PL221052B1 - Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplA - Google Patents
Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplAInfo
- Publication number
- PL221052B1 PL221052B1 PL382770A PL38277007A PL221052B1 PL 221052 B1 PL221052 B1 PL 221052B1 PL 382770 A PL382770 A PL 382770A PL 38277007 A PL38277007 A PL 38277007A PL 221052 B1 PL221052 B1 PL 221052B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tyr
- trp
- leu
- ser
- thr
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy metody otrzymywania proteinazy SplA, jej zastosowania do specyficznej hydrolizy łańcucha polipeptydowego, sekwencji aminokwasowych przez nią rozpoznawanych oraz ich zastosowań.
Enzymy proteolityczne (proteinazy) o wysokiej specyficzności działania (rozpoznające i hydrolizujące jedynie wybrane wiązania peptydowe) są stosowane na szeroką skalę w laboratoriach i przemyśle biotechnologicznym do specyficznej hydrolizy polipeptydów (przede wszystkim następujące: enterokinaza, czynnik X, trombina, proteinaza TEV, proteinaza PreScission™ oraz o mniejszej specyficzności, ale też szeroko wykorzystywane, jak V8 i trypsyna). W szczególności, lecz nie jedynie, stosuje się omawiane enzymy do usuwania tzw. metek fuzyjnych, fragmentów polipeptydów rekombinowanych użytecznych na pośrednich etapach analizy lub produkcji (służących np. do detekcji, oczyszczania) jednak niepożądanych w produkcie końcowym. W teorii wysoka specyficzność zastosowanego enzymu w połączeniu z wydajnie rozpoznawanym przez niego miejscem wprowadzonym pomiędzy „metką” a częścią polipeptydu stanowiącą ostatecznie pożądany produkt pozwala na precyzyjne usunięcie „metki” bez ryzyka degradacji pożądanego polipeptydu. Niestety, brak całkowicie specyficznych enzymów proteolitycznych powoduje, że w wielu przypadkach rezultatem ich działania jest nie tylko pożądane odcięcie „metki” fuzyjnej, ale także niespecyficzna degradacja interesującego polipeptydu, jeśli zawiera on miejsca podobne do sekwencji specyficznie rozpoznawanej przez enzym. Ponadto, najpopularniejsze ze stosowanych obecnie enzymów nie są dostępne w postaci białek zrekombinowanych lub z uwagi na trudności w produkcji są w tej formie znacznie droższe od białek natywnych izolowanych z osocza krwi (trombina, czynnik X) lub jelit (enterokinaza). Zastosowanie białek natywnych stwarza jednak ryzyko zanieczyszczenia preparatów niepożądaną aktywnością innych enzymów lub patogenami.
Wymienione czynniki stwarzają zapotrzebowanie na nowe enzymy, które będą mogły sprostać specyficznym zadaniom.
Szczególnie pożądane jest uzyskanie proteinaz o wąskiej specyficzności substratowej, które mogłyby znaleźć zastosowanie jako precyzyjne narzędzie biotechnologiczne (przykładowe opisy patentowe nr nr: US 4 543 329, US 5 013 653, US 6 906 176, US 7 189 540).
Sekwencja aminokwasowa białka SplA pochodzącego ze Staphylococus aureus jest znana i została opisana w publikacji J. Mol. Biol. (2006) 358, 270-279. Do tej pory nie została jednak ujawniona metoda produkcji rekombinowanego białka SplA, ani metoda oczyszczania natywnego SplA. Nie wykazano także bezpośrednio aktywności proteolitycznej tego białka, ani nie była poznana specyficzność substratowa tego enzymu. Tak więc, stan techniki w kwestii białka SplA obejmuje jedynie znajomość sekwencji aminokwasowej białka SplA i pozwala stwierdzić jej homologię do sekwencji aminokwasowych chymotrypsynopodobnych proteinaz serynowych. Jednak nie znana jest metoda otrzymywania białka, nie wiadomo czy białko to jest w rzeczywistości proteinazą, nie jest znana jego struktura, ani specyficzność substratowa, a tym samym nie można wskazać na potencjalne zastosowania.
Ponadto, znane jest wiele proteinaz serynowych chymotrypsynopodobnych (w przypadku podobieństw strukturalnych określenie chymotrypsynopodobny odnosi się do tej samej grupy proteinaz co określenie trypsynopodobny i są one tutaj stosowane zamiennie; jedynie w przypadku określania typów aktywności określenia te są rozdzielne jednak jako takie nie są używane w opisie, chyba że zaznaczono inaczej), do których należy proteinaza SplA. Podobieństwo sekwencji aminokwasowej do innych proteinaz z tej grupy pozwoliło zaliczyć proteinazę SplA do rodziny S1 wg ogólnie przyjętej klasyfikacji za bazą danych MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/; Rawlings, N. D., Morton, F. R. & Barrett, A. J. (2006) MEROPS: the peptidase database, 34, D270-D272). Zgodnie z powszechnym przeświadczeniem wyrażonym m. in. w wiodącej referencji z dziedziny enzymów proteolitycznych, bazie danych MEROPS uznaje się, że: „wszystkie scharakteryzowane peptydazy należące do rodziny chymotrypsynopodobnych są endopeptydazami. Istnieją także liczne, nie będące peptydazami homologii, w których reszty katalityczne zostały zastąpione. Istnieją trzy główne typy aktywności: trypsynopodobny, w którym następuje odtrawienie substratu amidowego następującego po resztach Arg lub Lys w pozycji P1, chymotrypsynopodobny, w którym trawienie następuje za jednym z aminokwasów hydrofobowych w P1 i elastazopodobny, w którym trawienie następuje za resztą Ala w pozycji P1. Specyficzność substratowa rodziny S1 zależy jedynie od aminokwasu znajdującego się w pozycji P1. Większość peptydaz należących do tej rodziny podlega sekrecji i posiada N-końcowy sekrecyjny pepPL 221 052 B1 tyd sygnałowy. Są one syntetyzowane w postaci prekursorów z dodatkową sekwencją na N-końcu, której usunięcie daje aktywną formę enzymu. Aktywacja nie zawsze wymaga usunięcia propcptydu”.
Jak pokazano w dalszej części niniejszego opisu ogólne wskazówki zawarte w stanie techniki mogą prowadzić jedynie do błędnych wniosków dotyczących specyficzności substratowej proteinazy SplA i uznania ją za enzym o nikłej przydatności przemysłowej.
W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie wysoce specyficznej proteinazy oraz sposobu jej otrzymywania oraz charakterystyki jej aktywności pozwalającej na jej przemysłowe wykorzystywanie.
Nieoczekiwanie twórcy tego wynalazku ustalili, że proteinaza SplA posiada dużo węższą niż oczekiwana specyficzność substratową. Bazując na tym odkryciu zaproponowano nowe specyficzne substraty dla proteinazy SplA oraz sposoby hydrolizy i/lub otrzymywania białek wykorzystujące takie peptydy (fragmenty sekwencji) oraz nowe zastosowania proteinazy SplA. Uzyskanie tych wyników było możliwe dzięki opracowaniu wydajnej metody produkcji proteinazy SplA, która stanowi kolejny aspekt tego wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA posiadający sekwencję aminokwasową wybraną spośród:
Trp-Leu-Tyr, Trp-Leu-Tyr-Ser, Tyr-Glu-Tyr-Ala, Tyr-Glu-Tyr, Tyr-Met-Tyr, Tyr-Ala- Tyr-Ser, Tyr-Ala-Tyr, Tyr-Thr-Tyr-Ser, Tyr-Thr-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-GIy, Tyr-Leu-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr, Val-Leu-Tyr-Thr, Val-Leu-Tyr, Trp-Leu-Ser-Thr, Trp-Leu-Ser, Trp-Met-Asn-Thr, Trp-Met-Asn, Trp-Trp-Tyr-Thr, Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp, Tyr-Trp-Met-Asn, Tyr-Trp-Met, Tyr-Trp-Leu-Ser, Tyr-Trp-Leu, Trp-Leu-Tyr.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko rozpoznawane przez proteinazę SplA posiadające sekwencję aminokwasową zawierającą zdefiniowany powyżej polipeptyd według wynalazku.
Kolejnymi przedmiotami wynalazku są sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptyd według wynalazku zdefiniowany powyżej oraz sekwencje nukleotydowe kodujące białko według wynalazku zdefiniowane powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie sekwencji polipeptydu według wynalazku zdefiniowanej powyżej przy wytwarzaniu białka rozpoznawanego przez proteinazę SplA
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania pożądanego białka charakteryzujący się tym, że:
a) dostarcza się białko fuzyjne posiadające sekwencję wybraną spośród Z1-Trp-Leu-Tyr-Z2, Z1-Trp-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Z2, Z1-Tyr-Glu-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Met-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Ala-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Ala-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Thr-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Thr-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Gly-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Phe-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Phe-Leu-Tyr-Z2, Z1-Val-Leu-Tyr-Thr-Z2, Z1-Val-Leu-Tyr-Z2, Z1-Trp-Leu-Ser-Thr-Z2, Z1-Trp-Leu-Ser-Z2, Z1-Trp-Met-Asn-Thr-Z2, Z1-Trp-Met-Asn-Z2, Z1-Trp-Trp-Tyr-Thr-Z2, Z1-Trp-Trp-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Trp-Trp-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Trp-Trp-Z2, Z1-Tyr-Trp-Met-Asn-Z2, Z1-Tyr-Trp-Met-Z2, Z1-Tyr-Trp-Leu-Ser-Z2, Z1-Tyr-Trp-Leu-Z2, Z1-Trp-Leu-Tyr-Z2, gdzie Z1 i Z2 oznacza polipeptyd zawierający jeden lub więcej aminokwasów, przy czym jeden z nich oznacza polipeptyd zawierający pożądane białko a drugi polipeptyd zawierający polipeptyd znacznikowy,
b) izoluje się białko fuzyjne, korzystnie techniką chromatograficzną, stosując złoże posiadające powinowactwo do polipeptydu znacznikowego,
c) prowadzi się reakcję hydrolizy białka fuzyjnego za pomocą proteinazy posiadającej aktywność enzymatyczną proteinazy SplA, przy czym korzystnie izoluje się pożądane białko z mieszaniny reakcyjnej.
Korzystnie, hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 0°C do 45°C, w pH od 5,0 do 8,0.
Korzystniej, hydrolizę prowadzi się w buforze octanowym, cytrynianowym, mrówczanowym, MES, HEPES, PłPES, MOPS, Bis-Tris, fosforanowym lub Tris o stężeniu od 1 do 250 mM.
Najkorzystniej, hydrolizę prowadzi się w roztworze zawierającym od 0 do 500 mM NaCl.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie proteinazy SplA do specyficznej hydrolizy polipeptydu do produkcji białek zawierającego sekwencję aminokwasową Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4, gdzie:
Xaa1 jest aminokwasem wybranym spośród: Trp, Tyr, Phe, Vał, He, Leu,
Xaa2 jest aminokwasem wybranym spośród: Leu, Glu, Met, Ala, Thr, Trp, Ile, Val, Ser, Tyr, Phe,
Asp,
Xaa3 jest aminokwasem wybranym spośród: Tyr, Phe, Trp, Leu, Asn, Gln, Ser, Met, Iie, Val, Thr,
PL 221 052 B1
Xaa4 jest pominięty lub jest dowolnym aminokwasem, korzystnie wybranym spośród: Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Asn, Asp, Gln, Glu, Tyr.
Korzystnie, hydrolizowany polipeptyd posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję wybraną spośród:
Trp-Leu-Tyr, Trp-Leu-Tyr-Ser, Tyr-Glu-Tyr-Ala, Tyr-Glu-Tyr, Tyr-Met-Tyr, Tyr-Ala- Tyr-Ser, Tyr-Ala-Tyr, Tyr-Thr-Tyr-Ser, Tyr-Thr-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Gly, Tyr-Leu-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr, Val-Leu-Tyr-Thr, Val-Leu-Tyr, Trp-Leu-Ser-Thr, Trp-Leu-Ser, Trp-Met-Asn-Thr, Trp-Met-Asn, Trp-Trp-Tyr-Thr, Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp, Tyr-Trp-Met-Asn, Tyr-Trp-Met, Tyr-Trp-Leu-Ser, Tyr-Trp-Leu, Trp-Leu-Tyr.
Korzystniej, hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 0°C do 45°C, w pH od 5,0 do 8,0.
Korzystnie, hydrolizę prowadzi się w buforze octanowym, cytrynianowym, mrówczanowym, MES, HEPES, PIPES, MOPS, Bis-Tris, fosforanowym łub Tris o stężeniu od 1 do 250 mM.
Najkorzystniej, hydrolizę prowadzi się w roztworze zawierającym od 0 do 500 mM NaCl.
Dla celów niniejszego opisu jako polipeptyd zawierający polipeptyd znacznikowy, zwany też w niniejszym opisie metką łub polipeptydem znacznikowym, należy rozumieć sekwencję pozwalającą na izolowanie zawierającego ją polipeptydu, zwłaszcza techniką chromatografii powinowactwa. Specjalista będzie w stanie zaproponować opierając się na powszechnie dostępnej wiedzy szereg tego rodzaju sekwencji, które można wykorzystać do zaprojektowania układu do izolowania produkowanego białka, w szczególności techniką chromatografii powinowactwa. Przykładowo, wprowadzenie sekwencji rozpoznawanej przez przeciwciało pozwała na izolowanie zawierającego ją białka za pomocą tego przeciwciała. Innym przykładem są sekwencje aminokwasowe posiadające powinowactwo do glutationu. Kolejnym przykładem są techniki opierające się na znanym zjawisku tworzenia kompleksów niektórych jonów metali z niektórymi resztami aminokwasowymi. Najbardziej znanym przykładem takiego układu jest kompleksowanie jonów niklu przez pierścienie imidazolowe histydyn wprowadzonych do izolowanego łańcucha polipeptydowego. Wszystkie tego typu układy składające się ze znacznikowej sekwencji aminokwasowej i substancji, do której taka sekwencja posiada odpowiednio silne powinowactwo, pozwalają zaprojektować system oczyszczania białka zawierającego sekwencję znacznikową. Zwykle będzie to technika chromatografii powinowactwa na złożu zawierającym wspomnianą substancję.
W związku z powyższym, w korzystnych realizacjach wynalazku, znacznikowa sekwencja aminokwasowa zawiera sekwencję składającą się z sześciu kolejnych histydyn (His6). Pożądane białko wchodzące w skład białka fuzyjnego według wynalazku wspominanego powyżej może być dowolnym znanym białkiem, dla którego znana jest sekwencja aminokwasowa lub sekwencja kodująca. Przykładowo, może to być białko lecznicze, którego produkcja pożądana jest ze względu na jego właściwości terapeutyczne. W oparciu o instrukcje ujawnione w niniejszym opisie oraz powszechnie dostępną wiedzę, fachowiec będzie w stanie opracować sekwencję kodującą białko fuzyjne zawierającą sekwencję kodującą pożądane białko. Sekwencje aminokwasowe lub sekwencje kodujące znanych białek mogą być przykładowo pozyskane z bazy GenBank dostępnej w sieci internet pod adresem http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html, w której zgromadzono sekwencje znanych genów oraz sekwencje aminokwasowe znanych białek. Aby zwiększyć poziom ekspresji białka fuzyjnego w układzie bakteryjnym można zastosować znane metody podnoszenia poziomu ekspresji w komórkach bakteryjnych, które obejmują stosowanie silnych promotorów, stosowanie sekwencji wzmacniających transkrypcję lub stosowanie kodonów preferowanych przez wybraną komórkę bakteryjną.
W opisie ujawniono wariant proteinazy SplA charakteryzującego się tym, że posiada sekwencję aminokwasową zawierającą następującą modyfikację:
- przyłączenie wiązaniem peptydowym do aminokwasu znajdującego się na N-końcu dojrzałej formy proteinazy SplA polipeptydu zawierającego co najmniej jedną spośród następujących sekwencji: znaną sekwencję sekrecyjną, znaną bakteryjną sekwencję sekrecyjną, sekwencję polipeptydu wykazującego powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, sekwencję rozpoznawaną przez enzym proteolityczny, sekwencję znanego polipeptydu znacznikowego.
Korzystnie, ujawniony wariant proteinazy charakteryzuje się tym, że sekwencja sekrecyjna jest bakteryjną sekwencją sekrecyjną z Bacillus subtilis.
Równie korzystnie ujawniony wariant proteinazy charakteryzuje się tym, że posiada sekwencję wybraną spośród: SEQ ID NO: 4 lub SEQ ID NO: 6.
Kolejno, ujawniono sekwencję nukleotydową kodująca wariant proteinazy według wynalazku zdefiniowanego powyżej.
PL 221 052 B1
Następnie, ujawniono sekwencję nukleotydową posiadającą sekwencję nukleotydową wybraną spośród: SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 5.
Kolejno, ujawniono sposób otrzymywania proteinazy SplA i jej wariantów charakteryzujący się tym, że:
a) w komórkach gospodarza bakteryjnego lub innego prowadzi się ekspresję ujawnionego białka, jak zdefiniowano powyżej, korzystnie kodowanego przez ujawnioną sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej, a następnie;
b) izoluje się pożądany enzym lub zawierającą go frakcję.
W korzystnej realizacji ujawnionego sposobu gospodarzem bakteryjnym jest szczep Bacillus subtilis ekspresjonujący białko kodowane przez sekwencję nukleotydową przedstawioną jako SEQ ID NO: 3.
W równie korzystnej realizacji ujawnionego sposobu w etapie b) oddziela się brzeczkę fermentacyjną od masy bakteryjnej poprzez wirowanie, białka sekrecyjne znajdujące się w pozbawionej bakterii pożywce wysala się siarczanem amonu, oddziela się wysolone białka i rozpuszcza w niewielkiej ilości roztworu buforowego i dializuje się do buforu o pH około 5,5.
W równie korzystnej realizacji ujawnionego sposobu w etapie b) dodatkowo oczyszcza się wyizolowane białko techniką chromatografii powinowactwa, chromatografii jonowymiennej i/lub sączenia molekularnego, a ostatecznie oczyszczony preparat ewentualnie zagęszcza się i ewentualnie poddaje krystalizacji.
W jednej z korzystnych realizacji ujawnionego sposobu produkcji aktywnej proteinazy SplA można wykorzystać zdolności katalityczne samego enzymu lub innego enzymu zdolnego do precyzyjnej hydrolizy łańcucha polipeptydowego. W metodzie tej produkuje się enzym z N-terminalną metką fuzyjną wybraną korzystnie z bogatej puli opisanych metek lub nowym peptydem o własnościach pożądanych dla metki. Metkę taką może stanowić przykładowo, lecz nie jedynie metka histydynowa (tzw. ang. His-tag). Pomiędzy metkę fuzyjną a sekwencję proteinazy SplA wstawia się dogodnie sekwencję rozpoznawaną i przecinaną przez proteinazę SplA lub sekwencję rozpoznawaną i przecinaną przez inny enzym zdolny do precyzyjnej hydrolizy łańcucha polipeptydowego. Po wyprodukowaniu opisanego białka fuzyjnego izoluje się je wykorzystując właściwości metki, a następnie odcina się metkę przy pomocy katalitycznych ilości proteinazy SplA lub innego enzymu zdolnego do precyzyjnej hydrolizy łańcucha polipeptydowego. W przypadku odcinania przy wykorzystaniu proteinazy SplA uwolniona od metki proteinaza SplA zwiększa pulę aktywnego enzymu przyspieszając zakończenie procesu odcinania.
Odcinanie metki można prowadzić bezpośrednio na złożu stosowanym do izolacji białka fuzyjnego lub też po elucji, przy czym pierwsza metoda pozwała na jednoczesne oczyszczenie proteinazy od metki fuzyjnej, natomiast w drugim przypadku konieczne jest wprowadzenie dodatkowego stopnia oczyszczania. Dodatkowy stopień oczyszczania jest także pożądany przy wykorzystaniu enzymu zdolnego do precyzyjnej hydrolizy łańcucha polipeptydowego innego niż SplA, by oddzielić ten enzym od proteinazy SplA.
Kolejno ujawniono zastosowanie proteinazy SplA do specyficznej hydrolizy polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4, gdzie:
Xaa1 jest aminokwasem wybranym spośród: Trp, Tyr, Phe, Val, Ile, Leu,
Xaa2 jest aminokwasem wybranym spośród: Leu, Glu, Met, Ala, Thr, Trp, Ile, Val, Ser, Tyr, Phe,
Asn,
Xaa3 jest aminokwasem wybranym spośród: Tyr, Phe, Trp, Leu, Asn, Gln, Ser, Met, Ile, Val, Thr,
Xaa4 jest pominięty lub jest dowolnym aminokwasem, niemniej w najkorzystniejszej realizacji wynalazku jest on aminokwasem, korzystnie wybranym spośród: Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Asn, Asp, Gln, Glu, Tyr.
Korzystnie, hydrolizowany polipeptyd posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję wybraną spośród:
Trp-Leu-Tyr, Trp-Leu-Tyr-Ser, Tyr-Glu-Tyr-Ala, Tyr-Glu-Tyr, Tyr-Met-Tyr, Tyr-Ala-Tyr-Ser, Tyr-Ala-Tyr, Tyr-Thr-Tyr-Ser, Tyr-Thr-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Gly, Tyr-Leu-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr, Val-Leu-Tyr-Thr, Val-Leu-Tyr, Trp-Leu-Ser-Thr, Trp-Leu-Ser, Trp-Met-Asn-Thr, Trp-Met-Asn, Trp-Trp-Tyr-Thr, Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp, Tyr-Trp-Met-Asn, Tyr-Trp-Met, Tyr-Trp-Leu-Ser, Tyr-Trp-Leu, Trp-Leu-Tyr.
Równie korzystnie, hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 0°C do 45°C, w pH od 5,0 do 8,0.
PL 221 052 B1
Równie korzystnie, hydrolizę prowadzi się w buforze octanowym, cytrynianowym, mrówczanowym, MES, HEPES, PłPES, MOPS, Bis-Tris, fosforanowym łub Tris o stężeniu od 1 do 250 mM.
Równie korzystnie, hydrolizę prowadzi się w roztworze zawierającym od 0 do 500 mM NaCl.
Kolejno, ujawniono proteinazę posiadającą aktywność proteinazy SplA, charakteryzującą się tym, że posiada centrum aktywne tworzone przez triadę katalityczną zawierającą co najmniej jeden spośród następujących aminokwasów His, Asp i Ser, w szczególności przez wspomniane aminokwasy, przy czym RMSD węgli Ca łańcucha głównego wchodzących w skład aminokwasów tworzących triadę katalityczną jest nie większe niż 2,2 A, korzystnie nie większe niż 1,8 A, w zestawieniu z węglami Ca łańcucha głównego wchodzących w skład aminokwasów His 39, Asp 78 i Ser 154 zawartych w proteinazie SplA o strukturze trzeciorzędowej określonej w tabeli 1.
Korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że RMSD węgli Ca łańcucha głównego w obrębie dobrze zdefiniowanych struktur drugorzędowych rdzenia cząsteczki (a więc nie uwzględniając pętli, innych elementów ruchomych, fragmentów eksponowanych na zewnątrz cząsteczki oraz jej słabo zdefiniowanych elementów wg sztuki) jest nie większe niż 2 A, korzystnie nie większe niż 1,5 A, w zestawieniu z odpowiadającymi im strukturalnie węglami Ca łańcucha głównego zawartymi w proteinazie SplA o strukturze trzeciorzędowej określonej w tabeli 1.
Równie korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że dobrze zdefiniowana struktura drugorzędowa rdzenia cząsteczki zawiera fragmenty odpowiadające strukturalnie fragmentowi białka SplA wybranemu korzystnie spośród następujących sekwencji: Val4 do Glu6, Asn16 do Ala20, Gyy24 do Val29, Thr33 do Asn37, Val51 do Ala53, Asn64 do Val67, He70 do Glu72, Leu79 do His85, Arg112 do He116, Met128 do He135, Phe142 do Phe145, Ser154 do Leu159, Gly167 do Ala171, Asn181 do Tyr185, Glu192 do Gln195.
Równie korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że zawiera fragment tworzący a-helisę odpowiadający strukturalnie fragmentowi białka SplA wybranemu korzystnie spośród następujących sekwencji: Lys38 do Ala41, Glul92 do Asn196.
Równie korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że zawiera fragmenty tworzące β-harmonijkę odpowiadające strukturalnie fragmentom białka SplA wybranym korzystnie spośród następujących sekwencji: Val4 do Lys5, Val18 do Ala20, Thr25 do Val28 Thr33 do Thr36, Val51 do Ala53, Asn64 do Val67, Asp69 do Glu72 Ala80 do Val84, Arg112 do He116, Phe129 do Gly133, Phe142 do Phe145, Val158 do Leu159, Gly167 do Ala171, Asn181 do Val184.
Równie korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że posiada strukturę trzeciorzędową, dla której RMSD węgli Ca łańcucha głównego jest nie większe niż 2,5 A, korzystnie nie większe niż 1,8 A, w zestawieniu z odpowiadającymi im węglami Ca łańcucha głównego zawartymi w proteinazie SplA o strukturze trzeciorzędowej określonej w tabeli 1.
Równie korzystnie, ujawniona proteinaza charakteryzuje się tym, że posiada następujące elementy strukturalne:
- w pozycji odpowiadającej Val28 w sekwencji SplA zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Val29 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Ile34 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Val35 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Thr36 zawiera aminokwas wybrany spośród Ser, Thr;
- w pozycji odpowiadającej His39 zawiera His;
- w pozycji odpowiadającej Val67 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Ile70 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala;
-w pozycji odpowiadającej Asp78 zawiera Asp;
- w pozycji odpowiadającej Leu79 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Ile81 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala, Met;
- w pozycji odpowiadającej Val82 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala, Met;
- w pozycji odpowiadającej Val98 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala, Ser, Thr;
- w pozycji odpowiadającej Gly117 zawiera Gly;
- w pozycji odpowiadającej Tyr118 zawiera aminokwas wybrany spośród Tyr, Phe, Trp;
-w pozycji odpowiadającej Met128 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala, Met;
- w pozycji odpowiadającej Gln150 zawiera aminokwas wybrany spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
- w pozycji odpowiadającej Pro151 zawiera Pro;
- w pozycji odpowiadającej Gly152 zawiera Gly;
PL 221 052 B1
- w pozycji odpowiadającej Asn 153 zawiera aminokwas wybrany spośród Asn, Gin, Asp, Glu;
- w pozycji odpowiadającej Ser154 zawiera Ser;
- w pozycji odpowiadającej Gly155 zawiera Gly;
- w pozycji odpowiadającej Ser156 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Ala, Ser, Thr, Gly;
- w pozycji odpowiadającej Pro157 zawiera Pro;
- w pozycji odpowiadającej Gly167 zawiera Gly;
- w pozycji odpowiadającej Ile168 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Leu169 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, He, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Tyr170 zawiera aminokwas wybrany spośród Tyr, Phe, Trp;
- w pozycji odpowiadającej Ala171 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Gly172 zawiera Gly;
- w pozycji odpowiadającej Glu177 zawiera aminokwas wybrany spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
- w pozycji odpowiadającej Ser178 zawiera aminokwas wybrany spośród Ser, Thr, Val, Leu,
He, Ala;
- w pozycji odpowiadającej Asn181 zawiera aminokwas wybrany spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
- w pozycji odpowiadającej Phe193 zawiera aminokwas wybrany spośród Tyr, Phe, Trp;
- w pozycji odpowiadającej Ile194 zawiera aminokwas wybrany spośród Val, Leu, Ile, Ala.
Zgodnie z powyższym, uszczegóławiając podany powyżej opis istoty kolejnych aspektów niniejszego wynalazku należy uznać, że opis ujawnia polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA posiadający sekwencję aminokwasową Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4, gdzie:
Xaa1 jest aminokwasem z hydrofobowym łańcuchem bocznym lub tyrozyną, korzystnie wybranym spośród: Trp, Tyr, Phe, Val, He, Leu,
Xaa2 jest aminokwasem korzystnie wybranym spośród Leu, Glu, Met, Ala, Thr, Trp, Ile, Val,
Ser, Tyr, Phe, Asn,
Xaa3 to aminokwas z hydrofobowym łańcuchem bocznym, tyrozyną albo aminokwas z niewielkim łańcuchem bocznym, korzystnie Xaa3 jest aminokwasem wybranym spośród Tyr, Phe, Trp, Leu,
Asn, Gln, Ser, Met, He, Val, Thr,
Xaa4 jest pominięty lub jest dowolnym aminokwasem, niemniej w najkorzystniejszej realizacji wynalazku jest on aminokwasem korzystnie wybranym spośród: Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Asn, Asp, Gln,
Glu, Tyr.
W sekwencjach odpowiednie symbole oznaczają: A, Ala, alanina; V, Val, walina; L, Leu, leucyna; I, Ile, izoleucyna; P, Pro, prolina; F, Phe, fenyloalanina; W, Trp, tryptofan; M, Met, metionina; G, Gly, giicyna; S, Ser, seryna; T, Thr, treonina; C, Cys, cysteina; Y, Tyr, tyrozyna; N, Asn, asparagina; Q Gln, glutamina; D, Asp, kwas asparaginowy; E, Glu, kwas glutaminowy; K. Lys, lizyna; R, Arg, arginina; H, His, histydyna.
Xaa4 może być w przypadku proteinazy SplA pominięty lub być dowolnym aminokwasem, gdyż nieoczekiwanie proteinaza SplA odróżnia się od innych proteinaz cechujących się wysoką specyficznością substratową, które wykazują zazwyczaj określoną specyficzność również wobec aminokwasu znajdującego się bezpośrednio za hydrolizowanym wiązaniem (na nowym N-końcu powstającym w wyniku hydrolizy wiązania peptydowego, tj. w miejscu P1' zgodnie z systemem numeracji przyjętym w tym zgłoszeniu, a zaproponowanym przez: Schechter, I. and Berger, A. (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162). W przypadku proteinazy SplA obserwujemy jedynie preferencję w stosunku do aminokwasów w pozycji P1' wybranych spośród: Ser, Thr, Gly, Ala, Val. Jednak zastąpienie na tej pozycji preferowanych aminokwasów innymi resztami nie powoduje całkowitej utraty zdolności hydrolizy omawianych wiązań. Cecha ta jest szczególnie korzystna, ponieważ pozwała na dowolne projektowanie N-końca uwalnianych produktów.
Kolejny aspekt dotyczy białek posiadających ustaloną aktywność proteinazy SplA dzięki zachowaniu przez te białka struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA przedstawionej w tabeli 1.
Istnieje powszechnie stosowany parametr określający podobieństwo struktur trzeciorzędowych, który pozwała na zdefiniowanie grupy ujawnionych białek o pożądanych właściwościach. Parametr ten to RMS distance (deviation) (ang. root mean square distance (deviation)), określany także jako RMSD lub po prostu RMS (oznaczenia należy traktować równoważnie i tak też stosowano w opisie). Wartość parametru RMSD wylicza się porównując położenia odpowiadających sobie atomów po uprzednim nałożeniu na siebie porównywanych struktur w celu ich optymalnego dopasowania. Wartość parametru wyraża się w angstremach (A) i tak też przyjęto w dalszym tekście. Ogólnie, im niższa wartość parametru, tym struktury bardziej podobne.
PL 221 052 B1
Zatem, ujawniono białka o aktywności proteolitycznej, których struktura trzeciorzędowa jest dostatecznie podobna do struktury proteinazy SplA. Rzeczone podobieństwo mierzymy wartością parametru RMSD dla istotnych komponentów strukturalnych proteinazy SplA w stosunku do odpowiadających im komponentów strukturalnych porównywanego białka. W szczególności ujawniono enzym, który korzystnie spełnia co najmniej jedno z następujących kryteriów:
a) RMSD węgli Ca łańcucha głównego wchodzących w skład aminokwasów tworzących triadę katalityczną (histydyny, seryny i kwasu asparaginowego) jest mniejsze lub równe 2,2 A, korzystnie mniejsze lub równe 1,8 A,
b) RMSD odpowiadających strukturalnie węgli Ca łańcucha głównego w obrębie dobrze zdefiniowanych struktur drugorzędowych jest mniejsze lub równe 2,0 A, korzystnie mniejsze lub równe 1,5 A,
c) tak jak w (b), z tym, że dobrze zdefiniowane strukturalnie elementy cząsteczki obejmują fragmenty łańcucha polipeptydowego wybrane korzystnie spośród następujących fragmentów określonych wg numeracji SplA oraz odpowiadających im strukturalnie fragmentów porównywanej cząsteczki: Val4 do Glu6, Asn16 do Ala20, Gly24 do Val29, Thr33 do Asn37, Val51 do Ala53, Asn64 do Val67, Ile70 do Glu72, Leu79 do His85, Arg112 do He116, Met128 do Ile135, Phe142 do Phe145, Ser154 do Leu159, Gly167 do Ala171, Asn181 do Tyr185, Glu192 do Gln195;
d) RMSD atomów łańcucha głównego w obrębie dobrze zdefiniowanych struktur drugorzędowych jest mniejsze łub równe 2,2 A, korzystnie mniejsze lub równe 1,8 A;
e) tak jak w (d), z tym, że dobrze zdefiniowane strukturalnie elementy cząsteczki obejmują fragmenty łańcucha polipeptydowego wybrane korzystnie spośród następujących fragmentów określonych wg numeracji SplA oraz odpowiadających im strukturalnie fragmentów porównywanej cząsteczki: Val4 do Glu6, Asn16 do Ala20, Gly24 do Val29, Thr33 do Asn37, Val51 do Ala53, Asn64 do Val67, Ile70 do Glu72, Leu79 do His85, Arg112 do He116, Met128 do Ile135, Phe142 do Phe145, Ser154 do Leu159, Gly167 do Ala171, Asn181 do Tyr185, Glu192 do Gln195;
f) fragmenty odpowiadające strukturalnie fragmentom białka SplA wybranym korzystnie spośród określonych poniżej tworzą β-harmonijkę: Val4 do Lys5, Val18 do Ala20, Thr25 do Val28 Thr33 do Thr36, Val51 do Ala53, Asn64 do Val67, Asp69 do Glu72, Ala80 do Val84, Arg112 do He116, Phe129 do Gly133, Phe142 do Phe145, Val158 do Leu159, Gly167 do Ala171, Asn181 do Val184;
g) fragmenty odpowiadające strukturalnie fragmentom białka SplA wybranym korzystnie spośród określonych poniżej tworzą helisę: Lys38 do Ala41, Glu192 do Asn196.
Analiza struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA pozwoliła zlokalizować regiony oraz reszty szczególnie istotne w procesie rozpoznawania substratu i katalizy. Ujawniano zatem białka posiadające reszty odpowiadające następującym kluczowym resztom aminokwasowym w sekwencji proteinazy SplA:
a. ) reszty tzw. triady katalitycznej, które w przypadku proteinazy SplA stanowią: S154, H39 i D78. Zamiana tych reszt skutkuje całkowitą utratą zdolności katalitycznych.
b. ) reszty odpowiedzialne za rozpoznanie substratu:
P1: przede wszystkim A149, Q150, P151, N153, L169, A171, G172, E177, S178 i N181,
P2: przede wszystkim Y170, H39 i D78,
c. ) reszta kwasu glutaminowego na N-końcu łańcucha polipeptydowego, która to reszta jest odpowiedzialna za stabilizację N-końca białka przez wiązania wodorowe, a tym samym umożliwia wyrażanie pełnej aktywności proteolitycznej. Reszta ta może być ewentualnie zastąpiona resztą kwasu asparaginowego wykazującą podobne właściwości fizykochemiczne.
Ujawnione w pracy J. Mol. Biol. (2006) 358, 270-279 porównanie sekwencji aminokwasowych homologicznych białek gronkowcowych (proteinazy V8 oraz toksyn epidermolitycznych) i trypsyny wskazuje na ważne rejony w sekwencji białka niezbędne dla prawidłowego fałdowania i/lub zachowania funkcji (fig. 1): V28 do 140; D78 do V82; G117 do P119 oraz G152 do I168. Ponadto, widać wyraźnie konserwację pojedynczych reszt: V51; S131; N181; V184 i I194. Jednak dopiero rozwiązanie struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA pozwała na stworzenie porównania sekwencji na podstawie porównania struktur - a więc porównania sekwencji odpowiadających sobie elementów strukturalnych (najpierw porównuje się struktury, a następnie tam, gdzie są podobne, zestawia się tylko sekwencje, nawet jeśli nie są one homologiczne w klasycznym rozumieniu). Rozwiązanie takie niesie ze sobą dużo więcej informacji niż zwykłe porównanie sekwencji, gdyż wskazuje elementy ważne dla zachowania funkcji białka. Porównanie takie zostało przedstawione na fig. 2, gdzie odpowiednie fragmenty są zgrupowane na podstawie podobieństw strukturalnych. Takie podejście pozwala na ewidentne wyróżnienie regionów konserwatywnych istotnych dla funkcji białka. Zatem ujawnione białko powinno
PL 221 052 B1 posiadać w miejscach odpowiadających następującym aminokwasom w sekwencji SplA następujące reszty:
Val28 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Val29 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Ile34 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Val35 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Thr36 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Ser, Thr;
His39 - histydyna triady katalitycznej; optymalnie zawiera His;
Val67 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Ile70 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, He, Ala;
Asp78 - kwas asparaginowy triady katalitycznej; optymalnie zawiera Asp;
Leu79 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Ile81 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, He, Ala, Met;
Val82 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala, Met;
Val98 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, He, Ala, Ser, Thr;
Gly117 - optymalnie Gly;
Tyr118 - optymalnie zawiera aminokwasy z dużym, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Tyr, Phe, Trp;
Met 128 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, He, Ala, Met;
Ala149 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Gln150 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
Pro151 - optymalnie Pro;
Gly152 - optymalnie Gly;
Asn153 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
Ser154 - seryna triady katalitycznej o której była mowa wcześniej, musi być Ser;
Gly155 - optymalnie Gly;
Ser156 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Ala, Ser, Thr, Gly;
Pro157 - optymalnie Pro;
Gly167 - optymalnie Gly;
He168 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, He, Ala;
Leu169 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, He, Ala;
Tyr 170 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Tyr, Phe, Trp;
Ala171 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala;
Gly172 - optymalnie Gly;
Glu177 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
Ser178 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ala;
Asn181 - optymalnie zawiera aminokwasy wybrane spośród Asn, Gln, Asp, Glu;
Phe193 - optymalnie zawiera aminokwasy z dużym, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Tyr, Phe, Trp;
Ile194 - optymalnie zawiera aminokwasy z niewielkim, hydrofobowym łańcuchem bocznym wybrane spośród Val, Leu, Ile, Ala.
Szczególną ujawnioną realizacją jest białko posiadające strukturę proteinazy SplA określoną w tabeli 1.
Zgodnie z prezentowanym wynalazkiem proteinaza SplA rozpoznaje specyficzną sekwencję aminokwasową i hydrolizuje łańcuch polipeptydowy zaraz za lub w obrębie rozpoznawanej sekwencji. Z uwagi na długość rozpoznawanej sekwencji (trzy kolejne aminokwasy) liczba identycznych sekwencji w proteomie człowieka jest niewielka, a więc enzym ten nadaje się m. in. do odcinania metek fuzyjnych przy produkcji pozostałej większości białek ludzkich.
PL 221 052 B1
Wynalazek obejmuje przede wszystkim sekwencje aminokwasowe łańcucha polipeptydowego specyficznie rozpoznawane lub specyficznie rozpoznawane i hydrolizowane przez proteinazę SplA, sekwencje nukleotydowe kodujące rzeczone sekwencje aminokwasowe (a więc pozwalające na produkcję polipeptydów je zawierających przy pomocy technologii białek rekombinowanych) oraz metodę specyficznej hydrolizy polipeptydów zawierających rzeczone sekwencje aminokwasowe przy pomocy proteinazy SplA.
Wynalazek obejmuje także samą proteinazę SplA jako enzym rozpoznający łub rozpoznający i hydrolizujący wybrane sekwencje aminokwasowe oraz sposoby produkcji proteinazy SplA w systemie rekombinowanym. Ponadto wynalazek obejmuje syntetyczne substraty oparte na sekwencjach specyficznie rozpoznawanych i hydrolizowanych przez proteinazę SplA.
Podsumowując, najważniejsze zalety prezentowanego wynalazku, należy uznać, że szczególnie korzystne aspekty wynalazku mogą znaleźć zastosowanie w następujących procesach:
a) rozpoznanie specyficznej sekwencji aminokwasowej łańcucha polipeptydowego (w szczególności sekwencji białka rekombinowanego) i jego specyficzna hydroliza w ściśle określonym miejscu w obrębie lub w niewielkiej odległości od rozpoznawanej sekwencji,
b) wysoce wydajna produkcja proteinazy SplA.
Kolejne przedmioty i poszczególne aspekty niniejszego wynalazku zostały zdefiniowane w zastrzeżeniach patentowych.
Dla lepszego zilustrowania istoty wynalazku niniejszy opis wzbogacono o wykaz sekwencji i figury.
Sekwencja nr 1 (SEQ ID NO 1) prezentuje sekwencję kodującą proteinazę SplA ze Staphylococus aureus wraz z jej natywnym peptydem sygnalnym.
Sekwencja nr 2 (SEQ ID NO 2) prezentuje sekwencję aminokwasową proteinazy SplA ze Staphylococus aureus (dojrzałe białko: aminokwasy od 1 do 200) wraz z jej natywnym peptydem sygnalnym (aminokwasy od -35 do -1).
Sekwencja nr 3 (SEQ ID NO 3) prezentuje sekwencję kodującą wariant proteinazy SplA ze Staphylococus aureus, w której sekwencję kodującą natywny peptyd sygnalny zastąpiono sekwencją kodującą peptyd sygnalny pochodzący z Bacillus subtilis.
Sekwencja nr 4 (SEQ ID NO 4) prezentuje sekwencję aminokwasową wariantu proteinazy SplA ze Staphylococus aureus, w której sekwencję natywnego peptydu sygnalnego zastąpiono sekwencją peptydu sygnalnego pochodzącego z Bacillus subtilis (aminokwasy od -29 do -1).
Sekwencja nr 5 (SEQ ID NO 5) prezentuje sekwencję kodującą białko fuzujne zawierające sekwencję dojrzałej formy SplA z S. aureus, do której przyłączono metkę histydynową i sekwencję rozpoznawaną przez SplA natomiast sekwencja nr 12 (SEQ ID NO 12) prezentuje sekwencję aminokwasową tego białka.
Figura 1 zawiera porównanie sekwencji aminokwasowych blisko spokrewnionych proteinaz: proteinaza SplA, proteinaza SplC, V8 (proteinaza V8 ze Staphylococus aureus zwana inaczej glutamylendopeptydazą), ETA - toksyna epidermolityczna A ze Staphylococus aureus oraz daleko spokrewnionego enzymu - trypsyny (modelowy enzym dla grupy proteinaz trypsynopodobnych). Podobieństwa sekwencji oznaczono odcieniami szarości - im ciemniejsze, tym większe podobieństwo. Regiony o wyraźnej homologii sekwencji oraz pojedyncze konserwatywne reszty zaznaczono ramkami.
Figura 2 prezentuje porównanie sekwencji aminokwasowych blisko spokrewnionych proteinaz stworzone na podstawie znajomości ich struktur trzeciorzędowych oraz znajomości struktury trzeciorzędowej ustalonej dla proteinazy SplA; (chymotryps - chymotrypsyna; enterokina - enterokinaza; czynnik - czynnik X (dziesiąty)); odcieniami szarości wskazano reszty szczególnie istotne dla zachowania struktury i aktywności proteinazy.
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu lepszego wyjaśnienia poszczególnych aspektów wynalazku i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
P r z y k ł a d 1. Wstępna charakterystyka proteinazy SplA
Wyjściowym eksperymentem, umożliwiającym dalsze prace było wyznaczenie optimum pH i temperatur oraz stabilności enzymu. W tym celu należało opracować ilościową metodę oznaczania aktywności enzymu. Wśród znanych substratów proteinaz trypsynopodobnych zidentyfikowano jedynie jeden substrat trawiony tylko w minimalnym stopniu przez proteinazę SplA (N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA). W przypadku trawienia tego substratu konieczne było stosowanie nadmiaru molowego enzymu w stosunku do substratu oraz długich (rzędu godzin) czasów inkubacji. Pozostałe substraty
PL 221 052 B1 nie były trawione. Przy użyciu zidentyfikowanego substratu udało się jednak określić wstępną charakterystykę aktywności proteinazy SplA jako: optimum pH na 6,5 (± 1,5 jednostki w dół i w górę), brak wyraźnej zależności aktywności od stężeń popularnych soli do 0,5 M, brak wpływu środków redukujących do kilku mM, szeroką tolerancję temperaturową.
Na tej podstawie ustalono podstawowe parametry reakcji hydrolizy zalecane dla reakcji prowadzonej z wykorzystaniem proteinazy SplA. W efekcie, wszystkie kolejne eksperymenty prowadzono w temperaturze od 20°C do 37°C, w 10 do 100 mM buforze octanowym lub cytrynianowym przy wartości pH od 5,5 do 7,5 i stężeniu NaCl od 0 do 150 mM.
