PL223182B1 - Sposób rewersji faz antygenów rzęskowych Salmonella spp. metodą mostka bibułowego i zastosowanie pożywki agarowej AKG do rewersji faz antygenów rzęskowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób rewersji faz antygenów rzęskowych Salmonella spp. metodą mostka bibułowego poprzez zastosowanie pożywki agarowej AKG do rewersji faz antygenów rzęskowych. Bardziej szczegółowo, rozwiązanie według wynalazku stwarza możliwość określenia drugiej, pierwotnie nie eksponowanej fazy antygenów rzęskowych, a tym samym identyfikację serowaru Salmonella. Dodatkowo, czas poświęcany na identyfikację izolatów Salmonella ulega skróceniu o 24 + 48 h, przy jednoczesnym ograniczeniu kosztów badania wynikających ze zmniejszenia zużycia surowic diagnostycznych i nakładu pracy.

Wszystkie serowary Salmonella uznaje się za potencjalnie chorobotwórcze dla ludzi i/lub zwierząt. Stopień ich chorobotwórczości zależy od przynależności do poszczególnych serowarów. Niektóre z serowarów cechuje swoistość gatunkowa, a więc zdolność do wywoływania salmonellozy tylko u naczelnych bądź określonych gatunków zwierząt (Wray, 2000), większość jest jednak zdolna do zakażenia i wywołania objawów choroby u wielu gatunków ptaków i ssaków. Zakażenia Salmonella spp. w stadach zwierząt mają charakter wertykalny lub horyzontalny, a infekcje bezobjawowe i okresowe lub stałe nosicielstwo sprzyja rozprzestrzenianiu się zarazka. Ważnym źródłem zakażenia wpływającym w sposób istotny na rozprzestrzenianie się Salmonella pozostaje środowisko, które może zostać zanieczyszczone przez odchody zwierzęce czy ścieki komunalne (Wray, 2000).

Identyfikacja i różnicowanie gatunków i podgatunków Salmonella opiera się na analizie cech biochemicznych izolatów bakteryjnych. Kolejnym etapem diagnostyki jest identyfikacja serowaru, czyli określenie struktury antygenowej izolatu. Struktura antygenowa 2610 znanych obecnie serowarów została opisana w schemacie White-KauffmannieMinor (Grimont i Weill, 2007). Obecność antygenów rzęskowych warunkuje zdolność bakterii do ruchu - jedną z cech typowych dla rodzaju Salmonella. Istnieją nieliczne serowary, które nie posiadają takich właściwości (np. 5. Gallinarum), a inne serowary Salmonella mogą tracić zdolność do wytwarzania jednej lub obu faz antygenów rzęskowych i tym samym tracą zdolność do ruchu.

Rozpoznanie serowarów Salmonella polega na identyfikacji antygenów somatycznych i rzęskowych. Antygeny somatyczne są lipopolisacharydami, natomiast rzęskowe - białkami kodowanymi przez geny fliC i fljB, które są odpowiedzialne za ekspresję 1 i 2 fazy. W danym momencie pojedyncza komórka bakteryjna jest zdolna do ekspresji antygenów reprezentujących tylko jedną z faz, a złożony układ genów reguluje proces ich rewersji (Bonifield i Hughes, 2003; McQuiston i wsp., 2004). Salmonella posiadające dwa antygeny rzęskowe cechuje tzw. „zmienność fazowa”, która polega na naprzemiennej ekspresji obu genów. Wytwarzanie białka fljB skutkuje szeregiem przemian których efektem jest hamowanie transkrypcji fliC. Zmiana ekspresji fazy występuje zwykle raz na 10-10 generacji. Na populację bakterii uzyskanych w hodowli zwykle składają się zarówno komórki z ekspresją 1 fazy, jak te produkujące antygeny fazy 2. Dzięki temu możliwa jest identyfikacja pełnej struktury antygenowej szczepu metodą aglutynacji szkiełkowej w której hodowlę bakteryjną miesza się z surowicami diagnostycznymi zawierającymi specyficzne przeciwciała. Identyfikację antygenów somatycznych wykonuje się przy użyciu hodowli Salmonella uzyskanych na 3% agarze odżywczym. Do oznaczania antygenów rzęskowych wykorzystuje się hodowle prowadzone na tzw. miękkim (półpłynnym) agarze, który ułatwia rozwój antygenów rzęskowych. Koncentracja agaru półpłynnego waha się w pożywce od 0,5% do 1%, w zależności od jego siły żelującej (PN-EN ISO 6579:2003).

