PL221515B1

PL221515B1 - Sposób otrzymywania związków terpenoidowych, zwłaszcza smakowo-zapachowych

Info

Publication number: PL221515B1
Application number: PL392386A
Authority: PL
Inventors: Mariusz Trytek; Jan Fiedurek
Original assignee: Univ Marii Curie Skłodowskiej
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2016-04-29
Also published as: PL392386A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest biokatalityczny sposób otrzymywania związków terpenoidowych, zwłaszcza smakowo-zapachowych np. werbenolu i werbenonu oraz trans-pinokarweolu, mających szerokie zastosowanie w przemyśle perfumeryjnym, spożywczym lub farmaceutycznym.

Terpeny, wchodzące w skład kompozycji olejków eterycznych, produkowane są przez wiele roślin na drodze wtórnego metabolizmu, a także przez niektóre mikroorganizmy i zwierzęta. Najcenniejsze związki terpenoidowe takie jak werbenol, werbenon, pinokarweol, myrtenol, karwon, terpineol, czy alkohol perylowy, występują w przyrodzie w małych ilościach, stąd w niedużych stężeniach izolowane są z olejków eterycznych, np. z olejku werbenowego, eukaliptusowego, miętowego czy lawendowego. Werbenol i werbenon naturalnie występują np. w olejku werbena, rozmarynowym i truskawkach. P ozyskiwanie olejków z tkanek roślinnych (kwiaty, owoce, warzywa) lub zwierzęcych, zachodzi najczęściej przez destylację z parą wodną, ale także przez wytłaczanie i ekstrakcję rozpuszczalnikami lub tłuszczami jak np. w przypadku najcenniejszych wyciągów z jaśminu czy róży, (Schaffner W., Rośliny lecznicze - chemizm, działanie, zastosowanie. 1996, Oficyna Wydawnicza Multico, Warszawa). Procesy takie przebiegają z dużą stratą materiału roślinnego, często o ograniczonym dostępie, co wpływa na wysoką wartość rynkową takich komponentów.

Znane sposoby pozyskiwania związków smakowo-zapachowych przebiegają z użyciem metod chemicznych, prawie 80% związków aromatycznych obecnych na rynku światowym produkowanych jest na drodze chemicznej. (Krings U., Berger R.G., Appl. Microbiol. Biotechnol. Nr 49, 1998). Metody chemiczne przebiegają ze stosunkowo niską regio- i stereoselektywnością, nierzadko z użyciem substancji toksycznych co powoduje, że nie zawsze mają one zastosowanie, zwłaszcza do produkcji komponentów żywności. Alternatywnymi metodami otrzymywania terpenowych związków smakowozapachowych są metody biotechnologiczne, wykorzystujące biokatalizatory w postaci wolnych enzymów lub komórek czy tkanek zawierających takie enzymy. Wysokie stężenia lotnych i mało rozpus zczalnych monoterpenów, powodują inaktywację enzymów katalizujących proces biotransformacji i obniżenie jej wydajności. Często też, drobnoustroje metabolizują produkt w dalszych etapach reakcji, prowadząc ostatecznie do jego degradacji. W klasycznej metodzie wykorzystującej żywe komórki, niezbędne jest stosowanie podłoża do namnożenia biomasy, zawierającego odpowiednio dobrane składniki tj. źródło węgla, azotu, sole mineralne i inne mikroelementy oraz zoptymalizowanie składu podłoża dla samego procesu biotransformacji. Bariery dyfuzyjne pomiędzy substratem i centrum aktywnym enzymu, wymuszają efektywne mieszanie układu i wydłużają czas biokonwersji. Zwykle proces trwa kilka dni.

