244,83 ± 15,34 244.83 ± 15.34 121,41 ± 2,64 121.41 ± 2.64 87,82 ± 4,17 87.82 ± 4.17 3 3 247,24 ± 14,63 247.24 ± 14.63 126,10 ± 5,25 126.10 ± 5.25 98,47 ± 3,04 98.47 ± 3.04 4 4 198,50 ± 10,33 198.50 ± 10.33 85,18 ± 3,20 85.18 ± 3.20 81,09 ± 3,19 81.09 ± 3.19 5 5 229,55 ± 5,67 229.55 ± 5.67 100,10 ± 3,67 100.10 ± 3.67 96,64 ± 7,16 96.64 ± 7.16 6 6 242,59 ± 13,38 242.59 ± 13.38 123,01 ± 7,06 123.01 ± 7.06 95,91 ± 6,73 95.91 ± 6.73 7 7 258,07 ± 11,03 258.07 ± 11.03 134,85 ± 3,42 134.85 ± 3.42 99,23 ± 8,07 99.23 ± 8.07 8 8 252,82 ± 17,26 252.82 ± 17.26 121,01 ± 5,85 121.01 ± 5.85 87,11 ± 2,20 87.11 ± 2.20 9 9 248,41 ± 2,94 248.41 ± 2.94 127,09 ± 5,08 127.09 ± 5.08 106,03 ± 3,45 106.03 ± 3.45 średnia average 239,44 ± 17,75 239.44 ± 17.75 117,62 ± 15,32 117.62 ± 15.32 93,97 ± 7,54 93.97 ± 7.54

P r z y k ł a d 2P r z k ł a d 2

1. Przygotowanie badanych preparatów polifenolowych.1. Preparation of tested polyphenolic preparations.

Do badania włączono ekstrakt otrzymany zgodnie ze sposobem opisanym w pkt. 1 przykładu 1. Badany preparat zawierający ekstrakt z wychmielin oznaczony został w niniejszym przykładzie jako EO4. Do każdego cyklu badań przygotowano roztwór roboczy ze stałego preparatu polifenolowego otrzymanego według procedury opisanej w pkt. 1 przykładu 1, o stężeniu w przeliczeniu na kwas galusowy 5 mg/ml w 10% DMSO. Uzyskany roztwór sączono na jałowych filtrach 0,22 μm przeznaczonych do sączenia cieczy agresywnych. Po sączeniu, z jałowego roztworu wyjściowego 5 mg/ml sporządzano odpowiednie roztwory pośrednie preparatu, które dodawano w odpowiedniej objętości do hodowli komórek śródbłonka naczyniowego do uzyskania końcowych stężeń 1 i 6 μg/ml.The extract obtained in accordance with the method described in point 1 of Example 1. The test preparation containing leachyelin extract is designated EO4 in this example. For each test cycle, a working solution was prepared from a solid polyphenol preparation obtained according to the procedure described in point 1 of Example 1 at a concentration of 5 mg / ml based on gallic acid in 10% DMSO. The obtained solution was filtered on sterile 0.22 μm filters designed for filtering off aggressive liquids. After filtration, from a sterile 5 mg / ml stock solution, appropriate intermediate solutions were prepared and added in the appropriate volume to the vascular endothelial cell culture to obtain final concentrations of 1 and 6 µg / ml.

2. Materiał badawczy2. Research material

Materiał badawczy stanowiły ludzkie komórki śródbłonka naczyniowego izolowane z żyły pępowinowej (HUVEC, Human Umbilical Vascular Endothelium Cells) oraz ludzkie płytki krwi izolowane z krwi zdrowych dawców.The research material consisted of human umbilical vascular endothelium cells (HUVEC) and human platelets isolated from the blood of healthy donors.

3. Metodyka badań3. Research methodology

Badania prowadzone były zgodnie ze standardowymi metodami znanymi w stanie techniki. Dla oznaczenia ekspresji CD39 na powierzchni komórek śródbłonka oraz CD62 i PAC-1 na powierzchni płytek krwi, fosforylacji Ser1177 i Thr495 w eNOS (FlexSet) stosowano cytometrię przepływową. Metody kolorymetryczne stosowano dla oznaczenia białka kitem BCA.The tests were carried out according to standard methods known in the art. Flow cytometry was used to determine CD39 expression on endothelial cells and CD62 and PAC-1 on platelet surface, phosphorylation of Ser1177 and Thr495 in eNOS (FlexSet). Colorimetric methods were used for protein determination with BCA kit.