Oprócz miękkiego agaru odżywczego, którego skład podaje cytowana norma, dostępne są również komercyjne pożywki „półpłynne” wykorzystywane w tym samym celu, np. „Swarm agar” (SIFIN TN1702), Schworm agar (SSI art. no. 29565), Sven Gard Agar (Biorad 53430). Pożywki te są stosowane w celu uzyskania maksymalnej ekspresji antygenów rzęskowych w namnażanych komórkach Salmonella. Umożliwia to ich identyfikację metodą aglutynacji szkiełkowej przy użyciu zestawu surowic diagnostycznych, które zawierają przeciwciała skierowane przeciwko określonym antygenom Salmonella. Posiew pożywek „półpłynnych” wykonuje się zwykle w środkowej części płytki bakteriologicznej, a inkubację prowadzi w temperaturze 37 ± 1°C przez 16-24 h. Dzięki zdolności komórek Salmonella spp. do ruchu hodowla migruje po powierzchni pożywki.

Duże zróżnicowanie antygenowe w obrębie rodzaju Salmonella stwarza szereg problemów diagnostycznych. Prawidłowe określenie serowaru Salmonella jest podstawowym i nieodzownym elementem dochodzenia epidemiologicznego. Wszelkie metody typowania epidemiologicznego oparte o metody feno- lub genotypowe wykonywane są bowiem w obrębie izolatów reprezentujących ten sam serowar Salmonella (Hoszowski i Wasyl, 2001; Wasyl i Hoszowski, 2012). Pomimo obserwowanego

PL 223 182 B1 w ostatnich latach rozwoju metod molekularnych, żadna z nich nie jest wstanie zastąpić identyfikacji serologicznej. W najlepszym przypadku, metody te stwarzają możliwość identyfikacji około 100 najczęściej występujących serowarów (Wattiau i wsp., 2008; Ben-Darif i WSP., 2010; Franklin i wsp., 2011; Zając i wsp., 2013). Inne, takie jak PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis) lub MLST (Multilocus Sequence Typing) dają możliwość różnicowania izolatów wyłącznie w obrębie tego samego serowaru (Wasyl i wsp., 2008; Singh i wsp., 2012).

Zdarza się jednak, że dominująca produkcja jednej z faz, uniemożliwia identyfikację antygenów drugiej fazy, Do ich uwidocznienia konieczne jest zastosowanie metod tzw. rewersji faz antygenów (Graber i wsp., 1954; Szwarc i wsp., 2008). Pierwszą, stosowaną od lat 40-tych XX w. metodą jest tzw. „płytka Garda”. Polega ona na dodaniu do agaru półpłynnego surowicy skierowanej przeciwko antygenowi stwierdzonemu w badanym izolacie Salmonella. Obecne w surowicy przeciwciała w trakcie inkubacji hamują migrację komórek Salmonella posiadających ten antygen. Dzięki temu na obrzeżach hodowli na płytce Garda uzyskuje się hodowlę Salmonella, która wykazuje obecność drugiej fazy antygenów rzęskowych. Zaproponowane w kolejnych latach metody rewersji faz polegają na zastąpieniu agaru Garda (ok. 0,6%) pożywkami agarowymi o jeszcze niższej koncentracji agaru (np. 0,3%) umieszczonymi w probówce-rurce (kształt litery U) lub tzw. probówce Craigie (rurka umieszczona w probówce o średnicy kilku centymetrów). Posiew do jednego z ramion U-rurki lub rurki probówki Craigie skutkuje uzyskaniem na przeciwległym ramieniu hodowli wykazującej cechy rewersji faz rzęskowych Salmonella. Kolejna opisana metoda (Chiou i wsp., 2006) polega na umieszczeniu nasączonego surowicą diagnostyczną mostka bibułowego nad szczeliną wyciętą w agarze TSA (Trypticase Soya Agar). Inokulacja Salmonella po jednej stronie mostka powoduje, że po inkubacji (16 ± 2 h, 37 ± 1°C) po drugiej stronie mostka uzyskuje się wzrost bakterii, które były zdolne do pokonania bariery przeciwciał - tj. produkujących antygen nieujawnionej dotychczas fazy. Kolejny pasaż na pożywce półpłynnej umożliwia uzyskanie hodowli używanej w aglutynacji szkiełkowej. Wymienione metody rewersji faz nie są objęte ochroną patentową i zwykle są powszechnie dostępne (np. http://www.hpastandardmethods.org.uk/documents/bsopTP/pdf/bsoptp32.pdf).

