PL226610B1 - Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego oraz zastosowanie nanoluminoforów domieszkowanych jonami lantanowców do wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego oraz zastosowanie nanoluminoforów domieszkowanych jonami lantanowców do wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego mający zastosowanie w mikroskopii wysokorozdzielczej STED.

Mikroskopia STED (ang. STimulated Emission Depletion) została wynaleziona przez niemieckiego fizyka Stefana Hell'a. Jest to technika, która pozwala na obrazowanie z rozdzielczością poniżej limitu dyfrakcji co jest niezwykle ważne w przypadku obrazowania np. struktur komórkowych o rozmiarach od 10 do 200 nm. Idea mikroskopii STED polega na zastosowaniu, prócz właściwej konfokalnej wiązki wzbudzającej, dodatkowej wiązki promieniowania, która ma za zadanie wygaszanie fluorescencji na obrzeżach wzbudzonego punktu. Jest to możliwe dzięki użyciu dwóch wiązek światła o odpowiednio ukształtowanym profilu poprzecznym. W typowej konfiguracji pierwsza wiązka - wzbudzająca - ma profil gaussowski, druga wiązka - wygaszająca - ma profil obwarzanka, z tym, że druga wiązka oświetla ten sam obszar próbki zwykle z niewielkim opóźnieniem w stosunku do pierwszej wiązki. Pozwala to zainicjować stymulowaną emisję, czyli w sposób intencjonalny wygasić emisję próbki z obszarów oświetlonych drugą wiązką. Pomiar luminescencji wzbudzonego w ten sposób obszaru pochodzi ze znacznie ograniczonej przestrzennie objętości i pozwala na rejestrację obrazów z rozdzielczością (~30-80 nm) przewyższającą rozdzielczość tradycyjnych mikroskopów konfokalnych (tj. ~400-500 nm). Aktualnie do obrazowania szeroko stosowane są barwniki fluorescencyjne, które niekorzystnie podlegają fotowybielaniu i nieodwracalnej degradacji, co uniemożliwia prowadzenie długotrwałej obserwacji próbek. Dodatkowo barwniki te wymagają zwykle wzbudzenia w zakresie UV/niebieskim, co odpowiada za wzbudzenie endogennej fluorescencji chromoforów organicznych (tzw. autofluorescencji) i podnosi sygnał tła istotnie ograniczając stosunek użytecznego sygnału do szumu, a tym samym ograniczając czułość detekcji. Fluorescencji chromoforów organicznych nie można praktycznie odróżnić od autofluorescencji, ani w dziedzinie długości fali, ani w dziedzinie czasu. W szczególności wymienione czynniki ograniczają możliwość prowadzenia obserwacji próbek invivo lub próbek o grubości > 100 μm. Aktualnie do obrazowania wysokorozdzielczego stosuje się impulsowy tryb pracy przestrajalnych femtosekundowych laserów wzbudzających (np. Ti:szafir), co wiąże się z koniecznością precyzyjnej synchronizacji pracy obu wiązek promieniowania laserowego (tj. wiązki wzbudzającej i wygaszającej) z dokładnością do femtosekund lub pikosekund.

Z opisu patentowego US20100176307 znany jest sposób wysokorozdzielczego obrazowania struktur biologicznych z wykorzystaniem cząsteczek barwnika fluorescencyjnego, który wybarwia badane struktury. Sposób według przytoczonego wynalazku wykorzystuje dwie długości fali, pierwszą, do wzbudzenia emisji spontanicznej cząsteczek barwnika fluorescencyjnego, drugą, do wygaszenia emisji spontanicznej barwnika fluorescencyjnego w obszarze wokół obszaru pomiarowego. Wygaszeniu ulega obszar, który jest fragmentem pierwszego naświetlonego obszaru z wyłączeniem obszaru pomiarowego znajdującego się w ognisku wzbudzenia. Po podwójnej ekspozycji otrzymano emisję z barwników fluorescencyjnych z bardzo małego obszaru pomiarowego. W przytoczonym patencie wiązka wzbudzająca fluorescencję barwników pochodzi z lasera impulsowego, który jest urządzeniem złożonym i drogim, zwiększając tym samym koszt całego urządzenia do wysokorozdzielczego obrazowania struktur. Opisany w US20100176307 tryb pracy powoduje, że energia impulsu pochodząca z lasera impulsowego jest wielokrotnie większa od energii wiązki pochodzącej z laserów pracy ciągłej, co powoduje również niepożądane fotowybielanie znaczników fluorescencyjnych.