Ekspozycja komórek śródbłonka na preparat polifenolowy EO4 w stężeniach 1 lub 6 μ/ml wynosiła 24 godziny. Układem kontrolnym były komórki śródbłonka nietraktowane EO4.Exposure of endothelial cells to the polyphenolic preparation EO4 at concentrations of 1 or 6 μ / ml was 24 hours. Endothelial cells untreated with EO4 were the control system.

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

Analiza statystyczna uzyskanych wynikówStatistical analysis of the obtained results

Do analizy statystycznej wyników zastosowano test t dla prób sparowanych lub test pojedynczej próby z poprawką Bonferroniego dla porównań wielokrotnych.For statistical analysis of the results, the t-test for paired samples or the single-sample test with Bonferroni correction for multiple comparisons was used.

3. Wyniki3. Results

1/ Ekspresja CD39 na powierzchni komórek ludzkiego śródbłonka naczyniowego1 / Expression of CD39 on the surface of human vascular endothelial cells

W celu sprawdzenia wpływu preparatu polifenolowego EO4 na ekspresję CD39 na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego przeprowadzono 11 niezależnych eksperymentów. Do eksperymentu włączano komórki pomiędzy 3 a 7 pasażowaniem. Średni poziom ekspresji CD39 na powierzchni komórek kontrolnych (nietraktowanych EO4) wynosił 29.0 ± 5.8% (odsetek komórek CD39-pozytywnych).11 independent experiments were performed to test the effect of the EO4 polyphenol preparation on the expression of CD39 on the surface of vascular endothelial cells. Cells between passages 3 and 7 were included in the experiment. The mean level of CD39 expression on the surface of control cells (untreated with EO4) was 29.0 ± 5.8% (percentage of CD39 positive cells).

Zaobserwowano, że preparat EO4 zwiększa poziom ekspresji CD39 na powierzchni komórek a efekt ten zależy od stężenia preparatu. Istotne zwiększenie o 50% stwierdzono dla stężenia 6 pg/ml EO4 w porównaniu do komórek nieinkubowanych z polifenolem (ρ<0,01).It was observed that the EO4 preparation increases the level of CD39 expression on the cell surface and this effect depends on the concentration of the preparation. A significant increase of 50% was found for the concentration of 6 pg / ml EO4 compared to cells not incubated with polyphenol (ρ <0.01).

Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, iż preparat polifenolowy EO4 zwiększa ekspresję CD39 (NTPDazy) na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego po 24-godzinnej inkubacji z preparatem EO4, a efekt ten utrzymuje się przez kolejne 24 godziny mimo usunięcia EO4 z medium komórkowego.The conducted research allowed to conclude that the polyphenolic preparation EO4 increases the expression of CD39 (NTPDase) on the surface of vascular endothelial cells after 24-hour incubation with the preparation EO4, and this effect persists for the next 24 hours despite the removal of EO4 from the cell medium.

Uzyskane wyniki wskazują, że preparat EO4 może przyczyniać się do zwiększonego przeciwpłytkowego działania komórek śródbłonka, które poprzez ekspresję CD39 na swojej powierzchni powodują hydrolizę ADP, podstawowego stymulatora płytek krwi.The obtained results indicate that the preparation of EO4 may contribute to the increased antiplatelet effect of endothelial cells which, by expressing CD39 on their surface, cause the hydrolysis of ADP, the primary stimulator of platelets.

