PL224489B1 - Elektrodowy nanosensor biochemiczny oraz sposób wytwarzania elektrodowego nanosensora biochemicznego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest elektrodowy nanosensor biochemiczny przeznaczony zwłaszcza do pomiarów w roztworach oraz sposób wytwarzania elektrodowego nanosensora biochemicznego za pomocą zogniskowanej wiązki jonów (FIB). Układy sensorowe wytwarzane w procesach nanotechnologicznych są wykorzystywane w analizach biochemicznych, w diagnostyce medycznej, czy w walce z bioterroryzmem.

Z poniższych publikacji znane są zminiaturyzowane systemy biosensorowe pracujące w skali manometrycznej: K. Balasubramanian, Challenges in the use of 1D nanostructures for on-chip biosensing and diagnostics: A review, Biosensors and Bioelectronics 26 (2010) 1195-1204, O.A. Sadik i in, Smart electrochemical biosensors: From advanced materials to ultrasensitive devices, Electrochimica Acta 55 (2010) 4287-4295 i G.M. Walker, i in., A Framework for Bioelectronics Discovery and Innovation, National Institute of Standards and Technology (2009), http://www.nist.gov/pml/- /div683/upload/bioelectronics report.pdf. Głównymi zaletami tych systemów jest duża czułość i krótki czas detekcji, co daje im niewątpliwie przewagę nad czujnikami stacjonarnymi. Ze względu na małe wymiary sensory tego rodzaju mogą pracować jako urządzenia przenośne mierzące próbki o niewielkich rozmiarach, nie wymagające specjalnej preparatyki.

Elektrochemiczne biosensory wykonujące analizy w nanometrowych objętościach roztworów mogą być szczególnie przydatne do detekcji bardzo małych w stężeniu ilości bakterii czy wirusów lub ich detekcji w bardzo małych objętościowo próbkach (S. Subramanian i in., Rapid, sensitive and labelfree detection of Shiga-toxin producing Escherichia coli O157 using carbon nanotube biosensors, Biosensors and Bioelectronics 32 (2012) 69-75). Ponadto możliwa jest detekcja patogenów powstałych w bardzo złożonych próbkach podczas produkcji żywności w szczególności w bardzo małych ilościach wody (P. Arora i in., Biosensors as innovative tools for the detection of food borne pathogens, Biosensors and Bioelectronics 28 (2011) 1-12) czy określanie lokalnych zmian pH krwi i moczu w monitorowaniu wielu chorób i związanych z nimi pomiarami koncentracji metabolitów czy enzymów. Poprzez pomiary pH prowadzone w nanometrowej objętości możliwa jest także detekcja pojedynczych biomolekuł czy hybrydyzacja DNA prowadząca do sekwencjonowania DNA (J. Wang, Electrochemical biosensors, Towards point-of-care cancer diagnostics, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 18871892 oraz Semiconductor sequencing for life, http://www.iontorrent.com/technology-scalability-sim- plicitv-speed/).

Jednym ze sposobów wytwarzania nanosensorów tego typu jest sposób wykorzystujący zogniskowaną wiązkę jonów (ang. Focused Ion Beam - FIB). Ponieważ urządzenie FIB pozwala na prowadzenie z dużą dokładnością operacji technologicznych w skali mikro- i manometrycznej to umożliwia wykonanie zminiaturyzowanych przyrządów.

Znane są różne konstrukcje nanosenorów przeznaczonych do pomiarów pH. Do najbardziej znanych należą sensory oparte na tranzystorach FET, które wykorzystują czułe na zmiany pH warstwy (np. warstwy na bazie ZnO: K. Koike i in., Characteristics of Polycrystalline ZnO-Based ElectrolyteSolution-Gate Field-Effect Transistors Fabricated on Glass Substratem, Applied Physics Express 2 (2009) 087001) czy nanodruty (np. nanodruty Si: F. Patolsky i C.M. Liber, Nanowire nanosensors, Materialstoday 8-4 (2005) 20-28). W rozwiązaniu tym elektrody źródło/dren są wyizolowane z otoczenia, tak, że tylko procesy biochemiczne zachodzą na powierzchni tzw. bramki czyli czułej warstwy lub nanodrutu rozpiętego pomiędzy elektrodami źródło/dren. Wówczas, podczas styku elektrolitu z czułą warstwą czy nanodrutem następuje detekcja sygnałów elektrycznych. Nanosensory te charakteryzują się wprawdzie dużą czułością ale ich wadą jest skomplikowana konstrukcja a co się z tym wiąże utrudnienia technologiczne. Kłopotliwe jest nie tylko wytworzenie samego tranzystora ale i wykonanie warstwy sensorowej czy przymocowanie w odpowiednim miejscu czułego nanodrutu. Problemy te sprawiają, że wykonanie odpowiedniego nanosensora jest czasochłonne i drogie.