Z kolei patent US20120202216 dostarcza informacji na temat nowych barwników fluorescencyjnych, które mogą być stosowane w mikroskopii ze szczególnym uwzględnieniem STED. Barwniki te są pochodnymi rodaminy i pironiny i zawierają absorbujące promieniowanie UV chromofory, które wzbudzane światłem z zakresu 254-490 nm ulegają fotolizie i generują fluorescencyjne barwniki rodaminę lub pironinę. Konieczność wykorzystania światła z powyższego zakresu może powodować powstawanie autofluorescencji badanych obiektów, która może zakłócać wyniki pomiarów. Koherentne źródła światła z zakresu UV/VIS są zdecydowanie droższe od np. źródeł światła NIR/IR znanych z telekomunikacji światłowodowej. Prowadzi to do wzrostu kosztów budowy impulsowego systemu STED, jak i jego eksploatacji.

Z publikacji naukowej R. Kolesov i inni, „Super-resolution upconversion microscopy of praseodymium-doped yttrium aluminium garnet nanoparticles,” Phys.Rev. B84, 153413 (2011), znane jest wykorzystanie nanocząsteczek domieszkowanych jonem lantanowca (YAG:Pr) w optycznej mikroskopii STED, które umożliwiają detekcję bez udziału autofluorescencji tła. Zastosowano jon Pr³⁺

PL 226 610 B1 ze względu na krótki czas życia poziomu 4f5d na 34000 cm^-1 (~18 ns), duży przekrój czynny przejść f-d i możliwość wzbudzenia poprzez konwersję energii w górę (tu 609 nm z impulsowego lasera barwnikowego z Rodaminą 6G i lasera 532 nm). W publikacji wykazano, że pod wpływem wiązki 609 nm ₁ następowała populacja poziomu¹D2, chyba, że przed odczytem następowało naświetlenie promienio₁ waniem 532 nm (w kształcie obwarzanka), które ze względu na długi czas życia stanu ¹D2 (~150 ₁

-200 ąs) prowadziło do absorpcji ze stanu wzbudzonego ( D₂ >4f5d) i szybką (~18 ns) emisję fotonów d >f. W ten sposób uzyskano ograniczone przestrzennie wzbudzenie w centrum wiązki (pompa

3+ 1 + obwarzanek) jonów Pr³⁺ do poziomu ¹D2. Odczyt następował ponownie za pomocą wiązki 532 nm, 3+ 3 która ze względu na brak rezonansu nie wzbudza jonów Pr³⁺ ze stanu podstawowego ³H4, ale ze 11 względu na długi czas życia poziomu ¹D2, pozwala na absorpcję ze stanu wzbudzonego ¹D2>4f5d tylko w centrum obwarzanka (pozostałe jony Pr³⁺ zostały aktywnie „wygaszone” przed odczytem). Przytoczone wykorzystanie nanocząstek domieszkowanych jonem Pr³⁺ w obrazowaniu poniżej poziomu dyfrakcyjnego wymaga przestrajalnych źródeł światła laserowego z zakresu VIS, które są złożone w konstrukcji, niewygodne w użyciu i drogie, tak jak laser barwnikowy 609 nm stosowany jako pompa w przytoczonej publikacji. Ponadto, w opisanej publikacji wykorzystano depopulację poziomów pośrednich, które wykazują relatywnie krótsze czasy życia. Wykorzystanie poziomów pośrednich skutkuje również niekorzystnie większym poziomem skomplikowania schematu wzbudzenia, wygaszania i odczytu sygnału. Schemat wzbudzenia opiera się bowiem na zjawisku wzbudzenia ze stanu wzbudzonego (ang. excited state absorption), którego przekrój czynny i prawdopodobieństwo jest kilka rzędów mniejsze niż typowe zjawisko konwersji energii w górę z wykorzystaniem sumowania fotonów (APTE) w jonach lantanowców lub parach lantanowców.