Oksydatywne procesy biotransformacji z udziałem licznych gatunków bakterii (Pseudomonas fluorescens NCIMB 11671; Pseudomnas putida NCIMB 8248; Pseudomonas sp.; Bacillus pallidus BR425) oraz grzybów (Armillariella mellea; Basidiomycetes sp.; Aspergillus niger NC1M 612; Pleurotus flabellatus, Aspergillus sp.), opisane w literaturze, van Keulen F., Correia C., da Fonseca M.M.R J Mol. Catal. B: Enzym. Nr 5, 1998; Agrawal R., Deepika NU, Joseph R. Biotechnol. Bioeng. Nr 63, 1999; Vidya C.M., Agrawal R. Appl. Microbiol. Biotechnol. Nr 62, 2003; van Dyk MS, van Rensburg E, Moleleki N Biotechnol. Lett. Nr 20, 1998 oraz dokumencie patentowym US 6344350, przebiegają z niską - wydajnością, przykładowo rzędu >1 g/L dla metabolitów takich jak tlenek α-pinenu, werbenon i werbenol, w koncentracji odpowiednio 0.3 i 0.4 g/L, po 4 dniach biotransformacji, i niewiele ponad 90 mg/L całkowitej wydajności mieszaniny 8 produktów, po 24 godzinach dwufazowego systemu biotransformacji α-pinenu przy udziale bakterii Bacillus pallidus BR425.

W mikrobiologicznym procesie utleniania α-pinenu w środowisku rozpuszczalnika organicznego przy użyciu rekombinowanego szczepu Escherichia coli BL21 (DE3), w którym poddano nadekspresji wariant V26T/R47F/A74G/F87V/L188K monooksygenazy P450 CYP102Alz Bacillus megaterium (P450BM-3 QM; P450(BM-3), uzyskano stężenie wszystkich produktów w mieszaninie: tlenku α-pinenu, werbenolu i myrtenolu nieco ponad 1 g/L - Schewe H., Holtmann D., Schrader I, Appl Microbiol Biotechnol Nr 83, 2009. Znany z opisu patentowego PL 198 047 sposób otrzymywania terpenów z udziałem porfiryn, jako biokatalizatora, charakteryzuje się niską regioselektywnością i specyficznością w zakresie typu reakcji, co wymaga zastosowania skomplikowanych metod oczyszczania i rozdzielania mieszanin ceramicznych dla otrzymania czystych enancjomerów o pożądanych właśc iwościach, np. organoleptycznych. Wyższy stopień czystości optycznej produktów, nawet powyżej 95%. (Niemiec A., Szeja W. 2001. Biotechnologia, 54, 104-123), uzyskuje się w procesie oksydatywnej transformacji przy użyciu drobnoustrojów mezofilnych - grzybów lub bakterii, wykazujących optiPL 221 515 B1 mum aktywności biokatalitycznej w zakresie temperatur 30-40°C. Z literatury wiadomo, że w procesach biotransformacji terpenów z użyciem drobnoustrojów mezofilnych, prowadzonych w temperaturach wyższych niż pokojowe, wydajność produktów malała w skutek strat spowodowanych ich nadmiernym parowaniem. Przykładowo, po biotransformacji limonenu trwającej 48 godzin w temperaturze 28-30°C z użyciem Penicillium digitatum NRRL 1202, w podłożu pozostają jedynie śladowe ilości limonenu (Tan, D.F. Day, K.R. Cadwallader, Process. Biochem. 33 (1998) 29-37). W tego typu reakcjach istnieje również możliwość zakażenia innymi drobnoustrojami (R. Cavicchioli, K.S. Siddiqui, D. Andrews, K R. Sowers, Curr. Opin. Biotechnol. 13 (2002) 253-261; C. Gerday, M. Aittaleb, M. Bentahir, J.P. Chessa, P. Claverie, T. Collins, S. D'Amico, J. Dumont, G. Garsoux, D. Georlette , A. Hoyoux, T. Lonhienne, M.A. Meuwis, G. Feller, Trends Biotechnol. 18 (2000) 103-107.

Pomimo, iż badania nad biotransformacją monoterpenów prowadzone są na świecie od początku lat 1960-tych, jak dotąd nie wdrożono do praktyki przemysłowej metody biotechnologicznego otrzymywania wysokiej jakości związków smakowo-zapachowych, zwłaszcza do produkcji komponentów żywności, wykorzystującej naturalne substraty i przebiegającej w korzystnych, z punktu widzenia ekonomicznego, warunkach.

Celem wynalazku jest opracowanie metody otrzymywania terpenoidowych związków smakowo-zapachowych, z łatwo dostępnych naturalnych surowców, przebiegającej w niskich temperaturach, z zadowalającą wydajnością i wysoką jakością otrzymywanych produktów.