Należy dodać, że w obecnej sytuacji prawnej w krajach UE badania urzędowe w kierunku zak ażeń zwierząt pałeczkami Salmonella są wykonywane wyłącznie przy zastosowaniu mikrobiologicznych metod hodowlanych, a w zależności od wykrytego serowaru Salmonella organa administracji weterynaryjnej podejmują określone decyzje administracyjne o istotnych konsekwencjach ekonomicznych.

Pożywka agarowa do ekspresji faz antygenów rzęskowych Salmonella w zgłoszeniu patentowym określana jest jako pożywka agarowa AKG.

Pomimo obserwowanego w ostatnich latach rozwoju metod molekularnych istnieje ciągła potrzeba uzyskania metod umożliwiających skrócenie czasu koniecznego do identyfikacji struktury antygenowej szczepu, a tym samym czasu trwania badania.

Celem wynalazku jest zastąpienie agaru TSA pożywką AKG, której skład promuje ekspresję antygenów rzęskowych, a koncentracja agaru w tej pożywce pozwala na uzyskanie wzrostu, który można bezpośrednio wykorzystać w aglutynacji szkiełkowej. Proponowana metoda pozwala skrócić czas konieczny do identyfikacji struktury antygenowej szczepu, a tym samym czas trwania badania co najmniej o 1 dobę. Dodatkowo, ze względu na konsystencję pożywki AKG (agar półpłynny), istotne znaczenie ma sposób umieszczenia mostka bibułowego nad wyciętą szczeliną, który powinien uniemożliwić połączenie się obu części pożywki AKG, Połączenie obu części pożywki powoduje bowiem, że uzyskana po inkubacji hodowla Salmonella nie wykazuje cech rewersji faz rzęskowych, gdyż migracja hodowli nie zachodziła poprzez nasączony przeciwciałami mostek bibułowy.

Nieoczekiwanie okazało się, że rozwiązanie według wynalazku stwarza warunki ułatwiające określenie pełnej struktury antygenowej obejmującej obie fazy antygenów rzęskowych badanego szczepu. Dodatkowo, czas poświęcany na identyfikację izolatów Salmonella ulega skróceniu o 24 + 48 h przy jednoczesnym ograniczeniu kosztów badania wynikających ze zmniejszenia zużycia surowic diagnostycznych i nakładu pracy.

Przedmiotem wynalazku jest sposób rewersji faz antygenów rzęskowych Salmonella spp. metodą mostka bibułowego, charakteryzujący się tym, że rewersji faz antygenów dokonuje się z zastosowaniem pożywki agarowej AKG, która zawiera bulion koński, glicerynę oraz agar, przy czym stosunek bulionu do gliceryny zawarty jest w przedziale 100 : 1,8; 100 : 2,2, zaś zawartość agaru wynosi od 0,5% do 1% i, że w pożywce AKG wycina się szczelinę o szerokości od 5 + 8 mm, nad szczeliną umieszcza się co najmniej 2 sterylne paski, korzystnie z bibuły, tak aby każdy z pasków utworzył p onad szczeliną rodzaj mostu, przy czym na środek pasków nakrapia się jałowo po 20 + 30 μl surowicy

PL 223 182 B1 diagnostycznej, zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko antygenom rzęskowym zidentyfikowanym w badanym szczepie, po czym odczekuje się do czasu wchłonięcia się surowicy i inokuluje badany szczep w miejscu zetknięcia się brzegu paska z pożywką AKG, po czym na płytce oznacza się kierunek migracji hodowli bakteryjnej, a następnie płytkę umieszcza się w cieplarce i inkubuje do czasu uzyskania wzrostu po stronie mostka przeciwległej do miejsca inokulacji.