Z kolei publikacja naukowa K. Willing i inni, „STED microscopy with continuous wave beams”, Nature Methods, vol4. No.11 (2007), 915-918, przedstawia wykorzystanie trybu pracy ciągłej (CW ang. Continuous wave) STED, które uprasza implementację nanoskopii (mikroskopii wysokorozdzielczej) i pozwala potencjalnie uzyskać lepszą rozdzielczość nie tylko w płaszczyźnie X-Y, ale również w objętości 3D. Niemniej jednak ze względu na stosowane barwniki, zastosowano m.in. przestrajalny laser CW na 760 nm (Ti:szafir). W pracy tej wykorzystano barwniki organiczne (np. Atto647N, Atto565), które wykazują typowe dla barwników organicznych niedostatki, tzn. podlegają fotowybielaniu. Nanoskopia CW STED nie może być również stosowany w przypadku barwników wykazujących istotną absorpcję single-tryplet. Jest to szczególnie istotne, ponieważ w przypadku pracy ciągłej minimalna wymagana intensywność wiązki STED jest około 4 razy większa niż w trybie pracy impulsowej i 10-15 krotnie mniejsza niż intensywność w 250 ps impulsie STED. Ponadto o ile uproszczono konstrukcję nanoskopu eliminując femto- lub -piko sekundowe źródła światła z laserów przestrajalnych, konieczność korzystania z laserów przestrajalnych nadal pozostaje, gdyż brak jest komercyjnie dostępnych np. półprzewodnikowych źródeł laserowych CW w zakresie 680-770nm.

Zatem nadal istnieje potrzeba dostarczenia nowych sposobów wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego oraz nowych fluoroforów dedykowanych STED, które uproszczą konstrukcję układu mikroskopowego STED, wykorzystają tanie i dobrze znane technologie laserów na ciele stałym pompowanych diodą laserową oraz lasery półprzewodnikowe, będą eliminować autofluorescencję badanych obiektów, będą wykorzystywać nie toksyczne znaczniki fluorescencyjne umożliwiając ich wykorzystanie w biologii i medycynie, pozwolą na obrazowanie grubych próbek takich jak tkanki, o grubości powyżej 100 ąm, poprawią stosunek sygnału do szumu zwiększając tym samym czułość metody obrazowania oraz pozwolą na długotrwałe obserwacje umożliwiające badanie kinetyki procesów biologicznych. Nieoczekiwanie wspomniane problemy rozwiązał prezentowany wynalazek.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego obejmujący następujące etapy:

a) wybarwia się badaną strukturę znacznikami fluorescencyjnymi,

b) oświetla się badaną strukturę wiązką światła będącą złożeniem dwóch wiązek laserowych pracujących w trybie pracy ciągłej, przy czym co najmniej wiązka wzbudzająca pochodzi z zakresu bliskiej podczerwieni, gdzie wiązka wzbudzająca o pierwszej długości fali (X_EXC) posiada profil gaussowski oraz wiązka wygaszająca STED o drugiej długości fali (X_STED) posiadająca profil obwarzanka, powodując wymuszenie emisji świetlnej, czyli wyświecenie się barwników fluorescencyjnych oznaczających badaną strukturę w obszarach obwarzanka wokół punktu pomiarowego,

c) po czasie t_DELAY > 0s, niezbędnym do aktywnego wygaszenia luminescencji znaczników za pomocą wiązki o profilu obwarzanka, rejestruje się intensywność emisji ze znaczników

PL 226 610 B1 fluorescencyjnych ze środka wiązki dla długości fali pomiarowej (X_emi) różnej od długości fali wzbudzającej (ź-_exc) i wygaszającej (X_STED),

