PL223540B1 - Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. - Google Patents
Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp.Info
- Publication number
- PL223540B1 PL223540B1 PL397896A PL39789612A PL223540B1 PL 223540 B1 PL223540 B1 PL 223540B1 PL 397896 A PL397896 A PL 397896A PL 39789612 A PL39789612 A PL 39789612A PL 223540 B1 PL223540 B1 PL 223540B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteria
- carotovorum
- genus
- primers
- reaction
- Prior art date
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 14
- 241001148142 Pectobacterium atrosepticum Species 0.000 title claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 15
- 241001187099 Dickeya Species 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 claims description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 4
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 28
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 230000002351 pectolytic effect Effects 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000531155 Pectobacterium Species 0.000 description 2
- 241000588702 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Species 0.000 description 2
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588700 Dickeya chrysanthemi Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 241001624371 Pectobacterium atrosepticum SCRI1043 Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N alpha-D-galacturonic acid Chemical compound O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BKBMJHBISA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N gelred Chemical compound [I-].[I-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 JGBUYEVOKHLFID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002803 maceration Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp.. które powodują choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna.
W literaturze tego tematu znane są pojedyncze reakcje PGR. za pomocą których można przeprowadzić wykrywanie bakterii pektynolitycznych. Metody klasyczne składają się z następujących etapów, izolacja bakterii pektynolitycznych na płytkach z podłożem wybiórczo-różnicującym, przesiewanie izolatów do momentu uzyskania czystych kolonii, przeprowadzenie 3 oddzielnych reakcji PCR w celu identyfikacji bakterii należących do różnych rodzajów/gatunków patogenów w pojedynczej próbie. W badaniach standardowych bada się obecność wszystkich trzech grup bakterii w dużej liczbie prób roślin lub bulw można także prowadzić bezpośrednią identyfikację w próbie wykonując trzy kolejne reakcje PCR.
Ziemniak (Solanum tuberosum) jest jedną z głównych roślin uprawnych w Polsce. Polska jest największym producentem ziemniaka wśród krajów Unii Europejskiej (UE). Średnie plony ziemniaka uzyskiwane w Polsce (207 dt/ha) są niższe niż średnie plony w UE (286 dt/ha). Jedną z przyczyn takiej sytuacji są straty w produkcji ziemniaka spowodowane przez choroby bakteryjne.
Bakterie pektynolityczne z rodzaju Pectobacterium (poprzednio Erwinia carotovora) oraz Dickeya (poprzednio Erwinia chrysanthemi) powodujące choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna przyczyniają się w znacznej mierze do obniżenia plonów ziemniaka i wysokich strat ekonomicznych.
Bakterie z gatunku Pectobacterium atrosepticum (Pba) infekują rośliny i są przyczyną pojawienia się objawów chorobowych w klimacie umiarkowanym i chłodnym. Bakterie z rodzaju Dickeya (Dsp) powodują objawy chorobowe na roślinach ziemniaka w klimacie ciepłym i wilgotnym. Jednak, w ostatnich latach, szczepy z rodzaju Dickeya są coraz częściej izolowane z roślin ziemniaka z objawami czarnej nóżki w Polsce, Holandii oraz Finlandii (Laurila i in., 2008; Sławiak i in., 2009ab). Ostatnie doniesienia sugerują, ze bakterie z rodzaju Dickeya mogą efektywnie infekować rośliny ziemniaka i wywoływać objawy chorobowe także w klimacie umiarkowanym, co może stanowić istotne zagrożenie dla upraw ziemniaka w Polsce i całej Europie. Propagacja wolnego od patogenów materiału siewnego oraz odpowiednie zabiegi fitosanitarne są jedynymi środkami dającymi możliwość ochrony uprawy ziemniaka przed chorobą zwaną czarna nóżka.
Czarna nóżka i mokra zgnilizna są dość powszechnie występującymi chorobami ziemniaka i innych roślin, które powodują straty w plonach. W krajach europejskich, takich jak Holandia, Szkocja bakterie te są przyczyną wysokich strat plonów. W Polsce, straty te nie osiągają takich rozmiarów jak w Holandii, jednak istnieje duże ryzyko, że będą one coraz poważniejsze w związku z coraz szerszą wymianą materiału sadzeniakowego oraz coraz częstszym nawadnianiem plantacji. Z badań przeprowadzonych w laboratorium Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego wynika, że bakterie powodujące wyżej wymienione choroby występują także w zbiornikach wodnych na terenie Polski. Podobną sytuację obserwuje się także w Finlandii, Holandii i Szkocji. Firmy zajmujące się produkcją sadzeniaków poszukują efektywnej i szybkiej metody badania przesiewowego sadzeniaków w kierunku obecności bakterii powodujących choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna.