Korzystnie, gdy mostek, korzystnie bibułowy, nad wyciętą szczeliną uniemożliwia połączenie się obu części pożywki AKG.

Korzystnie, gdy uzyskana po inkubacji hodowla Salmonella wykazuje cechy rewersji faz rzęskowych.

Korzystnie, gdy niezależne inokulacje większej liczby mostków zwiększają skuteczności rewersji.

Korzystnie, gdy skraca się czas konieczny do identyfikacji struktury antygenowej szczepu, a tym samym czas trwania badania co najmniej o 1 dobę.

Korzystnie, gdy sposób służy do określenia pełnej struktury antygenowej obejmującej obie fazy antygenów rzęskowych badanego szczepu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pożywki agarowej AKG zawierającej bulion koński, glicerynę oraz agar, przy czym stosunek bulionu do gliceryny zawarty jest w przedziale 100 : 1,8; 100 : 2,2, zaś zawartość agaru wynosi od 0,5% do 1,0%, przy czym gliceryna stanowi glic erynę cz.d.a, do rewersji faz antygenów rzęskowych Salmonella spp. sposobem mostka bibułowego określonym powyżej.

W celu lepszego zilustrowania wynalazku przedstawiono rysunek, gdzie:

figura 1 przedstawia porównanie rozwiązania według wynalazku z trzema najczęściej stosowanymi metodami rewersji faz rzęskowych, ze szczególnym naciskiem na różnice w ilości odczynników i czasu koniecznego do wykonania aglutynacji szkiełkowej i identyfikacji serowaru Salmonella.

W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Skład pożywki agarowej

a) bulion koński - 1 litr

b) gliceryna cz.d.a - 20 ml

c) wysoce oczyszczony agar przeznaczony dla celów bakteriologicznych - 7 g

Przygotowanie pożywki agarowej

1. Przygotowanie wyciągu końskiego:

Świeże mięso końskie chłodzono w temp. 5°C (możliwy zakres temperatur 5 ± 33°C) przez 21 godzin (możliwy czas chłodzenia 21 godzin ± 3 godziny), oczyszczono z tkanki łącznej i tłuszczowej, pokrojono na drobne kawałki i zalano równą objętością (w/v) wody drugiego stopnia czystości. Pozostawiono w temp. 5°C ± 3°C przez 21 godzin (możliwy czas 21 godzin ± 3 godziny). Następnie gotowano przez ok. 1 godzinę, uzupełniając ubytki wody w celu zachowania objętości wyjściowej. Uzyskany wyciąg koński schłodzono do temp. około 80°C, zdekantowano do kolb bakteriologicznych i poddano sterylizacji w temp. 121°C przez 15 min.

2. Przygotowanie bulionu końskiego:

Jałowy wyciąg koński przesączono przez bibułę filtracyjną i uzupełniono wodą dr ugiego stopnia czystości w stosunku 1:1. Wymieszano i dodano 1% peptonu bakteriologicznego uzyskanego poprzez enzymatyczne trawienie mięsa, 0,5% chlorku sodowego cz.d.a, oraz 1 g/L sodu diwodorofosforanu bezwodnego cz.d.a. (Na₂HPO₄). Po rozpuszczeniu składników ustalono pH bulionu na 7,4 ± 0,2 przy pomocy 1N NaOH. Sterylizowano w temp. 121 °C przez 15 min.

3. Wykonanie pożywki AKG:

Do 1 litra jałowego, klarownego bulionu końskiego, dodano 20 ml gliceryny bezwodnej cz.d.a. Wymieszano i dodano 7 g wysoce oczyszczonego agaru przeznaczonego do stosowania w bakteriologii. Całość ogrzewano w temp. 97,5°C, wytrząsając przez około 0,5 h. Rozpuszczoną pożywkę ro zlano do zamykanych pojemników (butelek). Sterylizowano w temp. 117°C przez 15 min. Końcowe pH pożywki wynosiło 7,0 ± 0,2. Okres przechowywania w temperaturze schłodzenia: 3 m-ce.

