PL223465B1 - Urządzenie i sposób prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli - Google Patents

Abstract

Urządzenie składające się z umieszczonych na podstawie: źródła światła koherentnego wraz z układem rozszerzającym wiązkę światła, detektora obrazu w postaci kamery CCD, wyposażonego w obiektyw ze zmienną przesłoną, oprogramowanie do rejestracji filmu lub serii zdjęć oraz oprogramowanie do analizy zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć, a także podstawki pod obiekt, charakteryzuje się tym, że źródło światła koherentnego jest generatorem światła o przynajmniej dwóch różnych długościach fali. Źródło światła koherentnego zestawione jest z przynajmniej dwóch laserów (7) stosujących różne długości fal, przy czym lasery (7) ustawione są tak, że kąt (α) zawarty między strumieniem światła a osią obiekt (6) - detektor (3) jest taki sam dla wszystkich długości fali albo źródłem światła koherentnego jest jeden laser przystosowany do wytwarzania światła o zmiennej długości fali. Korzystnie światło generowane przez źródło światła koherentnego ma długości fali 635 nm i 830 nm. Sposób polegający na umieszczeniu badanego obiektu na podstawce na obiekt, nakierowaniu na niego strumienia światła ze źródła światła koherentnego wyposażonego w układ rozszerzający wiązkę światła, rejestrowaniu filmu lub serii zdjęć ze stałym krokiem czasowym oraz analizie zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć charakteryzuje się tym, że na badany obiekt (6) ze źródła światła koherentnego kierowane są naprzemiennie przynajmniej dwa strumienie światła o różnych długościach fali, przy czym kąt (α) zawarty między strumieniem światła a osią obiekt (6) - detektor (3) jest taki sam dla wszystkich długości fali.

Description

Przedmiotem wynalazku jest urządzenie i sposób prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli, które umożliwia niedestrukcyjne monitorowanie zachodzących w ich tkankach zmian, przede wszystkim po zbiorze, podczas przechowywania.

Jeżeli powierzchnia chropowatego obiektu zostanie oświetlona koherentnym światłem laserowym, w wyniku interferencji promieni odbitych, na płaszczyźnie obrazowania, przy użyciu kamery CCD lub kliszy fotograficznej powstanie wzór jasnych i ciemnych punktów nazywany obrazem plamkowym (speckle pattern). Gdy badany materiał jest częściowo przezroczysty dla światła laserowego, obraz plamek będzie wynikiem interferencji z powierzchni i z warstw wewnętrznych materiału. Jeżeli materiał wykazuje jakiekolwiek zmiany w czasie zarówno na powierzchni jak wewnątrz, obraz plamkowy dodatkowo będzie zmieniał się w czasie. Na zarejestrowanym filmie (lub sekwencji kolejnych klatek) widoczny jest wówczas ruch plamek.

W komórkach roślinnych następuje ciągły ruch organelli i cząstek wywołany z jednej strony dyfuzją i ruchami Browna, a z drugiej cyklicznym ruchem cytoplazmy, oraz przebudową struktury komó rkowej. Skutkiem tego ruchu jest zmiana w czasie i przestrzeni obrazu plamkowego. Dla materiałów biologicznych ruch plamek może być bardzo dynamiczny. Stąd zjawisko to dla tych materiałów zostało określone w języku angielskim jako biospeckle.

Podstawowymi elementami systemu do pomiaru biospeckli znanego z opisu patentowego US7123363 są:

- źródło światła koherentnego, korzystnie laserowego generującego wiązkę światła o jednej, wybranej długości fali z zakresu 600-680 nm, które kieruje się na badaną próbkę,

- układ rozszerzający wiązkę lasera,

- detektor w postaci kamery CCD (charge-coupled device) wyposażony w obiektyw ze zmienną przesłoną rejestrujący obrazy biospeckli,

- oprogramowanie do rejestracji filmu (AVI- Audio Video Interleave) lub serii zdjęć w formacie bezstratnym (BMP) z możliwością regulacji liczby rejestrowanych klatek na sekundę w zakresie minimum 15 klatek na sekundę, czasu ekspozycji obrazu, jasności i wzmocnienia oraz

- oprogramowanie do analizy zmian powstałego obrazu plamkowego.