Ponadto ustalono, że enzym można przechowywać w stanie zamrożonym bez wyraźnej utraty aktywności, oraz kilkakrotnie zamrażać i rozmrażać, a także liofilizować. Można go także przechowywać kilka miesięcy w temperaturze 4°C bez wyraźnej utraty aktywności. Wszystkie powyższe warunki stanowią dogodne formy przechowywania enzymu, co jest niezwykłe istotne w codziennej praktyce.
P r z y k ł a d 2. Wstępne próby ustalenia specyficzności substratowej proteinazy SplA
Trawienie β-kazeiny
Standardowo dla oznaczenia specyficzności substratowej proteinazy kontaktuje się ją z różnymi białkami, oznacza się miejsca hydrolizy i na podstawie odpowiedniej ilości prób metodami analizy statystycznej ustala się najbardziej optymalne miejsce cięcia. Takie standardowe postępowanie zastosowane zostało w pierwszym podejściu także dla proteinazy SplA, jednak nie przyniosło ono spodziewanych wyników. Wykazano, że szereg testowanych białek lizozym jaja kury, ludzki cytochrom c, mioglobina wieloryba, fibrynogen wołowy, Rnaza, inhibitor trypsyny z nasion soi, elastaza, kozie przeciwciała IgG nawet przy przedłużonej inkubacji z nadmiarem enzymu nie ulega proteolizie.
Wykrywalną aktywność białka SplA wykazano jedynie metodą zymografii na β-kazeinie. Dalsze eksperymenty innymi metodami (kontaktowanie proteinazy i kazeiny w roztworze, analiza produktów proteolizy przy pomocy SDS-PAGE) potwierdziły ten fakt jednak wykazały też, że dla przeprowadzenia reakcji hydrolizy potrzeba zastosowania molowego nadmiaru enzymu i bardzo długich czasów inkubacji - kilkunastu godzin. Oznacza to, że enzym „bardzo niechętnie” hydrolizuje 8-kazeinę (standardowo przy tego typu badaniach stosuje się katalityczne ilości enzymu - 100 x i mniej niż substratu oraz krótkie czasy inkubacji - rzędu minut). Metodami spektrometrii masowej oraz chemicznego sekwencjonowania aminokwasowego udało się oznaczyć trzy miejsca cięcia w obrębie cząsteczki β-kazeiny oraz jedno miejsce cięcia w obrębia karboksymetylowanego lizozymu (cięcie karboksymetylowanego lizozymu opisano poniżej; spacja oznacza miejsce cięcia):
KIHPF AQTQS
PVEPF TESQS
AFLLY QEPVL
GSTDY GILGI
Na podstawie tej niewielkiej (a więc mało reprezentatywnej) grupy można by założyć, że zgodnie z wiedzą, iż w tego typu proteinazach specyficzność determinuje reszta w pozycji P1 proteinaza SplA potrzebuje reszty o dużym relatywnie hydrofobowym łańcuchu bocznym (Y, F) w miejscu P1 substratu (wyróżnione tłustym drukiem). Założenie takie nie tłumaczy zupełnie dlaczego trawieniu nie ulegają inne białka zawierające bardzo wiele reszt tyrozyny i fenyloalaniny, a w szczególności sama β-kazeinia która była trawiona jedynie na kilka fragmentów pomimo, że zawiera łącznie kilkanaście reszt Y i F. Ponadto, założenie takie nie tłumaczy także, dlaczego proteinaza SplA jest tak mało wydajna.
Warto także zauważyć, że w pozostałych pozycjach sekwencji trawionych przez SplA w kazeinie, tj. P5 do P1 oraz P1' do P5' nie można ustalić żadnego wspólnego elementu czy charakterystycznego układu, który sugerowałby znaczenie tych pozycji dla specyficzności substratowej badanej proteinazy.
Trawienie substratów syntetycznych, denaturowanych białek i peptydów syntetycznych
W obliczu niepowodzenia eksperymentów opisanych powyżej przyjęto robocze założenie, że proteinaza SplA może trawić jedynie w specjalnych, eksponowanych rejonach białek, a z uwagi na ukrycie innych rejonów zawierających reszty F i Y wewnątrz struktury cząsteczki białek stosowanych jako substraty nie są one rozpoznawane i trawione. Dlatego przeanalizowano ponownie wybrane białka po uprzedniej denaturacji (karboksymetylowany lizozym, apomioglobina w formie denaturowanej, po usunięciu cząsteczki hemu) oraz wybrane peptydy powstające podczas degradacji cząsteczki hemoglobiny. Testowano także substraty syntetyczne charakteryzujące się brakiem struktur drugorzę12
PL 221 052 B1 dowych a posiadające w miejscu P1 reszty z hydrofobowymi łańcuchami bocznymi, gdyż zgodnie ze stanem wiedzy oraz wynikami eksperymentalnego trawienia kazeiny substraty takie powinny być hydrolizowane. Testowano następujące substraty (reszta w pozycji P1 pogrubiona):
N-Ala-Phe-pNa
N-Gly-Phe-pNA
N-Suc-Phe-pNA
N-Acetyl-L-Tyr-pNa
N-Meo-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA
N-Suc-L-Phe-pNA
Nsuc-Ala-Ala-Ala-pNa
Z-Leu-Leu-Leu-Amc
Suc-Ala-Ala-Ala-Amc
We wszystkich przypadkach, pomimo stosowania także nadmiarów molowych proteinazy SplA oraz przedłużonych czasów inkubacji (do 72 h) nie udało się wykazać hydrolizy badanych polipeptydów. Jedynie karboksymetylowany lizozym był słabo hydrolizowany do dużych fragmentów (niewiele miejsc cięcia). Oznaczono jedno z miejsc cięcia w karboksymetylowanym lizozymie.
Zatem, standardowa metoda oznaczania specyficzności substratowej opisana powyżej, w przypadku proteinazy SplA zupełnie zawiodła.
P r z y k ł a d 3. Metoda otrzymywania proteinazy SplA
SEQ ID NO: 1 i 2 przedstawia odpowiednio sekwencję nukleotydową genu kodującego proteinazę SplA ze Staphylococus aureus oraz odpowiadającą jej sekwencję aminokwasową. Numeracja nukleotydów rozpoczyna się od ,,a(1)” trójki startu translacji (atg) a kończy na ,,a(708)” trójki stopu translacji (taa). Łańcuch polipeptydowy proteinazy powstaje w procesie translacji w połączeniu z peptydem sygnalnym (numeracja reszt aminokwasowych od M(-35) do A(-1)), który w procesie sekrecji jest odcinany przez proteinazę sygnalną. Powstaje wtedy aktywna zewnątrzkomórkowa forma proteinazy SplA, którą można wyizolować z pożywki hodowlanej (numeracja reszt aminokwasowych od E1 do K200). W opisie stosuje się numerację wprowadzoną na tych sekwencjach.
Sekwencje kodujące dojrzałą formę proteinazy SplA (E1 do K200) sklonowano do odpowiedniego plazmidu ekspresyjnego otrzymując plazmid umożliwiający produkcję zewnątrzkomórkową dojrzałej formy proteinazy SplA w bakteriach gramdodatnich. Sekwencję białka fuzyjnego składającego się z sygnałowej sekwencji sekrecyjnej specyficznej dla B. subtilis oraz dojrzałej formy proteinazy SplA, a także sekwencję nukleotydową kodującą to białko przedstawiono odpowiednio jako SEQ ID No 4 i SEQ ID No 3.
W celu uzyskania białka zrekombinowanego bakterie B. subtilis szczep WB800 transformowano plazmidem ekspresyjnym i prowadzono selekcję transformantów na płytkach zawierających kanamycynę (50 μg/m). Wyselekcjonowanymi klonami inokulowano niewielką ilość płynnej pożywki (TSB; Sigma) zawierającej antybiotyk selekcyjny i inkubowano w 37°C z intensywnym mieszaniem przez 8 do 10 h. Tak przygotowaną hodowlą startową inokulowano hodowlę właściwą (4-16 L płynnej pożywki z antybiotykami) i inkubowano przy intensywnym mieszaniu w 37°C przez 13 do 16 godzin. Wszystkie dalsze etapy oczyszczania przeprowadzano w 4°C. Bakterie oddzielano od pożywki przez wirowanie przy przyspieszeniu 6000 x g przez 30 min. Białka sekrecyjne znajdujące się w pozbawionej bakterii pożywce wysalano siarczanem amonu do 80% nasycenia (561 g/L w 4°C). Wysolone białka oddzielano od pożywki przez wirowanie (15000 x g, 1 h), rozpuszczano w niewielkiej ilości 50 mM buforu octanowego pH 5,5 i dializowano przez noc do dużego nadmiaru tego samego buforu. Przedializowaną próbkę poddawano chromatografii jonowymiennej na złożu SP Sepharose FF (GE Healthcare) i zbierano frakcje zawierające największy szczyt białkowy wymywający się przy przewodnictwie buforu wynoszącym ok. 27 mS/cm. W razie wątpliwości frakcje testowano na obecność aktywności proteolitycznej metodą zymografii lub na obecność białka o odpowiedniej masie cząsteczkowej przy pomocy elektroforezy SDS-PAGE albo w inny dogodny sposób. Preparat dializowano do 50 mM buforu octanowego pH 5,0 i poddawano chromatografii jonowymiennej na złożu SOURCE 15S (GE Healthcare). Zbierano frakcje zawierające główny szczyt białkowy i poddawano sączeniu molekularnemu na złożu Superdex S75 w buforze PBS. Tak przygotowany, oczyszczony preparat zagęszczano, porcjowano i przechowywano zamrożony w -20°C.
P r z y k ł a d 4. Ustalenie struktury trzeciorzędowej i specyficzności substratowej proteinazy
SplA
PL 221 052 B1
Metoda opisana w przykładzie 3 pozwoliła na wydajną produkcję badanego białka umożliwiając prowadzenie dalszej analizy jego struktury, a zwłaszcza uzyskanie krystalicznej postaci proteinazy SplA i ustalenie struktury trzeciorzędowej badanej proteinazy, co w efekcie przyczyniło się do określenia specyficzności substratowej proteinazy SplA.
Analiza struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA
W celu wskazania na ewentualne determinanty strukturalne obserwowanej bardzo słabej kinetyki hydrolizy wiązań peptydowych oraz ewentualne wskazanie lepszych substratów, metodą krystalografii rentgenowskiej określono strukturę trzeciorzędową proteinazy SplA. Ustalone koordynaty poszczególnych atomów białka dojrzałej proteinazy SplA zgromadzono w tabeli 1. Analiza otrzymanego modelu strukturalnego wskazała, że proteinaza SplA wykazuje budowę charakterystyczną dla proteinaz rodziny SI (trypsynopodobnych/chymotrypsynopodobnych) nie wykazując wyraźnych uwarunkowań w budowie triady katalitycznej dla obserwowanej słabej aktywności. Choć dwa z czterech modeli wykazywały nieznaczne odstępstwo His39 od normalnie obserwowanej pozycji w proteinazach serynowych jest to raczej wynikiem oddziaływań z wewnątrz kryształu, a nie wewnętrzną cechą samej proteinazy SplA. Tym bardziej, że dwa pozostałe modele wykazują bardzo niewielkie odstępstwo od ogólnie przyjętego dła proteinaz serynowych rodziny S1 wzorca. Ponadto, analiza wykazała dobrze wykształcone miejsce P1 zdolne do przyjęcia aminokwasów dużych relatywnie hydrofobowych reszt bocznych aminokwasów, takich jak: Y, F oraz ewentualnie W.
Kluczowe reszty aminokwasowe w sekwencji proteinazy SplA
Ze stanu techniki wiadomo, że kluczowymi resztami dla aktywności trypsynopodobnych proteinaz serynowych są reszty tzw. triady katalitycznej. W przypadku proteinazy SplA, uzyskana struktura trzeciorzędowa potwierdza, że są to: S154, H39 i D78. Zamiana tych reszt skutkuje całkowitą utratą zdolności katalitycznych.
Na podstawie ustalonej struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA oraz modelowania sposobu dokowania substratu m. in. na podstawie znajomości struktur kompleksów homologicznych białek z ich substratami i inhibitorami wynika, że reszty odpowiedzialne za rozpoznanie substratu to:
P1: przede wszystkim A149, Q150, P151, N153, L169, A171, G172, E177, S178 i N181,
P2: przede wszystkim Y170, H39 i D78.
Porównanie sekwencji aminokwasowych oraz struktur trzeciorzędowych homologicznych białek gronkowcowych (proteinazy V8 oraz toksyn epidermolitycznych) i trypsyny wskazuje na ważne rejony w sekwencji białka niezbędne dla prawidłowego fałdowania i/lub zachowania funkcji (patrz figura 1): V28 do 140; D78 do V82; G117 do P119 oraz G152 do I168. Ponadto, widać wyraźnie konserwację pojedynczych reszt: V51; S131; N181; V184 i I194.
Analiza bibliotek substratów syntetycznych
Bazując na wynikach analizy krystalograficznej, w dalszym etapie poszukiwania optymalnych substratów dla proteinazy SplA wykorzystano kombinatoryczną bibliotekę substratów syntetycznych zawierającą 104976 różnych substratów. Biblioteka zawiera substraty, w których na pozycjach P4 do P1 znajdują się wszystkie możliwe permutacje 18 aminokwasów (poza metioniną i cysteiną), a pozycję P1' zajmuje 7-amido-4-fluorometylokumaryna, barwnik wykazujący fluorescencję po odcięciu przez proteinazę od części peptydowej co pozwala na detekcję preferowanych substratów (szczegółowy opis Biol. Chem. (2004). 385: 1093-1098). W pierwszym etapie badań zgodnie z przekonaniem wynikającym ze stanu techniki, że reszta w pozycji P1 determinuje specyficzność proteinaz tyrpsynopodobnych skupiono się na ustaleniu preferowanej reszty w pozycji P1. Przegląd biblioteki proteinazą SplA pozwolił na ustalenie, że proteinaza SplA w pozycji P1 na 18 testowanych reszt bocznych toleruje jedynie następujące aminokwasy: Phe i Tyr (wynik zgodny z wynikami trawienia β-kazeiny oraz z przewidywaniami na podstawie analizy struktury proteinazy). Szybkość trawienia wyselekcjonowanych substratów była porównywalna z innymi proteinazami demonstrując, że proteinaza SplA wcale nie jest mało wydajna, jak sugerowały wyniki wcześniejszych eksperymentów opisanych w przykładach 1 i 2.
Stosowana biblioteka nie umożliwia odczytania wyników selekcji w pozycjach P2 do P4. Rozważając jednak odpowiedź na pytanie dlaczego proteianza SplA nie trawi innych poza B-kazeiną białek, w których znajduje się cały szereg reszt Phe i Tyr, na tym etapie prac stało się oczywiste, że trypsynopodobna proteinaza SplA posiada znacznie większą specyficzność substratową w porównaniu z jej bliskimi (proteinaza V8) i dalekimi (trypsyna, chymotrypsyna i wiele innych) homologami.
PL 221 052 B1
Analiza biblioteki kombinatorycznej CLiPS
Wysoka specyficzność substratowa zmusza do przesiania znacznie większej ilości substratów dla znalezienia tego właściwego i stąd konieczność zastosowania bardziej zaawansowanej metody CLiPS (opisanej w publikacji PNAS (2006), 130: 7583-7588). Bardzo ogólnie, w uzyskanej tą techniką bibliotece jedno z białek zewnętrznej błony komórkowej bakterii jest tak skonstruowane syntetycznie, że zawiera wszystkie możliwe permutacje liniowej sekwencji kilku aminokwasów (każdy szczep bakterii należący do biblioteki zawiera białko o konkretnej sekwencji, ale inne niż pozostałe szczepy bakterie należące do biblioteki). Za sekwencją zmienną znajduje się sekwencja umożliwiająca detekcję fluorescencyjną. Pierwszy etap selekcji (cytometria przepływowa) wybiera komórki fluoryzujące (gdzie interesujące białko ulega ekspresji) następnie komórki te kontaktuje się z testowaną proteinazą i selekcjonuje się te, które nie fluoryzują, a więc te, dla których proteinaza odcięła część fluoryzującą. Następnie dla wyselekcjonowanych w ten sposób szczepów określa się sekwencję interesującego białka, a więc i sekwencje cięcia. Zastosowanie tej metody pozwala na przesianie 64 milionów substratów i uzyskanie informacji co do aminokwasów występujących w pozycjach P5 do P1', a nie tylko P1 (jak w technice opisanej powyżej). Wykorzystując tą metodę wyselekcjonowano następujące sekwencje rozpoznawane i cięte przez proteinazę SplA:
| P3P2Pl*Pl’ | Szybkość cięcia |
| M RWLY * - - | 0,9 |
| - WLY * S E | 0,9 |
| T GWLY * - - | 0,8 |
| - IYEY * A - | 0,6 |
| E LYEY * - - | 0,7 |
| T VYEY * - - | 0,9 |
| G VYMY * - - | 0,7 |
| - VYAY * S - | 0,95 |
| - FYTY * S - | 0,9 |
| - LYLY * G - | 0,9 |
| - AFLY * G- | 0,6 |
| T TFLY * - - | 0,6 |
| - IVLY * T - | 0,3 |
| - VVLY * T - | 0,9 |
| - YWLS * T - | 0,9 |
| - YWMN * T - | 0,8 |
| - YWWY * T- | 0,95 |
| G AWLY * - - | 0,95 |
| (Y, W, F)LY* | Sekwencja konsensusowa |
Wytłuszczoną czcionką zaznaczono aminokwasy odpowiadające dokładnie wyselekcjonowanej sekwencji konsensusowej, podkreślono aminokwasy dobiegające od sekwencji konsensuowej, gwiazdką oznaczono miejsce cięcia. Liczba po prawej stronie sekwencji jest miarą szybkości trawienia.
W świetle wcześniejszych eksperymentów i stanu techniki uzyskany wynik jest co najmniej nieoczywisty. Dotychczasowa wiedza o biochemii dziesiątek proteinaz trypsynopodobnych wskazuje prawie wyłącznie na miejsce P1 jako determinujące specyficzność substratową w tego typu białkach. Również wysoce homologiczna do proteinazy SplA - proteinaza V8 także ze Staphylococus aureus wykazuje specyficzność jedynie dla reszty P1. Dlatego pierwotne oczekiwano, zgodnie z ogólnym stanem wiedzy, że tak samo będzie w przypadku proteinazy SplA. Ponieważ proteinazy specyficzne tylko dla P1 nie są szczególnie specyficzne mierząc miarą metody CLiPS, metoda ta nie jest zalecana
PL 221 052 B1 do określania specyficzności takich enzymów. Dopiero wiele niepowodzeń przy próbach przyrównania proteinazy SplA do wiedzy wynikającej ze stanu techniki skłoniło twórców do postawienia i przetestowania innej, mniej prawdopodobniej hipotezy dotyczącej specyficzności badanej proteinazy, która to hipoteza nieoczekiwanie okazała się prawdziwa.
P r z y k ł a d 5. Wykorzystanie proteinazy SplA do specyficznej hydrolizy białek zawierających sekwencje aminokwasowe według wynalazku
Trafność wyboru sekwencji konsensusowej oraz przydatność proteinazy SplA zostały potwierdzone w kolejnych eksperymentach. Wykorzystano plazmid umożliwiający ekspresję stafostatyny A jako białka fuzyjnego z GST odcinalnym przy pomocy trombiny (opisany w Mol. Microbiol. (2003) 49: 1051-1066; zawierający sekwencję kodującą białko stafostatyna A, którą sklonowano techniką PCR z matrycy genomowego DNA S. aureus do plazmidu pGEX-5T w miejsca BamHl/XhoI uzyskując plazmid umożliwiający ekspresję białka fuzyjnego GST-miejsce cięcia trombiny-stafostatyna A). Inkubacja białka fuzyjnego GST-miejsce cięcia trombiny-stafostatyna A z proteinazą SplA, nawet przy przedłużonym czasie inkubacji z nadmiarem enzymu, nie prowadzi do widocznej w metodzie SDS-PAGE hydrolizy interesującego łańcucha polipeptydowego.
Metodami inżynierii genetycznej (mutageneza punktowa) zamieniono w omówionym wyżej plazmidzie sekwencję nukleotydową kodującą miejsce cięcia dla trombiny (LVPR*GS) na sekwencję konsensusową (YLY*S) uzyskując plazmid umożliwiający ekspresję białka fuzyjnego GST-miejsce cięcia proteinazy SplA-stafbstatyna A. Białko to wyprodukowano w bakteriach E. coli szczepu BL21 pLysS i oczyszczono wykorzystując powinowactwo białka fuzyjnego GST do immobiłizowanego glutationu analogicznie jak opisano Mol. Microbiol. (2003) 49: 1051-1066 dla białka fuzyjnego GST-miejsce cięcia trombiny-stafostatyna A.
Kontaktując tak przygotowane białko z proteinazą SplA wykazano bardzo szybką hydrolizę łańcucha polipeptydowego (w czasie rzędu kilkunastu minut przy stukrotnym nadmiarze molowym substratu nad proteinazą SplA). Oznacza to, że proteinaza SplA nie jest mało wydajnym katalitycznie enzymem jak sugerowały eksperymenty z trawieniem B-kazeiny. Przeciwnie, dowodzi to, że jest ona enzymem bardzo wydajnym katalitycznie ale jedynie w stosunku do substratów o prawidłowej sekwencji, która jest nieoczekiwanie znacznie bardziej rozbudowana w porównaniu ze znanymi proteinazami trypsynopodobnymi.
Ponadto, wyizolowano stafostatynę A uwolnioną z białka fuzyjnego przez trawienie proteinazą SplA i oznaczono metodą degradacji Edmana jej N-końcową sekwencję wykazując, że proteinaza SplA tnie specyficznie i precyzyjnie w obrębie rozpoznawanej sekwencji jedynie w określonym * miejscu (YLY*S).
Podobny wynik powinien przynieść eksperyment, w którym sekwencję rozpoznawaną przez proteinazę SplA wg. opisu, zwłaszcza sekwencję konsensusową YLYS, umieszcza się pomiędzy „metką” histydynową (His-Tag) lub dowolną inną „metką” a dowolnym interesującym białkiem lub między dowolnym interesującym białkiem a dowolną metką, by tak samo jak poprzednio uzyskać precyzyjne odcinanie metki od interesującego białka.