4. Przygotowanie pożywki AKG do posiewu:

Pożywkę rozpuszczono w łaźni wodnej i rozlano na płytki bakteriologiczne o średnicy 60 lub

100 mm, tak aby uzyskać warstwę agaru o grubości 4-5 mm. Pozostawiono do zestalenia. Nie należy odwracać płytek.

Posiew pożywki AKG:

PL 223 182 B1

Badany izolat Salmonella inokulowano w centrum pożywki. Inkubowano przez noc w temperaturze 37°C (możliwa temperatura 37 ± 1°C). Wzrost bakterii (hodowla) powinien być widoczny na całej lub przeważającej części powierzchni pożywki. Do aglutynacji szkiełkowej, w celu identyfikacji obu faz antygenów rzęskowych, pobierano materiał z różnych części hodowli, odległych od siebie i miejsca inokulacji izolatu Salmonella.

P r z y k ł a d 2

Skład pożywki agarowej

a) bulion koński - 1 litr

b) gliceryna cz.d.a - 18 ml

c) agar bakteriologiczny - 5 g

P r z y k ł a d 3

Skład pożywki agarowej

a) bulion koński - 1 litr

b) gliceryna cz.d.a - 22 ml

c) agar agar - 10 g

P r z y k ł a d 4

Przygotowanie płytki do posiewu

W płytce AKG, przygotowanego w sposób opisany w zgłoszeniu, wydęto jałowo pasek pożywki o długości równej średnicy płytki i szerokości około 1 cm. Nad powstałą szczeliną umieszczono 2 jałowe paski bibuły filtracyjnej o gramaturze 160-200 g/m i grubości 0,30 + 0,45 mm. Paski bibuły o wymiarze około 2 x 0,3 + 0,5 cm umieszczano tak, aby ich końce opierały się na obu krawędziach pożywki tworząc mostek nad szczeliną wyciętą w pożywce AKG. Odległość między mostkami wynosiła 1 + 1,5 cm. Na środek mostka naniesiono 5 + 20 ąl surowicy zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko stwierdzonej fazie antygenu rzęskowego. Zastosowana objętość surowicy powinna zapewnić nasączenie całego mostka bibułowego, przy czym nadmiar surowicy nie powinien ściekać na pożywkę AKG lub do wyciętej w niej szczeliny.

Posiew płytki

Badany izolat Salmonella 4,5,12:-:1,2, który cechuje ekspresja fazy II antygenów rzęskowych (H:1,2), inokulowano w punkcie styku jednego z końców mostka i pożywki AKG. Na płytce oznaczono miejsce inokujacji, po czym płytkę inkubowano przez noc w temp. 37°C. W przypadku wystąpienia szukanej fazy antygenów rzęskowych, wzrost bakterii był widoczny na powierzchni pożywk i po stronie mostka przeciwległej miejscu posiewu. W celu identyfikacji szukanej fazy I antygenów rzęskowych pobierano materiał z hodowli na części pożywki przeciwległej miejscu posiewu i wykonano aglutynację szkiełkową z surowicami H:e,h, H:i, H:r. Stwierdzono wystąpienie reakcji aglutynacji z surowicą H:i, co pozwoliło określić strukturę antygenową badanego izolatu jako 4,5,12: i :1,2 (Salmonella Typhimurium). W przypadku braku wzrostu czas inkubacji przedłużono do 48 h.

P r z y k ł a d 5

Przygotowanie płytki do posiewu

W płytce AKG, przygotowanego w sposób opisany w zgłoszeniu, wydęto jałowo pasek pożywki o długości równej średnicy płytki i szerokości około 1 cm. Nad powstałą szczeliną umieszczono jałowy ₂ pasek bibuły filtracyjnej o gramaturze 160 - 200 g/m i grubości 0,30 + 0,45 mm. Pasek bibuły o wymiarze około 2 x 0,3 + 0,5 cm umieszczano tak, aby jego końce opierały się na obu krawędziach pożywki tworząc mostek nad szczeliną wyciętą w pożywce AKG. Na środek mostka naniesiono 5 + 20 ąl surowicy zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko stwierdzonej fazie antygenu rzęskowego. Zastosowana objętość surowicy powinna zapewnić nasączenie całego mostka bibułowego, przy czym nadmiar surowicy nie powinien ściekać na pożywkę AKG lub do wydętej w niej szczeliny.

