PL225776B1 - Biosensor hybrydowy do wykrywania katecholu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest biosensor hybrydowy przeznaczony do wykrywania katecholu w roztworach wodnych.

Znane są bioczujniki hybrydowe wytwarzane z wykorzystaniem różnych technik samoorganizacji cząstek na powierzchni z kwasów tłuszczowych, fosfolipidów, porfiryn oraz makrostruktur przew odzących.

Powszechnie znane są biosensory, których czułe elementy stanowią: acetylcholinoesteraza, ureaza, oksydaza glukozowa, oraz mutarotaza i inwertaza. Biokatalizatory te zostały unieruchomione w membranach, wytworzonych z albumin oraz innych białek wołowych. Enzymy zostały związane kowalencyjnie w porowatych membranach co zostało np. ujawnione w opisie nr UA27284 (U).

Z innego zgłoszenia patentowego nr KR20130135707 (A) znany jest immunobiosensor, w którym część biologiczna układu immobilizowana jest na cienkim filmie otrzymanym z parylenu (poli-p-ksylilen).

Z opisu wzoru użytkowego nr CN203231995 (U) znany jest biosensor do wykrywania jonów metali szlachetnych i metali ciężkich. Urządzenie tego typu posiada elektrodę pracującą wytworzoną z politetrafluoroetylenu.

Innym bioczujnikiem znanym ze zgłoszenia nr US2010116655 (A1) jest warstwowy sensor do wykrywania katecholamin w organizmie ludzkim, który zbudowany jest z warstwy detekcyjnej w post aci cyklodekstryn oraz elementów biologicznych.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe nr US2003236448 (A1) dotyczy wytwarzania i aplikacji elektrochemicznego sensora biologicznego do wykrywania obecności acetoaminofenonu, kwasu m oczowego i askorbinowego oraz katecholoamin w zakresie potencjału +0,3 do -0,25V.

Polimerowe matryce służące do pułapkowania białek enzymatycznych ujawniono w europejskim opisie patentowym nr EP1826564 (B1).

W ostatnich latach coraz częściej warstwy Langmuira-Schaefera wykorzystywane są w konstrukcji szczególnie selektywnych urządzeń diagnozujących różne substancje w środowisku natura lnym oraz diagnostyce medycznej.

Biosensor hybrydowy do wykrywania katecholu według wynalazku ma warstwę aktywną w postaci tyrozynazy zimmobilizowanej adsorpcyjnie na powierzchni filmu Langmuira-Schaefera zawierającego W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazol.

Korzystnie biosensor utworzony jest z równomolowej mieszaniny W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu oraz tyrozynazy.

Biosensor według wynalazku wytworzony jest z ultracienkiej warstwy i nadaje się do wykrywania katecholu i jego pochodnych w roztworach wodnych. Zaletą biosensora jest jego duża czułość i fakt, że nadaje się do wykrywania małych stężeń katecholu. Nie bez znaczenia jest również dość długa żywotność zimmobilizowanego białka, które zachowuje swoją katalityczną aktywność w ciągu kolejnych 25 cykli reakcyjnych (2 miesiące). Warstwa Langmuira-Schaefera według wynalazku i powtarzalność otrzymanych wyników oraz różne odpowiedzi czujnika zbudowanego z W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu oraz tyrozynazy na różne stężenia katecholu, typują ten materiał do budowy czujników stosowanych w diagnostyce medycznej.

Przedmiot wynalazku jest wyjaśniony w przykładzie realizacji i na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat pracy biosensora białkowego, fig. 2 - wykres zależności relatywnej aktywności białka unieruchomionego w filmie LS od kolejnego cyklu reakcyjnego, fig. 3 ilustruje aktywność tyroz ynazy zimmobilizowanej w filmie zbudowanym z dodatkiem W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu.

P r z y k ł a d

Biosensor hybrydowy zawierający tyrozynazę unieruchomioną adsorpcyjnie w filmach Langmuira-Schaefera, otrzymano z równomolowej mieszaniny W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu oraz tyrozynazy.

Następnie biosensor białkowy B według wynalazku wprowadzono do reaktora mieszalnikowego, o pojemności 25 ml zawierającego 0,2 mM katecholu S jako substratu, a następnie prowadzono reakcję do momentu otrzymania produktu P. Proces i pomiar aktywności zimmobilizowanego białka (tyrozynazy) prowadzono w temperaturze 30°C, w 0,1 molowym buforze fosforanowym o pH 7,0. Zmianę absorbancji notowano przy użyciu spektrofotometru PR typu UNICAM HELIOS-α. Spektrofotometr UNICAM HELIOS-a w trakcie prowadzonego procesu zmieniał sygnał chemiczny na mierzalny

PL 225 776 B1 sygnał optyczny SY. W trakcie prowadzonego procesu, pomiary absorpcyjne rejestrowano przy długości fali równej 400 nm.

Aktywność białek zimmobilizowanych, przedstawiono na fig. 2 jako funkcję liczby jednostek aktywności U na 1 cm otrzymanego filmu LS w czasie kolejnych reakcji. Za 1 U przyjęto taką ilość białka, która w warunkach testu powoduje zmianę absorbancji o 0,0001 w ciągu jednej minuty. Omawiane badania nad aktywnością tyrozynazy były wykonywane przy zastosowaniu katecholu.

W przedstawionym na fig. 3 wykresie uwidaczniającym porównanie aktywności danych jednoznacznie wynika, że wprowadzenie do filmu Langmuira-Schaefera W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu powoduje wzrost aktywności zimmobilizowanego białka o około 40%. Z przeprowadzonych badań wynika, że obecność W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu w filmach LS ze względu na mediacyjny charakter elektroprzewodzącego układu, usprawnia transport elektronów, przez co znacznie poprawia aktywność katalityczną unieruchomionego białka.

Zaobserwowano duże różnice w aktywności tyrozynazy pułapkowanej w filmie LS otrzymanym z dodatkiem lub bez W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu. Efekt ten związany jest z rolą W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu jako elektronowego mediatora procesu.

Długość życia zimmobilizowanego białka według wynalazku wynosi co najmniej 2 miesiące. Stała, wysoka zdolność utleniania substratu zachowana jest przez kolejne 25 cykli reakcyjnych.

Claims (2)

1. Biosensor hybrydowy do wykrywania katecholu, znamienny tym, że ma warstwę aktywną w postaci tyrozynazy zimmobilizowanej adsorpcyjnie na powierzchni filmu Langmuira-Schaefera zawierającego W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazol.

2. Biosensor według zastrz. 1, znamienny tym, że utworzony jest z równomolowej mieszaniny W-heksylo-3,6-bis(5-benzofurazano)karbazolu oraz tyrozynazy.