PL222746B1 - Przepływowy mikrosystem z detekcją spektrofotometryczną do analizy medium hodowlanego - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest przepływowy mikrosystem z detekcją spektrofotometryczną do analizy medium hodowlanego i oznaczania żywotności komórek. Tego typu mikrosystemy mogą znaleźć zastosowanie szczególnie w mikrobioanalityce i laboratoriach biologicznych.

Analiza żywotności komórek i aktywność cytotoksyczna związków prowadzona jest w wysoko wyspecjalizowanych laboratoriach biologicznych. Badania te, przeprowadzane są na poziome komórkowym z wykorzystaniem bezpośrednich lub pośrednich metod. Testy bezpośrednie polegają na obserwacji komórek po dodaniu do nich barwników (np. jodku propidyny, kalceiny-AM) rozróżniających komórki martwe od żywych. Z kolei w testach pośrednich oznaczany jest charakterystyczny marker (np. test MTT, LDH). Powyższe badania, wykonywane w klasycznych laboratoriach, wymagają dużych nakładów finansowych i są czasochłonne. W związku z czym, istotne jest poszukiwanie nowych rozwiązań pozwalających na skrócenie, zautomatyzowanie czy ułatwienie etapów badań związanych z analizą związków o potencjalnym działaniu leczniczym. W tym celu wykorzystywane są systemy Lab-on-a-chip, umożliwiające między innymi ocenę toksycznego wpływu określonych związków na komórki. Mikrosystemy opisywane w literaturze, najczęściej przeznaczone są do prowadzenia hodowli komórek, a następnie analizy toksyczności leków za pomocą metod bezpośrednich, np. obserwacji mikroskopowej. Brakuje doniesień literaturowych na temat przepływowych mikrosystemów z detekcją spektrofotometryczną, umożliwiających analizę medium znad hodowli komórkowej. Opracowanie tego typu mikrosystemu umożliwi analizę, w małej objętości, zmian składu w medium hodowlanym występujących po inkubacji z wybranymi związkami.

Mikrosystem według wynalazku składa się z dwóch połączonych ze sobą płytek polimerowych, korzystnie z polimetakrylanu metylu) PMMA, otrzymanego metodą wylewania. Mikrosystem według wynalazku składa się z głównego mikrokanału przepływowego, tworzącego w układzie liniowym od czterech do dwudziestu czterech, korzystnie osiem oddalonych od siebie o 4,5 mm, mikrospiral. Główny mikrokanał przepływowy, przeznaczony do przeprowadzenia reakcji, zaopatrzony jest w dwa mikrokanały wlotowe, dla badanego roztworu i reagenta oraz mikrokanał wylotowy. Na końcu głównego mikrokanału przepływowego, tworzącego mikrospirale, znajduje się mikrocelka pomiarowa połączona ze światłowodami. Współosiowe ułożenie światłowodów i celki pomiarowej umożliwia przeprowadzenie pomiaru z wykorzystaniem detekcji spektrofotometrycznej. Światłowody znajdują się w dodatkowych mikrokanałach o przekroju kwadratowym, rozchodzących się prostopadle od środka celki pomiarowej ku brzegom płytki. Światłowody, korzystnie wykonane z PMMA, podłączone są do źródła światła oraz układu pomiarowego. Ułożenie mikrospiral, w mikrosystemie według wynalazku, odpowiada ułożeniu jednej kolumny mikrodołków w płytce 384-dołkowej, co dodatkowo pozwala na przeprowadzenie pomiarów z wykorzystaniem czytnika płytek, w każdej kolejnej mikrospirali układu.

Mikrosystem według wynalazku charakteryzuje się tym, że w jednym procesie technologicznym, razem z mikrospiralami wytwarza się celkę pomiarową umieszczoną w tej samej płaszczyźnie co mikrospirale. Światłowody, podłączone do źródła światła oraz układu detekcyjnego, umożliwiają analizę mikroobjętości medium hodowlanego w przepływie z wykorzystaniem detekcji spektrofotometrycznej. Mikrosystem według wynalazku może stać się alternatywnym rozwiązaniem pozwalającym na ocenę działania terapeutycznego związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym.