PL 221 052 B1
T a b e l a 1
Koordynaty struktury trzeciorzędowej proteinazy SplA ze Staphylococus aureus oznaczenia: NA - numer porządkowy atomu, A - rodzaj atomu, AK - rodzaj aminokwasu,
NAK - numer porządkowy aminokwasu w strukturze pierwszorzędowej, X, Y, Z - koordynaty atomu
| MA | Α | j AC | HAK | X | Y | 2 | 99 | CA | ERO | 14 | 39.322 | -11.100 | 43.759 | |
| 1 | Μ | ! GUI | 1 | 13.268 | -17.309 | 45 -246 | Ϊ00 | CB | PRO | 14 | .38.224 | -11 950 | 43.012 | |
| 2 | CA | i GLU | 1 | 18.925 | -17.451 | 46-600 | 101 | cq | PRO | 14 | 37-Θ12 | -13.009 | 43 .912 | |
| 3 | CB | j GLU | 1 | 20.353 | - 17.991 | 46,556 | 102 | CD | PRO | 14 | 38.622 | •13-001 | 45,172 | |
| 4 | CG | OLU | 1 | 20-602 | -19.027 | 45.545 | 103 | c | PRO | 14 | 38.701 | -9.858 | 44.276 | |
| 5 | CD | GLU | 1 | 21.864 | -19.794 | 45.851 | 104 | G | PRO | 14 | 3S ,614 | -a.953 | 43 .487 | |
| 6 | οει | GŁt) | 1 | 22.425 | -19-813 | 47.CBS | Ϊ.05 | N | TYK | 15 | 38.547 | •9-753 | 45,571 | |
| Ί | ΟΕ2 | GLU | 1 | 22.279 | -20.427 | 44 .089 | 1.06 | CA | TYR | 15 | 37-930 | -8-578 | 46.205 | |
| Β | C | GLU | 1 | 19.003 | -15.175 | 47.393 | 107 | CB | TYR | 15 | 37.663 | -8.813 | 47.727 | |
| 9 | Ο | GL0 | 1 | 19.021 | -15.042 | 46.807 | 108 | CG | TYR | 15 | 37.193 | -10.229 | 47.942 | |
| 10 | Μ | LYS | 2 | 19.07? | -15.373 | 48.715 | 109 | CDI | TYR | 15 | 39.059 | -11.236 | 40.471 | |
| 11 | CA | LYG | 2 | 15.421 | -15.354 | 49.657 | 110 | CEł | TYR | 15 | 37.605 | -12.62J | 48-558 | |
| 13 | CB | LYS | 2 | 19.273 | -15.175 | 50.646 | 111 | cz | TYR | 15 | 36.304 | 12.944 | 40.095 | |
| 13 | CG | LYS | 2 | 17.446 | -13 -903 | 50.453 | 112 | OH | TYR | 15 | 35-768 | -14.233 | 48.13$ | |
| 14 | CD | LYS | 2 | 16.021 | -14 174 | 50,791 | 113 | CE2 | TYR | 15 | 3^.475 | -11-956 | 47.569 | |
| 15 | CE | LYS | 2 | 15.179 | -12.908 | 50.635 | 114 | CD 2 | TYR | 15 | 35.926 | -10.609 | 47.504 | |
| 16 | ΝΖ | LYS | 2 | 13.516 | -13,214 | 50.178 | 115 | C | TYR | 15 | 38.662 | -7.201 | 45.964 | |
| 17 | C | LYS | 2 | 20.727 | -15 724 | 50.304 | 116 | O | TYR | 15 | 38-039 | -6.291 | 45.931 | |
| ; 16 | Ο | LYS | 2 | 20.-514 | •15.642 | 51.605 | 117 | M | ASM | 16 | 39.976 | -7.354 | 45-Ή4 | |
| 19 | X | ASM | 3 | 31-768 | 16,101 | 49.655 | HS | CA | ASM | 16 | 40.7C5 | -6.104 | 45.614 | |
| 20 | CA | ASM | 3 | 23 -056 | -16,396 | 50.298 | 119 | CB | ASM | 16 | 42,120 | -6.103 | 46.100 | |
| 21 | CB | AKM | 3 | 23.523 | -17.778 | 49.817 | 120 | CC | ASN | Ifi | 42.971 | -7.063 | 45-287 | |
| 22 | ; CG | AEN | 3 | 24.702 | ifi.aai | 50.62R | 121 | GDI | ASM | 16 | 42.516 | -7,841 | 44.466 | |
| 23 | 001 | ASM | 3 | 24.762 | -18,123 | 51,879 | 122 | WD2 | ASM | 16 | 44-222 | -6.969 | 45.512 | |
| 24 | ΝΌ2 | ASM | 3 | 25.649 | -18.960 | 49-930 | 123 | C | ASM | 1S | 40-550 | -5 -459 | 44.237 | |
| 25 | C | ASM | 3 | 24.210 | -15.320 | 50.235 | 124 | O | ASM | 1S | 41.101 | -4.348 | 44.002 | |
| 26 | (5 | ASM | 3 | 25-005 | -15.270 | 49.300 | 125 | N | SER | 17 | 39.759 | -6.105 | 43.377 | |
| 27 | H | VAL | 4 | 24.319 | -14-533 | 51-296 | 126 | CA | SER | 17 | 39.441 | ”5-549 | 42.07Ć | |
| 26 | CA | VAL | 4 | 25.074 | -13.283 | 51.368 | 127 | CB | SER | 17 | 39.S65 | -6.545 | 40-912 | |
| 29 | ca | VAL | 4 | 24.003 | -12.086 | 51.338 | 328 | CG | SER | 17 | 30.786 | “7.614 | 40.991 | |
| 30 | CG1 | VAL | 4 | 24-603 | -10.717 | 51.691 | 129 | C | SER | 17 | 30.034 | “4.92 6 | 42.046 | |
| 31 | CG2 | VAL | 4 | 23.241 | -12.060 | 50.020 | 130 | c | SER | 17 | 37.557 | -4.463 | 40.991 | |
| 32 | C | VAL | 4 | 26.127 | -13.1ĆS | 52.592 | 131 | H | VAL | 18 | 37.382 | -4.S91 | 43-213 | |
| 33 | Ο | VAL | 4 | 25.740 | -L3.15S | 53.784 | 132 | CA | VAL | 18 | 36.007 | “4.375 | 43.271 | |
| 34 | X | LYS | 5 | 27.436 | -13.102 | 52-277 | 133 | CB | YAL | ia | 35.092 | “5.235 | 44.141 | |
| 35 | CA | LYS | s | 28.532 | 12.904 | 53.260 | 134 | CC-1 | VAL | 18 | 33.710 | -4.624 | 44-20S | |
| 36 | C5 | LYS | 5 | 29.749 | -13.654 | 53.006 | »5 | CG2 | VAL | 18 | 35.045 | -6.756 | 43.55$ | |
| 37 | CG | LYS | 5 | 29.410 | -15-174 | 52.412 | 136 | c | VAL | 10 | 3S.090 | -2.950 | 43.715 | |
| 3S | C | LYS | 5 | 29.052 | 11.453 | 53-133 | 137 | 0 | VAL | 18 | 36 .787 | -2*631 | 44.6eo | |
| 39 | Ο | LYS | 5 | 23.385 | -11.031 | 52.003 | ue | M | VAL | 19 | 35.414 | -2.051 | 43.010 | |
| 40 | Μ | GŁU | 6 | 29.137 | -10.721 | 54 .248 | 139 | CA | VAL | 29 | 35.417 | -O . 6-68 | 43.454 | |
| 41 | CA | GŁU | 6 | 29.926 | -•3-507 | 54-239 | 140 | CB | VAL | 29 | 36.033 | 0.278 | 42 . 3W2 | |
| 42 | CB | GLU | 6 | 22.821 | -8.714 | 55.529 | 141 | CG1 | VAL | 19 | 37.549 | -0.062 | 42-230 | |
| 43 | C£1 | GLU | 6 | 31-041 | -7.852 | 55.678 | 142 | CG2 | VAL | 19 | 35.397 | 0.169 | 41.033 | |
| 44 | CU | GLU | 6 | 30.864 | -6-650 | 56.481 | 143 | C | VAL | 19 | 34.015 | - 0,2.17 | 43.352 | |
| 45 | GE1 | GLC | 6 | 31.616 | -5.664 | 55,257 | 144 | O | VAL | 19 | 33.050 | -0,721 | 43.330 | |
| 46 | GE 2 | GLU | O | 29.990 | -6.658 | 57.354 | 145 | H | ALA | 20 | 33.924 | C-. 742 | 44.767 | |
| 47 | C | GLU | 6 | 31.389 | -9.854 | 53.921 | 146 | CA | ALA | 20 | 32.648 | 1.441 | 45.094 | |
| 46 | 0 | GŁU | 6 | 31.896 | -10.852 | 54.358 | 147 | CB | ALA | 20 | 32-562 | 1.785 | 46 .547 | |
| 49 | X | ILE | 7 | 32.045 | -9.051 | 53.005 | 148 | C | ALA | 20 | 32-450 | 2-701 | 44.280 | |
| 50 | CA | ILE | 7 | 33.481 | -S.1S6 | S2.939 | 149 | O | ALA | 20 | 33.308 | 3 .525 | 44-174 | |
| 51 | ca | ILE | 7 | 33.971 | -9.38S | SI,526 | 150 | » | ?HE | 21 | 31.315 | 2 <303 | 41.605 | |
| S2 | CGl | ILE | 7 | 33-510 | -10.784 | 51-056 | 151 | CA | PHE | 21 | 30.954 | 4.077 | 43.001 | |
| 53 | CDI | ILE | 7 | 33 . 382 | -10.872 | 49.642 | 152 | CB | PHE | 21 | 30.237 | 3.913 | 41.652 | |
| 54 | 032 | ILE | 7 | 35.493 | 9.354 | 51.481 | 153 | CG | PHE | 21 | 31.161 | 3.752 | 40.552 | |
| 55 | C | ILE | 7 | 34.172 | -a.152 | 53.739 | 154 | CDI | PHE | 21 | 31.782 | 2.509 | 40.337 | |
| 56 | 0 | ILE | Γ 7 | 34.09S | -6.941 | 53.438 | 155 | CE1 | PHE | 21 | 32.734 | 2 .344 | 39.326 | |
| 57 | K | THR | S | 34.793 | -S .702 | 54.770 | 156 | CC | ?HE | 21 | 33.127 | 3 .4 87 | 33-551 | |
| 5β | CA | IMfe | 8 | 35.417 | -7.970 | 55.907 | 167 | CE2 | PHE | 21 | 32.533 | 4.731 | 38.786 | |
| 59 | ca | TH fi | 8 | 35.479 | “9.021 | 57.069 | 1SB | CD2 | PHE | 21 | 31-544 | Ł-8S? | 33.807 | |
| 60 | 0G1 | THE | 3 | 34.384 | -a.77B | 57.972 | 159 | C | ?:-!£ | 21 | 30.«42 | 4-650 | 44.025 | |
| 61 | CG2 | THR | a | 36.S33 | 9.14C | 57.748 | 160 | O | PHE | 21 | 29.634 | 3.995 | 44.3S7 | |
| 62 | C | THR | 8 | 36.750 | -7.272 | 55.544 | 161 | H | VAL | 22 | 29.581 | 5.877 | 43.813 | |
| 63 | O | THS. | 8 | 36.948 | -6.092 | 55.33? | 162 | CA | TOK | 22 | 28.783 | 0-4Θ5 | 44.763 | |
| 64 | ti | ASP | 9 | 37.612 | -S.OOC | 54.855 | 163 | CB | VAL | 22 | 28.782 | e.eeo | 44..48S | |
| 6S | CA | ASP | 8 | 38.367 | -7.50S | 54,377 | 164 | ran | VAŁ | 22 | 27.721 | 8.440 | 43.437 | |
| «δ | CB | ASP | 9 | 39.991 | -0.290 | 55.105 | 165 | CG2 | VAL | 22 | 28.747 | 8.615 | 45.791 | |
| > 67 | CC | ASP | 3 | 41.387 | '7.734 | 54 .023 | 166 | C | VAL | 22 | 27,373 | 5-737 | 44.917 | |
| 60 | CDI | ASP | 9 | 41-838 | -7.752 | 53.643 | 167 | o | VAL | 22 | 26.087 | 5.550 | 46.037 | |
| 69 | 002 | AS? | 9 | 42.059 | -7.281 | 55.792 | 160 | N | GLY | 23 | 26.746 | 5.3 04 | 43.821 | |
| 70 | C | AS? | 9 | 3S.S52 | -7.667 | 52.331 | 169 | CA | GLY | 23 | 25.519 | 4.513 | 43.936 | |
| 71 | O | ASP | 9 | 33.110 | -B .789 | 52.314 | 170 | C | GLY | 23 | 25.535 | 3.122 | 43.289 | |
| 72 | N | AIA | 10 | 30-900 | -6.540 | S2.103 | 171 | O | GLY | 23 | 24.SS2 | 2.570 | 43-649 | |
| 73 | CA | ALA | 10 | 38 .814 | 6.566 | 50,628 | 172 | N | GLY | 24 | 26.762 | 2.723 | 43.223 | |
| 74 | CR | ALA | 10 | 37 -826 | -5.578 | 50.085 | 173 | CA | GLY | 24 | 2S.917 | 1-216 | 42.594 | |
| 75 | C | AIA | 10 | 40.222 | -6.450 | 49.953 | 174 | C | GLY | 7.4 | 28.328 | 3.671 | 42-646 | |
| 76 | 0 | AIA | 10 | 40.388 | -5.921 | 48-535 | 175 | 0 | GLY | 24 | 29.170 | 1 . 037 | 43-502 | |
| 77 | N | THR | 11 | 41.214 | -7.005 | 50.633 | 176 | N | THR | 25 | 28,603 | 0.228 | 41.715 | |
| 78 | CA | THR | u | 42.624 | -6-697 | 50.421 | 177 | CA | TUR | 25 | 29 803 | -1-001 | 41.828 | |
| 73 | CB | THR | 11 | 43.249 | -6 .676 | 51.823 | 178 | CB | THR | 2S | 29.455 | •2.47S | 45.313 | |
| 30 | DCI | TKR | 11 | 43.670 | -5 .347 | 53 -097 | 179 | OG1 | THR | 25 | 25.000 | -2.410 | 43.5B4 | |
| 81 | CG 2 | TOR | 11 | 44,374 | -7 .069 | 51.963 | łoa | CG2 | THR | 25 | 30-693 | -3.339 | 45.413 | |
| 32 | c | THR | 11 | 43-192 | -7.742 | 49,492 | lei | C | THR | 25 | 30.492 | •0.993 | 40,486 | |
| 83 | 0 | THR | 11 | 44.037 | -7.466 | 40 - 663 | 182 | O | THR | 25 | 25.8B0 | -0.664 | 39.493 | |
| 34 | M | LYS | 12 | 42.657 | -3.949 | 49-616 | 103 | N | GLY | 26 | 31.771 | -1.349 | 40.492 | |
| 35 | CA | LYS | 12 | 43.104 | -10.005 | 40.842 | 184 | CA | GLY | 26 | 32.574 | -1-606 | 3S.25B | |
| 86 | CB | LYS | 12 | 43.215 | 11.337 | 49.763 | IBS | C | GLY | 26 | 33.706 | -2.575 | 39.566 | |
| 87 | C | LYS | 12 | 42.154 | -10.266 | 47.626 | 106 | O | GLY | 26 | 33,949 | -2.012 | 40.746 | |
| S8 | a | LYS | 12 | 41,015 | -3.748 | 47.650 | 107 | M | VAL | 27 | 34.291 | -3.199 | 38.51? | |
| S9 | M | GLU | 13 | 42,642 | -10.962 | 46.578 | 108 | CA | VAL | 27 | 30.472 | -4.131 | 38.603 | |
| 30 | CA | GLU | 13 | 41.944 | 11.105 | 45.204 | 199 | CB | VAL | 27 | 35.3S7 | -5.431 | 37.7M i | |
| 91 | ca | GLU | 13 | 42.913 | -11.496 | 44.154 | 190 | CG1 | VAL | 27 | 35 - 624......Γ | -5.113 | 38.583 | |
| 92 | CG | GLU | 13 | 44.423 | -11 . 252 | 44-513 | 191 | CG 2 | VA1, | 27 | 34,217 j | -5.539 | 36.810 | |
| 93 | CD | GW | 13 | 45.298 | -11 .499 | 43 .254 | 192 | C | VAL | 27 | 36.660 ί | -3.55« | 37,859 | |
| 94 | OE1 | GLU | 13 | 44.832 | -12.311 | 42.366 | 293 | O | VAL | 2? | 36.496 | -2.5β9 | 36,750 | |
| 95 | OE2 | GLU | 13 | 46.400 | -10.845 | 43-153 | 194 | M | YAI, | 28 | 37.854 | -3.825 | 38.394 | |
| 96 | C | C-LU | 13 | 40.944 | -12 .240 | 45.379 | 1S5 | CA | VAL | 28 | 33.103 j | -3-355 | 37.765 | |
| 97 | O | GLU | 13 | 41.284 | -13.24S | 45.915 S | 196 | CB | UAL | 28 | 40.242 t | -3 -071 | 3S.747 | |
| 98 | X | FRO | 14 | 39.738 | -12-122 | 44.780 j | 197 | CESI | VAŁ | 28 | 41.423 { | -2 .525 | 37.956 |
PL 221 052 B1
| 193 1 CG2 | VAL | 28 | 39.730 | 2-03Ϊ | 39-733 | |
| 139 i C | VAL | 28 | 39.592 | -4.316 | 36.740 | |
| 200 | C | VAL | 20 | 39.712 | -5.4H9 | 36.962 |
| 201 | N | VAL | 29 | 39.863 | 3.789 | 35.585 |
| 202 | CA | VAL | 29 | 40.104 | -4.037 | 34.425 |
| 203 | CB | VAL | 29 | 36-905 | 4.349 | 33.476 |
| 204 | CG1 | VAL | 29 | 39.260 | -3.547 | 32-185 |
| 205 | CG2 | VAL | 29 | 38.004 | -5.561 | 33,349 |
| 206 | C | VAL | 39 | 41. .565 | -4.472 | 33.871 |
| 207 | 0 | VAL | 29 | 41.968 | 5.312 | 32.983 |
| 2oe | u | GLY | 30 | 42.366 | -3.560 | 34.460 |
| 209 | CA | GLY | 30 | 43.636 | -3.108 | 33.087 |
| 210 | C | GLY | 3C | 44 ,136 | -1.753 | 34.299 |
| 211 | a | SLY | 30 | 43.616 | -1.056 | 36.138 |
| 212 | N | LYS | .11 | 45-349 | -1.380 | 33.743 |
| 213 | CA | LYS | 31 | 45.976 | - 0.092 | 34,061 |
| 214 | CB | LYS | 31 | 47.131 | 0 - 225 | 33-080 |
| 225 | CG | LYS | 31 | 40.168 | 1.447 | 33-422 |
| i 216 | C | LYS | 31 | 44-863 | 1.006 | 34.033 |
| 217 | 0 | LYS | 31 | 44 .297 | 1.337 | 32.972 |
| 23 8 | N | ASN | 32 | 44.558 | 1.544 | 36.207 |
| 2X9 | CA | ASN | 32 | 43,628 | 2.680 | 35.400 |
| 220 | CB | ASN | 32 | 44.309 | 4.050 | 35,170 |
| 221 | CG | ASN | 32 | 45.724 | 4.092 | 35-710 |
| 222 | GDI | ASM | 32 | 46.639 | 4.573 | 35,061 |
| 223 | NDJ | ASM | 32 | 45.911 | 3.568 | 36.861 |
| 224 | C | ASN | 32 | 42.213 | 2.556 | 34.781 |
| 225 | 0 | ASN | 32 | 41.560 | 3.566 | 34 .435 |
| 226 | K | TOR | 33 | 41.727 | 1.318 | 34 .739 |
| 227 | CA | TOR | 33 | 40.632 | 0.977 | 33.862 |
| 223 | CB | TOR | 33 | 41.109 | 0.244 | 32.568 |
| 229 | OG1 | TOR | 33 | 41-957 | 1.115 | 31.813 |
| 230 | CG2 | TOR | 33 | 39.3R7 | -0.05? | 31.613 |
| 231 | C | TOR. | 33 | 39.616 | 0.162 | 34.592 |
| 232 | 0 | TOR | 33 | 39.371 | -0.963 | 34.530 |
| 233 | H | JLB | 34 | 38.442 | 0.746 | 34.795 |
| 234 | CA | ILE | 14 | 37.250 | 0.107 | 35.473 |
| 235 | CE | ILE | 34 | 36.752 | 0-989 | 36-644 |
| 236 | CG1 | ILE | 34 | 37.752 | 0.984 | 37.796 |
| 237 | CDI | ηε | 34 | 37.744 | 2.214 | 3 8 .596 |
| 238 | CG2 | ILE | 34 | 35.433 | 0.534 | 37.186 |
| 239 | C | ILE | 34 | 35.117 | -0,369 | 34.519 |
| 240 | O | ILE | 34 | 35.910 | 0.603 | 33.644 |
| 241 | N | YAL | 35 | 35-370 | -1.248 | 34.783 |
| 242 | CA | VAL | 35 | 34-146 | -1,540 | 34.045 |
| 243 | CB | VAL | 35 | 34.209 | -2-919 | 33.371 |
| 244 | CG1 | VAL | 35 | 32.823 | 3.3 26 | 32.850 |
| 245 | CG2 | VAL | 35 | 35.205 | -2.S69 | 32.174 |
| 246 | C | VAL | 33 | 32.904 | -1.4D6 | 34.953 |
| 247 | O | VAL | 35 | 32.895 | -1.937 | 36.090 |
| 248 | El | TOR | 36 | 31.855 | -0.702 | 34.463 |
| 249 | CA | TOR | 36 | 30,575 | -0-540 | 35,227 |
| 250 | ca | TOR | 36 | 3C . 683 | 0.576 | 36-273 |
| 251 | GGl | TOR | 36 | 29 .530 | 0.534 | 27.123 |
| 252 | C'52 | TOR | 36 | 30.369 | I . 937 | 35.608 |
| 253 | C | TUR | 36 | 29.375 | -0.330 | 34.298 |
| 254 | 0 | TOR | 36 | 25.564 | -0.476 | 33.128 |
| 256 | N | ASN | 37 | 28.159 | -0.040 | 34.902 |
| 256 | CA | ASN | 37 | 27.041 | 0.337 | 33-953 |
| 257 | Cfl | ASN | 37 | 25.746 | 0.265 | 34.775 |
| 256 | CG | ASN | 37 | 2fi.381 | 1 .146 | 35-173 |
| 259 | OO1 | ASN | 37 | 25.616 | - 2,116 | 34.446 |
| 250 | ND2 | ASN | 37 | 24.803 | -1.275 | 36.323 |
| 261 | C | ASN | 37 | 27.217 | 1.746 | 33.395 |