Publikacja P.Llop et I., Journal of Microbiological Methods, 1999,37, 23-31, „A simple extraction procedurę for efficient routine detection of pathogenic bacteria in plant material by polymerase chain re action”, ujawnia sposób przygotowania materiału roślinnego, który poddaje się homogenizacji do całkowitej maceracji buforem, bez żadnych dodatków, następnie miesza i wiruje, otrzymując materiał roślinny, który służy do wykrywania i identyfikacji bakterii.
Natomiast metodzie ujawnionej w publikacji Johanna Jackoba Van Der Merwe, 2009, Etiology of Soft Rot and Blackleg on Potatoes in South Africa, Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master Scientae (Agriculturae), przeciwstawiona jest metoda, będąca przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego, łącznej identyfikacji bakterii Pectobacterium carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. przy użyciu multiplex PCR.
W przedmiotowym zgłoszeniu patentowym ujawniono jako istotną nowość dobór odpowiednich primerów do przeprowadzenia reakcji Multiplex. Dobór trzech par primerów do reakcji Multiplex jest trudny, ich odpowiednia sekwencja jest istotniejsza niż w przypadku pojedynczej reakcji PCR czy też multipleksu z dwoma parami primerów. Zastosowane przez twórców wynalazku primery nie wykazują wzajemnej homologii, a uzyskiwane w trzech niezależnych reakcjach PCR produkty różnią się od
PL 223 540 B1 siebie istotnie wielkością tak, że można je łatwo identyfikować w wyniku rozdziału elektroforetycznego w żelu agarozowym.
Do tej pory w literaturze nie pojawiły się doniesienia o opracowaniu metody opartej na multipleks PCR służącej do wykrywania aż trzech patogenów powodujących choroby o nazwie czarna nóżka i mokra zgnilizna w pojedynczej reakcji PCR. W porównaniu do tradycyjnej metody wykrywania i identyfikacji tych bakterii, metoda ta jest prostsza, tańsza, mniej pracochłonna i efektywniejsza. Całkowity czas potrzebny na realizację wszystkich etapów wykrywania i identyfikacji to ok. 10 godzin dla jednej próby, procedurę można podzielić na 2 dni. Wykrywanie i identyfikacja patogenów za pomocą nowego sposobu jest bardzo szybka w porównaniu do dni/tygodni potrzebnych na wykrycie i identyfikację bakterii za pomocą metod klasycznych. Nowy sposób jest tańszy od tradycyjnego ze względu na fakt liczby przeprowadzonych reakcji PCR oraz zużytych materiałów w trakcie poszczególnych etapów identyfikacji. Sposób ten jest szczególnie przydatny, gdy przebadać należy większą liczbę prób, w których mogą być obecne bakterie z rodzaju Pectobacterium i Dickeya. Ponadto nowy sposób pozwala na szybką i jednoznaczną identyfikację bakterii pektynolitycznych zasiedlających rośliny ziemniaka w uprawach potowych i w przechowalni.
Sposób według wynalazku służy do wykrywania i identyfikacji bakterii powodujących choroby o nazwie: czarna nóżka i mokra zgnilizna na szeregu roślin uprawnych. Dzięki temu sposobowi, można w szybki sposób wykrywać bakterie wywołujące te choroby w tkance roślinnej oraz w wodzie.
Sposób może być zastosowany do przeprowadzania badań przesiewowych sadzen iaków ziemniaka pod kątem obecności patogenów, ma to duże znaczenie w ochronie upraw jeszcze przed pojawieniem się choroby w trakcie sezonu wegetacyjnego. Jest to szczególnie istotne ze względu na fakt, że propagacja nieskażonego materiału siewnego daje jedyną możliwość uchronienia upraw ziemniaka przed tymi chorobami.
Nowy sposób pozwala na wykrywanie i identyfikację bakterii powodujących choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna należące do gatunków: Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc), Pectobacterium atrosepticum oraz do rodzaju Dickeya spp. za pomocą pojedynczej reakcji PCR. W reakcji multipleks PCR zostały użyte startery specyficzne dla każdego z wymienionych gatunków/rodzajów bakterii. Startery zostały tak dobrane, aby uzyskać 3 różnej wielkości produkty łatwo identyfikowane w wyniku elektroforezy produktów multipleks PCR w żelu agarozowym Zastosowane startery są opisane w literaturze.