Mikrosystem według wynalazku został zilustrowany w przykładzie wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat mikrostruktury układu w widoku z góry, fig. 2 przedstawia powiększenie pojedynczej mikrospirali, fig. 3 przedstawia przekrój poprzeczny celki pomiarowej, fig. 4 - widok perspektywiczny sposobu wytwarzania kolejnych warstw mikrosystemu.

Mikrosystem wykonano z dwóch płytek polimerowych 1 i 2 z polimetakrylanu metylu). Płytki są ze sobą trwale połączono w procesie bondowania termicznego, zapewniając uszczelnienie mikrowzorów. Mikrosystem zawiera główny mikrokanał przepływowy 3 tworzący osiem mikrospiral 4 oddalonych od siebie o 4,5 mm, dwa kanały wlotowe służące do wprowadzania badanego roztworu 5 i reagenta 6 oraz kanał wylotowy 7. W tej samej płaszczyźnie poziomej, w której umieszczone są mikrospirale 4 znajduje się celka przepływowa 8 - stanowiąca miejsce detekcji, połączona z dodatkowymi mikrokanałami 9, przeznaczonymi do umieszczenia światłowodów.

Wykonanie przepływowego mikrosystemu z detekcją spektrofotometryczną do analizy medium hodowlanego rozpoczyna się od zaprojektowania w programie SolidWorks, z dokładnością odwzorowania wymiarów wynoszącą 1 μm, przebiegu głównego mikrokanału przepływowego 3 i miejsca

PL 222 746 B1 detekcji - celki przepływowej 8. Zaprojektowany model CAD należy przetłumaczyć na język maszynowy przy pomocy modułu CAM - SolidCAM.