Cel ten osiągnięto poprzez zastosowanie do biokonwersji pochodzących z naturalnych źródeł terpenów, psychrofilnego organizmu w postaci grzyba nitkowatego z rodzaju Chrysosporium pannorum 18, wyizolowanego z gleby pochodzącej z terenów zachodniego Spitsbergenu. Sposób otrzym ywania terpenoidowych związków smakowo-zapachowych, zwłaszcza werbenolu oraz werbenonu oraz tram-pinokarweolu według wynalazku charakteryzuje się tym, że monoterpen, korzystnie w postaci a- lub β-pinenu, wyizolowany znaną metodą z naturalnych surowców np. terpentyny, owoców cytrusowych lub olejku eukaliptusowego, poddaje się oksydatywnej transformacji z udziałem biokatalizatora w postaci wyhodowanego na pożywce szczepu psychrotroficznego grzyba nitkowatego z rodzaju Chrysosporium pannorum 18. Grzyb Chrysosporium pannorum 18, w celu zachowania stałej aktywności metabolicznej, przeszczepiany jest na stałe, jałowe pożywki i po kilku dniach wzrostu w temperat urze ok. 20°C, przechowywany jest w temperaturze ok. 4°C, aż do momentu użycia go w procesie biotransformacji monoterpenu. Proces biotransformacji rozpoczyna się hodowlą wgłębną szczepu Chrysosporium pannorum 18 z wytrząsaniem, w czasie 24-96 godzin, temperaturze 18-23 °C, na wy sterylizowanej płynnej pożywce. Następnie, do pożywki z grzybem, o stężeniu wagowym w stosunku do podłoża zależnym od długości hodowli i mieszczącym się w granicach 0,016%-1,2%, dodaje się monoterpenu wyizolowanego w znany sposób z naturalnych surowców np. terpentyny, owoców cytrusowych lub olejku eukaliptusowego, w postaci a-pinenu lub β-pinenu, w ilościach prowadzących do uzyskania stężenia objętościowego w stosunku do podłoża, zawartego w granicach od 0,2 do 1,5%, korzystnie w drugim bądź trzecim dniu hodowli. Reakcję biotransformacji prowadzi się w środowisku wodnym w zakresie temperatur od 10 do 30°C przez 6-108 godzin, po czym uzyskane produkty ekstrahuje się hydrofobowym rozpuszczalnikiem organicznym np. eterem dietylowym lub octanem etylu i rozdziela, korzystnie przez destylację frakcjonowaną lub chromatografię kolumnową. Korzystnym jest, jeśli biotransformacja prowadzona jest bez wymiany podłoża hodowlanego, czyli na podłożu otrzymanym po wyrośnięciu grzybni.

W drugim wariancie wynalazku, sposób opisany jak wyżej zmodyfikowano, poprzez wieloetapowe dozowanie monoterpenu.

Do podłoża zawierającego co najmniej 1-dniową hodowlę grzyba, począwszy od stężenia o wartości 0,2% objętościowych w stosunku do podłoża, dodaje się co 12 h kolejne porcje monoterpenu, do uzyskania stężeń: 0,5%; 1% i końcowego 1,5%, po czym proces biotransformacji prowadzi się jeszcze przez 36 h. W porównaniu z biotransformacją jednoetapową, stopniowe dodawanie substratu powoduje kontrolowany przyrost masy biokatalizatora wskutek obniżania toksyczności reagentów, co w konsekwencji wpływa na zwiększanie wydajności procesu. Biokonwersja monoterpenów z zastosowaniem psychrotroficznego grzyba nitkowatego z rodzaju Chrysosporium pannorum 18, pozwala na prowadzenie procesu w niskiej temperaturze, nawet w 1 0°C, co zmniejsza możliwość zakażenia produktów innymi drobnoustrojami, a także znaczne minimalizuje straty spowodowane parowaniem reagentów, przyczyniając się do zwiększenia wydajności biotransformacji. Metodą według wynalazku z a-pinenu otrzymano głównie werbenol i werbenon, zaś z β-pinenu szerszą gamę produktów takich jak: trans-pinokarweol, 2-hydroksypinan-3-on, izo-pinokamfon, a także w dużo mniejszym stężeniu

PL 221 515 B1 myrtenol oraz nowy niezidentyfikowany do tej pory związek. Niewielkie wymagania pokarmowe szc zepu zimnolubnego, zastosowanego według wynalazku, oraz jego duże zdolności adaptacyjne, umożliwiają prowadzenie procesu biotransformacji na ubogich podłożach bez ich wymiany, a także przy niewielkim nakładzie energii. Metoda jest niezależna od wpływów zewnętrznych, charakteryzuje się stałą wydajnością oraz dobrą jakością produktów, jest przyjazna dla środowiska.