d) przechodzi się do następnego punktu pomiarowego, charakteryzujący się tym, że znacznikami fluorescencyjnymi są nanokrystality NaYF4 współdomieszkowane jonami ziem rzadkich, a pierwsza - wzbudzająca wiązka laserowa posiada długość fali z zakresu bliskiej podczerwieni. Korzystnie między etapem c) i d) niewygaszony obszar oświetla się za pomocą pierwszej wiązki laserowej o pierwszej długości fali posiadającej profil gaussowski powodując wygaszenie emisji świetlnej z barwników fluorescencyjnych. Równie korzystnie, jako znaczniki fluorescencyjne stosowane są nanokrystality domieszkowane jonami ziem rzadkich posiadające poziomy energetyczne charakteryzujące się długimi czasami życia od 10^-6 do 10^-3 s (tzw. poziomy metastabilne). W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku znaczniki fluorescencyjne są domieszkowane lub współdomieszkowanie jonami ziem rzadkich z grupy obejmującej neodym, iterb, terb, tul albo ich kombinacji. W następnej korzystnej realizacji wynalazku wygaszeniu STED podlega poziom metastabilny na długości fali innej niż długość fali obserwacji i wzbudzenia, a różnica długości fali pomiędzy wzbudzającą wiązką laserową, wygaszającą wiązką laserową i emisją świetlną ze znaczników fluorescencyjnych wynosi co najmniej 30 nm.

Drugim przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nanoluminoforów domieszkowanych jonami lantanowców do oznaczania badanych struktur w wysokorozdzielczym obrazowaniu fluoroscencyjnym, charakteryzujący się tym, że nanoluminoforami są nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami ziem rzadkich wybranych z grupy obejmującej neodym, iterb, terb, tul albo ich kombinacji. Korzystnie nanokrystality domieszkowane jonami ziem rzadkich posiadają poziomy metastabilne charakteryzujące się długimi czasami życia poziomów wzbudzonych od 10^-6 do 10^-3 s. Równie korzystnie różnica długości fali pomiędzy wzbudzającą wiązką laserową, wygaszającą wiązką laserową i emisją świetlną z nanoluminoforów domieszkowanych jonami lantanowców wynosi co najmniej 30 nm.

Najważniejszą zaletą przedstawianego wynalazku jest wykorzystanie odpowiedniej i dotychczas nie stosowanej kombinacji wiązek światła wzbudzającego znaczniki fluorescencyjne mające postać nanoluminforów domieszkowanych jonami ziem rzadkich, które absorbują promieniowanie z zakresu bliskiej podczerwieni oraz wykazują długie czasy życia poziomów wzbudzonych, co pozwala wyeliminować niepożądaną autofluorescencję badanych obiektów. Dzięki doskonale znanej i opracowanej technologii laserów na ciele stałym i laserów półprzewodnikowych oraz detektorów z zakresu promieniowania widzialnego i NIR, możliwe jest znaczące uproszczenie układu pomiarowego i wykorzystanie relatywnie tanich elementów składowych. Wykorzystując do wzbudzania bliską podczerwień 808 lub 980 nm można obrazować grube próbki biologiczne dzięki znacznie mniejszemu rozpraszaniu światła NIR co poprawia stosunek sygnału do szumu, zwiększając tym samym czułość metody. Znaczniki fluorescencyjne posiadają długi czas życia, rzędu 10^-6-10^-3 s, dzięki czemu można zastosować dużo prostsze i tańsze półprzewodnikowe źródła światła ciągłego (zamiast bardzo skomplikowanych przestrajalnych i impulsowych laserów femtosekundowych). Znaczniki te ponadto charakteryzują się brakiem fotowybielania co pozwala na długotrwałe obserwacje, m.in. badanie kinetyki procesów biologicznych. Ponadto różnica długości fali (tzw. przesunięcie Stokesa) pomiędzy wzbudzającą wiązką laserową, wygaszającą wiązką laserową i emisją świetlną ze znaczników luminescencyjnych wynosi co najmniej 30 nm, co pozwala znacząco uprościć układ detekcyjny systemu do obrazowania oraz zwiększyć jego czułość. O ile te cechy lantanowców są doskonale znane [A. Gnach, A. Bednarkiewicz, NanoToday 2012], nie stosowano ich w nanoskopii STED. Stymulowana emisja z jonów lantanowców jest znana w laserach na ciele stałym, jednak wówczas stymulowana emisja służy do osiągnięcia wzmocnienia w ośrodku laserowym i nie ma nic wspólnego z poprawą rozdzielczości obrazowania w nanoskopii.