Opis przedstawia również metody analizy pozyskanego obrazu plamkowego. Sposób prowadzenia badania próbki polega na oświetleniu badanego obiektu wiązką światła koherentnego, korzystnie laserowego o jednej, wybranej długości fali z zakresu 600-680 nm, i zarejestrowaniu filmu wideo lub sekwencji klatek z danego badanego obszaru ze stałym krokiem czasowym. Analizie poddawana jest zmiana uzyskanego rozkładu odcieni szarości poszczególnych pikseli w czasie na poszczegó lnych zdjęciach.

Zastosowanie metody biospeckli do określenia stanu owoców i warzyw zostało przedstawione między innymi w publikacjach „Temporal and spatial properties of the time-varying speckles of botanical specimens. Optical Engineering” , Xu Z., Joenathan C., Khorana B. M., 1995, str. 34, 5, 1487 -1501, czy też „Point-wise and whole-field laser speckle intensity fluctuation measurements applied to botanical specimens. Optics and Lasers in Engineering” , Zhao Y., Wang J., Wu X., Williams F., Schmidt R.J., 1997, str. 28, 443-456. W publikacjach wykazana została przydatność metody do badań stanu różnych obiektów biologicznych, w tym owoców i warzyw. Stwierdzono też, że w przypadku owoców i warzyw, informacja jaką niosą obrazy plamkowe charakteryzuje również obszary pod skó rką, ze względu na przezroczystość tkanki dla promieni świetlnych.

Biospeckle nadają się do wczesnego wykrywania ciemnienia miąższu wynikającego z uszkodzeń mechanicznych - publikacja „Bio-speckle assessment of bruising in fruits. Optics and Laser Engineering”, Pajuelo M., Baldwin G., Rabal H., Cap N., Arizaga R., Trivi M., 2003, str. 40,13-24.

W publikacji „Detection of fungi in beans by the laser biospeckle technique. Biosystems Engineering”, Braga R.A., Rabelo G.F., Granato L.R., Santos E.F., Machado J.C., Arizaga R., Rabal H.J., Trivi M., 2005, str. 91, 4, 465-469, przedstawiono możliwość wykrywania przy pomocy biospeckli zmian tkanek wynikających z chorób grzybowych.

Jednym z ważniejszych zastosowań metody biospeckli jest niedestrukcyjne monitorowanie zmian cech owoców i warzyw po zbiorze, podczas przechowywania. W publikacji „New nondestructive method based on spatial-temporal speckle correlation technique for evaluation of apples quality during shelf-life”. International Agrophysics, Zdunek A., Muravsky L., Frankevych L, Konstankiewicz K, 2007,

PL 223 465 B1 str. 21, 3, 305-310 wykazano, że dynamika plamek maleje wraz z przechowywaniem jabłek. Natomiast z publikacji „Comparison of puncture test, acoustic emission and spatial-temporal speckle correlation technique as the methods for apple quality evaluation”, Acta Agrophysica, Zdunek A., Frankevych L., Konstankiewicz K., Ranachowski Z. 2008, str. 11(1), 303-315 wynika, że wyniki uzyskane przy pomocy tej metody korelują z wynikami destrukcyjnych testów jędrności.

Zmiany dynamiki biospeckli owoców i warzyw podczas przechowywania wiążą się z utratą wody, a co za tym idzie ze zmniejszeniem mobilności cząstek i organelli wewnątrz komórek oraz z rozkładem chlorofilu, który zanikając podczas dojrzewania umożliwia głębszą penetrację światła laserowego, co przedstawiono w publikacji „Bio-speckle activity applied to the assessment of tomato. Biosystems Engineering”. Romero G.G., Martinez C.C., Alanis E.E., Salazar G.A., Broglia V.G., Alvarez L., 2009, str. 103, 116-119 oraz „Relation of biospeckle activity with chlorophyll content in apples. Postharvest Biology and Technology”, Zdunek A., Herppich W. B., 2012, str. 64, 58-63.