| 252 | O | ASN | 37 | 27.370 | 2.5AC | 34.012 |
| 253 | H | LYS | 38 | 26.599 | 2.073 | 32.276 |
| 264 | CA | LYS | 38 | 26.613 | 3.475 | 31.763 |
| 265 | CB | LYS | 38 | 25.028 | 3-543 | 30,450 |
| 266 | CG | LYS | 38 | 26.403 | 2.859 | 29.227 |
| 2 67 | CD | LYS | 38 | 25.546 | 2.SS7 | 27.967 |
| 2-68 | CB | LYS | 38 | 26.292 | 2.326 | 26.740 |
| 269 | NZ | LYS | 3« | 25.435 | 2.203 | 26.503 |
| 270 | C | LYS | 3S | 26.067 | 4.557 | 32,781 |
| 271 | O | LYS | 38 | 26.640 | 5.560 | 32,968 |
| 272 | N | HIS | 39 | 24.991 | 4.240 | 33-448 |
| 273 | CA | HIS | 39 | 24.339 | 5.175 | 34.366 |
| 274 | CB | HIS | 39 | 22.873 | 4,794 | 34.663 |
| 275 | CG | HIS | 39 | 22.691 | 2.527 | 35.465 |
| 276 | ND1 | HIS | 39 | 22.366 | 2.316 | 34.861 |
| 277 | CEi | HIS | 39 | 22.221 | 1,390 | 35.023 |
| 275 | NB2 | HIS | 39 | 22 .427 | 1.959 | 37.003 |
| 279 | CD2 | ars | 39 | 22.704 | 3.299 | 36.Bil |
| 280 | C | HIS | 39 | 25.199 | 5.364 | 35.634 |
| 2SJ | O | HIS | 35 | 25 .365 | 6 .483 | 36-075 |
| 282 | U | ILE | 40 | 25.776 | 4 .237 | 36.202 |
| 283 | CA | 1LR | 40 | 26,763 | 4.413 | 37.307 |
| 284 | CB | ILE | 40 | 27 .191 | 3.010 | 37.810 |
| 285 | CG1 | ILE | 4C | 2S.005 | 2.268 | 33.327 |
| 286 | cni | ILE | 4C | 25.106 | 3-072 | 39.310 |
| 287 | CG2 | ILB | 40 | 23.213 | 3.103 | 38 ,896 |
| 23B | C | ILB | 40 | 27.992 | 5.232 | 36.886 |
| 289 | O | ILB | 40 | 20.555 | 5.966 | 37.647 |
| 290 | w | ALA | 41 | 26 .435 | 5.120 | 35,669 |
| 291 | CA | ALA | 41 | 29.676 | 5.765 | 35.333 |
| 292 | ca | ALA | 41 | 3-0,347 | 4.997 | 34.252 |
| 2 93 | c | ALA | 41 | 20.527 | 7.243 | 34.932 |
| 294 | 0 | ALA | 41 | 30.503 | e .00? | 35.003 |
| 295 | H | LYS | 42 | 23 .313 | 7 .653 | 34.526 |
| 296 | CA | LYS | 42 | 23.085 | 8.934 | 33.6Θ2 |
| 297 | CB | LYS | 43 | 26.681 | 3 .9SS | 33,239 |
| 293 | C | LYS | 42 | 20.219 | 10.095 | 34 824 |
| 299 | 0 | LYS | 42 | 28.723 | 11.173 | 34.442 |
| 300 | u | SER | 43 | 27.771 | 9.907 | 36.054 |
| 301 | CA | SER | 43 | 27.039 | 10.999 | 36.694 |
| 302 | CB | SER | 43 | 25,631 | 10.443 | 36.919 |
| 303 | OG | SER | 43 | 25.7S6 | 9-261 | 37.742 |
| 304 | C | SER | 43 | 27.641 | 11.438 | 33.053 |
| 305 | O | SER | 43 | 23.662 | 11 -153 | 38,313 |
| 305 | N | ASN | 44 | 26.637 | 12-095 | 33.966 |
| 307 | CA | ASN | 44 | 25.838 | 13.4C2 | 33,590 |
| 308 | CB | ASN | 44 | 25.315 | 13.033 | 39.959 |
| 309 | C | ASN | 44 | 26.119 | 14.716 | 37.810 |
| 310 | C | ASN | 44 | 25.139 | 15.472 | 37.565 |
| 311 | N | ASP | 45 | 27.367 | 13.095 | 37.538 |
| 312 | CA | ASP | 45 | 27.6SS | 16.507 | 37.106 |
| 313 | CE | ASP | 45 | 26-655 | 17.137 | 36-132 |
| 314 | C | ASP | 45 | 27,952 | 17.510 | 38.260 |
| 315 | O | ASP | 45 | 2B,567 | 19.544 | 38-009 |
| 316 | N | ILE | 46 | 27.53S | 17-216 | 39.502 |
| 317 | CA | ILE | 46 | 27.£19 | 10.232 | 40.578 |
| 310 | CB | ILE | 46 | 26.161 | 10.859 | 40.984 |
| 319 | CG1 | ILE | 46 | 25.CEO | 17.812 | 41.296 |
| 320 | CG2 | ILE | 46 | 35.749 | 19,866 | 39.947 |
| 321 | C | ILB | 46 | 23.421 | 18.124 | 41,895 |
| 322 | O | ILB | 46 | 29.025 | 19.105 | 42,334 |
| 323 | N | phb | 47 | 20.537 | 16.99« | 42-572 |
| 324 | CA | ΡΉ3 | 47 | 29.275 | 15.752 | 42.290 |
| 325 | CR | PHB | 47 | 29.371 | 14.530 | 42.554 |
| 326 | CG | PHB | 47 | 27.244 | 14.877 | 43.502 |
| 327 | CDI | PHE | 47 | 25-903 | 14.7-34 | 13.102 |
| 329 | CE1 | PHE | 4 7 | 24,05? | 15.152 | 47.924 |
| 329 | CS | PB2 | 47 | 25-165 | 15,752 | 45.190 |
| 330 | CEL | PHE | 47 | 28.502 | 15-920 | 45.592 |
| 331 | CD2 | PHE | 47 | 27.524 | 15.494 | 44.742 |
| 333 | C | PHD | 47 | 30.594 | 15.379 | 41.456 |
| 323 | O | PHB | 47 | 30.625 | 15.450 | 40.223 |
| 334 | » | LYS | 45 | 31.636 | 15-613 | 42 259 |
| 335 | CA | LYS | 48 | 33.021 | 15.107 | 41.586 |
| 336 | CB | LYS | 48 | 34.023 | 15.364 | 43-020 |
| 337 | C | LYS | 40 | 32 .843 | 13.632 | 41-653 |
| 338 | O | LYS | 49 | 32.581 | 12.695 | 42.582 |
| 339 | N | ASN | 49 | 32.942 | 13.189 | 40.413 |
| 340 | CA | ASM | 49 | 32.692 | 11.755 | 40.123 |
| 341 | CB | ASN | 49 | 32,847 | 11.562 | 33.614 |
| 312 | CG | ASN | 49 | 32.332 | 10,183 | 3S .209 |
| 343 | OLI | ASN | 43 | 31.971 | 9,313 | 39.049 |
| 344 | NL2 | ASN | 49 | 32,266 | 9.973 | 36.904 |
| 34 5 | C | ASN | 49 | 34.071 | 10.935 | 40,720 |
| 348 | O | ASN | 49 | 35.153 | 10.931 | 40.150 |
| 347 | N | ARG | 50 | 33.063 | 10.299 | 41.807 |
| 348 | CA | ARG | 50 | 34.929 | 3.417 | 42.443 |
| 349 | CB | ARG | 50 | 35.276 | 10.011 | 43.793 |
| 3S0 | CG | ARG | 50 | 35,989 | 11.207 | 43 .833 |
| 351 | CD | ARG | 50 | 36.181 | 11.456 | 45,263 |
| 352 | NE | ARG | 50 | 37.543 | 12 .442 | 45.338 |
| 353 | CS | ARG | 30 | 37.407 | 12.743 | 45.630 |
| 354 | NH1 | ARO | 50 | 33.500 | 14.495 | 45.639 |
| 355 | NH2 | ARG | so | 36.222 | 14.305 | 45.943 |
| 366 | C | ARG | 50 | 34.650 | 7-896 | 42.745 |
| 357 | 0 | ARG | 50 | 33-509 | 7 .4.82 | 43.054 |
| 359 | N | VAL | 51 | 35.733 | 7-098 | 42.734 |
| 359 | CA | VAŁ | 51 | 35.675 | 5.701 | 43.114 |
| 360 | CB | VAL | 51 | 36.031 | 4.736 | 41.953 |
| 361 | CGl | VAL | 51 | 35.281 | 5.037 | 40.716 |
| 362 | CG2 | VAL | 51 | 37.487 | 4.933 | 41.599 |
| 363 | C | VAL | 51 | 36,521 | 5.522 | 44.348 |
| 364 | O | VAL | 51 | 37.422 | 6.306 | 44.523 |
| 36Ξ | N | SER | 52 | 36.134 | 4.502 | 45.121 |
| 366 | CA | SER | 52 | 36.826 | 4-063 | 46.321 |
| 367 | CB | SER | 52 | 36.926 | 4.158 | 47.551 |
| 3 68 | OG | SER | 52 | 36.539 | 3.677 | 48 . 718 |
| 369 | C | SER | 52 | 37.168 | 2.634 | 46.034 |
| 370 | O | SER | 52 | 36.360 | 1,814 | 45.800 |
| 371 | N | ALA | 53 | 30.473 | 2-370 | 45.930 |
| 3 72 | CA | ALA | 53 | 39.020 | 1.05? | 45.694 |
| 373 | CB | ALA | 53 | 4-0.521 | 1-158 | 4S.3C9 |
| 374 | C | ALA | 53 | 38.810 | 0.101 | 46.866 |
| 375 | 0 | ALA | 53 | 39.216 | 0.374 : | 48 024 |
| 376 | N | HIS | 54 | 38.136 | •1.005 i | 46.574 |
| 377 | CA | HIS | 54 | 37.007 | -2.038 i | 47.545 |
| 379 | CB | HIS | 54 | 33,763 | 3.213 | 47.408 |
| 379 | CG | HIS | 54 | 40.146 | -2.927 ; | 47.896 |
| 380 | MDI | HIS | 54 | 41.223 | 2.314 | 47.047 |
| 381 | CB1 | HIS | 54 | 42.316 | -2.620 | 47.760 |
| 382 | NE 2 | HIS | 54 | 41,983 | -2.572 | 49.039 |
| 383 | CD 2 | HIS | 54 | 40.638 | -2.759 | 49.151 |
| 384 | C | HIS | 54 | 37,604 | -1.604 | 49.007 |
| 385 | O | HIS | 54 | 36.096 | -2.229 | 49.944 |
| 3S6 | N | HIS | 55 | 36.793 | •0.569 | 49.208 |
| 387 | CA | HIS | 55 | 36.371 | -0-219 | 50.577 |
| 38S | CB | HIS | 55 | 35.460 | 1.022 | 50.592 |
| 369 | CG | HIS | 5$ | 35.261 | 1.583 | 51.965 |
| 330 | ND1 | HIS | 55 | 34,443 | 0.994 | 52.899 |
| 391 | CB1 | HIS | 55 | 34.473 | 1.681 | 54-023 |
| 392 | NEL | HIS | 55 | 35.312 | 2.682 | 53.850 |
| 393 | CD2 | HIS | 55 | 35.B15 | 2 .646 | 52.583 |
| 394 | C | HIS | 55 | 35.660 | -1.425 | 51.243 |
| 395 | O | HIS | 55 | 34,620 | -2.111 | 50.S17 |
PL 221 052 B1
| 3 95 | Ν | SER | 56 | 36.007 | -1-575 | 52.490 |
| 297 | CA | SER | 56 | 35.407 | -2 . 72G | 53.311 |
| 398 | CB | SER | 56 | 56 .134 | -4.065 | 53.144 |
| 393 | OG | SES | 56 | 37.448 | -3 ,947 | 53.674 |
| 400 | C | SER. | 56 | 35.535 | -2.204 | 54 .744 |
| 401 | 0 | SER | 55 | 36.081 | Ί.Ι45 | 54.953 |
| 402 | H | SER | 57 | 33-028 | -2.347 | 55.717 |
| 403 | L‘A | SER | 57 | 34.812 | -2-377 | 57.031 |
| •404 | CB | SER | 57 | 33,674 | -2-972 | $7.500 |
| 405 | OG | SER | 57 | 33.690 | 4.369 | S7.710 |
| 40G | C | SER | 57 | 36,050 | -2 .546 | S? .931 |
| 107 | 0 | SER | 57 | 36 .423 | -1.59® | £& .617 |
| 408 | tl | LYS | 58 | 36,663 | 3 .742 | 57-940 |
| 409 | CA | LYS | 58 | 37.946 | -3.993 | £0,671 |
| 410 | CB | LYS | 58 | 37,928 | -5.355 | 59,405 |
| 411 | C | LYS | 58 | 35.071 | -3 .389 | 57 .59« |
| 412 | 0 | LYS | 58 | 39-771 | 4.359 | 57.302 |
| 413 | H | GI.Y | 59 | 35.209 | -2-705 | 56.992 |
| 414 | CA | GLY | 59 | 35.753 | 2 .601 | 55.627 |
| 415 | C | GLY | 59 | 41.259 | -2 .643 | 55.476 |
| 41& | 0 | GLY | 59 | 41.859 | -3.718 | 55.503 |
| 417 | w | LY£ | €0 | 41.853 | -1.457 | 55.341 |
| 413 | CA | LYS | 60 | 43.250 | 1.255 | 55.CS4 |
| 419 | CS | LYS | 60 | 44.239 | -2.302 | £5.709 |
| 420 | c | LYS | 611 | 43.426 | -1.186 | 53 -542 |
| 421 | 0 | LYS | 60 | 44.49Q | -1.479 | 62-939 |
| 422 | N | GLY | 61 | 42.344 | -Θ .736 | 52.923 |
| 423 | CA | Gt.Y | 63 | 42.435 | -0.613 | 51.478 |
| 424 | C | GLY | 61 | 42.0-44 | 0,600 | 50-£48 |
| 425 | O | GLY | 61 | 43.076 | 0,237 | 50.0S9 |
| 425 | N | GLY | 62 | 41.965 | 1-52$ | 49,702 |
| 427 | CA | GLY | 63 | 42.748 | 1.346 | 48.443 |
| 42 θ | C | GLY | 62 | 43.062 | 2.682 | 47,874 |
| 429 | 0 | GLY | 62 | 43.093 | 2 .322 | 46.964 |
| 430 | 34 | GLY | 63 | 42.364 | 3.666 | 46 -43® |
| 431 | CA | GLY | £3 | 42.374 | 5.032 | 47.946 |
| 432 | C | GLY | 63 | 41.035 | 5 .594 | 47,475 |
| 433 | 0 | GLY | 63 | 39,361 | 5.042 | 47.730 |
| 434 | N | ASM | 64 | 41 .092 | 6.717 | 46.B33 |
| 435 | CA | ASN | 64 | 39-917 | 7,354 | 46.294 |
| 436 | CB | ASM | 64 | .19.404 | 8 -435 | 47.135 |
| 437 | CG | ASM | 64 | 38,506 | 8 ,(100 | 48.2 97 |
| 430 | OBI | ASH | £4 | 37.870 | 8 .791 | 48.990 |
| 439 | KO3 | ASN | 64 | 38.449 | 6.690 | 48 .479 |
| 440 | C | ASM | £4 | 40.531 | 7.929 | 45.08B |
| 441 | 0 | ASM | 64 | 41-619 | 8,516 | 45 .lSfi |
| 442 | K | TYR | 65 | 39.867 | 7-734 | 43.953 |
| 443 | CA | TYR | 65 | 40.424 | 8,103 | 42-685 |
| 444 | CB | TYR | 65 | 40.868 | 6,822 | 41.968 |
| 445 | CG | TYR | 65 | 41.905 | £.055 | 42 .791 |
| 446 | CDI | TYR | 65 | 41 -51.7 | 5-125 | 4.3.769 |
| 447 | CB1 | TYR | 65 | 42.500 | 4,435 | 44.561 |
| 443 | CK | TYR | 65 | 43.902 | 4.S37 | 44,357 |
| 443 | OK | TYR | £5 | 44.857 | 3.950 | 45,106 |
| 450 | CE2 | TYR | S5 | 44.299 | £.60? | 43.390 |
| 451 | CD2 | TYR | 65 | 43 .307 | 6.236 | 42-616 |
| 452 | C | TYR | 65 | 39.443 | S-997 | 41.910 |
| 4 53 | O | TYR | 65 | 38.301 | S.S64 | 41-713 |
| 454 | t; | ASP | 56 | 39.B83 | 10.157 | 41-482 |
| 455 | c* | ASP | 66 | 39.062 | 10.909 | 40.555 |
| 456 | CB | ASP | 66 | 39.£35 | 12.282 | 40.359 |
| 457 | CG | ASP | 66 | 39.409 | 13.226 | 41 .S45 |
| 458 | oni | ASP | 66 | 40,366 | 13.928 | 42.993 |
| 459 | 0O2 | ASP | es | 38.230 | 13-255 | 42 .011 |
| 460 | C | ASP | 66 | 38.960 | 10.191 | 39.216 |
| 461 | 0 | ASP | 66 | 39-94S | 9.685 | 38,72£ |
| 462 | VAL | 67 | 37.7€8 | 10.125 | 33.643 | |
| 463 | CA | VAL | 67 | 37,569 | 9.610 | 37.287 |
| 464 | CG | VAL | 67 | 36,033 | 9-372 | 36-93B |
| 465 | CG1 | VAŁ | 67 | 35.773 | 9.222 | 35-545 |
| 465 | CG2 | VAL | 67 | 35.438 | 8.190 | 37 .777 |
| 467 | C | VAL | 67 | 38.134 | 10.665 | 36.235 |
| 468 | O | VAL | 67 | 37.347 | 11.636 | 36.571 |
| 469 | LYS | SS | 38.783 | 10.247 | 35.239 | |
| 470 | CA | LYS | £8 | 39.538 | 11.147 | 34.320 |
| 47.1 | C’8 | LYS | 40.514 | 10.504 | 34,010 | |
| 472 | CG | LYS | SS | 41.823 | 11.210 | 12.99B |
| 473 | CD | LYS | 63 | 43.228 | 10.736 | 33,073 |
| 474 | CE | LYS | 63 | 43-333 | 9-294 | 32,684 |
| 475 | »2 | LYS | 63 | 42.955 | 9-117 | 31.27S |
| 476 | C | LYS | 68 | 38 .759 | 11,648 | 33.037 |
| 477 | O | LYS | 63 | 37.631 | 12 .109 | 33,011 |
| 479 | ΟΧΤ | LYS | 66 | 39.085 | IX .700 | 31.8S8 |
| 479 | N | ASP | 69 | 39.11S | 5.702 | 32.539 |
| 4&0 | CA | ASP | 69 | 37-237 | 5.878 | 31.300 |
| 481 | CB | ASP | 65 | 37.977 | 10.159 | 30.054 |
| 462 | CG | ASP | SS | 39.040 | 9.12Ś | 29,781 |
| 463 | OD1 | ASP | 69 | 38.698 | 8.078 | 39.198 |
| 464 | OD2 | ASP | 65 | 40.219 | 9.329 | 30.170 |
| 465 | c | ASP | 69 | 36.454 | 8.573 | 31.368 |
| 485 | 0 | ASP | £9 | 36,767 | 7.669 | .32.159 |
| 487 | M | ILI | 70 | 35,483 | 8.4S3 | 30.475 |
| 456 | CA | ILE | 70 | 34.501 | 7.446 | 30.478 |
| 489 | CB | ILE | 70 | 33,3.59 | 7.997 | 31.091 |
| 490 | CG1 | ILE | 70 | 33.227 | 8.010 | 33.62'? |
| 4 91 | CDI | ILE | 70 | 32.414 | 9.201 | 3 3,2 94 |
| 492 | CG2 | ILE | 7 0 | 31.93S | 7.258 | 30.622 |
| 493 | C | ILE | 70 | 34.343 | 7.172 | 29.994 |
| 494 | O | ILE | 70 | 34,231 | 8.131 | 28.195 |
| 4 95 | ΪΙ | VAL | 71 | 34.313 | 5 -BS3 | 2B.606 |
| 4 96 | CA | VAL | 71 | 33.533 | 5.540 | 27.240 |
| 4 97 | CB | UAL | 71 | 35.074 | 4.803 | 26.490 |
| 4 90 | CG1 | VAL | 71 | 34.773 | 4,784 | 24.999 |
| 4 99 | CG2 | UAL | 71 | 35 .483 | 5.441 | 26.793 |
| 500 | C | UAL | 71 | 32.664 | 4,683 | 27.328 |
| 501 | O | UAL | 71 | 32 -669 | 3,655 | 27.994 |
| 502 | M | GL.U | 72 | 31 .582 | 5.090 | 26.697 |
| 503 | CA | □LU | 72 | 30.375 | 4-347 | 26.718 |
| 504 | CB | □LU | 72 | 29.1S4 | 5,254 | 25.567 |
| 505 | CG | □LU | 72 | 28.978 | 6.34? | 27.647 |
| 506 | CD | GLU | 72 | 27.551 | 6.93 5 | 27.588 |
| 507 | OBI | GLU | 72 | 25.97S | 7.300 | 28.663 |
| 5oa | OE2. | OLU | 72 | 26.935 | 7.001 | 26.457 |
| 509 | C | GLU | 72 | 30.339 | 3.418 | 25-553 |
| 510 | O | GLU | 72 | 30.716 | 3.78 6 | 24 .444 |
| 511 | N | TYR | 73 | 29.049 | 2.207 | 25.765 |
| 512 | CA | TYR | 7 3 | 29.710 | 1.275 | 24.642 |
| 513 | CB | TYR | 73 | 22-268 | 0,121 | 25.114 |
| 514 | CG | TYR | 73 | 29-193 | -1.073 | 23.965 |
| 515 | CDI | TYR | 73 | 27,843 | -1,406 | 23-406 |
| 516 | CE1 | TYR | 73 | 27,703 | -2.299 | 22.432 |
| 517 | cz | TYR | 73 | 28.857 | -2.822 | 21.823 |
| 518 | GB | TYR | 73 | 2B.744 | -2.713 | 20.801 |
| 519 | CE 2 | TYR | 73 | 30.124 | -2-4G9 | 22.256 |
| 52 0 | CD 2 | TYR | 73 | 30.239 | 1.632 | 23.223 |
| 521 | C | TYR | 73 | 2B.70I | 1.078 | 23-626 |
| 522 | O | TYR | 73 | 27.672 | 2.403 | 24-062 |
| 523 | N | PRO | 74 | 29.00S | 1.848 | 22.293 |
| 524 | CA | PRO | 74 | 28.065 | 2.432 | 21,231 |
| 525 | CB | PRO | 74 | 20-784 | 2.296 | 19.990 |
| 526 | CG | PRO | 74 | 30.211 | 2.102 | 20.316 |
| 527 | CD | PRO | 74 | 30.190 | 1.396 | 21.579 |
| 520 | C | PRO | 74 | 26.706 | 1. CSC | 21.329 |