Sposób przygotowania materiału roślinnego został tak opracowany aby czas izolacji był krótszy, a procedura bardziej efektywna.
Określono poziom wykrywalności bakterii z wymienionych powyżej grup używając jako matrycy DNA genomowego w/w szczepów w stężeniu od 1000 ng do 0.001 ng w pojedynczej reakcji. Zastosowanie wybranych starterów pozwala na wykrywanie 0,1 ng DNA w przypadku Pba i Pcc, natomiast 0,01 ng DNA w przypadku Dsp w pojedynczej reakcji.
Tkanki roślin ziemniaka porażonych czarną nóżką zasiedlone są przez wiele różnych gatunków bakterii, dlatego sprawdzono poziom wykrywalności DNA wymienionych wcześniej patogenów także w obecności DNA genomowego izolowanego z komórek Pseudomonas fluorescens CCM2115. W obecności DNA genomowego P. fluorescens poziom wykrywalności Pcc, Pba i Dsp obniża się dziesięciokrotnie. Dzięki zastosowaniu nowego sposobu przygotowania materiału roślinnego i sposobu wykrywania i identyfikacji z homogenatów porażonych tkanek roślinnych określono również poziom wykrywalności bakterii w homogenatach tkanki bulw oraz łodyg i liści ziemniaka. Pozwala to na szybką, efektywną i jednoznaczną identyfikację bakterii pektynolitycznych zasiedlających rośliny ziemniaka w uprawach potowych i w przechowalni.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Pectobacienum atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp., które powodują choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna według wynalazku polega na tym, że:
- pojedyncza reakcja multipleks PCR zawiera: jednokrotnie stężony bufor reakcyjny ,1U rekombinowanej polimerazy Taq DNA 2,5 mM MgCI2. 80 μΜ każdego z dNTPs, 0,32 μΜ starterów Df i Dr, 0,1 μΜ starterów Y45 i Y46, 1,2 μΜ starterów ExpccF i ExpccR,
- reakcje PCR przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach reakcji: denaturacja w temperaturze 95°C przez 4 min, 30 cykli denaturacji w temperaturze 94°C przez 45 s, przyłączania starterów w temperaturze 62°C przez 90 s i wydłużania w temperaturze 72°C przez 90 s, z pojedynczym ostatecznym krokiem wydłużania w temperaturze 72°C przez 3 min,
PL 223 540 B1
- produkty PCR poddaje się elektroforezie przeprowadzanej w 1-2% żelu agarozowym, korzystnie stężenie 1,5%,
- w reakcji PCR stosuje się dwie kontrole negatywne, pierwsza stanowi kontrolę negatywną samej reakcji PCR, a druga kontrola negatywna pozwala na potwierdzenie braku zanieczyszczenia odczynników używanych do izolacji całkowitego DNA genomowego z homogenatu tkanki roślinnej; w kontroli procesu izolacji DNA używano zamiast homogenatu podwójnie destylowanej, sterylnej wody.
Bufor reakcyjny składa się z 10 mM Tris-HCl o pH 8,8 w temperaturze 25°C, 50 mM KCl, 0,08% (v/v) Nonidet P40.
Opis rysunków:
Fig.1 - przedstawia wyniki reakcji multiplex PCR przeprowadzonej dla rożnych kombinacji lizatow bakteryjnych. Wielkość prążków dla poszczególnych grup Paktem wynosi 630 pz (Pcc), 420 pz (Pca), 130 pz (Dsp) Pcc - P. carotpvprum subsp carotovorum SCRI 3193 Pba - P. atrosepticum SCRI 1043 Dsp Dickeya spp ZOBR ch99. NC - kontrola negatywna, M - marker wielkości 100 bp (Fermentas).
Tabela 1 - przedstawia sekwencje i temperatury topnienia starterów użytych do konstrukcji reakcji multipleks PCR.
Tabela 2 - przedstawia poszczególne sekwencje.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia.