Dotychczas w badaniach cech materiału biologicznego przy pomocy metody biospeckli stosowano jedną wybraną długość fali generowaną przez jedno źródło światła laserowego. Długość ta mieściła się zazwyczaj w obszarze światła czerwonego około 630 nm. Jest to długość, która jest absorbowana przez chlorofil.

Istotą wynalazku jest urządzenie do prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli składające się z umieszczonych na antywibracyjnej podstawie: źródła światła koherentnego wraz z układem rozszerzającym wiązkę światła, detektora obrazu w postaci kamery CCD, wyposażonego w obiektyw ze zmienną przesłoną, oprogramowanie do rejestracji filmu lub serii zdjęć oraz oprogramowanie do analizy zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć a także podstawki pod obiekt, charakteryzujące się tym, że źródło światła koherentnego jest generatorem światła o przynajmniej dwóch różnych długościach fali.

W pierwszej odmianie źródło światła koherentnego zestawione jest z przynajmniej dwóch laserów stosujących różne długości fal, przy czym lasery ustawione są tak, że kąt a zawarty między strumieniem światła a osią obiekt -detektor jest taki sam dla wszystkich długości fali. Korzystnie lasery ustawione są względem osi obiekt - detektor symetrycznie, pod kątem a.

W drugiej odmianie źródłem światła koherentnego jest jeden laser przystosowany do wytwarzania światła o zmiennej długości fali.

Światło generowane przez źródło światła koherentnego ma korzystnie długości fali 635 nm i 830 nm.

Urządzenie charakteryzuje się również tym, że podstawa wsparta jest na nóżkach zakończonych gumą, dzięki czemu jest ona niepodatna na wibracje i drgania, co zapewnia uzyskiwanie niezakłóconego obrazu. Ponadto podstawka na obiekt osadzona jest na zamocowanym na podstawie trzpieniu, za pomocą którego realizowany jest jej przesuw w kierunku pionowym, co umożliwia dokładne pozycjonowanie badanego obiektu w pionie. Natomiast w osi detektora znajduje się otwór umieszczonego na podstawie ogranicznika. Umieszczenie badanego obiektu na podstawce na obiekt w taki sposób, by przylegał on do ogranicznika w miejscu otworu zapewnia każdorazowo jego prec yzyjne położenie w identycznej odległości od detektora.

Istotą wynalazku jest także sposób prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli prowadzony w urządzeniu do prowadzenia analizy, polegający na umieszczeniu badanego obiektu na podstawce na obiekt, nakierowaniu na niego strumienia światła ze źródła światła koherentnego wyposażonego w układ rozszerzający wiązkę światła, rejestrowaniu filmu lub serii zdjęć ze stałym krokiem czasowym oraz analizie zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć, który charakteryzuje się tym, że na badany obiekt ze źródła światła koherentnego kierowane są naprzemiennie przynajmniej dwa strumienie światła o różnych długościach fali, przy czym kąt a zawarty między strumieniem światła a osią obiekt - detektor jest taki sam dla wszystkich długości fali.

Na badany obiekt korzystnie kierowane są dwa strumienie światła koherentnego o długościach fali 635 nm i 830 nm.

Sposób charakteryzuje się również tym, że położenie badanego obiektu regulowane jest w pionie podstawką na obiekt a w poziomie ogranicznikiem, do którego obiekt podczas badania przylega a badaniu poddawany jest obszar ograniczony otworem w ograniczniku.