| 523 | O | PRO | 74 | 25.666 | 2.137 | 21.512 |
| 510 | ft | GLY | 75 | 26.639 | 0-372 | 21,059 |
| 531 | CA | GLY | 75 | 25.342 | -0.2B7 | 21-210 |
| 532 | C | GLY | 75 | 24.458 | -a. 067 | 22.453 |
| '333 | O | GLY | 75 | 24.559 | 0.92 5 | 23.Ł&1 |
| S34 | N | LYS | 76 | 23 .562 | -1.024 | 22.690 |
| 535 | CA | LYS | 76 | 22.550 | -o.saj | 23.715 |
| 536 | CB | LYS | 76 | 21.310 | -1.461 | 23.200 |
| $37 | CG | LYS | 76 | 21.042 | -2.985 | 23 .300 |
| 538 | CD | LYS | 76 | 19.565 | -3.309 | 23.070 |
| 539 | C | LYS | 76 | 22.910 | 1.466 | 25.124 |
| 540 | a | LYS | 76 | 22.217 | -1.208 | 26.105 |
| S4ł | N | GLU | 77 | 24.026 | -2.196 | 25.194 |
| 542 | CA | GLU | 77 | 24.436 | -2.965 | 26 .365 |
| 543 | CH | GLU | 77 | 25.610 | -3.859 | 26 .022 |
| 54 4 | CG | GLU | 77 | 25-3S8 | 5.094 | 25 .112 |
| 545 | CD | GLU | 77 | 24-956 | 4.773 | 23.672 |
| 54 6 | OE1 | GLU | 77 | 24.997 | -3,610 | 23.302 |
| 547 | GE 2 | glu | 77 | 24.515 | -5,692 | 22,093 |
| 540 | C | GLU | 77 | 34-876 | -1.S51 | 27.394 |
| 549 | O | GLU | 77 | 35.648 | -1.039 | 27.071 |
| 5S0 | X | ASP | 78 | 24.364 | -2.0S6 | 28.627 |
| 551 | Πια | ASP | 78 | 24.599 | -1.099 | 29.691 |
| 552 | CB | ASP | 78 | 23.526 | -1,2S6 | 30.789 |
| 553 | CS | ASP | 78 | 23 .486 | -0-167 | 31-780 |
| 554 | GDI | ASP | 78 | 24.240 | 0.835 | 51-570 |
| 555 | 0D2 | ASP | 7S | 22.621 | -0.261 | 32.599 |
| 55S | C | ASP | 70 | 26.038 | -1.333 | 30.19S |
| 557 | O | ASP | 78 | 26,244 | -1.854 | 31.273 |
| 558 | N | LSU | 79 | 27.020 | -0.910 | 29.386 |
| $59 | CA | LEU | ?9 | 28.450 | -1.090 | 29.679 |
| 560 | CS | LEU | 79 | 2&.9S7 | -2.304 | 28.903 |
| 5S1 | CG | LEU | 79 | 30.4SS | 2 .372 | 28.706 |
| 562 | CDI | LEU | 79 | 30.985 | -2.ea& | 29.950 |
| £63 | CD2 | LEU | 79 | 30.847 | -3 ,372 | 27.62$ |
| 564 | C | LSU | 75 | 29-275 | O. IBS | 29.43.7 |
| 565 | O | LSU | 79 | 29.176 | 0.759 | 29 .340 |
| 556 | N | ALA | 80 | 30.073 | 0.633 | 30.405 |
| 567 | CA | AIA | 80 | .30,920 | 1.860 | 30.503 |
| 566 | ca | ALA | 00 | 30,395 | 3.032 | 21.170 |
| 569 | c | ALA | BO | 32-278 | 1.423 | 30.S32 |
| S70 | O | ALA | 80 | 32.316 | 0.575 | 31,746 |
| 571 | N | ILE | SI | 33.339 | 1.594 | 30.268 |
| 572 | CA | ILE | 81 | 34.642 | 1.916 | 30.016 |
| 573 | CB | ILE | Bi | 35.BJ.4 | 1.155 | 29.836 |
| 574 | CG1 | ILE | 81 | 36.762 | 2. L87 | 29.333 |
| 575 | CDI | ILB | ei | 37,645 | 2.333 | 30.279 |
| 576 | CG2 | ILE | BI | 35.372 | 0 -123 | 23,749 |
| 577 | C | ILS | 81 | 34.997 | 3.153 | 31433 |
| 578 | O | ILS | 81 | 34,705 | 4.219 | 30.926 |
| 579 | N | UAL | 82 | 35-591 | 3 -095 | 32,606 |
| 580 | CA | UAL | 82 | 35.361 | 4.309 | 33.35B |
| 561 | CB | UAL | 82 | 33.374 | 4 .351 | 34,770 |
| 562 | ecu | VAL | 83 | 3S.706 | 5 .573 | 35-511 |
| 583 | CG 2 | VAL | 82 | 33 .767 | 4.300 | 34-645 |
| 584 | C | UAL | 82 | 37.477 | 4.314 | 33.596 |
| 585 | O | UAL | 82 | 38.056 | 3.32S | 34.0S0 |
| 506 | a | HIS | 83 | 38.115 | &.403 | 33.195 |
| 587 | CA. | KIR | 83 | 39.4S7 | £.695 | 33.626 |
| 5B8 | CB | HIS | B3 | 40 .235 | 6.241 | 32.453 |
| 509 | CG | KIS | 83 | 40 .351 | 5.349 | 31.264 |
| 530 | NC1 | HI.S | 83 | 39.673 | 5.716 | 30,06$ |
| 591 | CE1 | KIS | S3 | 39.B45 | 4.75 7 | 29.179 |
| 592 | WE2 | HIS | 83 | 40.529 : 3.7S8 | 29.759 | |
| 533 | CE2 | HIS | 83 | 40 .801 1 4.132 | 31.062 |
PL 221 052 B1
| 594 | C | HIS | 33 | 33-608 | 6.622 | 34.822 |
| 595 | 0 | HIS | 83 | 38 .928 | 7.628 | 34.89? |
| . 556 | K | VAŁ | B4 | 40-502 | 5.235 | 35.729 |
| 59? | CA | VAL | 84 | 40.309 | 6.976 | 36.923 |
| 598 | CK | VAIz | 84 | 40.343 | 6-023 | 3B.238 |
| 599 | Cdi | VAL | 84 | 39-517 | 5.563 | 3B.613 |
| GtJO | CG 2 | VAŁ | 84 | 41.529 | 4.764 | 30.180 |
| 601 | C | VAŁ | 84 | 42.242 | 7.721 | 36.727 |
| 602 | c | VAL | 34 | 43.073 | 7.289 | 35.934 |
| 603 | K | HIS | 65 | 42.419 | 8.879 | 17.384 |
| 604 | CA | HIS | B5 | 43.753 | 9,457 | 37.64$ |
| 605 | CB | HIS | 65 | 43.659 | 10.365 | 38-241 |
| 606 | CG | HIS | 65 | 43.005 | 11.870 | 37,333. |
| 50? | ND1 | HIS | Θ5 | 43.694 | 12.535 | 36.333 |
| 608 | CE1 | HIS | B5 | 42.868 | 13 .353 | 35.689 |
| S09 | ME 2 | HIS | 8S | 41.672 | 13.264 | 36.251 |
| 510 | CD2 | HIS | 85 | 41.728 | 32.334 | 37.275 |
| 611 | C | HIS | 85 | 44-429 | 8.53G | 33.639 |
| 512 | O | HIS | 55 | 43.520 | 8-261 | 39,754 |
| G13 | M | OLU | 86 | 45.573 | B-040 | 38.22? |
| 614 | CA | GUI | 96 | 46.200 | €983 | 38.942 |
| 615 | CB | 3IU | 86 | 47.465 | 6.563 | 33.101 |
| £16 | CG | 01 LF | 36 | 48 .429 | 5.641 | 38.765 |
| 61? | cc | OLU | 36 | 49.470 | S.1.49 | 17.795 |
| 616 | OBI | CŁU | 36 | 50.013 | 4.037 | 37.990 |
| 619 | OE2 | GLU | 36 | 49.717 | 5.675 | 16,624 |
| €20 | c | GLU | 36 | 46 .758 | 7-25« | 40,361 |
| €21 | 0 | GŁU | 36 | 46.924 | 6,303 | 41.145 |
| 622 | H | TOR | 37 | 47,018 | 8.529 | 40-691 |
| 623 | CA | TOR | 87 | 47,437 | 8.905 | 42.049 |
| 624 | CB | TOR | 37 | 48 ,321 | 10,157 | 42.059 |
| 625 | OGJ. | THH | 8? | 49-607 | 9.861 | 41-522 |
| 626 | CG2 | THR | 87 | 48.495 | 10-713 | 43,496 |
| 627 | C | twr | 8? | 46.LSB | 9.282 | 42,726 |
| 62& | 0 | THR | 87 | 45.450 | 10.078 | 42.241 |
| 629 | N | SER | 83 | 45.928 | 8.695 | 43.859 |
| 630 | CA | SER | BS | 44.70? | $.025 | 44.563 |
| 633 | ca | SER | 83 | 44,435 | 7.932 | 45.615 |
| 632 | OG | SER | 8B | 44.897 | 3.319 | 46.390 |
| 533 | C | SER | 88 | 44 .776 | 10.911 | 45.259 |
| 634 | O | ŚKR | 88 | 45.683 | 11.196 | 45-049 |
| 535 | w | THR | 83 | 43.773 | 10.673 | 46.066 |
| 6.3S | CA | TOR | 39 | 43.617 | 11.353 | 45.897 |
| 63? | CB | THR | 39 | 42.175 | 11.771 | 47.489 |
| S3P | 0(51 | THR | 89 | 41.234 | 11.90? | 46.41$ |
| 53$ | CG2 | THR | B9 | 41.931 | 12-830 | 45 .544 |
| 640 | C | THR. | 89 | 44.691 | 11.790 | 48.014 |
| «41 | G | THR | 39 | 45.416 | 12.743 | 48.241 |
| 542 | H | GL 17 | 90 | 44.774 | 10.629 | 43.664 |
| 643 | CA | GLU | 30 | 45-G02 | 10.302 | 49.75$ |
| «44 | CB | GLU | 90 | 45-384 | S.873 | 50.270 |
| «45 | CG | GL U | 90 | 43.960 | B -624 | 50.666 |
| 645 | CD | GLu | 90 | 42.864 | 8.376 | 49.004 |
| $4? | 0£l | GLU | 90 | 43.171 | 7.909 | 48.687 |
| ¢46 | 0E2 | GL7 | 90 | 41 .68? | 8 .666 | 50-098 |
| 649 | C | GLU | 90 | 47,163 | 10.338 | 4S-380 |
| 650 | 0 | GLJ | 90 | 4ft . 029 | 10.30? | 50.263 |
| 651 | M | GLY | 91 | 47-460 | 10-322 | 48,084 |
| 652 | CA | GLY | 91. | 48.846 | 10-275 | 47.627 |
| 653 | C | GLY | 91 | 49,105 | 8-995 | 46.668 |
| 654 | O | GbY | 91 | 50.093 | 8.910 | 46.150 |
| 655 | tł | LEU | 92 | 48 .185 | 8.028 | 47.009 |
| 656 | CA | LEU | 92 | 48.326 | 6.597 | 46.626 |
| 657 | CB | ŁEU | 93 | 47.231 | 5-814 | 47.328 |
| 653 | CG | ŁEU | 92 | 47 .440 | 5-247 | 48.715 |
| 659 | CDI | ŁEU | 92 | 48.636 | 5.37S | 49.434 |
| 660 | CD2 | ŁEU | 32 | 46.120 | 5-333 | 49.530 |
| 661 | C | LEC | 92 | 4S .259 | 6.245 | 45.124 |
| 662 | O | LJ£U | 92 | 47.648 | 6.971 | 44.313 |
| 663 | N | Α3» | 93 | 49.872 | 5-111 | 44.764 |
| €64 | CA | ASN | 93 | 43.923 | 4-694 | 43.35B |
| 665 | CB | Α3» | 93 | 50-340 | 4.24« | 42,350 |
| bib | CG | ASM | 93 | 50.415 | 3.740 | 41.503 |
| 6G7 | 0D1 | A3N | 93 | 50.262 | 2.556 | 41,229 |
| 665 | KD3 | ASM | 93 | 50.647 | 4.647 | 40.584 |
| 669 | C | ASM | 93 | 47,864 | 3.620 | 43.046 |
| 670 | O | ASM | 93 | 47-676 | 2.513 | 43.641 |
| 671 | K | PHE | 94 | 46.948 | 3.955 | 42.331 |
| 672 | CA | PHD | 94 | 45.891 | 3.031 | 41,780 |
| 6?3 | CS | PHE | 94 | 45.224 | 3 .423 | 40.485 |
| 674 | CG | PHD | 94 | 44.040 | 2 .550 | 40.118 |
| 675 | CDI | PHE | 94 | 44.066 | ł .763 | 30.953 |
| 676 | CBS | PH8 | 94 | 42-978 | 0.955 | 30.592 |
| 677 | cz | PHE | 94 | 41.807 | 0,927 | 39.419 |
| 673 | CS2 1 PHE | 34 | 41.770 | 1,700 | 40.626 | |
| 679 | CD2 l £H£ | 34 | 42.878 | 2 -510 | 40.950 | |
| 690 | C ! PHE | 94 | 46-424 | 1,601 | 41-677 | |
| 681 | O | PHE | 94 | 45.932 | 0.679 | 42.363 |
| 632 | M | ASM | Ϊ5 | 47.463 | 1 .429 | 40-845 |
| 683 | CA | ASM | 95 | 47.847 | 0.063 | 40.360 |
| 684 | CB | ASM | 95 | 48.592 | 0.142 | 39.047 |
| 585 | 03 | ASM | 95 | 47.710 | C .662 | 37.982 |
| 686 | GDI | ASM | 95 | 47.74? | 1-842 | 37.54$ |
| SB7 | WD2 | ASM | 95 | 46.832 | -0.183 | 37.501 |
| G&0 | C | ASM | 95 | 43 .448 | -0,922 | 42.346 |
| 539 | 0 | ASM | 95 | 48 .420 | -2.146 | 41.120 |
| 690 | N | LYS | $6 | 43.922 | •0.363 | 42.450 |
| 691 | CA | LYS | 9E | 49,513 | -1.103 | 43.476 |
| 692 | CB | LYS | 96 | 50.350 | - 0.300 | 43.931 |
| 693 | CG | LYS | $6 | 51.836 | 0 . C5S | 42.831 |
| 594 | CD | LYS | 96 | 53.182 | 0.575 | 43.464 |
| 695 | CE | LYS | 96 | 54.482 | 0.316 | 42.584 |
| 6 96 | !J2 | LYS | 96 | 54.726 | -1.181 | 42 .449 |
| 69? | c | LYS | 96 | 48.605 | Ί.360 | 44 .604 |
| 698 | O | LYS | $6 | 48-833 | -2.047 | 45.625 |
| 69$ | M | ASM | 97 | 47.375 | -0.916 | 44.359 |
| 700 | CA | ASM | 97 | 46.315 | 1.140 | 45.347 |
| 701 | ca | ASM | $7 | 45.054 | 0.184 | 45.938 |
| 702 | CG | ASM | $7 | 46.901 | 0.804 | 46.KS0 |
| 703 | om | ASN | 9? | 46.994 | 0 .440 | 48,020 |
| 704 | MD2 | ASM | 97 | 47.S63 | 1.760 | 4S.341 |
| 705 | C | ASM | $7 | 45-115 | -1-96$ | 44-925 |
| 706 | O | ASM | $7 | 44.234 | -2.243 | 45.763 |
| 70? | ti | YAL | 98 | 45.107 | -2 .433 | 43.681 |
| 708 | CA | VAL | 98 | 44.006 | -3,202 | 41.115 |
| 709 | CB | VAL | 98 | 43.073 | -2.331 | 42.149 |
| 710 | CG1 | VAL | 98 | 42.435 | -1.171 | 42.902 |
| 711 | CG2 | VAL | 98 | 43.502 | -i.as? | 40.901 |
| 7.1.2 | C | VAL | 93 | 44.576 | -4.392 | 42.36$ |
| 713 | O | VAL | $a | 45.723 | •4.35? | 42.022 |
| 714 | M | SER | 99 | 43-500 | 5-446 | 42.131 |
| ?15 | CA | SER | y$ | 44,179 | -6 -423 | 41.09S |
| ?26 | CB | SER | s$ | 44,210 | -?.845 | 41.62$ |
| 71? | OG | SER | $9 | 43.025 | - a.is o | 42.262 |
| ?1B | C | SER | $9 | 43,31? | • 5.316 | 3$.«25 |
| 71$ | 0 | SER | 99 | 42.252 | -5.696 | 33.830 |
| ?20 | H | tyr | 100 | 43.832 | 6.667 | 38.734 |
| 721 | CA | TYK | loo | 43.132 | -6.891 | 37.476 |
| 722 | CB | TYR | 100 | 44.115 | -6.777 | 36-360 |
| 723 | CG | TYR | 100 | 44.962 | 36.474 | |
| 724 | CDI | TYR | 100 | 46.194 | -5.526 | 35.636 |
| 725 | CE1 | TYR | 100 | 47.011 | -4.422 | 35.940 |
| 726 | ca | TYR | l«0 | 46 .602 | -3,312 | 36-669 |
| 727 | OH | TYR | 100 | 47 .448 | 2,21$ | 36,715 |
| 720 | CR2 | TYR | 100 | 45 .371 | -3-319 | 37-341 |
| 72$ | CD2 | TYR | 100 | 44.566 | -4.463 | 37-240 |
| 730 | c | TYR | 100 | 42.42® | -6.196 | 37.320 |
| 731 | o | TYR | 1(10 | 4.3.027 | -9.24? | 37.471 |
| 7 52 | h | THR | 101 | 41.147 | -8.14$ | 37.000 |
| 733 | CA | THR | ΪΟ1 | 40.382 | -9-372 | 36.934 |
| 734 | CB | THR | 101 | 35.899 | -9,135 | 37.353 |
| 73S | OG1 | THR. | 101 | 18.564 | •10.050 | 33 402 |
| 73« | CG2 | THR | 101 | 37,957 | $.345 | 36.168 |
| 737 | C | THR | 101 | 40.495 | -9.975 | 35.53« |
| 73S | O | TOR | 101 | 40.557 | -9.22? | 34.568 |
| 73$ | « | LYS | 102 | 40,517 | -11.314 | 35.442 |
| 740 | CA | ŁYS | 102 | 40.727 | • 12,020 | 34.163 |
| 741 | CB | ŁYS | 102 | 41.665 | -13.256 | 34.401 |
| 742 | C | ŁYS | 102 | 39.351 | -3.2.436 | 33 -624 |
| 743 | 0 | ŁYS | 102 | 38,466 | -12.799 | 34.396 |
| 744 | N | PHS | 10Λ | 33-185 | -12.411 | 32.307 |
| 745 | CA | PHE | 103 | 37-934 | -12.906 | 31.659 |
| 796 | CB | PHE | 103 | 37.772 | -12.403 | 30.209 |
| 74? | CG | PHE | 103 | 37.591 | -10.895 | 30.DSB |
| 748 | CDI | PHE | 103 | 38.33? | -10-15$ | 29,19? |
| 749 | CE1 | PHE | 3 03 | 38.186 | -0.741 | 29-096 |
| 750 | CZ | PHE | 103 | 37.293 | •8.08« | 29.839 |
| 751 | CES | PHE | 303 | 36.554 | -6.813 | 30.736 |
| 752 | CD2 | PHE | 103 | 36.702 | -10-209 | 30.«33 |
| 7S3 | C | PHK | 103 | 37.720 | -14-418 | 31.65? |
| 754 | O | PHE | 103 | 38.64? | -15x240 | 31.399 |
| 755 | M | AŁA | 3C4 | 36.460 | -14-777 | 31-919 |
| 75S | CA | ALA. | 104 | 35.318 | -16,081 | 31.575 |
| 757 | CB | ALA | 104 | 34 -Ξ15 | -16,148 | 32.01$ |
| 756 | C | ALA | 104 | 36.013 | -lfi.399 | 30.073 |
| 75$ | O | ALA | 104 | 3S.S57 | -15.515 | 29.224 |
| 760 | N | ASP | 105 | 36162 | -17.673 | 29.758 |
| 761 | CA | ASP | 105 | 36-12? | -18.166 | 28.395 |
| 762 | ca | ASP | 105 | 36 .69? | -19.589 | 28 -416 |
| 763 | CG | ASP | 10$ | 37.190 | -20.0S6 | 27.062 |
| 764 | GDI | ASP | 105 | 38.27$ | -20.66$ | 37-064 |
| 765 | OD2 | ASP | 105 | 36.503 | -19.855 | 26.016 |
| 766 | C | ASP | 105 | 34-646 | -16.174 | 27.945 |
| 767 | O | ASP | 105 | 34.317 | -18.017 | 26.730 |
| 763 | M | GLY | 106 | 33.774 | -18.34$ | 28,$28 |
| 7S9 | CA | GLY | 106 | 32.338 | -18.195 | 28-8U |
| 770 | C | GLY | 106 | 31.720 | -18.785 | 30-091 |
| 771 | O | GLY | 106 | 32 .407 | -19.105 | 31-073. |
| 772 | N | ALA | 107 | 30.400 | 18,975 | 30.037 |
| 773 | CA | ALA | 107 | 29.655 | -19.623 | 31,094 |
| 774 | CB | ALA | 107 | 29 .278 | -18-596 | 32,218 |
| 775 | C | ALA | 107 | 28.435 | -20,230 | 30,413 |
| 7?6 | 0 | ALA | 107 | 2B .150 | -19.963 | 29.231 |
| 777 | M | LYS | 10S | 27.792 | -21,199 | 31.161 |
| 778 | CA | LrS | 108 | 26 .714 | -22.093 | 30.726 |
| 77$ | CB | 1YS | 10S | 27.1S8 | -23.581 | 30.87$ |
| ?8B | CG | LYS | 108 | 27.86$ | -24 .193 | 2$.6$3 |
| 781 | C | LYS | 108 | 25,500 | -21-B94 | 31.655 |
| 7S2 | O | LYS | 108 | 25.636 | -21.77? | 32.926 |
| 783 | M | VAL | 109 | 24.306 | 21.910 | 31.071 |
| 7B4 | CA | VAL | 10$ | 23-132 | -21-991 | 31.927 |
| 765 | CB | VAL | 109 | 21,796 | -22.289 | 31.161 |
| 736 | CG1 | VAL | 109 | 20,619 | -22.333 | 32.143 |
| 787 | CG2 | VAŁ | 103 | 21-512 | -21.212 | 30.041 |
| ?S8 | C | VAL | 10$ | 23.432 | -23.059 | 32.97? |
| 789 | O | VAL | 109 | 24,101 | -24.046 | 32 .G95 |
| 790 | H | ŁYS | 310 | 22.951 | -22.320 | 34 .190 |
| 791 | CA | ŁYS | 110 | 23.200 | -23.651 | 35.34$ |
PL 221 052 B1