Przykłady realizacji wynalazku przedstawiono na załączonym rysunku, na którym na Fig. 1 przedstawia poziomy energetyczne jonu Nd³+ i mechanizm wzbudzenia (Xexc) i depopulacji (XSTED) prowadzący do przestrzennie ograniczonego punktu pomiarowego do centrum „obwarzanka” z emisją na długości fali XEMI inną niż długość fala Xexc i XSTED, Fig. 2 przedstawia poziomy energetyczne jonu Yb³+ i Tm³+ oraz mechanizm wzbudzenia (Xexc) i depopulacji (A_STED) prowadzący do przestrzennie ograniczonego punktu pomiarowego do centrum „obwarzanka” z emisją na długości fali X_EMI inną niż długość fala X_exc i X_STED, natomiast Fig. 3 przedstawia poziomy energetyczne jonu Yb³+ i Tb³+ oraz mechanizm wzbudzenia (X_exc) i depopulacji (X_STED) prowadzący do przestrzennie ograniczonego punktu pomiarowego do centrum „obwarzanka” z emisją na długości fali X_EMI inną niż długość fala X_exc ⁱ Ated·

PL 226 610 B1

P r z y k ł a d 1

Jako znacznik luminescencyjny wykorzystano nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami neodymu Nd³⁺. Poziomy energetyczne jonu Nd³⁺ oraz schemat wzbudzenia STED zostały przedstawione na rysunku Fig. 1. Nanokrystality domieszkowane jonami Nd³⁺ wzbudzano wiązką światła CW będącego złożeniem wiązek A_EXC = 808 nm oraz X_STED = 1064 nm. Wiązka 808 nm miała profil gaussowski i odpowiadała za wzbudzenie jonów Nd³+ ze stanu podstawowego ⁴l9/2 do stanu wzbudzonego ⁴F5/2. Następowała szybka bezpromienista relaksacja do poziomu metastabilnego ⁴F3/2 o średnim czasie życia około 250-400 gs (Fig. 1a). Pod wpływem skolokalizowanej wiązki XSTED = 1064 nm o kształcie obwarzanka (Fig. 1 b), następowała stymulowana emisja ⁴F3/₂->^4ll11/2 na 1064 nm, powodując opróżnienie poziomów ⁴F3/2 w oświetlonych wiązką X_STED obszarach. W stanie ⁴F3/2 pozostały jedynie te jony wzbudzone, które znajdowały się w centrum obwarzanka (Fig. 1c). W większości materiałów współczynnik podziału (ang. branching ratio) emisji ⁴F3/2 >⁴lJ (J = 9/2, 11/2, 13/2, 15/2) wskazywał na dominację przejścia ⁴F3/2>⁴I11/2 (~55%) nad przejściem ⁴F3/2>⁴I9/2 (~35%), które służyło do odczytu właściwego, ograniczonego przestrzennie, sygnału (XEMi = 860-940 nm, Fig. 1c). Mimo, że czas życia poziomu wzbudzonego ⁴F3/2 był relatywnie długi (~330 gs) i istniała możliwość jego regulacji na etapie syntezy poprzez kontrolę koncentracji domieszki (w zakresie 330-11 gs), ze względu na szybkość skanowania (rejestracja obrazów STED odbywała się w trybie pomiaru konfokalnego poprzez skanowanie obszaru próbki wiązką laserową punkt po punkcie), „czyszczenie” obszaru pomiarowego następuje przy przejściu do kolejnego punktu pomiarowego w sposób automatyczny. Było to realizowane przez oświetlenie kolejnego punktu podwójną wiązką (wzbudzającą w kształcie Gaussowskim i wygaszającą w kształcie obwarzanka) przesuniętą do nowej pozycji. Promieniowanie 1064 nm nie było absorbowane przez jon Nd³+ znajdujący się z wstanie podstawowym ⁴l9/2 (Fig. 1b) jednak na drodze stymulowanej emisji, X_STED wymuszało opróżnienie metastabilnego poziomu ⁴F3/2 do ⁴I11/2 a następnie w wyniku szybkich przejść niepromienistych (NR, Fig. 1d) elektrony wracały na poziom podstawowy ⁴l9_/2.