Zastosowanie źródła generującego koherentne światło o przynajmniej dwóch różnych dług ościach fali lub jednego źródła o zmiennej długości fali w jednym urządzeniu umożliwia analizę odrębnej aktywności biospeckli dla każdej użytej długości fali świetlnej. Aktywności te dla różnych długości fali będą różne ze względu na różną absorpcję przez barwniki w materiale biologicznym i różną głębokość

PL 223 465 B1 penetracji. Zarówno urządzenie jak i sposób pozwala uzyskać dodatkowe informacje o cechach materiału biologicznego w porównaniu do dotychczas stosowanych urządzeń i sposobów wykorzystujących jedną ustaloną długością fali.

Zastosowanie więcej niż jednej długości fali światła laserowego w urządzeniu do oceny aktywności zjawiska biospeckli, pozwala na uzyskanie nowych informacji dotyczących aktywności biologic znej badanych obiektów oraz ich składu chemicznego. Jak wykazano, źródłem aktywność biospeckli rejestrowanej na obiekcie biologicznym są procesy związane z ruchem wewnątrz komórek, aktywność ta jest jednak odwrotnie proporcjonalna do zawartości substancji chemicznych absorbujących zastosowaną długość fali światła laserowego. Tak więc, stosując więcej niż jedną długość fali światła laserowego, możliwa jest np. ocena tendencji zmian zawartości kilku substancji absorbujących światło o różnych długościach fali lub określenie aktywności elementów komórkowych absorbujących światło o innych długościach fali. Dodatkowo wybranie lasera o długości fali nie absorbowanej przez barwniki pozwala na ocenę stanu materiału biologicznego zwłaszcza owoców i warzyw związanych metabolizmem i ruchem cząstek wewnątrz materiału biologicznego bez wpływu barwników.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładowym wykonaniu na rysunku, na którym:

Fig. 1 przedstawia typowy obraz plamkowy powierzchni obiektu biologicznego,

Fig. 2 przedstawia schematycznie urządzenie w widoku z góry, w wersji ze źródłem światła z dwóch laserów o różnych długościach fali,

Fig. 3 przedstawia schematycznie urządzenie w widoku z góry, w wersji z jednym źródłem światła laserowego o zmiennej długości fali,

Fig. 4 przedstawia, w postaci wykresu, aktywność biospeckli podczas badania jabłek w kolejnych dniach eksperymentu, rejestrowaną dla różnych długości fali światła laserowego,

Fig. 5 przedstawia, w postaci wykresu, transmitancję wybranych długości fal świetlnych rejestrowanych podczas badania jabłek w kolejnych dniach eksperymentu,

Fig. 6 przedstawia, w postaci wykresu, fluorescencję chlorofilu badanych jabłek w kolejnych dniach eksperymentu.

Przykład I wykonania urządzenia przedstawionego schematycznie na Fig. 2

Urządzenie składa się z umieszczonych na podstawie (1) źródła światła koherentnego wraz z układem (2) rozszerzającym wiązkę światła, detektora (3) obrazu w postaci kamery CCD wyposażonego w obiektyw (4) ze zmienną przesłoną, oprogramowanie do rejestracji filmu lub serii zdjęć oraz oprogramowanie do analizy zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć a także podstawki (5) na obiekt (6). Jako źródło światła zastosowane są dwa lasery (7) ustawione symetrycznie pod kątem α względem osi: obiekt (6) - detektor (3). Zastosowane lasery generują światło o dwóch długościach fali: 635 nm i 830 nm. Podstawa (1) wsparta jest na, nieprzedstawionych na rysunku, nóżkach zakończonych gumą. Podstawka (5) na obiekt (6) osadzona jest na zamocowanym na podstawie (1) trzpieniu (8) nat omiast w osi detektora (3) znajduje się otwór (9) w umieszczonym na podstawie (1) ograniczniku (10).