Sposób według wynalazku przedstawiono w przykładach wykonania.

P r z y k ł a d I

Stałe podłoża agarowo-porzeczkowe szczepiono konidiami grzyba Chrysosporiian pannorum 18 i inkubowano przez 7 dni w temp. 20°C do momentu uzyskania gęstej warstwy grzybni z pełni wykształconymi konidiami. Przechowywane w temp. 4°C grzyby, spłukiwano jałową wodą destylowaną do uzyskania gęstej zawiesiny ok. 5 x 10^- komórek lub spor na 1 ml. Zawiesinę dokładnie wytrząsano i szczepiono nią wysterylizowane podłoże hodowlane, stosując proporcję 2 ml zawiesiny na 25 ml podłoża. Tak przygotowane podłoże z grzybnią umieszczono w kolbkach Erlenmayera na wytrząsarce rotacyjnej (150 obr/min) i po upływie 96 godzin dodano do niego α-pinen zakupiony w firmie SigmaAldrich, w ilości 1% (v/v). Reakcję biotransformacji prowadzono przez 72 h w temperaturze 20°C. Namnożoną biomasę oddzielono od podłoża pohodowlanego metodą filtracji. Uzyskany filtrat ekstrahowano przy użyciu eteru dietylowego. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów wykonano za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii masowej. Na podstawie indeksów retencji i widm masowych zidentyfikowano werbenol i werbenon jako główne produkty o stężeniach werbenol - 0,048 g/L, i werbenon - 0,079 g/L.

P r z y k ł a d II

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 72 godzinnej hodowli grzyba, dodano α-pinenu w ilości 1,5% (v/v). Reakcję biotransformacji, prowadzono przez 3 doby w temperaturze 30°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie 1. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,005 g/L i werbenonu - 0,003 g/L.

P r z y k ł a d III

Sposobem jak w przykładzie I, po 72 godzinnej hodowli grzyba, dodano α-pinen bezpośrednio do medium hodowlanego w ilości 0,75% (v/v). Reakcję biotransformacji, prowadzono przez 3 doby w temperaturze 20°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,138 g/L i werbenonu - 0,166 g/L.

P r z y k ł a d IV

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 72 godzinnej hodowli grzyba, dodano β-pinen zakupiony w firmie Sigma - Aldrich, w ilości 0,5% (v/v). Reakcję biotransformacji prowadzono przez 48 godz. w temperaturze 15°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: trans-pinokarweolu - 0,073 g/L; 2-hydroksypinan-3-onu - 0,023 g/L; izopinokamfonu - 0,012 g/L i myrtenolu - 0,08 mg/L.

P r z y k ł a d V

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 48 godzinnej hodowli grzyba, dodano α-pinenu w ilości 1% (v/v). Reakcję biotransformacji, prowadzono przez 6 godzin w temperaturze 20°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,356 g/L i werbenonu - 0,06 g/L.

P r z y k ł a d VI

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 72 godzinnej hodowli grzyba, dodano substrat α-pinen w ilości 1,5% (v/v). Reakcję biotransformacji, prowadzono przez 3 doby w temperaturze 10°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,389 g/L i werbenonu - 0,125 g/L.

PL 221 515 B1

P r z y k ł a d VII

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 48 godzinnej hodowli grzyba, dodano substrat α-pinenu w ilości 1,5% Reakcję biotransformacji prowadzono przez 108 godzin w temperaturze 18°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,392 g/L i werbenonu 0,252 g/L.

P r z y k ł a d VIII

Do podłoża hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, po 24 godzinnej hodowli grzyba, dodano substrat α-pinen w ilości 1,5%. Reakcję biotransformacji prowadzono przez 72 godziny w temperaturze 20°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,01 S g/L i werbenonu 0,008 g/L.