Posiew płytki

Badany izolat Salmonella 6,7:z₁₀:-, który cechuje ekspresja fazy I antygenów rzęskowych (H:z10), inokulowano w punkcie styku jednego z końców mostka i pożywki AKG. Płytkę inkubowano przez noc w temp. 37°C. W przypadku wystąpienia szukanej fazy antygenów rzęskowych, wzrost bakterii był widoczny na powierzchni pożywki po stronie mostka przeciwległej miejscu posiewu. W celu identyfikacji szukanej fazy II antygenów rzęskowych pobierano materiał z hodowli na części pożywki przeciwległej miejscu posiewu i wykonano aglutynację szkiełkową z surowicami H:1,2,5, H:e,n,x, H;e,n,z15, H:l,w. Stwierdzono wystąpienie reakcję aglutynacji z surowicą H:e,n,z15, co pozwoliło określić strukturę antygenową badanego izolatu jako 6,7:z₁₀:e,n,z₁₅ (Salmonella Mbandaka). W przypadku braku wzrostu czas inkubacji przedłużono do 48 h.

PL 223 182 B1

P r z y k ł a d 6

Przygotowanie płytki do posiewu

W płytce AKG, przygotowanego w sposób opisany w zgłoszeniu, wycięto jałowo pasek pożywki o długości równej średnicy płytki i szerokości około 1 cm. Nad powstałą szczeliną umieszczono paski bibuły filtracyjnej o gramaturze 160 - 200 g/m i grubości 0,30 + 0,45 mm nasączone surowicą zawierającą przeciwciała skierowane przeciwko stwierdzonej fazie antygenu rzęskowego. Nadmiar surowicy nie powinien ściekać na pożywkę AKG lub do wyciętej w niej szczeliny.

Posiew płytki

Badany izolat Salmonella 6,8:z₁₀:-, który cechuje ekspresja fazy I antygenów rzęskowych (H:z₁₀), inokulowano w punkcie styku jednego z końców mostka i pożywki AKG, po czym płytkę inkubowano przez noc w temp. 37°C. W przypadku wystąpienia szukanej fazy antygenów rzęskowych, wzrost bakterii był widoczny na powierzchni pożywki po stronie mostka przeciwległej miejscu posiewu, W celu identyfikacji szukanej fazy II antygenów rzęskowych pobierano materiał z hodowli na części pożywki przeciwległej miejscu posiewu i wykonano aglutynację szkiełkową z surowicami H:1,2,5, H:e,n,x, H:e,n,z₁₅, H:1,7. W przypadku braku wzrostu czas inkubacji można przedłużyć do 48 h. Stwierdzono wystąpienie reakcję aglutynacji z surowicą H:e,n,x, co pozwoliło określić strukturę ant ygenową badanego izolatu jako 6,8:z10:e,n,x (Salmonello Hadar). W przypadku braku wzrostu czas inkubacji przedłużono do 48 h.

Piśmiennictwo

Ben-Darif E, De Pinna E, Threlfall EJ, Bolton FJ, Upton M, Fox AI (2010), Comparison of a semi-automated rep-PCR system and multilocus sequence typing for differentiation of Salmonella enterica isolates. J Microbiol Methods 81 (1), 11 -16.

Bonifield HR, Hughes KT (2003), Flagellar phase variation in Salmonella enterica is mediated by a posttranscriptional control mechanism, J Bacteriol 185 (12), 3567-3574.

Chiou CS, Huang JF, Tsai LH, Hsu KM, Liao CS, Chang HL (2006), A simple and low-cost paper-bridged method for Salmonella phase reversal. Diagn Microbiol Infect Dis 54 (4), 315-317.

Franklin K, Ungohr EJ, Yoshida C, Anjum M, Bodrossy L, Clark CG, Kropinski AM, Karmali MA (2011), Rapid genoserotyping tool for classification of Salmonella serovars. J Clin Microbiol 49 (8), 2954-2965.