Przykład II wykonania urządzenia przedstawionego schematycznie na Fig. 3

Urządzenie składa się z umieszczonych na podstawie (1) źródła światła koherentnego wraz z układem (2) rozszerzającym wiązkę światła, detektora (3) obrazu w postaci kamery CCD, wyposażonego w obiektyw (4) ze zmienną przesłoną, oprogramowanie do rejestracji filmu lub serii zdjęć oraz oprogramowanie do analizy zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć a także podstawki (5) na obiekt (6). Jako źródło światła zastosowano jeden laser (11) przystosowany do wytwarzania światła o zmiennej długości fali, który generuje światło o długościach fali: 635 nm i 830 nm. Podstawa (1) wsparta jest na, nieprzedstawionych na rysunku, nóżkach zakończonych gumą. Podstawka (5) na obiekt (6) osadzona jest na zamocowanym na podstawie (1) trzpieniu (8) natomiast w osi detektora (3) znajduje się otwór (9) w umieszczonym na podstawie (1) ograniczniku (10).

Przykład wykonania sposobu

Sposób prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych według wynalazku, prowadzony w urządzeniu do prowadzenia analizy, polega na umieszczeniu badanego obiektu (6) na podsta wce (5) na obiekt (6), nakierowaniu na niego strumienia światła ze źródła światła koherentnego wyposażonego w układ rozszerzający (2) wiązkę światła, rejestrowaniu filmu lub serii zdjęć ze stałym kr okiem czasowym oraz analizie zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć, przy czym na badany obiekt (6) ze źródła światła koherentnego kierowane są naprzemiennie dwa strumienie światła o długościach fali 635 nm i 830 nm a kąt α zawarty między strumieniem światła a osią: obiekt (6) - detektor (3) jest taki sam dla obu długości fali. Przed skierowaniem na obiekt wiązki światła, położenie badanego obiektu (6) regulowane jest w pionie podstawką (5) na obiekt (6) a w poziomie ogranicznikiem (10), do którego

PL 223 465 B1 obiekt (6) podczas badania przylega. Badaniu poddawany jest obszar ograniczony otworem (9) w ograniczniku (10). Badanie według sposobu stanu uszkodzenia przeprowadzono na jabłku które uprzednio poddane zostało wysokiemu ciśnieniu hydrostatycznemu o wartości 150 MPa, jako potencjalnej metody sterylizacji mikrobiologicznej. Przeprowadzone badanie polegało na pomiarze param etrów fizjologicznych: fluorescencji chlorofilu, danych spektralnych i aktywności biospeckli owoców w pierwszym dniu przed oraz przez 5 dni po traktowaniu wysokim ciśnieniem. Wyniki doświadczenia przedstawione są na wykresach przedstawionych na figurach Fig. 4 - Fig. 6.

Jak wynika z wykresu przedstawionego na Fig. 4, pierwszego dnia przed poddaniem owoców działaniu wysokiego ciśnienia, aktywność biospeckli, w skrócie BA, dla obu długości fal jest zbliżona i relatywnie wysoka. Drugiego dnia po traktowaniu owoców wysokim ciśnieniem, aktywność zjawiska jest minimalna dla długości fali 635 nm po czym w kolejnych dniach BA dla tej długości fali wzrasta. Minimum aktywności biospeckli dla długości fali 830 nm następuje trzeciego dnia eksperymentu, po czym także widoczny jest wzrost wartości tego parametru.