| 792 | CB | LYS | 110 | 22.892 | -25.113 | 33.004 |
| 793 | CG | LYS | 110 | 21.372 | -35.443 | 35.158 |
| 794 | CD | LYS | 110 | 20.970 | -26.363 | 34.020 |
| 795 | C | LYS | 110 | 24.S25 | -23,497 | 36.130 |
| 7S6 | 0 | LYS | 3.10 | 24.644 | >24.115 | 37-21S |
| 79? | N | ASP | 111 | 25 -513 | -22.723 | 35.650 |
| 79$ | CA | ASP | lii | 26.794 | -22.560 | 36.398 |
| 799 | CB | ASP | Ϊ1Ϊ | 27 .849 | -21.811 | 25.597 |
| 800 | CG | ASP | Ili | 20 .459 | -22.670 | 34 .500 |
| 801 | O£>1 | ASP...........' | lii | 28 .254 | -23.390 | 34.516 |
| S02 | ÓC-l | ASP | 111 | 29.105 | -22,119 | 33 .592 |
| 803 | C | ASP | iii | 26.562 | -21-804 | 37-695 |
| 804 | 0 | ASP | 111 | 25.670 | -20.956 | 27.734 |
| 805 | M | ARG | 112 | 27.330 | -22.llę | 38.745 |
| 806 | CA | ARG | 112 | 27.300 | -21.263 | 39.980 |
| 807 | CB | ARG | 112 | 27.674 | -22.029 | 41.242 |
| 806 | CG | ARG | 112 | 26.926 | -23,375 | 41.424 |
| 809 | CD | ARG | 112 | 25.717 | -23,303 | 42.381 |
| 3X0 | NE | ARG | 112 | 25.956 | -22.414 | 43.543 |
| Sil | CS | ARG | 112 | 24.9Θ3 | -21-752 | 44.153 |
| 812 | NH1 | ARG | 112 | 23 .733 | -21.832 | 43 .693 |
| 813 | NH2 | ARG | 112 | 25.233 | -20.965 | 45.182 |
| 814 | C | ARG | 112 | 28 .233 | -20.017 | 39.861 |
| 815 | 0 | ARG | 312 | 29.373 | -20.090 | 39.353 |
| SIS | N | ile | 113 | 27 .737 | -18,891 | 40.306 |
| 81? | CA | ILE | 113 | 28.379 | -17.629 | 4B.023 |
| 818 | CB | ILE | 113 | 27 -613 | • 16.799 | 38.897 |
| 819 | cci | IŁE | 113 | 26 .078 | -16.626 | 39.131 |
| 820 | CDI | ILE | 113 | 25.639 | -15.500 | 29.891 |
| 821 | CG2 | ILE | 113 | 27 .774 | -17.510 | 3? .565 |
| 822 | C | ILE | 113 | 2S.326 | -16.885 | 41.316 |
| 821 | 0 | ILE | 113 | 27.466 | -17.164 | 42.147 |
| 824 | N | SER | 114 | 29.236 | -15,932 | 41.515 |
| 825 | CA | SER | 114 | 20,995 | -15,022 | 42.604 |
| 826 | CB | SER | 114 | 29.907 | -15.298 | 43.818 |
| 627 | ΟΓΪ | SER | 114 | 31 .203 | -16.194 | 43.507 |
| 828 | C | SER | 114 | 29.030 | -13.616 | 42.137 |
| 829 | 0 | SER | 114 | 29.645 | -13.303 | 41.162 |
| 830 | N | VAL | 115 | 20,309 | -12,706 | 42.054 |
| 631 | CA | VAL | 115 | 28.155 | -11-359 | 42.683 |
| 832 | CB | VAL | 115 | 26.693 | -11,020 | 42-414 |
| 833 | CGl | VAL | 115 | 26 .451 | -9.535 | 42.209 |
| 834 | CG2 | VAL | 115 | 26 .151 | -11.860 | 41.242 |
| 835 | C | TAL | 115 | 28 .002 | -10.619 | 43.795 |
| 836 | 0 | VAL | 115 | 28.554 | -10.959 | 44.934 |
| 837 | M | ILE | lló | 29.640 | -9.631 | 43.544 |
| 836 | CA | ILE | 116 | 30-319 | -$-937 | 44-617 |
| 839 | CB | ILE | 116 | 31-806 | -9-321 | 44-635 |
| 840 | CCI | ILE | 116 | 32.083 | -10.846 | 44,732 |
| 641 | CDi | ILR | 116 | 33.511 | -11.252 | 44.472 |
| 842 | CG2 | ILE | 11 o | 32.722 | -0.496 | 45.674 |
| 641 | C | ILE | 116 | 30.068 | -7.446 | 44.384 |
| 844 | £> | ILE | 116 | 30.241 | -6.921 | 43.273 |
| 645 | N | GLY | 117 | 29-669 | -6.735 | 45.420 |
| 846 | CA | GLY | 117 | 29-571 | -5-336 | 45-240 |
| 847 | C | GLY | 1.17 | 29.039 | -4.669 | 46.457 |
| 845 | 0 | GLY | 31? | 29-266 | -5.129 | 47.602 |
| 849 | N | TYR | lis | 20.213 | -3.584 | 46.220 |
| 85C | CA | TYR | lis | 28 .016 | -2.710 | 47.391 |
| 851 | CB | TYR | na | 28.797 | -1.374 | 47.254 |
| 85 2 | CG | TYR | na | 30.276 | 1.551 | 47.440 |
| 653 | CDI | TYR | lis | 31.109 | -1.798 | 46.365 |
| 854 | CEI | TYR | 110 | 32.546 | -5.947 | 46.540 |
| 855 | cz | TYR | lis | 33.070 | -1.059 | 47.816 |
| 806 | ON | TYR | 313 | 34.427 | -1.982 | 40.033 |
| 657 | CE2 | TYR | 118 | 32 .227 | -1.63S | 45.914 |
| 858 | CGl | TYR | lis | 30.839 | -1.493 | 45.710 |
| 859 | C | TYR | 110 | 26 .548 | -2.625 | 47 .730 |
| 850 | 0 | TYR | 11$ | 25.138 | -1.238 | 47 .665 |
| 861 | N | PRO | 119 | 25 .754 | 3.495 | 48 .045 |
| 352 | CA | PRO | 119 | 24.327 | 3.521 | 48 .296 |
| 863 | CS | PRO | 115 | 24 .176 | -4.724 | 49.152 |
| 664 | CG | PRO | 119 | 25.1X1 | -5.681 | 40.575 |
| 865 | CD | PRO | 319 | 25-291 | -4.860 | 40.104 |
| 856 | C | PRO | 119 | 23 .«ES | 2.26S | 4B .879 |
| 867 | 0 | PRO | 119 | 22 .761 | -1.697 | 48 .231 |
| 868 | N | LYS | 12C | 24.103 | -1.771 | 50.043 |
| 869 | CA | LYS | 120 | 23.645 | -0.380 | 50.327 |
| 870 | CB | LYS | 320 | 22.445 | -0.338 | SI,311 |
| 071 | CG | LYS | 120 | 21,054 | -0.912 | SG.775 |
| B72 | C | LYS | 120 | 24.809 | 0.675 | 50.510 |
| 673 | 0 | LYS | 120 | 25.763 | 0,624 | 49.757 |
| 874 | N | GLY | 121 | 24.780 | 1 647 | 51-410 |
| 875 | CA | GLY | 121 | 25.86S | 2.608 | SI .373 |
| 876 | c | GLY | 121 | 25.491 | 3.894 | 52.223 |
| 877 | 0 | GLY | 121 | 24.875 | 4.850 | 51.747 |
| 87ft | M | THR | 324 | 24.670 | 1-493 | 55.274 |
| S79 | CA | THR | 124 | 25.826 | 0.574 | 55 .609 |
| 630 | CB | THR | 124 | 25.S73 | -0.635 | 54.694 |
| $31 | OC1 | THR | 124 | 26 -902 | -0-53$ | 53-690 |
| 882 | CG 2 | TOR | 124 | 21 .490 | 0.922 | 54,042 |
| 8S3 | C | TOR | 124 | 27 .006 | 1,366 | 55 -357 |
| 834 | 0 | TOR | 124 | 27.340 | 2.323 | 54 .574 |
| 3S5 | M | LYS | 125 | 2& .232 | 1.106 | 55.925 |
| 836 | CA | LYS | 125 | 29.146 | 2.220 | 55.525 |
| SB7 | CB | LYS | ' 125 | 29.776 | 3,019 | 56.724 |
| 838 | c | LYS | 125 | 39-086 | 1.669 | 54.355 |
| 3S9 | 0 | LYS | 12S | 31-301 | 2,096 | 54.413 |
| 890 | N | TYR | 126 | 29-481 | 1.337 | 53.258 |
| 991 | CA | TYR | 126 | 30.170 | 0 .764 | 52.153 |
| 092 | CB | TYR | 126 | 31,058 | 1.766 | 51.399 |
| 093 | CG | TYR. | 12« | 30,241 | 2 .775 | 50-627 |
| 094 | CDI | TYR. | 126 | 29,655 | 2,445 | 49,405 |
| 095 | CEI | TYR | 12« | 20 .069 | 3.370 | 48,322 |
| B96 | CZ | TYR | 126 | 28.663 | 4.640 | 49.270 |
| 897 | CK | TYR | 12« | 27.884 | 5.590 | 4&.S36 |
| 898 | CR2 | TYR | 126 | 29.255 | 4.906 | 50,400 |
| 899 | CD2 | TYR | 126 | 30.014 | 4.055 | 51.156 |
| 900 | C | TYR | 12« | 30.861 | 0-545 | 52-308 |
| 901 | O | TYR | 126 | 32,055 | -0,744 | 52,314. |
| 902 | ti | LYS | 127 | 30 .064 | -1.461 | 53-001 |
| 903 | CA | LYS | 12? | 30-S23 | -2.760 | 53-29? |
| 904 | CK | LYS | 127 | 29.526 | -3.367 | 54.270 |
| 905 | CG | LYS | 12? | 29.451 | -2.693 | 55 .$53 |
| 906 | CD | LYS | 127 | 28 .813 | -3.674 | 56.665 |
| 907 | CR | LYS | 127 | 29.574 | -3.672 | 57.975 |
| 90 S | MS | LYS | 12? | 29,S7£ | 2,340 | 58.710 |
| 909 | C | LYS | 127 | 30,425 | -3.543 | 52.001 |
| 910 | O | LYS | 127 | 29-435 | 3-427 | 51-295 |
| 911 | N | MET | 128 | 31.441 | -4.350 | 51,708 |
| 912 | CA | PIET | 128 | 31.446 | -5.253 | 50.570 |
| 913 | CB | KET | 128 | 32.869 | -5.546 | 50.133 |
| 914 | CG | KET | 128 | 33.022 | 6.008 | 4$.709 |
| 915 | SD | MET | 120 | 34 ,750 | -6,208 | •46,212 |
| 916 | CE | KET | 128 | 34.489 | -7.911 | 47.985 |
| 917 | C | MET | 123 | 30.712 | •6.562 | 50.Θ78 |
| 910 | C | KET | 128 | 30.967 | -7.211 | 51.085 |
| 919 | KI | PHE | 129 | 29.786 | -6.943 | SO.Olft |
| 920 | CA | phs | 129 | 29.082 | -8.220 | 50.163 |
| 921 | CB | PHB | 129 | 27.609 | -7.999 | 50.380 |
| 922 | CG | PHE | 129 | 27.322 | -7.264 | 51,664 |
| 923 | CDI | PHE | 129 | 27.363 | -5.839 | 51.704 |
| 924 | CEI | me | 129 | 27,062 | -S.169 | 52,374 |
| 925 | CZ | PHE | 129 | 2« .768 | -5.852 | 54.029 |
| 926 | CK2 | PHE | 129 | 26.729 | -7.2SS | 53,995 |
| 927 | CD2 | PHE | 129 | 27.012 | -7.940 | 52.818 |
| 92$ | C | PHD | 129 | 29.291 | -9.13S | 49.021 |
| 929 | C | PHE | 129 | 29-671 | -S,750 | 47-955 |
| 930 | N | GLU | 130 | 29.042 | -10.385 | 49.260 |
| 931 | CA | GLD | 130 | 29.187 | -11,356 | 18,233 |
| S22 | CB | GLU | 130 | 30.437 | -12.190 | 48.479 |
| 933 | CG | GŁU | 130 | 20.591 | -13.200 | 47,422 |
| 934 | CD | GLU | 130 | 31.048 | -14.020 | 47.494. |
| 935 | CEI | GLU | 130 | 32.105 | -14,625 | 46,446 |
| 936 | CE2 | CŁU | 130 | 32.561 | -14,110 | 48.544 |
| 33? | C | GLD | 130 | 27.$8$ | -12.212 | 4$.233 |
| 93$ | 0 | GLy | 130 | 27.464 | -13-707 | 19-266 |
| 939 | N | SER | 131 | 27.250 | -12,341 | 47,075 |
| 940 | CA | SER | 131 | 2& .961 | 13.041 | 16.909 |
| 941 | CB | SER | 131 | 24.873 | -12.043 | 46.491 |
| 942 | CG | SER | 131 | 22.&9S | -12.634 | 46,503 |
| 943 | C | SER | 131 | 26.137 | -14.116 | 45.362 |
| 944 | O | SER | 131 | 2£ .74$ | -13.860 | 44,32« |
| 945 | N | THR | 132 | 25 .658 | • 15,329 | 16.154 |
| 946 | CA | THR | 132 | 25 . H42 | -16.477 | 45,247 |
| 947 | CB | THR | 132 | 26.539 | -17.673 | 45,&7? |
| 945 | CGl | TOR | 132 | 25.904 | -17.020 | 47,239 |
| 949 | CG2 | TOR | 132 | 28,080 | -17.415 | 46,225 |
| 950 | C | THR | 132 | 24.009 | -16.944 | 14.949 |
| 951 | c | THR | 132 | 23.405 | -16.S44 | 45.002 |
| 952 | N | GLY | 133 | 24 .630 | -17.701 | 43.463 |
| 953 | CA | GLY | 133 | 23.459 | -18.125 | 12,732 |
| 954 | C | GLY | 133 | 23.022 | -18.755 | 41-400 |
| 355 | 0 | GLY | 133 | 24,99$ | -19,093 | 41,154 |
| 956 | K | TOR | 134 | 22.832 | -IB,909 | 40-520 |
| 957 | CA | TOR | 134 | 23.000 | -19.754 | 39.325 |
| 95$ | CB | TOR | 134 | 22,04$ | 30.975 | 39-433 |
| 959 | OG1 | THR | 134 | 22.071 | 21,410 | 40,792 |
| 960 | CG2 | THR | 134 | 22.514 | 22,15 9 | 38,560 |
| 961 | C | THR | 134 | 22.661 | -18-961 | 38-121 |
| 962 | O | THR | 134 | 21.900 | -17-999 | 30-214 |
| 963 | K | ILE | 135 | 23.21$ | -19-324 | 36-9S9 |
| 964 | CA | ILE | 135 | 22 -812 | -1$ .701 | 35.711 |
| 965 | CB | ILE | 135 | 23.959 | -18.665 | 54.673 |
| 966 | CGl | ILE | 135 | 25 .237 | -17.902 | 35.296 |
| 967 | CDI | ILE | 135 | 26.360 | -17,634 | 34-271 |
| 960 | C02 | ILE | 135 | 23.573 | Ί7-983 | 33,393 |
| 969 | C | ILE | 135 | 21.619 | -19,483 | 35-157 |
| 970 | C | ILE | 135 | 21.785 | -20.641 | 34-7S3 |
| 371 | N | A SN | 136 | 2G.42& | - 18,861 | 35-179 |
| 972 | CA | ASM | 136 | 19.141 | -is,3$a | 34,652 |
| 973 | CB | ASM | 136 | 17 .955 | -18,664 | 35,327 |
| 974 | CG | ASM | 13« | IB.013 | -18,716 | 36-970 |
| 975 | GDI | ASM | 136 | 17.745 | -17.694 | 37-503 |
| 976 | eW2 | ASN | 136 | 18,359 | -19.898 | 37,404 |
| 3?7 | c | ASM | 136 | 18.911 | -19-220 | 33-140 |
| 970 | 0 | ASM | 136 | 18.105 | -15.947 | 32,577 |
| 979 | M | HIS | 137 | 19.545 | -18,246 | 32.478 |
| 9&0 | CA | HIS | 137 | 19.295 | -17.955 | 31,062 |
| S&l | CB | HIS | 13? | 17.95$ | 17.204 | 30 - 912 |
| 902 | CG | HIS | 137 | 17.561 | -16-953 | 29 -4B5 |
| 983 | MDI | HIS | 13? | 16 . 787 | -17.832 | 28.757 |
| 984 | CEI | HIS | 137 | 16.632 | -17.371 | 27.529 |
| 385 | NE2 | HIS | 137 | 17.254 | -16.209 | 27 ,433 |
| 986 | CD2 | HIS | 137 | 17,860 | -15.935 | 28,645 |
| 987 | C | HIS | 137 | 20.439 | -17.103 | 30-435 |
| 98$ | O | HIS | 13? | 20.870 | 16,073 | 31-070 |
| 989 | N | ILE | 138 | 20.919 | -17-510 | 29,237 |
PL 221 052 B1
| 990 j CA | ILE | 138 | 21,903 | -16.752 | 28.459 | |
| 991 J CB | ILE | 138 | 23-387 | -17.431 | 28.474 | |
| 992 j 031 | ILE | 138 | 24.016 | - 17.456 | 29.882 | |
| 993 j CDI | ILE | 138 | 25.026 | -18 561 | 30-086 | |
| 994 j CG2 | ILE | 138 | 24.398 | 16.764 | 27 .455 | |
| 999 j C | ILE | 118 | 21.463 | -16.553 | 26.398 | |
| 996 3 0 | ILE | 138 | 21,268 | -17.529 | 26.286 | |
| 997 3 H | SER | 139 | 21 -309 | -1S.32S | 26.524 | |
| 99 e | i CA | SER | 139 | 21.171 | -15.199 | 25.098 |
| 959 | CB | SER | 139 | 19.725 | -15-352 | 24,593 |
| loco | OG | SER | 139 | 18.982 | -14.149 | 24-723 |
| IOCI | c | SER | 139 | 21-760 | -13,949 -12.866 | 24.599 25.060 |
| 1002 | 0 | SER | 139 | 21.468 | ||
| 10C3 | K | GLY | 140 | 22.670 | -14-113 | 23.642 |
| 10(34 | CA | GLY | 140 | 23-507 | -13,020 | 23.142 |
| 1005 | c | GLY | 140 | 24 .426 | -12.464 | 24.205 |
| 100$ | 0 | GLY | 140 | 25.215 | 13.181 | 24.779 |
| 10 G 7 | K | TUR | 141 | 24.132 | -11.210 | 24.541 |
| 1003 | CA | THR | 141 | 24.tae | -30.275 | 25.309 |
| 1009 | ca | THE | 141 | 35.008 | -9.069 | 24.319 |
| 1010 | CGl | THR | 141 | 26.393 | -8-730 | 24.073 |
| 1011 | CG2 | THE | 141 | 24.163 | -·> .940 | 24.577 |
| 1012 | C | THR | 141 | 24.120 | -10.105 | 26.654 |
| 1013 | O | thb | 141 | 24.475 | -9.316 | 27.533 |
| 1014 | H | PHE | 142 | 23.C77 | -10.946 | 26.813 |
| inis | CA | PHE | 14 2 | 22.090 | -10.658 | 27.894 |
| 1016 | ca | PHE | 142 | 20.645 | -10.773 | 27.352 |
| 1017 | CG | PHE | 142 | 19.356 | lo.&ei | 29-431 |
| 1ΟΧΛ | CDI | PHE | 147. | 19.064 | -9.869 | 29.160 |
| 1019 | CE1 | PHE | 142 | 18.048 | -10.072 | 30.119 |
| 1020 | CS | PHE | 142 | 17.557 | -11.345 | 30.421 |
| 1021 | CE 2 | PHE | 142 | 19.043 | -12.465 | 29.696 |
| 1022 | CD 2 | PHE | 142 | 19-021 | -12.241 | 28.704 |
| 1020 | C | PHE | 142 | 22 .249 | -12.109 | 20.696 |
| 1024 | O | PHE | 142 | 22.384 | -13.196 | 28.145 |
| 1025 | sr | M3T | 14 3 | 22.272 | -11.531 | 30.016 |
| 1026 | CA | MET | 343 | 22.124 | -13.054 | 30.985 |
| 1027 | CE | MET | 143 | 23.485 | -13.517 | 31-559 |
| 1028 | CG | MET | 143 | 24.326 | -12.506 | 32,205 |
| 1029 | SC | MET | 143 | 25,733 | -13.242 | 33.087 |
| 1030 | CE | MET | 143 | 26.627 | -11.830 | 33.617 |
| 1031 | C | MET | 143 | 21.136 | -12.833 | 32.146 |
| 1032 | O | MET | 143 | 20.934 | -11.692 | 32.593 |
| 1031 | M | GLU | 144 | 20.542 | -13,335 | 32.646 |
| 1034 | CA | GUI | 144 | 19.773 | -13.862 | 33,899 |
| 1035 | CB | GLU | 144 | 18.293 | 14.160 | 33.648 |
| 1036 | CG | GLU | 144 | 17.370 | -13.881 | 34.837 |
| 1017 | CD | GLU | 144 | 15.991 | -14.360 | 34.535 |
| 1038 | OBI | GLU | 144 | 15,295 | 14,884 | 35.440 |
| 1039 | OE2 | GUI | 144 | 15-622 | -14.234 | 23.352 |
| 1040 | C | GLU | 144 | 20.267 | -14.877 | 34.981 |
| 1041 | O | OLU | 144 | 20.600 | -15.979 | 34.497 |
| 1042 | łi | PHE | 145 | 20.270 | -14.484 | 36.156 |
| 1043 | CA | PHE | 145 | 20.903 | ^-15.238 | 37.230 |
| 1044 | c:b | PHE | 145 | 32-421 | -14.953 | 37.329 |
| 1045 | CG | PHE | 145 | 22.775 | 13-502 | 37.509 |
| 1046 | CDI | PHE | 145 | 32.792 | 12.919 | 38,795 |
| 104? | CEL | PHE | 145 | 23.163 | -11.603 | 38,972 |