W dolnej płytce polimerowej 1 o grubości 2 mm, metodą mikrofrezowania, wykonano główny mikrokanał 3, tworzący osiem mikrospiral 4 o kwadratowym przekroju poprzecznym i wymiarze 200 μm. Mikrospirale 4 wykonano przy pomocy frezu walcowo-czołowego o średnicy 200 μm. Maksymalną prędkość obrotową wrzeciona ustawiono na 12000 rpm. Na końcowym odcinku głównego mikrokanału 3 wykonano celkę przepływową 8, w której następuje detekcja produktów powstających w mikrosystemie. Celka przepływowa 8 stanowi pogłębienie i poszerzenie mikrokanału głównego 3, gdzie maksymalna głębokość wynosi 500 μm natomiast maksymalna szerokość 1 mm. Celkę przepływową 8 wytworzono w dwóch procesach obróbczych. W pierwszym, przy zastosowaniu płaskiego frezu wykonano zgrubną obróbkę, gdzie zastosowano frezowanie przy stałym zagłębieniu pojedynczego cyklu. W obróbce wykańczającej zastosowano kuliście zakończony frez walcowo-czołowy o średnicy 200 μm, a jako proces obróbczy wykorzystano obróbkę ołówkową. Mikrokanały dodatkowe 9 przeznaczone do umieszczenia światłowodów, wykonano przy pomocy płaskiego frezu walcowo-czołowego o średnicy 500 μm, przy czym zastosowano analogiczne parametry obróbki jak przy wykonywaniu mikrokanału głównego 3. W drugiej płytce polimerowej 2, wywiercono otwory 5a, 6a i 7a o średnicy 1 mm, połączone z kanałami wlotowymi 5 i 6 oraz kanałem wylotowym 7. Następnie, koncentrycznie do otworów, wykonano gniazda o średnicy 2,5 mm i głębokości 4 mm do mocowania nanoportów. W gniazdach nacięto ręcznie gwinty wewnętrzne ISO529 M3. Dodatkowo w obu elementach mikrosystemu wycięto otwory 10 pod elementy justujące 11 o średnicy 3 mm mające na celu odpowiednie ustawienie względem siebie płytek polimerowych 1 i 2. Oczyszczone płytki: wodą destylowaną, izopropanolem, metanolem i ponownie wodą destylowaną umieszczono w temperaturze 95°C na około 20 min. Dolna płytka 1 została zaopatrzona w elementy justujące 11, natomiast górna płytka 2 została umieszczona na 4s nad powierzchnią chloroformu rozgrzanego do 85°C w celu chemicznego zmodyfikowania powierzchni. Tak przygotowane płytki polimerowe 1 i 2 połączono ze sobą w procesie bondowania termicznego przy użyciu laboratoryjnej prasy hydraulicznej, po uprzednim ogrzaniu ich do temperatury 96°C, pod naciskiem 45 kg/cm w czasie 30 min. Następnie, do mikrokanałów 9 wklejono światłowody z PMMA o średnicy 500 μm i uszczelniono poprzez użycie kleju silikonowego. W otworach wlotowych 5a, 6a i wylotowych 7a umieszczono poliuretanowe uszczelki 12 oraz wkręcono nano-porty 13. Wykonany mikroukład posłużył do przeprowadzenia oceny żywotności komórek na podstawie analizy supernatantu znad ich hodowli. Komórki nowotworowe płuc A549, hodowane na płytkach Petriego, zostały poddane działaniu roztworu 5-Fluorouracylu o różnym stężeniu (0:1200 μM). Po 24 godzinach inkubacji badano supernatant. Wykonano analizę żywotności komórek za pomocą testu LDH - oznaczania aktywności dehydrogenazy mleczanowej. W tym celu, za pomocą pompy strzykawkowej (przepływ 2 μ^ΐπ) do wlotu 5 wprowadzono badaną próbkę (supernatant), natomiast do wlotu 6 reagent (LDH-Cytotoxicity Assay Kit firmy BioVision). W wyniku przepływu wprowadzane roztwory ulegały wymieszaniu w mikrospiralach 4, w efekcie czego w celce przepływowej 8 za pomocą detekcji spektrofotometrycznej oznaczano produkt reakcji (długość fali 505 nm). Światłowody umieszczone w mikrokanale 9, połączone z układem detekcyjnym umożliwiły rejestrację sygnału w programie LAbView. NA podstawie powyższego eksperymentu wyliczono żywotność komórek dla każdego stężenia badanego roztworu, wykazując że żywotność komórek spada wraz ze wzrostem stosowanego stężenia 5-fluorouracylu, która dla 1200 μM wynosiła ok. 30%.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Przepływowy mikrosystem z detekcją spektrofotometryczną do analizy medium hodowlanego, znamienny tym, że składa się z dwóch płytek polimerowych (1) i (2), trwale połączonych ze sobą w procesie bondowania termicznego, zawierający dwa kanały wlotowe do wprowadzania badanego roztworu (5) i reagenta (6), główny mikrokanał przepływowy (3) tworzący od czterech do dwudziestu czterech mikrospiral (4) połączonych z celką przepływową (8) oraz kanał wylotowy (7), przy czym ułożenie mikrospiral (4) odpowiada ułożeniu jednej kolumny mikrodołków w płytce 384-dołkowej a celka przepływowa (8) znajduje się w tej samej płaszczyźnie poziomej, w której umieszczone są mikrospirale (4), ponadto podłączona jest ona z dodatkowymi mikrokanałami (9), przeznaczonymi do umieszczenia światłowodów.

   PL 222 746 B1
2. 2. Mikroukład według zastrz. 1, znamienny tym, że mikrokanał główny (3) ma przebieg w kształcie ośmiu mikrospiral (4) oddalonych od siebie o 4,5 mm.
3. 3. Mikrosystem według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że płytki polimerowe wykonane są z polimetakrylanu metylu.