Różny charakter zmian aktywności biospeckli w czasie dla dwóch długości fali rejestrowanej na tych samych obiektach, świadczy o nieco innych źródłach aktywności zjawiska co umożliwia uzysk anie dodatkowych informacji. W przypadku obu długości fal, aktywność biospeckli jest silnie związana z tempem procesów biologicznych o czym świadczy duży spadek fluorescencji chlorofilu przedstawiony na wykresie na Fig. 6 jak i aktywności biospeckli drugiego dnia po traktowaniu jabłek wysokim ciśnieniem. Dane spektroskopowe świadczą jednak, że silny spadek aktywności biospeckli drugiego dnia eksperymentu dla długości fali 635 nm może być związany także ze wzrostem absorpcji promieniowania przez uszkodzoną tkankę co widoczne jest jako spadek transmitancji z ponad 70% do poniżej 30% przedstawionym na wykresie Fig. 5. W przypadku długości fali 830 nm, dla której wzrost absorpcji światła jest nie tak znaczący, spadek transmitancji z ok. 95 do ok. 70%, aktywność biospeckli stopniowo obniża się wraz z zamieraniem uszkodzonych komórek aby trzeciego dnia osiągnąć minimum a następnie wzrasta wraz ze wzrostem tempa intensywności procesów autolitycznych lub rozwoju mikroorganizmów. Tak więc zastosowanie dwóch długości fali, umożliwia w przedstawionym przypadku ocenę zmian aktywności biologicznej jak i niesie informację na temat potencjalnych zmian składu chemicznego obiektów. Obserwowane zmiany mogą być też wynikiem różnej aktywności elementów komórek zdolnych do rozpraszania lub absorpcji określonych długości światła laserowego.

Claims (9)

1. Urządzenie do prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli składające się z umieszczonych na podstawie: źródła światła koherentnego wraz z układem rozszerzającym wiązkę światła, detektora obrazu w postaci kamery CCD, wyposażonego w obiektyw ze zmienną przesłoną, oprogramowanie do rejestracji filmu lub serii zdjęć oraz oprogramowanie do analizy zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć a także podstawki pod obiekt, znamienne tym, że źródło światła koherentnego jest generatorem światła o przynajmniej dwóch różnych długościach fali.

2. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że źródło światła koherentnego zestawione jest z przynajmniej dwóch laserów (7) stosujących różne długości fal, przy czym lasery (7) ustawione są tak, że kąt a zawarty między strumieniem światła a osią obiekt (6) - detektor (3) jest taki sam dla wszystkich długości fali.

3. Urządzenie według zastrz. 2, znamienne tym, że zastosowane są dwa lasery (7) ustawione względem osi obiekt (6) - detektor (3) symetrycznie, pod kątem a.

4. Urządzenie według zastrz. 1, znamienne tym, że źródłem światła koherentnego jest jeden laser (11) przystosowany do wytwarzania światła o zmiennej długości fali.

5. Urządzenie według zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że światło generowane przez źródło światła koherentnego ma długości fali 635 nm i 830 nm.

6. Urządzenie według zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że podstawa (1) wsparta jest na nóżkach zakończonych gumą, podstawka (5) na obiekt (6) osadzona jest na zamocowanym na podstawie (1) trzpieniu (8) natomiast w osi detektora (3) znajduje się otwór (9) umieszczonego na podstawie (1) ogranicznika (10).

7. Sposób prowadzenia analizy stanu materiałów biologicznych, zwłaszcza owoców lub warzyw z zastosowaniem zjawiska biospeckli prowadzony w urządzeniu do prowadzenia analizy, polegający

PL 223 465 B1 na umieszczeniu badanego obiektu na podstawce na obiekt, nakierowaniu na niego strumienia światła ze źródła światła koherentnego wyposażonego w układ rozszerzający wiązkę światła, rejestrowaniu filmu lub serii zdjęć ze stałym krokiem czasowym oraz analizie zarejestrowanego filmu lub serii zdjęć, znamienny tym, że na badany obiekt (6) ze źródła światła koherentnego kierowane są naprzemiennie przynajmniej dwa strumienie światła o różnych długościach fali, przy czym kąt a zawarty między strumieniem światła a osią obiekt (6) - detektor (3) jest taki sam dla wszystkich długości fali.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że na badany obiekt (6) kierowane są dwa strumienie światła koherentnego o długościach fali 635 nm i 830 nm.

9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że położenie badanego obiektu (6) regulowane jest w pionie podstawką (5) na obiekt (6) a w poziomie ogranicznikiem (10), do którego obiekt (6) podczas badania przylega a badaniu poddawany jest obszar ograniczony otworem (9) w ograniczniku (10).