Ponieważ poziomy wzbudzone wykazywały długie czasy życia łatwo uzyskano inwersję obsadzeń i łatwo wymuszono stymulowaną emisję z poziomów wzbudzonych do poziomów pustych. Prezentowany przykład wykonania wynalazku wykorzystywał dobrze rozwiniętą i relatywnie tanią technologię laserów półprzewodnikowych (λ = 808 nm) oraz laserów na ciele stałym na długości fali 1064 nm obniżając tym samym w sposób istotny koszt budowy urządzenia do obrazowania STED. Dzięki znacznym różnicom długości fali użytych wiązek świetlnych łatwo można było je odseparować od sygnału pomiarowego, co uprościło konstrukcję urządzenia pomiarowego. Promieniowanie z zakresu NIR było znacznie słabiej rozpraszane przez heterogenne obiekty i nie wzbudzało fluorescencji (endoi egzogennych) barwników organicznych, co skutkowało kilkukrotną poprawą stosunku użytecznego sygnału do szumu. Wykorzystanie znaczników luminescencyjnych domieszkowanych jonami lantanowców pozwoliło na pomiary długoczasowe dzięki fotostabilności tych jonów. Wykorzystane znaczniki luminescencyjne wykazywały brak toksyczności, co pozwoliło zastosować je w biologii i medycynie.

P r z y k ł a d 2

Jako znacznik luminescencyjny wykorzystano nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami iterbu (Yb³⁺) i tulu (Tm³⁺). Poziomy energetyczne oraz schemat wzbudzenia STED przedstawiono na Fig. 2. Nanokrystality domieszkowane jonami Yb/Tm były wzbudzane wiązką światła ciągłego (CW) będącego złożeniem wiązek λ^ = 980 nm (np. z diody laserowej) oraz λ^^ = 645 nm (np. z lasera Kr+ lub lasera diodowego). Wzbudzająca wiązka 980 nm miała profil gaussowski i odpowiadała za wzbudzenie jonów Yb³⁺. Następnie, w wyniku konwersji energii w górę następowało wzbudzenie jonu

1 3+ tulu ze stanu podstawowego ³H6 finalnie do stanu wzbudzonego ¹G4 (Tm³⁺). Pod wpływem skolokalizowanej wiązki λ^^ = 645 nm o kształcie obwarzanka (Fig. 2b), następowała stymulowana emisja

3 1

G₄ > F₄ na 645 nm, powodując opróżnienie poziomu G₄ w oświetlonych wiązką λ^^ obszarach.

₁

W stanie ¹G4 pozostały jedynie te jony wzbudzone, które znajdowały się w centrum obwarzanka. Do odczytu właściwego, ograniczonego przestrzennie, sygnału X_EMl = 475 nm, Fig. 2c) służyło przejście

3 1 ¹G4>³H6. Mimo, że czas życia poziomu wzbudzonego ¹G4 był relatywnie długi (~setki gs) i można było go regulować na etapie syntezy kontrolując koncentrację domieszki, ze względu na szybkość skanowania (rejestracja obrazów STED odbywała się w trybie pomiaru konfokalnego poprzez skanowanie obszaru próbki wiązką laserową punkt po punkcie), „czyszczenie” obszaru pomiarowego następowało przy przejściu do kolejnego punktu pomiarowego w sposób automatyczny. Było to realizowane przez oświetlenie kolejnego punktu podwójną wiązką (wzbudzającą w kształcie Gaussowskim i wygaszającą w kształcie obwarzanka) przesuniętą do nowej pozycji. Promieniowanie 645 nm nie było absorbowane

PL 226 610 B1

3+ 3 przez jon Tm³⁺ znajdujący się w stanie podstawowym ^{1 * 3 *}H6 (Fig. 2b) jednak na drodze stymulowanej 13 emisji, X_STED przesuniętej wiązki wymuszało opróżnienie metastabilnego poziomu G₄ do F₄, a na₃ stępnie w wyniku szybkich przejść niepromienistych elektrony wracały na poziom podstawowy ³H6.