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie otrzymanego materiału roślinnego do wykrywania bakterii w reakcji multipleks PCR
Otrzymano rośliny ziemniaka (bulwy oraz łodygi) z objawami chorób czarna nóżka (łodygi) oraz mokra zgnilizna (łodygi, bulwy). Rośliny zostały pobrane przez inspektorów Wojewódzkich Inspektoratów Ochrony Roślin i Nasiennictwa na plantacjach nasiennych ziemniaka na terenie Polski. Pobrano próby tkanki bulw - 1 g tkanki znajdującej się na granicy pomiędzy tkanką chorą i zdrową. Tkankę umieszczono w worku ekstrakcyjnym (Bioreba), rozcieńczono dziesięciokrotnie 50 mM buforem fosforanowym (pH=7,2) i zmacerowano z użyciem ręcznego homogenizatora (Bioreba). Następnie, z próby izolowano całkowity DNA genomowy. 1,5 ml tak przygotowanego homogenatu pobrano do probówki typu Eppendorf i wirowano 10 000 g, 10 min. Supernatant odrzucano a osad zawieszano w 500 μl buforu ekstrakcyjnego (200 mM Tris HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA 0,5% SDS: 2% PVP). Zawiesinę dokładnie wymieszano przy użyciu wstrząsarki typu vortex a następnie inkubowano 1 h w temperaturze pokojowej, z ciągłym delikatnym wstrząsaniem. Po inkubacji, próbę wirowano 10 000 g. 5 min. Supernatant przeniesionono do czystej probówki typu Eppendorf, dodano 450 μl izopropanolu i inkubowano 1 h w temperaturze pokojowej. Następnie próbę wirowano 15 000 g, 30 min. Supernatant odrzucono, natomiast osad osuszano i zawieszano w 50 μl sterylnej, podwójnie destylowanej wody i przechowywano w temperaturze 4°C do czasu analizy (najczęściej przechowywanie nie trwało więcej niż 24 h). Roztwór DNA wykorzystywany w reakcji multipleks PCR, rozcieńczano 10 lub 100 razy.
P r z y k ł a d 2
Przygotowanie otrzymanych prób wody do wykrywania bakterii w reakcji multipleks PCR.
Otrzymane próby wody pochodziły z różnego rodzaju zbiorników wodnych (naturalnych i sztucznych) i były pobrane na terenie całego kraju. 25 ml próby wody wirowano przy 4 000 rpm. 10-15 min. Supernatant odrzucano a osad zawieszano w 100 μl wody. Tak przygotowana próba była mrożona (-20°C), a następnie wykorzystywana w reakcji multipleks PCR.
P r z y k ł a d 3
Reakcja multipleks PCR
Reakcję multipleks PCR wykonywano w zawiesinie o objętości całkowitej 25 μ^. W celu wykrycia bakterii do zawiesiny dodawano 2 μI wyizolowanego DNA genomowego oczyszczonego z próby tkanki roślinnej lub 2 μl zagęszczonej próby wody. Pojedyncza reakcja multipleks PCR zawierała: 1x stężony bufor reakcyjny Fermentas (10 mM Tris-HCf o pH 8,8 w temperaturze 25°C, 50 mM KCI, 0,08% (v/v) Nonidet P40), 2,5 mM MgCl2, 80 pM każdego z dNTPs, 0,32 μΜ starterów Df i Dr, 0,1 μM starterów Y45 i Y46. 1,2 μΜ starterów ExpccF i ExpccR (tabela 1) oraz 1 U rekombinowanej polimerazy DNA Taq (Fermentas). Reakcje PCR przeprowadzano używając termocyklera TGradient Biometra z następującymi warunkami reakcji: denaturacja (95 C, 4 min), 30 cykli denaturacji (94'C, 45 s), przyłączania starterów (82°C. 90 s) i wydłużania (72°C, 90 s), z pojedynczym ostatecznym krokiem wydłużania (72°C, 3 min). Produkty PCR były poddawane elektroforezie przeprowadzanej w 1,5% żelu agarozowym (Prona). Wyniki rozdziału elektroforetycznego, produktów otrzymanych w reakcji PCR, były wizualizowane przy użyciu GelRed™ Nucleic Acid Stain i oglądane w świetle UV (fig. 1). Produkty
PL 223 540 B1
PCR były porównywane z wzorcem wielkości oraz z produktami otrzymanymi w reakcji PCR dla kontroli pozytywnych. Kontrole pozytywne stanowiły lizaty komórek poszukiwanych/wykrywanych szczepów bakterii z gatunków Pectobacterium atrosepticum (Pba) i Pectobacterium carotovorum (Pcc) lub rodzaju Dickeya (Dsp). W reakcji PCR stosowano dwie kontrole negatywne. Jedna stanowiła kontrolę negatywną samej reakcji PCR (dodawano podwójnie destylowaną sterylną wodę zamiast badanej próby). Druga kontrola negatywna stanowiła potwierdzenie braku zanieczyszczenia odczynników używanych do izolacji całkowitego DNA genomowego z homogenatu tkanki roślinnej. Zamiast homogenatu, w procesie izolacji DNA używano podwójnie destylowanej sterylnej wody i stosowano kolejne kroki izolacji tak jak dla homogenatów tkanki roślinnej.