P r z y k ł a d IX

Do medium hodowlanego, przygotowanego według sposobu opisanego w przykładzie I, dodawano α-pinen porcjami, najpierw po 24 godz. hodowli grzyba, porcję do uzyskania stężenia 0,2% (v/v), następnie po 36 godz. hodowli porcję do stężenia 0,5% (v/v), następnie po 48 godz. hodowli porcję do stężenia 1% i na końcu po upływie 60 h 1,5% (v/v), substratu w stosunku do użytego podłoża. Proces prowadzono jeszcze przez 36 h, cały czas w temperaturze 20°C. Analizę jakościową i ilościową powstałych produktów przeprowadzono jak w przykładzie I. Stężenia produktów otrzymanych tym sposobem wynosiły: werbenolu - 0,660 g/L i werbenonu - 0,159 g/L. Stopniowe dodawanie substratu powoduje kontrolowany przyrost masy biokatalizatora wskutek obniżania toksyczności reagentów, co w konsekwencji wpływa na zwiększanie wydajności procesu.

Pomiary przyrostu masy biokatalizatora przedstawiono w poniższej t a b e l i.

Czas biotransformacji	(%) wagowy suchej masy grzybni w odniesieniu do podłoża hodowlanego
Proces jednoetapowy, (przykład VIII)	Proces wieloetapowy (przykład IX)
12h	0.016	0.16
48 h	0.02	0.56
72 h	0.024	0.6

Znaczny przyrost suchej masy grzybni przy wieloetapowym dodawaniu α-pinenu, wpływa na zwiększenie wydajności produktów biotransformacji monoterpenu, czego dowodem są ilości werbenolu i werbenonu otrzymane w przykładzie VIII i IX.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania związków terpenoidowych, zwłaszcza smakowo-zapachowych, takich jak: werbenolu, werbenonu, frans-pinokarweolu, 2-hydroksypinan-3-onu, izo-pinokamfonu i myrtenolu, polegający na biokatalitycznej transformacji monoterpenów, znamienny tym, że monoterpen w postaci α-pinenu lub β-pinenu wyizolowany znaną metodą z naturalnych surowców poddaje się oksydatywnej transformacji z udziałem biokatalizatora w postaci szczepu psychrotroficznego grzyba nitkowatego z rodzaju Chrysosporium pannorum 18, przy czym sposób rozpoczyna się wgłębną hodowlą, na wysterylizowanej płynnej pożywce z wytrząsaniem, szczepu grzyba Chrysosporium pannorum 18, który wcześniej przeszczepiono do jałowej pożywki stałej i po co najmniej kilku dniach wzrostu w temperaturze ok. 20°C, przechowywano w temperaturze ok. 4°C dla zachowania stałej aktywności metabolicznej, przy czym hodowlę tę prowadzi się w środowisku wodnym, w czasie 24-96 godzin i w temperaturze 18°C-23°C, aż do uzyskania stężenia grzyba w stosunku do podłoża w granicach od 0,016 do 1,2% wagowych, po czym do hodowli grzyba dodaje się monoterpen w postaci α-pinenu lub β-pinenu, w ilościach prowadzących do uzyskania stężenia objętościowego od 0,2 do 1,5%, w stosu nku do podłoża i dalej prowadzi się biotransfonnację przez 6-108 godzin, bez wymiany podłoża hodowlanego, w zakresie temperatur od 10 do 30°C, a uzyskane produkty ekstrahuje się hydrofobowym

PL 221 515 B1 rozpuszczalnikiem organicznym np. eterem dietylowym lub octanem etylu i rozdziela, korzystnie przez destylację frakcjonowaną lub chromatografię kolumnową.
2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że monoterpen. dodawany jest do pożywki z grzybem w drugim bądź trzecim dniu jego hodowli.
3. Sposób według zastrzeżenia 1 i 2, znamienny tym, że wydajność procesu może być stymulowania poprzez przyrost biokatalizatora, wskutek wieloetapowego dozowania monoterpenu do podłoża zawierającego co najmniej 1-dniową hodowlę grzyba, począwszy od stężenia o wartości 0,2% objętościowych w stosunku do podłoża i dodawaniu co 12 godzin, kolejnych porcji monoterpenu, do uzyskania stężeń: 0,5%; 1% i końcowego 1,5%, po czym proces biotransformacji prowadzi się jeszcze przez 36 godz.