2/ Aktywność syntazy tlenku azotu (eNOS) - oznaczenie fosforylacji Ser1177 i Thr 4952 / Activity of nitric oxide synthase (eNOS) - determination of the phosphorylation of Ser1177 and Thr 495

Oznaczenie stopnia fosforylacji Ser1177 i Thr495 wykonano w lizatach komórek śródbłonka eksponowanych na działanie preparatu EO4 w stężeniach 0, 1 i 6 pg/ml przez 24 godziny. Wykonano 10 eksperymentów. Do oznaczeń zastosowano metodę monitorowania poziomu fosforylacji eNOS w cytometrze przepływowym (Phospho eNOS (S1177) i Phospho eNOS (T495) Flex Set). Zaobserwowano istotne zwiększenie poziomu fosforylacji Ser1177 po działaniu EO4 dla obu testowanych stężeń w porównaniu do komórek nietraktowanych EO4 (254,6 ± 15,6 dla 1 pg/ml i 328,2 ± 20,4 dla stężenia 6 pg/ml vs. 221,4 ± 16,4 dla kontroli, ρ<0,01). Jednocześnie stwierdzono istotne obniżenie stopnia fosforylacji dla Thr495 pod wpływem działania EO4 (255,9 ± 46,4 w kontroli, 196,8 ± 30,8 dla stężenia 1 pg/ml i 168,1 ± 27,8 dla stężenia 6 pg/ml). Zatem, uzyskane wyniki badania poziomu fosforylacji w eNOS wskazują na istotny wpływ preparatu EO4 na modulowanie fosforylacji aminokwasów w białku, a w efekcie zwiększenie aktywności eNOS i nasilenie produkcji NO przez komórki śródbłonka.Determination of the degree of phosphorylation of Ser1177 and Thr495 was performed in lysates of endothelial cells exposed to the EO4 preparation at concentrations of 0, 1 and 6 pg / ml for 24 hours. 10 experiments were performed. The method of monitoring the level of eNOS phosphorylation in a flow cytometer (Phospho eNOS (S1177) and Phospho eNOS (T495) Flex Set) was used for the determinations. There was a significant increase in the level of Ser1177 phosphorylation after treatment with EO4 at both tested concentrations compared to untreated cells with EO4 (254.6 ± 15.6 for 1 pg / ml and 328.2 ± 20.4 for 6 pg / ml vs. 221, 4 ± 16.4 for the control, ρ <0.01). At the same time, a significant reduction in the degree of phosphorylation for Thr495 was found under the influence of EO4 (255.9 ± 46.4 in the control, 196.8 ± 30.8 for the concentration of 1 pg / ml and 168.1 ± 27.8 for the concentration of 6 pg / ml. ). Thus, the obtained results of the study of the level of phosphorylation in eNOS indicate a significant effect of the EO4 preparation on the modulation of amino acid phosphorylation in the protein and, consequently, an increase in eNOS activity and an increase in NO production by endothelial cells.

3/ Ocena oddziaływania płytek krwi z komórkami śródbłonka eksponowanymi na EO43 / Assessment of the interaction of platelets with endothelial cells exposed to EO4

W eksperymencie oceniano ekspresję powierzchniowych markerów aktywacji płytek krwi (CD62, PAC-1) z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Płytki krwi inkubowane były z komórkami śródbłonka eksponowanymi wcześniej na działanie preparatu EO4 w stężeniach 1 i 6 pg/ml. Płytki krwi w obecności komórek śródbłonka stymulowane były 10 pM ADP. Kontrolę stanowiły komórki nietraktowane EO4.In the experiment, the expression of platelet surface activation markers (CD62, PAC-1) was assessed using flow cytometry. Platelets were incubated with endothelial cells previously exposed to EO4 at concentrations of 1 and 6 pg / ml. Platelets in the presence of endothelial cells were stimulated with 10 µM ADP. The controls were cells not treated with EO4.

Wykazano istotne obniżenie ekspresji PAC-1 (aktywnej formy receptora dla fibrynogenu; GPIIbllla) na powierzchni płytek inkubowanych ze śródbłonkiem podanym działaniu EO4 w stężeniu 6 pg/ml w porównaniu do kontroli (p<0,01). Uzyskany wynik potwierdza wcześniejsze obserwacje dotyczące działania EO4 na ekspresję CD39 (istotne zwiększenie ekspresji CD39) oraz na aktywność eNOS (zwiększenie fosforylacji Ser1177 oraz obniżenie fosforylacji Thr495).Significant reduction in the expression of PAC-1 (the active form of the fibrinogen receptor; GPIIbllla) was demonstrated on the surface of plates incubated with endothelium treated with EO4 at a concentration of 6 pg / ml compared to control (p <0.01). The obtained result confirms the earlier observations concerning the effect of EO4 on CD39 expression (significant increase in CD39 expression) and on the activity of eNOS (increase in Ser1177 phosphorylation and decrease in Thr495 phosphorylation).