Podobną metodą można wykrywać i identyfikować bakterie wymienionych powyżej gatunków także w tkance roślinnej nie wykazującej objawów chorobowych bądź wykluczać obecność tych bakterii w badanym materiale roślinnym. Można np. pobierać część stolonową bulw ziemniaków - sadzeniaków i wykluczać w nich obecność wymienionych bakterii pektynolitycznych będących patogenami ziemniaka powodującymi znaczne straty gospodarcze.
T a b e l a 1
| Nazwa | Sekwencja (5' -> 3') | Długość produktu | Tm [°C] | Wykrywany gatunek/rodzaj | Źródło |
| ExpccF | GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA | 630 bp | 60,8 | P.carotovorum subst. carotovorum | Kang et al., 2003 |
| BxoccR | GCCGTAATTGCCTACCTGCTTAAG | 630 bp | 57,4 | P.carotovorum subst. carotovorum | Kang et al., 2003 |
| Y45 | TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT | 420 bp | 64.2 | P. atrosepticum | Frechon et al., 1998 |
| Y46 | TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT | 420 bp | 57.4 | P. atrosepticum | Frechon et al., 1998 |
| Df | AGAGTCAAAAGCGTCTTG | 130 bp | 45,8 | Dickeya spp. | Laurila et al., 2010 |
| Dr | TTTCACCCACCGTCAGTC | 130 bp | 50,3 | Dickeya spp. | Laurila et al., 2010 |
T a b e l a 2.
| ExpccF | 5' - GAACTTCGCACCGCCGACCTTCTA - 3' |
| ExpccR | 5' - CCTACCTGCTTAAG - 3' |
| Y45 | 5' - TCACCGGAĆGCĆGAACTGTGGCGTAT - 3' |
| Y46 | 5' - TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT - 3' |
| Df | 5' - AGAGrCAAAAGCGTCTTG - 3' |
| Dr | 5' - TTTCACCCACCGTCAGTC - 3' |
Literatura:
1. De Boer SH, Ward LJ, (1995) PCR detection of Erwinia carotovorasubsp. Atroseptica asso ciated with potato tissue Phytopathology 85:854-958.
2. Hyman LJ, Brich PRJ, Dellagi A, Avrovra 1 AO, Toth IK. (2000) Development of a quantitative PCR-based detection system for Erwinia carotovora subsp. atroseptica on potato tubers. OEPPO/EPPO Bulletin 30:409-411.
3. van der Wolf JM, Hyman LJ, Jones DA et al. (1996) Immunomagnetic separation of Erwinia carotovora subsp. atroseptica from potato peel extracts to improve detection sensitivity on a crystal violet pectate medium or by PCR. J Appl Bacteriol 80:487-495.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp, carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp,, które powodują choroby zwane czarna nóżka i mokra zgnilizna znamienny tym, że- pojedyncza reakcja multipleks PCR zawiera: jednokrotnie stężony bufor reakcyjny, 1U rekombinowanej polimerazy Taq DNAl 2,5 mM MgCl2 80 μΜ każdego z dNTPs, 0,32 μΜ starterów Df i Dr, 0,1 μM starterów Y45 i Y46, 1,2 μΜ starterów ExpccF i ExpccR.- reakcje PCR przeprowadza sie w termocyklerze w następujących warunkach reakcji: denaturacja w temperaturze 95°C przez 4 min 30 cykli denaturacji w temperaturze 94°C przez 45 s, przyłączania starterów w temperaturze 62°C przez 90 s i wydłużania w temperaturze 72 C przez 90 s. z pojedynczym ostatecznym krokiem wydłużania w temperaturze 72°C przez 3 min,- produkty PCR poddaje się elektroforezie przeprowadzanej w 1-2% żelu agarozowym, korzystnie stężenie 15%- w reakcji PCR stosuje się dwie kontrole negatywne, pierwsza stanowi kontrolę negatywną samej reakcji PCR ,a druga kontrola negatywna pozwala na potwierdzenie braku zanieczyszczenia odczynników używanych do izolacji całkowitego DNA genomowego z homogenatu tkanki roślinnej: w kontroli procesu izolacji DNA używano zamiast homogenatu podwójnie destylowanej, sterylnej wody.