Ponieważ poziomy wzbudzone wykazywały długie czasy życia łatwo uzyskano inwersję obsadzeń i łatwo wymuszono stymulowaną emisję z poziomów wzbudzonych do poziomów pustych. Prezentowany przykład wykonania wynalazku wykorzystywał dobrze rozwiniętą i relatywnie tanią technologię laserów półprzewodnikowych na długości fali 645 nm, 980 nm obniżając tym samym koszt budowy urządzenia do obrazowania STED. Dzięki znacznym różnicom długości fali użytych wiązek świetlnych łatwo można było je odseparować od sygnału pomiarowego, co uprościło konstrukcję urządzenia pomiarowego. Wykorzystane promieniowanie z zakresu VIS/NIR (powyżej 500 nm) było znacznie słabiej rozpraszane przez heterogenne obiekty i nie wzbudzało fluorescencji (endo- i egzogennych) barwników organicznych, co skutkowało kilkukrotną poprawą stosunku sygnał do szumu. Dzięki fotostabilności jonów lantanowców, wykorzystanie znaczników luminescencyjnych domieszk owanych jonami lantanowców pozwoliło na pomiary długoczasowe. Wykorzystane znaczniki luminescencyjne wykazują brak toksyczności co pozwala zastosować je w biologii i medycynie.

P r z y k ł a d 3

Jako znacznik luminescencyjny wykorzystano nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami iterbu (Yb³⁺) i terbu (Tb³⁺). Poziomy energetyczne oraz schemat wzbudzenia STED przedstawiono na rysunku Fig. 3. Nanokrystality domieszkowane jonami Yb/Tb były wzbudzane wiązką światła CW będącego złożeniem wiązek XEXC = 980 nm oraz XSTED = 532 nm. Wiązka 980 nm miała profil gaussowski i odpowiadała za wzbudzenie jonów Yb³⁺, a następnie w wyniku konwersji energii w górę ze stanu podstawowego ⁷F6 jonu Tb³⁺ finalnie do stanu wzbudzonego ⁵D4 (Tb³⁺) (Fig. 3a). Pod wpływem skolokalizowanej wiązki XSTED = 532 nm o kształcie obwarzanka (Fig. 3b), następowała stymulowana emisja

7 5

D₄ > F₅ na 540/588 nm, powodując opróżnienie poziomu D₄ w oświetlonych wiązką X_STED obszarach. ₅

W stanie ⁵D4 pozostawały jedynie te jony wzbudzone, które znajdowały się w centrum obwarzanka. Do odczytu właściwego, ograniczonego przestrzennie, sygnału (X_EMI = 588 nm, Fig. 3c) służyło przej5 7 5 ście ⁵D4>⁷F6. Mimo, że czas życia poziomu wzbudzonego ⁵D4 był długi (~pojedyncze ms) i można go było regulować na etapie syntezy kontrolując koncentrację domieszek, ze względu na szybkość skanowania (rejestracja obrazów STED odbywała się w trybie pomiaru konfokalnego poprzez skanowanie obszaru próbki wiązką laserową punkt po punkcie), „czyszczenie” obszaru pomiarowego następuje przy przejściu do kolejnego punktu pomiarowego w sposób automatyczny. Było to realizowane przez oświetlenie kolejnego punktu podwójną wiązką (wzbudzającą w kształcie Gaussowskim i wygaszającą w kształcie obwarzanka) przesuniętą do nowej pozycji. Promieniowanie 532 nm nie było absorbowane przez jony Tb³⁺ znajdujące się w stanie podstawowym ⁷G6 (Fig. 3b) jednak na drodze stymulowanej emisji, X_STED wymuszało opróżnienie metastabilnego poziomu D₄ do F₅, a następnie w wyniku szybkich przejść niepromienistych (Fig. 3d) elektrony wracały na poziom podstawowy ⁷F6 jonu Tb³⁺.

Ponieważ poziomy wzbudzone wykazywały długie czasy życia łatwo uzyskano inwersję obsadzeń i łatwo wymuszono stymulowaną emisję z poziomów wzbudzonych do poziomów pustych. Prezentowany przykład wykonania wynalazku wykorzystywał dobrze rozwiniętą i relatywnie tanią technologię laserów półprzewodnikowych oraz laserów na ciele stałym na długości fali 532 nm oraz 980 nm obniżając tym samym koszt budowy urządzenia do obrazowania STED. Dzięki znacznym różnicom długości fali użytych wiązek świetlnych łatwo można było je odseparować od sygnału pomiarowego co uprościło konstrukcję urządzenia pomiarowego. Wykorzystane promieniowanie z zakresu ViS/NiR (powyżej 500 nm) było znacznie słabiej rozpraszane przez heterogenne obiekty i nie wzbudzało fluorescencji (endo- i egzogennych) barwników organicznych, co skutkowało kilkukrotną poprawą stosunku sygnału do szumu. Wykorzystanie znaczników luminescencyjnych domieszkowanych jonami lantanowców pozwoliło na pomiary długoczasowe dzięki fotostabilności jonów. Wykorzystane znaczniki luminescencyjne wykazują brak toksyczności co pozwala zastosować je w biologii i medycynie.