P r z y k ł a d 3P r z k ł a d 3

Oznaczenie cytotoksycznościDetermination of cytotoxicity

Oznaczenie cytotoksyczności dla preparatu otrzymanego zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 1 i oznaczonego w niniejszym przykładzie jako EO4, zostało wykonane w oparciu o wieloparametryczne zautomatyzowane badanie cytotoksyczności HCS „Cell health assay”, przy użyciu aparatu Thermo Scientific Cellomics® ArrayScan umożliwiającym automatyczną analizę mikroskopową, co pozwala na zbadanie uszkodzeń struktur komórkowych wywołanych przez analizowany preparat. Dzięki użyciu 3 barwników fluorescencyjnych (MitoTracker - lnvitrogen, YO-PRO 1 - lnvitrogen, Hoechst 33342 - Sigma) przeprowadzono ocenę wpływu badanych ekstraktów na rozmiar i morfologię jądra, integralność błony cytoplazmatycznej oraz aktywność mitochondriów. Testy przeprowadzono na płytkach 96-dołkowych przy użyciu 5 linii komórkowych (HepG2, HMEC-1, A549, Caco-2, 3T3). Pomiary przeprowadzono przy użyciu automatycznej stacji pipetującej JANUS firmy PerkinThe cytotoxicity determination for the preparation prepared according to the method described in Example 1 and designated as EO4 in this example was performed based on the HCS "Cell health assay" multi-parameter automated cytotoxicity test, using the Thermo Scientific Cellomics® ArrayScan apparatus enabling automatic microscopic analysis, which allows to examine damage to cellular structures caused by the analyzed preparation. Thanks to the use of 3 fluorescent dyes (MitoTracker - Invitrogen, YO-PRO 1 - Invitrogen, Hoechst 33342 - Sigma), the influence of the tested extracts on the size and morphology of the nucleus, the integrity of the cytoplasmic membrane and the activity of mitochondria was assessed. Assays were performed in 96-well plates using 5 cell lines (HepG2, HMEC-1, A549, Caco-2, 3T3). The measurements were performed using the Perkin JANUS automatic pipetting station

PL 226 894 B1PL 226 894 B1

Elmer. Preparat zbadano w 5 stężeniach, pomiary wykonano w duplikatach w 5 niezależnych powtórzeniach.Elmer. The formulation was tested at 5 concentrations, measurements were made in duplicate with 5 independent replications.

Na podstawie nieprzetworzonych danych eksperymentalnych przeprowadzono analizę statystyczną znamienności zaobserwowanych różnic w wartościach średnich dla trzech wybranych parametrów pomiarowych, mierzących natężenie fluorescencji i powierzchnię wybarwioną w komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych. Wybrane parametry obrazują:On the basis of raw experimental data, a statistical analysis of the significance of the observed differences in mean values for three selected measurement parameters measuring the intensity of fluorescence and the surface stained in cells with fluorescent dyes was performed. The selected parameters illustrate:

1. Powierzchnię jądra komórkowego (Hoechst (Sigma)1. The surface of the cell nucleus (Hoechst (Sigma)

2. Akumulację barwnika YO-PRO1 (lnvitrogen) wskazującą na uszkodzenie błony cytoplazmatycznej2. Accumulation of YO-PRO1 dye (Invitrogen) indicating damage to the cytoplasmic membrane

3. Potencjał mitochondrialny (MitoT racker - lnvitrogen)3. Mitochondrial potential (MitoT racker - Invitrogen)

Następnie statystycznie znamiennym różnicom dla każdego testowanego stężenia każdej substancji, które wskazują na zmiany morfologiczne i funkcjonalne w komórkach obrazujące działanie cytotoksyczne, przypisano wartości punktowe zgodnie z przedstawionym poniżej schematem oceny obserwowanych efektów.Subsequently, statistically significant differences for each tested concentration of each substance, which indicate morphological and functional changes in cells showing cytotoxic effect, were assigned point values according to the schema for evaluating the observed effects presented below.