- 2. Sposób według zaostrz. 1, znamienny tym, że bufor reakcyjny składa się z 10 mM Tris-HCI o pH 8.8 w temperaturze 25°C, 50 mM KCI, 0,08% (v/v) Nonidet P40.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL397896A PL223540B1 (pl) | 2012-01-25 | 2012-01-25 | Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL397896A PL223540B1 (pl) | 2012-01-25 | 2012-01-25 | Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL397896A1 PL397896A1 (pl) | 2013-08-05 |
| PL223540B1 true PL223540B1 (pl) | 2016-10-31 |
Family
ID=48904157
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL397896A PL223540B1 (pl) | 2012-01-25 | 2012-01-25 | Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL223540B1 (pl) |
-
2012
- 2012-01-25 PL PL397896A patent/PL223540B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL397896A1 (pl) | 2013-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| De Boer et al. | Pectobacterium spp. associated with bacterial stem rot syndrome of potato in Canada | |
| Potrykus et al. | Simultaneous detection of major blackleg and soft rot bacterial pathogens in potato by multiplex polymerase chain reaction | |
| Taylor et al. | Detection of Erwinia amylovora in plant material using novel polymerase chain reaction (PCR) primers | |
| Debode et al. | Quantitative detection and monitoring of Colletotrichum acutatum in strawberry leaves using real‐time PCR | |
| Kljujev et al. | Listeria monocytogenes–Danger for health safety vegetable production | |
| Strayer et al. | A multiplex real-time PCR assay differentiates four Xanthomonas species associated with bacterial spot of tomato | |
| Petersen et al. | Detection of Xanthomonas axonopodis pv. punicae causing bacterial blight on pomegranate in South Africa | |
| Thakur et al. | Identification of allele specific AFLP markers linked with bacterial wilt [Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.] resistance in hot peppers (Capsicum annuum L.) | |
| Elhalag et al. | Etiology of potato soft rot and blackleg diseases complex in Egypt | |
| Zhao et al. | Identification and characterization of the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in the Shaanxi province of China | |
| Bophela et al. | Identification of Pseudomonas isolates associated with bacterial canker of stone fruit trees in the Western Cape, South Africa | |
| Sudarsono et al. | Pathogen Causing Phalaenopsis Soft Rot Disease--16S rDNA and Virulence Characterisation. | |
| Santana et al. | A new bacterial disease of cassava in Venezuela caused by Enterobacter cloacae. | |
| Goh et al. | Development of an in planta infection system for the early detection of Ganoderma spp. in oil palm | |
| Birithia et al. | Identification of root-knot nematode species occurring on tomatoes in Kenya: use of isozyme phenotypes and PCR-RFLP | |
| Toaza et al. | First report of Pantoea ananatis causing leaf spot disease of maize in Ecuador | |
| Osdaghi | CABI Invasive Species Compendium | |
| Jia et al. | Combining simplified DNA extraction technology and recombinase polymerase amplification assay for rapid and equipment-free detection of citrus pathogen Phytophthora parasitica | |
| LAMOVŠEK et al. | Comparative study of diagnostic methods used for monitoring of common grape vine (Vitis vinifera L.) crown gall (Agrobacterium vitis Ophel & Kerr) in Slovenia | |
| Tegli | Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens | |
| Aono et al. | Asteraceae weeds may be an alternative host of Dickeya dianthicola, a causal agent of potato blackleg in Japan | |
| PL223540B1 (pl) | Sposób wykrywania i identyfikacji bakterii z gatunku Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pectobacterium atrosepticum oraz bakterii z rodzaju Dickeya spp. | |
| Ahmed et al. | Occurrence, etiology and molecular characterization of phytoplasma diseases on Solanum lycopersicum crop in Egypt | |
| Griffiths | Forest diseases caused by prokaryotes: phytoplasmal and bacterial diseases. | |
| Yasouri et al. | The effect of environmental stresses on lipL32 gene expression in pathogenic leptospira spp. Through real-time PCR |