Claims (8)

1. Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego obejmujący następujące etapy:

a) wybarwia się badaną strukturę znacznikami fluorescencyjnymi,

b) oświetla się badaną strukturę wiązką światła będącą złożeniem dwóch wiązek laserowych pracujących w trybie pracy ciągłej przy czym co najmniej wiązka wzbudzająca pochodzi

PL 226 610 B1 z zakresu bliskiej podczerwieni, wiązka wzbudzająca o pierwszej długości fali (X_EXC) posiada profil gaussowski oraz wiązka wygaszająca STED o drugiej długości fali (X_STED) posiadająca profil obwarzanka, powodując wymuszenie emisji świetlnej, czyli wyświecenie się barwników fluorescencyjnych oznaczających badaną strukturę w obszarach obwarzanka wokół punktu pomiarowego,

c) po czasie t_DELAY > 0s, niezbędnym do aktywnego wygaszenia luminescencji znaczników za pomocą wiązki wygaszającej o profilu obwarzanka, rejestruje się intensywność emisji ze znaczników fluorescencyjnych ze środka wiązki dla długości fali pomiarowej (X_emi) różnej od długości fali wzbudzającej (X_exc) i wygaszającej (X_STED),

d) przechodzi się do następnego punktu pomiarowego, znamienny tym, że znacznikami fluorescencyjnymi są nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami ziem rzadkich, a pierwsza - wzbudzająca wiązka laserowa posiada długość fali z zakresu bliskiej podczerwieni.

2. Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego według zastrz. 1, znamienny tym, że między etapem c) i d) niewygaszony obszar oświetla się za pomocą pierwszej wiązki laserowej o pierwszej długości fali posiadającej profil gaussowski powodując wygaszenie emisji świetlnej z barwników fluorescencyjnych.

3. Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że jako znaczniki fluorescencyjne stosowane są nanokrystality domieszkowane jonami ziem rzadkich posiadające poziomy metastabilne charakteryzujące się długimi czasami życia poziomów wzbudzonych od 10^-6 do 10^-3 s.

4. Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego według zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że znaczniki fluorescencyjne są domieszkowane jonami ziem rzadkich z grupy obejmującej neodym, iterb, terb, tul albo ich kombinacji.

5. Sposób wysokorozdzielczego obrazowania fluoroscencyjnego według zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że wygaszeniu STED podlega poziom metastabilny na długości fali innej niż długość fali obserwacji i wzbudzenia, a różnica długości fali pomiędzy wzbudzającą wiązką laserową, wygaszającą wiązką laserową i emisją świetlną ze znaczników fluorescencyjnych wynosi co najmniej 30 nm.

6. Zastosowanie nanoluminoforów domieszkowanych jonami lantanowców do oznaczania badanych struktur w wysokorozdzielczym obrazowaniu fluoroscencyjnym, znamienne tym, że nanoluminoforami są nanokrystality NaYF4 domieszkowane jonami ziem rzadkich z grupy obejmującej neodym, iterb, terb, tul albo ich kombinacji.

7. Zastosowanie nanoluminoforów według zastrz. 6, znamienne tym, że nanokrystality domieszkowane jonami ziem rzadkich posiadają poziomy metastabilne charakteryzujące się długimi czasami życia poziomów wzbudzonych od 10^-6 do 10^-3 s.

8. Zastosowanie nanoluminoforów według zastrz. 6 i 7, znamienne tym, że różnica długości fali pomiędzy wzbudzającą wiązką laserową, wygaszającą wiązką laserową i emisją świetlną z nanoluminoforów domieszkowanych jonami ziem rzadkich wynosi co najmniej 30 nm.