Różnice podlegające punktacji:Scoring differences:

1. Zmniejszenie lub zwiększenie powierzchni jądra1. Reduction or increase in the surface area of the testicle

2. Wzrost akumulacji YO-PRO12. Increase in accumulation of YO-PRO1

3. Spadek potencjału mitochondrialnego3. Fall in mitochondrial potential

Poniższa tabela 2 ilustruje przypisane wartości punktowe przyznawane badanym preparatom w teście „Cell health assay”.Table 2 below illustrates the assigned score values for the test specimens in the "Cell health assay" test.

T a b e l a 2T a b e l a 2

Wartości punktowe przyjęte w teście „Cell health assay”.Point values adopted in the "Cell health assay" test.

Zdarzenie Happening Punkty Points Maksymalna liczba pkt. Maximum number of points Istotna różnica w jednej linii komórkowej Significant difference in one cell line 0.2 za każde zdarzenie 0.2 for each event 3 3 Ta sama różnica w więcej niż jednej linii komórkowej Same difference in more than one cell line 1 za każdą kolejną linię 1 for each additional line 12 12 Więcej niż jedna różnica w jednej linii More than one difference on one line 1 za każdą kolejną różnicę 1 for each subsequent difference 10 10

Poniżej przestawiona tabela 3 ilustruje działanie cytotoksyczne preparatu polifenolowego (EO4) w oparciu o kumulatywny indeks cytotoksyczności obliczany dla każdej z badanych substancji na podstawie wyników uzyskanych w wieloparametrycznym pomiarze „cell health assay”.Table 3 below illustrates the cytotoxic activity of the polyphenol preparation (EO4) based on the cumulative cytotoxicity index calculated for each of the test substances based on the results obtained with the multi-parameter cell health assay.

T a b e l a 3T a b e l a 3

Pomiar cytotoksyczności preparatu polifenolowego z zastosowaniem naringiny jako kontroli negatywnej oraz kaempferolu jako kontroli pozytywnej.Measurement of cytotoxicity of a polyphenol preparation using naringin as a negative control and kaempferol as a positive control.

5 pg/ml 5 pg / ml 10 pg/ml 10 pg / ml 30 pg/ml 30 pg / ml 40 pg/ml 40 pg / ml 50 pg/ml 50 pg / ml Suma Sum Naringina Naringin 0,0 0.0 0,0 0.0 0,2 0.2 1,4 1.4 0,2 0.2 1,8 1.8 EO4 EO4 0,0 0.0 0,0 0.0 0,2 0.2 2,6 2.6 5,0 5.0 7,8 7.8 Kaempferol Kaempferol 2,6 2.6 1,4 1.4 8,4 8.4 8,4 8.4 6,2 6.2 27,0 27.0

Uzyskane wyniki wskazują, że badany preparat polifenolowy nie jest cytotoksyczny w stężeniach poniżej niż 30 pg/ml.The obtained results indicate that the tested polyphenol preparation is not cytotoxic at concentrations below 30 pg / ml.

Claims

Claims 1. Defatted extract of leachelin from which lipophilic compounds, including prenylflavonids, have been removed, for use in the treatment or prophylaxis of cardiovascular disease in humans or animals, said treatment or prophylaxis being related to the modulation of vascular endothelial activity.

2. The extract for use according to claim 1 The method of claim 1, wherein the disease is atherosclerosis, ischemic heart disease, aortic and peripheral vascular diseases, peripheral vein diseases, venous thromboembolism.

PL 226 894 B1

Pharmaceutical composition for use in the treatment or prophylaxis of cardiovascular diseases in humans or animals, said treatment or prophylaxis being related to the modulation of vascular endothelial activity, comprising the active ingredient and optionally auxiliary agents, characterized in that the active ingredient is a defatted extract from leachelins from which lipophilic compounds, including prenylflavonids, have been removed.