Graber CD, Ino J, Lincoln AF (1954), A rapid method for phase recovery in Salmonella cultures. 2 (6), 380-381.

Grimont PAD, Weill F-X. Antigenic formulas of Salmonella serovars, 9th editon. Paris: WHO Collaborating Centre for Research on Salmonella, Institute Pasteur, 2007.

Hoszowski A, Wasyl D (2001), Typing of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Mbandaka isolates, Vet Microbiol 80 (2), 139-148.

McQuiston JR, Parrenas R, Ortiz-Rivera M, Gheesling L, Brenner F, Fields PI (2004), Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella. J Clin Microbiol 42 (5), 1923-1932.

Singh P, Foley SL, Nayak R, Kwon YM (2012), Multilocus sequence typing of Salmonella strains by high-throughput sequencing of selectively amplified target genes. J Microbiol Methods 88 (1), 127-133.

Szwarc M, Skarżyńska M, Hoszowski A, Wasyl D (2008), Metody inwersji faz rzęskowyc h Salmonella. XII Kongres Polskiego Towarzystwa Nauk Weterynaryjnych „Od Nauki do Praktyki”, Olsztyn, s. 351.

Wasyl D, ElSedawy A, Lukinmaa S (2008), PulseNet Europe międzynarodowa sieć typowania molekularnego w nadzorze epidemiologicznym chorób szerzących się drogą pokarmową. Medycyna Wet 64 (2), 123-126.

Wasyl D, Hoszowski A (2012), First isolation of ESBL-produdng Salmonella and emergence of multiresistant Salmonella Kentucky in turkey in Poland. Food Res Int 45 (2), 958-961.

Wattiau P, Van Hessche M, Schlicker C, Vander Veken H, Imberechts H (2008), Comparison of classical serotyping and PremiTest assay for routine identification of common Salmonella enterica serovars. J Clin Microbiol 46 (12), 4037-4040.

Wray CWA. Salmonella in domestic animals. Oxon, UK and New York, USA, 2000: CABI Publishing, 2000.

Zając M, Hoszowski A, Wasyl D (2013), Identification of common, non-typable and autoagglutinating Salmonella strains with Premi®Test Salmonella Assay Acta Vet Hung 61 (w druku).

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób rewersji faz antygenów rzęskowych Salmonella spp. metodą mostka bibułowego, znamienny tym, że rewersji faz antygenów dokonuje się z zastosowaniem pożywki agarowej AKG, która zawiera bulion koński, glicerynę oraz agar, przy czym stosunek bulionu do gliceryny zawarty jest w przedziale 100 : 1,8; 100 : 2,2, zaś zawartość agaru wynosi od 0,5% do 1% i, że w pożywce AKG wycina się szczelinę o szerokości od 5 + 8 mm, nad szczeliną umieszcza się co najmniej 2 sterylne paski, korzystnie z bibuły, tak aby każdy 2 pasków utworzył ponad szczeliną rodzaj mostu, przy czym na środek pasków nakrapia się jałowo po 20 + 30 μl surowicy diagnostycznej, zawierającej przeciwciała skierowane przeciwko antygenom rzęskowym zidentyfikowanym w badanym szczepie, po czym odczekuje się do czasu wchłonięcia się surowicy i inokuluje badany szczep w miejscu zetknięcia się brzegu paska z pożywką AKG, po czym na płytce oznacza się kierunek migracji hodowli bakteryjnej, a następnie płytkę umieszcza się w cieplarce i inkubuje do czasu uzyskania wzrostu po stronie mostka przeciwległej do miejsca inokulacji.
2. 2. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że mostek, korzystnie bibułowy, nad wyciętą szczeliną uniemożliwia połączenie się obu części pożywki AKG.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskana po inkubacji hodowla Salmonella wykazuje cechy rewersji faz rzęskowych.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że niezależne inokulacje większej liczby mostków zwiększają skuteczności rewersji.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że skraca się czas konieczny do identyfikacji struktury antygenowej szczepu, a tym samym czas trwania badania co najmniej o 1 dobę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że służy do określenia pełnej struktury antygenowej obejmującej obie fazy antygenów rzęskowych badanego szczepu.