Inną grupę sensorów wytwarzanych na bazie półprzewodnikowych nanostruktur ZnO stanowią sensory przeznaczone dla wykrywania gazów takich jak: H₂ (O. Lupan i in., Fabrication of ZnO nanorod-based hydrogen gas nanosensor, Microelectronics Journal 38 (2007) 1211-1216), O₂ (Z. Fan i J.G. Lu, Chemical Sensing With ZnO Nanowire Field-Effect Transistor, IEEE Trans. Nanotechnol. 54 (2006) 393-396), NO₂ (M.W. Ahn, i in., On-chip fabrication of ZnO-nanowire gas sensor with high gas sensitivity, Sens. Actuators B 138 (2009) 168-173) i NH₃ (H. Huang i in., Metal oxide nanowire transistors, J. Mater. Chem. 22 (2012) 13428-13445).

PL 224 489 B1

Z opisów patentów: US 8263002 (B1) oraz KR 20090089084 (A) znane jest wykorzystanie systemów opartych na zogniskowanej wiązce jonów (FIB) do wytworzenia nanosensorów. W rozwiązaniu przedstawionym w patencie US8263002 opisano sensor gazu H₂ wykorzystujący nanodrut ZnO zawieszony pomiędzy mikroelektrodami. Umieszczenie nanodrutu odbywa się w systemie FIB, gdzie przy pomocy igły nośnej od manipulatora Kleindiek wspomniany nanodrut przenosi się w docelowe miejsce i łączy przy pomocy spawu z materiałem bazowym. Proces przenoszenia nanodrutu jest procesem skomplikowanym i czasochłonnym, ponieważ najpierw nanodrut trzeba przytwierdzić do igły nośnej a w końcowym etapie manipulacji połączyć go z materiałem bazowym.

Celem wynalazku jest opracowanie elektrodowego nanosensora biochemicznego o prostej konstrukcji oraz sposobu wytwarzania tego nanosensora za pomocą zogniskowanej wiązki jonów generowanej w urządzeniu (ang. Focused lon Beam - FIB).

Nanosensor według wynalazku posiada dielektryczne podłoże, korzystnie szklane na którym znajduje się elektrodowy układ detekcyjny w części pokryty warstwą dielektryczną. W nanosensorze tym przy jednej z krawędzi, korzystnie prostokątnego podłoża znajduje się pole kontaktowe, do którego od strony krawędzi przymocowany jest przewodzący drut łączący go z zewnętrznym źródłem zasilania. Z drugiej strony, pole kontaktowe połączone jest z co najmniej jedną elektrodą o długości co najmniej 4 mm do której dołączona jest metalowa, korzystnie platynowa mikrościeżka na końcu której znajduje się co najmniej jedna nanoelektroda. Nanoelektroda ta ma odsłoniętą powierzchnię poprzeczną, przy czym korzystnie jest jeżeli powierzchnia ta jest < 50 nm x 100 nm.

W sposobie według wynalazku układ detekcyjny wykonuje się na dielektrycznym podłożu, korzystnie szklanym, przy czym część operacji technologicznych wykonuje się za pomocą zogniskowanej wiązki jonów generowanej w urządzeniu FIB.

W pierwszym etapie sposobu, przy jednej z krawędzi podłoża określa się obszar pola kontaktowego i pokrywa się go warstwą przewodzącą prąd, korzystnie warstwą metalu. Następnie do tego pola przymocowuje się drut łączący go z zewnętrznym źródłem prądu. Później wyznacza się obszar co najmniej jednego paska elektrody o długości co najmniej 4 mm jednostronnie połączonego z polem kontaktowym i pokrywa się ten obszar warstwą przewodzącą. Korzystnie jest jeżeli obszar pola kontaktowego i obszar paska elektrody pokrywa się warstwą srebrnej pasty przewodzącej o grubości od kilku do kilkudziesięciu mikrometrów. W drugim etapie, za pomocą zogniskowanej końca wiązki jonów galu (Ga+) od końca paska elektrody prowadzi się metalowe, korzystnie platynowe mikrościeżki i na końcu każdej z nich wykonuje się co najmniej jedną nanoelektrodę, korzystnie z tego samego metalu co mikrościeżka, przy czym długość nanoelektrod jest jednakowa a ich szerokość i grubość jest różna. Po zakończeniu tej operacji, w tym samym urządzeniu, powierzchnię mikrościeżek i nanoelektrod pokrywa się warstwą dielektryczną, korzystnie warstwą TEOS, w której następnie nad obszarem nanoelektrody wykonuje się mikrozagłębienie odsłaniające przekrój poprzeczny nanoelektrody. Korzystnie jest jeżeli przekrój poprzeczny nanoelektrody wykonuje się prostopadle do osi wzdłużnej nanoelektrody.

Rozwiązanie według wynalazku ma charakter interdyscyplinarny, który skupia w swoich ramach takie główne dziedziny jak: micro- i nanotechnologia cienkich warstw i obiektów, inżynieria systemów, sensoryka, nanofizyko-chemia, jak również nanobiologia z nanobiotechnologią. Opracowany nanosensor charakteryzuje się prostą konstrukcją i niskim kosztem wytwarzania, może być stosowany w szerokim spectrum badawczym począwszy od prostych analiz wykorzystujących pomiary pH w roztworach aż po detekcję pojedynczych biomolekuł i związanego z tym sekwencjonowania DNA.

Wynalazek zostanie bliżej objaśniony na przykładzie pokazanym na rysunku. Fig. 1 rysunku pokazuje schemat układu sensorowego gdzie (a) widok z góry, (b) przekrój warstwowy. Zdjęcie przedstawione na Fig. 2 rysunku pokazuje poszczególne etapy wytwarzania układu sensorowego: (a) struktura sensora z polem kontaktowym oraz elektrodami, (b-d) struktura po procesach technologicznych wykorzystujących system FIB: (b) po nałożeniu platynowej nanoelektrody, (c) po nałożeniu izolatora na całej długości nanoelektrody oraz mikrościeżki i (d) po wytrawieniu skośnego w przekroju zagłębi enia na końcu każdej z nanoelektrod. Fig. 3. pokazuje przykładowy sensor poddany testom elektrochemicznym: (a) obraz układu sensorowego z pozycjonowaną do pomiaru mikropipetą w środku której znajdują się srebrna elektroda oraz elektrolit i (b) woltamogram cykliczny utleniania ferrocenometanolu zarejestrowany na nanoelektrodzie.

Przykładowy nanosensor posiada szklane prostokątne podłoże 1 o wymiarach 0,5 cm x 1 cm i grubości podłoża 1 mm, na którym znajduje się elektrodowy układ detekcyjny przykryty w części warstwą dielektryczną 7. Przy jednej z krawędzi podłoża znajduje się pole kontaktowe 2, do którego

PL 224 489 B1 od strony krawędzi przyłączony jest drut 3 łączący go z zewnętrznym źródłem zasilania. Z drugiej strony, pole kontaktowe 2 połączone jest z trzema elektrodami 4 o długości 4 mm. Do każdej z elektrod dołączona jest platynowa mikrościeżka 5 na końcu której znajduje się jedna nanoelektroda 6. Nanoelektroda ta ma odsłoniętą od góry powierzchnię o wymiarach 50 nm x 100 nm.

Przykładowy sposób składa się z dwóch etapów. W pierwszym etapie, na powierzchni szklanego podłoża o wymiarach 0,5 cm x 1 cm i grubości 1 mm, przy jednej z jego krawędzi, określono obszar pola kontaktowego 2 o powierzchni 10 mm i pokryto go warstwą srebrnej pasty przewodzącej o grubości 10 μm. Obszar ten może być też pokrywany za pomocą rozpylania katodowego warstwą metalu o grubości ~2 μm. Następnie, od strony krawędzi podłoża, do pola 2 przyłączono drut miedziany 3, który łączy pole kontaktowe z zewnętrznym źródłem prądu. Z drugiej strony pola 2 wyznaczono obszary pasków trzech elektrod 4 o długościach 4 mm, połączonych z polem 2 i pokryto te obszary również warstwą srebrnej pasty przewodzącej o grubości 10 μm. W drugim etapie, za pomocą zogniskowanej wiązki jonów galu (Ga+) od każdego paska elektrody 4 poprowadzono platynowe mikrościeżki 5 i na końcu każdej z nich wykonano platynowe nanoelektrody 6. Nanoelektrody te miały przekroje: 200 nm x 200 nm, 100 nm x 150 nm, 50 nm x 100 nm. Następnie, w tym samym urządzeniu, również za pomocą zogniskowanej wiązki jonów Ga+ nanoelektrody 6 i mikrościeżki 5 przykryto dielektryczną warstwą zabezpieczającą 7 TEOS (izolator SiO_x). W tak zabezpieczonej strukturze, nad obszarami nanoelektrod 6 wykonano mikrozagłębienia 8, które odsłoniły ich przekroje poprzeczne, w płaszczyźnie prostopadłej do osi wzdłużnej.

Dzięki temu, że część operacji technologicznych takich jak wykonanie platynowej mikroelektrody, nanoelektrody, zabezpieczenie ich warstwą izolacyjną TEOS (SiO_x) a także wykonanie skośnego w przekroju zgłębienia w celu uzyskania odkrytej powierzchni kontaktującej się z badanym medium wykonuje się za pomocą zogniskowanej wiązki jonów generowanej w urządzeniu FIB, zostaje znacznie uproszczona technologia wykonania tego sensora. Kontakt elektryczny odbywający się przez w yprowadzenie ścieżek z przewodzącej pasty srebrnej jest pewny. Wytworzony układ sensorowy został poddany testom elektrochemicznym. Zastosowano pomiar mikropipetą, w środku której znajdują się srebrna elektroda oraz elektrolit (Fig. 3a). Mikropipetę wypełniono elektrolitem wodnym o składzie: 1 mM ferrocenometanol + 0,1 M KCl i roztwór wpuszczono w wytrawione zagłębienie z odkrytym kontaktem nanoelektrody. Podczas kontaktu nanoelektrody z roztworem zarejestrowano woltamogram cykliczny elektrochemicznego utleniania ferrocenometanolu (Fig. 3b). Zarejestrowany prąd utleniania ferrocenometanolu (12 pA) odpowiada elektrodzie dyskowej o średnicy około 70 nm, której przekrój czynny jest zbliżony do przekroju nanoelektrody 6 (o wymiarach 50 nm x 100 nm). Wynik ten jest dowodem, że wytworzona nanoelektroda pracuje w środowisku roztworu oraz daje prawidłowy sygnał elektrochemiczny.

Otrzymany nanosensor jest czuły, ma małe gabaryty i dlatego może pracować jako urządzenie przenośne do pomiarów bardzo małych rozmiarów próbek (przy minimalnym przygotowaniu preparatu do badań lub nawet bez procesu przygotowania preparatów), co w konwencjonalnych metodach analitycznych jest trudne. Konwencjonalne metody analityczne są drogie, ponieważ są czasochłonne, w ymagają dobrze wykwalifikowanego personelu, odpowiedniej preparatyki a często i prowadzenia późniejszych analiz. W przypadku nanobiosensorów takich jak prezentowany, istnieje możliwość stworzenia bezobsługowych sensorów, które wykonają analizę preparatów szybko i w warunkach polowych.

Claims (5)

1. Elektrodowy nanosensor biochemiczny posiadający podłoże na którym znajduje się elektrodowy układ detekcyjny, znamienny tym, że przy jednej z krawędzi dielektrycznego podłoża, ma pole kontaktowe /2/ do którego od strony krawędzi przyłączony jest drut /3/ łączący go z zewnętrznym źródłem zasilania a z drugiej strony pole /2/ jest połączone z co najmniej jedną elektrodą /4/ o długości co najmniej 4 mm, przy czym elektroda /4/ połączona jest z metalową mikrościeżką korzystnie platynową /5/, na końcu której znajduje się co najmniej jedna metalowa nanoelektroda /6/, korzystnie platynowa o odsłoniętej powierzchni poprzecznej, korzystnie jest jeżeli powierzchnia ta jest < 50 nm x 100 nm.

2. Elektrodowy nanosensor według zastrz. 1, znamienny tym, że pole kontaktowe znajduje się na szklanym, prostokątnym podłożu, elektrodowego

3. Sposób wytwarzania elektrodowego nanosensora biochemicznego, w którym część operacji technologicznych wykonuje się za pomocą zogniskowanej wiązki jonów generowanej w urządzeniu

PL 224 489 B1

FIB, znamienny tym, że w pierwszym etapie, na powierzchni podłoża /1/, korzystnie szklanego, przy jego krawędzi, określa się obszar pola kontaktowego /2/ i pokrywa się go warstwą przewodzącą prąd, korzystnie warstwą metalu, następnie do pola /2/ przymocowuje się metaliczny drut /3/ łączący go z zewnętrznym źródłem prądu, po czym wyznacza się obszar co najmniej jednego paska elektrody /4/ o długości co najmniej 4 mm jednostronnie połączonego z polem kontaktowym /2/ i pokrywa się obszar ten warstwą przewodzącą, w drugim etapie, za pomocą zogniskowanej wiązki jonów galu (Ga+) od końca paska elektrody /4/ prowadzi się metalową, korzystnie platynową mikrościeżkę /5/ i na jej końcu wykonuje się co najmniej jedną nanoelektrodę /6/, korzystnie z tego samego metalu co mikrościeżka /5/, następnie, w tym samym urządzeniu, na nanoelektrodę /6/ i mikrościeżkę /5/ nakłada się warstwę dielektryczną /7/, korzystnie warstwę TEOS, i w warstwie tej nad obszarem nanoelektrody /6/ wykonuje się mikrozagłębienie /8/ odsłaniające przekrój poprzeczny tej nanoelektrody.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obszar pola kontaktowego i obszar paska elektrody /4/ pokrywa się warstwą srebrnej pasty przewodzącej o grubości od kilku do kilkudziesięciu m ikrometrów.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że mikrozagłębienie /8/ nad obszarem nanoelektrody /6/ wykonuje się prostopadle do jej osi wzdłużnej.