| 1043 | CS | PHE | 145 | 23.523 | -10.844 | 37.820 |
| 1049 | CE2 | PHE | 145 | 23.495 | -11.413 | 3S.R42 |
| 1050 | CO2 | PHE | 145 | 23.194 | -12.732 | 36.410 |
| 1051 | C | PHE | 145 | 20.217 | -14.370 | 38.497 |
| 1052 | c | PHE | Ϊ45 | 19.5SO | -13.793 | 38,553 |
| 1053 | N | ASP | 146 | 20.350 | -15.720 | 33.520 |
| 1054 | CA | ASP | 146 | 19,452 | -15.500 | 40.67Ϊ |
| ioss | CK | ASP | 146 | 16 467 | Ί6.655 | 40.799 |
| 1056 | CG | ASP | 146 | 19,155 | -17,677 | 41 119 |
| 1057 | □Dl | ASP | 146 | 20.194 | -17.712 | 41.723 |
| 1058 | OD2 | ASP | 146 | 16.713 | -18,975 | 40.742 |
| 1059 | C | ASP | 146 | 20.C37 | -15.167 | 42.073 |
| 1060 | □ | ASP | 146 | 19.347 | -15,301 | 43 .077 |
| 1061 | N | ALA | 147 | 21.267 | -14.699 | 42.126 |
| 1062 | CA | AIA | 147 | 21.759 | -14.186 | 43 .366 |
| 1063 | CB | ALA | 147 | 23.313 | -13.936 | 43.234 |
| 1064 | C | ALA | 147 | 21.002 | -12.933 | 43-947 |
| 1065 | O | ALA | 147 | 20-725 | -11,960 | 43.239 |
| 1066 | w | TYR | 14S | 20-645 | -12.350 | 45.228 |
| 1067 | CA | TYR | 148 | 20.133 | -11.758 | 46.904 |
| 1068 | CB | TYR | 148 | 20.33? | -11.962 | 47.406 |
| 1069 | CG | TYR | 148 | 19.463 | -11.01S | 48.236 |
| 1070 | CDI | TYR | 148 | 20.020 | 9.925 | 46.988 |
| 1071 | CB1 | TYR | 148 | 19.166 | -3-059 | 49,756 |
| 1072 | cz | TYR | 148 | 17.614 | -3.306 | 49.728 |
| 1073 | OH | TYR | 148 | 16-904 | -8.523 | 50.418 |
| 1074 | CE2 | TYR | 148 | 17.282 | -1C-347 | 48,965 |
| 1075 | CD2 | TYR | 148 | 18.090 | ‘11.270 | 4B.238 |
| 1076 | C | TYR | 148 | 20-904 | -10.471 | 45.465 |
| 1077 | 0 | TYR | 148 | 22.093 | -10.476 | 45-326 |
| loifl | K | ALA | 149 | 20.173 | -9.371 | 45.211 |
| 107 9 | CA | ALA | 149 | 20.784 | -&.057 | 44.949 |
| 1080 | CB | ALA | 149 | 21.220 | -7.891 | 43,519 |
| 1031 | C | AIA | 149 | 19-674 | -6.950 | 45.386 |
| 1082 | O | ALA | 149 | 18.701 | -7.132 | 45.504 |
| 1083 | N | GUT | 150 | 20.441 | -5.7B8 | 45.652 |
| 1084 | CA | GU4 | 150 | 19.714 | -4.627 | 46.108 |
| 1085 | CB | GUT | 150 | 19.938 | -4.515 | 47.507 |
| 1086 | CG | GLN | 150 | 19.068 | -5.391 | 48.385 |
| 1087 | en | GLH | 150 | 19.346 | -5.239 | 49.848 |
| loaa | OBI | GIJJ | 150 | 20-398 | -5.720 | 50.325 |
| 1039 | HE2 | GL ti | 150 | 19.414 | -4.564 | 50.693 |
| 1050 | C | GLH | 150 | 20.323 | -3.405 | 45.392 |
| 1091 | O | GLS | 150 | 21.373 | -3.549 | 44.847 |
| ' 1092 | K | PRO | 151 | 19.653 | 2.237 | 45.364 |
| 1093 | CA | PRO | 151 | 20.217 | -0.905 | 44.722 |
| 1094 | CB | PRO | 251 | 19.337 | 0.14 0 | 45.301 |
| : 1095 | CG | PRO | 251 | 13 .011 | -0.51« | 45.268 |
| 1096 | CD | PRO | 151 | 13.261 | -1.969 | 45.765 |
| 1097 | C | PRO | 151 | 21.752 | 0.663 | 44.665 |
| 1090 | O | PRO | 151 | 22 .217 | -0.106 | 43.629 |
| 1099 | W | GLY | 152 | 22.570 | -1.062 | 45 .632 |
| 1100 | CA | GLY | 152 | 24.031 | -0.9Q0 | 45.3.33 |
| 1101 | c | GLY | 152 | 24.723 | -1.793 | 44.292 |
| 1102 | 0 | GLY | 152 | 25.63B | -1.51.3 | 43.877 |
| 1103 | N | ASH | 153 | 24,034 | -2.79E | 43.7S6 |
| 1104 | CA | ASK | 153 | 24.654 | -3.841 | 42.934 |
| 1105 | CB | ASN | 153 | 23.936 | -5,175 | 43,275 |
| 1106 | CG | ASM | 153 | 24 .451 | -5.833 | 44.537 |
| 1105 | GDI | ASM | 153 | 25.640 | -6.320 | 44 .619 |
| 1103 | ND2 | ASK | 153 | 23 .610 | -6.009 | 45.534 |
| 1109 | C | ASM | 153 | 24.810 | -3.570 | 41.475 |
| 1110 | 0 | ASM | 153 | 25-488 | -4.234 | 40,724 |
| 1111 | N | SER | 154 | 24.158 | -2.501 | 41.029 |
| 1112 | CA | SER | 154 | 24.317 | -2.052 | 39.635 |
| 1113 | CB | SER | 154 | 23.790 | - 0.S23 | 39.556 |
| 1114 | OG | SER | 154 | 23.145 | -0.463 | 38-378 |
| 1115 | C | SER | 154 | 25.835 | -2.072 | 39 .339 |
| 1116 | 0 | SER | 154 | 36.619 | - 1.496 | 40.151 |
| 1117 | N | GLY | 15 5 | 26.217 | -2,74$ | 3S.235 |
| 1118 | CA | GLY | 155 | 27.586 | -2-913 | 37,793 |
| 1119 | c | GLY | 155 | 28 .483 | -3,794 | 38.523 |
| 1120 | 0 | GLY | 155 | 29.64,8 | - 3 · 883 | 38.205 |
| 1121 | H | SER | 1S6 | 27.347 | 4.496 | 39.53(5 |
| 1122 | CA | SER. | 136 | 28.592 | -5.533 | 40.261 |
| 1123 | CB | SER | 156 | 27.350 | -5.231 | 41.268 |
| 1124 | OG | SSR. | 156 | 27.491 | 5.417 | 42,371 |
| 1125 | C | S3R. | 156 | 29.203 | - 6 . &43 | 39.252 |
| 1126 | O | SER | 156 | 28 .473 | $.826 | 3fi.325 |
| 11?.? | H | PRO | 15? | 30-484 | -7.04? | 39.429 |
| 1128 | CA | PRO | 157 | 31.108 | -O-22& | 38.729 |
| 1129 | CB | PRO | 157 | 32,457 | 8,3 53 | 39.390 |
| 1130 | CG | PRO | 157 | 32 .341 | -7-612 | 40.676 |
| 1131 | CD | PRO | 157 | 31.419 | -6.4SS | 4O.38S |
| 1132 | C | PRO | 157 | 30.385 | -9.533 | 39.957 |
| 1133 | O | PRO | 157 | 29.899 | -9.773 | 40.037 |
| 1134 | ΪΓ | VAL | 156 | 30.333 | -1.0.38? | 37.954 |
| 1135 | CA | VAL | 158 | 29.63$ | -11.682 | 33,077 |
| 1136 | CB | VAL | 158 | 28.430 | -11-903 | 37.0S9 |
| 113 7 | cai | VAL | 158 | 37.923 | •13.307 | 37.217 |
| 1133 | CG2 | VAL | Χ5& | 27.357 | -10.885 | 37 297 |
| 113 9 | C | VAL | 15& | 30.907 | -12.642 | 37 .722 |
| 1140 | O | VAL | 158 | 31.369 | -12.640 | 36 .559 |
| 1141 | K | LEU | 159 | 31.12 9 | -13 .457 | 38.729 |
| 1142 | CA | LEU | 159 | 32.313 | -14-28S | 3E.694 |
| 13 43 | C3 | LEU | 159 | 33.163 | -13.95? | 39-905 |
| 1144 | CG | LEU | 139 | 33.683 | -12.548 | 40.104 |
| 1145 | CDI | LEU | 159 | 34.560 | •12.460 | 41.373 |
| 1146 | en 2 | LEU | 139 | 34.502 | -12 .162 | 38.921 |
| 1145 | C | LEU | 159 | 31-98 iJ | ••15.767 | 38.679 |
| 1148 | O | LEU | 159 | 31.149 | -16.213 | 32.484 |
| 1149 | N | ASH | 160 | 32.663 | -16.551 | 37,833 |
| 1150 | CA | ASM | 160 | 32.575 | -18.007 | 38-024 |
| 1151 | CB | ASH | 160 | 32.926 | - 18.777 | 36.742 |
| 1152 | CG | ASH | 160 | 34.380 | -18.634 | 36.313 |
| 1153 | OD1 | ASH | 160 | 34,722 | -18.797 | 35. U6 |
| 1154 | tiD2 | ASH | 160 | 35 277 | -18.320 | 37.286 |
| 1155 | C | ASH | 160 | 33.324 | -18.536 | 39.183 |
| 1156 | O | ASH | 160 | 33.899 | -17 .775 | 40.041 |
| 1157 | H | SER | 161 | 33.266 | -19.840 | 39.538 |
| 1158 | CA | SER | 161 | 34.041 | -20.931 | 40.504 |
| 1159 | CB | S8R | 161 | 33.61$ | -22.040 | 40.498 |
| 1160 | OG | SSR | 161 | 34.367 | -22.538 | 39,255 |
| 1161 | C | SER | 161 | 35.584 | •20.210 | 40.592 |
| 1162 | O | SER | 161 | 36.160 | -29.9S5 | 41=693 |
| 1163 | 34 | LYS | 162 | 36.211 | -20.178 | 39 381 |
| 11.64 | CA | LYS | 162 | 37.627 | -19.774 | 39.202 |
| 1165 | CB | LYS | 162 | 38.189 | -20,051 | 37,796 |
| 1166 | CG | LYS | 162 | 37.980 | -21-392 | 37.144 |
| L1S7 | CD | LYS | 162 | 33.917 | -21-460 | 35.920 |
| 11S8 | CE | LYS | 162 | 33.303 | -22.324 | 34,614 |
| 1169 | HZ | LYS | 262 | 37 .433 | 23.419 | 35-425 |
| ll?D | C | LYS | 162 | 37.906 | -18.286 | 39.362 |
| 1171 | O | LYS | 162 | 33-966 | -17.547 | 38.894 |
| 1172 | N | HIS | 163 | 35-979 | -17.511 | 39.958 |
| 1173 | CA | HIS | 16.3 | 37.040 | -16.044 | 39.996 |
| 1174 | CB | HIS | 163 | 37,999 | -15.583 | 41 .G93 |
| 1175 | CG | HIS | 163 | 37.741 | -16.257 | 42.412 |
| 1176 | MDI | HIS | 3 63 | 38 .734 | -16.8B3 | 43.141 |
| 1177 | CE1 | HIS | 163 | 36 .204 | -17-403 | 44.2.11 |
| 1173 | NS2 | HIS | 163 | 36.905 | -17.152 | 44.230 |
| 1179 | CD2 | HIS | 163 | 36 .539 | -15.43« | 43.102 |
| lisa | C | HIS | 163 | 37.335 | 15=311 | 33.702 |
| ll&l | O | HIS | 163 | 37.987 | -14.303 | 33.733 |
| I1&2 | H | GUI | Ł64 | 36.859 | -15.785 | 37 .553 |
| 1183 | CA | GUI | 164 | 36.954 | -14.963 | 36 .325 |
| .1184 | CB | GUI | 164 | 37-348 | -15,850 | 35=172 |
| 1185 | CG | GLU | 164 | 38.408 | -16.867 | 35 .S35 |
| 1186 | CD | GLU | 164 | 38-447 | • 13.008 | 34=42? |
| 1187 | OBI | GLU | 164 | 37.416 | -18.719 | 34.27B |
PL 221 052 B1
| 118© | CE2 | □LU | 164 | 39.499 | -10,169 | 33.863 |
| s i B 8 | C | OLU | 3S4 | 35-596 | -14,256 | 36.025 |
| 1190 | 0 | OLU | 164 | 34.570 | -14.773 | 3S.492 |
| 1191 | H | VAL | 165 | 35,514 | -13,037 | 35.120 |
| 1192 | CA | VAL | 165 | 34.403 | -12,257 | 35.007 |
| 1193 | CS | VAL | 165 | 34.514 | -10-635 | 34-703 |
| 1194 | CG 1 | VAL | 165 | 3.1.319 | -9-648 | 35.765 |
| 1195 | CG 2 | VAŁ | 165 | 35.789 | “10,215 | 34.3C9 |
| 1196 | C | VAL | 165 | 33.657 | -12.831 | 33 -842 |
| 1197 | 0 | VA1 | 165 | 34.I7Ł | -12.894 | 32.741 |
| 1138 | N | ILE | 166 | 32.379 | -1.3.163. | 34 .076 |
| 1399 | CA | ILE | 166 | 31 -455 | -13.523 | 32.969 |
| 1200 | ca | ILE | 166 | 30.40$ | -14 434 | 33.458 |
| 1201 | CG1 | ILE | 166 | 31.036 | -15.673 | 34-101 |
| 1202 | CDI | ILE | 166 | 30.336 | -16.019 | 35.379 |
| 1203 | CG2 | ILE | 166 | 29.431 | -14.739 | 32.308 |
| 1204 | C | ILE | 166 | 30,736 | -12.291 | 32,376 |
| 12 05 | 0 | ILE | 166 | 30.623 | -12.197 | 31.170 |
| 1206 | tł | GLY | 167 | 30.439 | -11 344 | 33,257 |
| 12 07 | CA | GLY | 167 | 29.531 | -10.025 | 32.868 |
| 1203 | C | GLY | 167 | 29.633 | -9.176 | 34.074 |
| 1209 | 0 | GLY | 167 | 30.244 | -9.385 | 35.106 |
| 1210 | M | ILE | 168 | 2B .705 | -8.206 | 33.964 |
| 1211 | CA | ILE | 168 | 28.332 | -7,302 | 35-058 |
| 1212 | CB | ILE | 168 | 26.899 | -5.852 | 34.689 |
| 1213 | CG1 | JLE | 168 | 28.356 | -£.200 | 33.629 |
| 1214 | CDI | ILE | L6B | 28.739 | -3.768 | 33.365 |
| 1235 | CG2 | ILE | 168 | 30.391 | -5 .850 | 34.977 |
| 1216 | C | ILE | 168 | 36,772 | -7.252 | 35-311 |
| 1217 | C | ILE | 168 | 36 .002 | -7.2J5 | 34.322 |
| 121$ | LSU | 163 | 26.320 | -7.149 | 36.576 | |
| 1219 | CA | L5U | 169 | 24.948 | 6.795 | 36.881 |
| 1320 | CB | LZD | 169 | 24 .735 | -£ .783 | 38.374 |
| 1221 | CG | LEU | 169 | 23.223 | -5.868 | 38.715 |
| 1222 | CDI | LEC | 169 | 23.O4G | -7-321 | 39.932 |
| 1223 | CC 2 | LEU | 169 | 22.612 | -5-481 | 39.068 |
| 1224 | C | LEU | 169 | 24 .476 | -5.460 | 36.269 |
| 1226 | 0 | LEU | 169 | 25.156 | -4.483 | 36.394 |
| 1226 | N | TYR | 17C | 23 .360 | -5.423 | 35.564 |
| 1227 | CA | TYR | 170 | 22.804 | -4.109 | 35.1S4 |
| 1229 | CB | TYR | 170 | 22.903 | -3 .800 | 33 .650 |
| 1229 | CG | TYR | 170 | 21.634 | -4.463 | 32.804 |
| 1230 | CDI | TYK | 170 | 20.609 | -3-859 | 32.554 |
| 1231 | CE1 | TYR | 170 | 13.522 | -4,507 | 31,735 |
| 1232 | CZ | TYR | 170 | 19.966 | -5.778 | 31 257 |
| 1233 | OH | TYR | 170 | 1S.050 | -6.505 | 30.536 |
| 1234 | CE 2 | TYR | 170 | 21.210 | -6.371 | 31.501 |
| 1235 | CD2 | TYR | 170 | 22.130 | -5.731 | 32.273 |
| 1236 | C | TYR | 170 J 21.402 | -3.712 | 35.754 | |
| 1237 | ϋ | TYR | 170 ! 21.124 | -2.532 | 35.830 | |
| 1238 | M | ALA | 171 | 20.560 | 4 .663 | 36.118 |
| 1239 | CA | ALA | 171 | 19.194 | -4 -402 | 36-475 |
| 1240 | CB | ALA | 171 | 18.328 | -4.271 | 35,178 |
| 1241 | C | ALA | 171 | 16.£90 | -5.553 | 37.309 |
| 3242 | 0 | ALA | 171 | 19.145 | -6.SB5 | 37,171 |
| 3243 | N | GLY | 172 | 17,740 | -S.257 | |
| 1244 | CA | GLY | 172 | 16-353 | -6.263 | 38.915 |
| 1245 | C | GLY | 172 | 15.475 | -£.250 | 38.569 |
| 1246 | 0 | GLY | 172 | L5.067 | -5-584 | 37,677 |
| 1247 | N | SER. | 173 | 14.662 | -6.999 | 39.296 |
| 1248 | CA | SER | 173 | 13.313 | -7.14« | 39 .032 |
| 1249 | CS | SER | 173 | 12.516 | -8.617 | 39.101 |
| 1350 | OG | SER | 173 | 12.034 | -9.007 | 37.772 |
| 1251 | c | SER | 173 | 12.155 | -6-437 | 39.894 |
| 1252 | 0 | SER | 173 | 11,3S9 | 7.121 | 40.534 |
| 1253 | N | GLY | 174 | 12.015 | “5-124 | 39.362 |
| 1254 | CA | GLY | 174 | 11.157 | -4.400 | 40.390 |
| 1255 | Ć ' | GLY | 174 | 11.555 | -4.694 | 42.367 |
| 1256 | 0 | GLY | 174 | 12.751 | 4.697 | 42.748 |
| 1257 | N | GLU | 177 | 14.944 | -4,906 | 46.813 |
| 1258 | CA | GLU | 177 | 15 .539 | -6,293 | 45.762 |
| 1259 | CB | GLU | 177 | 15,391 | -7.062 | 48.110 |
| 1260 | CG | GLU | 177 | 14.005 | -7-090 | 48 -758 |
| 1261 | CD | GLU | 177 | 14.047 | -7.698 | 50.132 |
| 1262 | 021 | GLU | 17 7 | 14.106 | -fi.977 | 51.262 |
| 1263 | CE2 | GLU | 177 | 14.047 | -8.923 | 50.196 |
| 1261 | C | GLU | 177 | 15.08S | -7.354 | 45.600 |
| 1265 | 0 | SLU | 177 | 14.113 | -6.825 | 44,989 |
| 1266 | N | SER | 179 | 15,757 | -B.225 | 45.31S |
| 126 7 | CA | SER | 173 | 15.573 | -9.034 | 44.020 |
| 126 3 | CB | SER | 179 | 15.852 | fi . 13 2 | 42 803 |
| 1269 | os | SER | 173 | 15.666 | -8.756 | 41,563 |
| 1270 | c | SER | 178 | 16.394 | -10.295 | 43.643 |
| 127 3 | 0 | SER | 178 | 17.538 | -20.294 | 43.935 |
| 1272 | N | GLU | 179 | 15.718 | -11.337 | 43 .564 |
| 1271 | CA | KLU | 179 | 16.438 | -12,594 | 43,192 |
| 1274 | CS | □1U | 179 | 16.097 | -13.722 | 44.Ϊ68 |
| 1275 | CG | SLU | 179 | 16-213 | -13.261 | 45.588 |
| 1276 | CD | GLU | 179 | 15.564 | 14.319 | 46.546 |
| 1277 | OE1 | GLU | 179 | 14.838 | -13.926 | 47.396 |
| 127& | OE2 | GLU | 179 | 16-007 | -15.542 | 46.403 |
| 1279 | C | GLU | 179 | 16.237 | -13,047 | 41.721 |
| 1290 | 0 | GLU | 179 | 16.373 | -14 .228 | 41.393 |
| 1281 | W | LYS | 180 | 15.913 | -12.082 | 40 .864 |
| 1292 | CA | LYS | iao | 15,9(39 | -12.255 | 39.402 |
| 1283 | CB | LYS | 180 | 14.497 | -12-580 | 3fi . 928 |
| 3 284 | CG | LYS | iao | 14-299 | -12.611 | 37.433 |
| 1285 | CD | LYS | 180 | 12-772 | -12,739 | 37.163 |
| 1286 | CK | LYS | 180 | 12.409 | “12.721 | 35-734 |
| 1287 | NZ | LYS | 1&0 | 12.5&7 | -14.163 | 35.366 |
| 1288 | C | LYS | iao | 1G.56G | -11.009 | 38.732 |
| 12 89 | 0 | LYS | 180 | 15.944 | -9,942 | 38.465 |
| 1290 | w | ASM | 131 | 17-850 | '11.16S | 38.443 |
| 1291 | CA | ASM | 181 | 18,714 | -10.039 | 38.062 |
| 12 92 | C3 | A SU | 182 | 19.799 | -9,817 | 39.13S |
| 1293 | CG | ASM | 181 | 19.193 | -9.583 | 40.505 |
| 1204 | CDI | ASM | 1S1 | 18.463 | -8.597 | 40-726 |
| 1295 | ND2 | ASM | iai | 19.405 | -10.519 | 41.419 |
| 1205 | C | ASM | 161 | 19.296 | *10.318 | 3S.656 |
| 1237 | 0 | ASM | 161 | 19.477 | 11 489 | 76.243 |
| 1298 | H | PKS | ia2 | 19-573 | -9.235 | 35.939 |
| 1299 | CA | PHE | 182 | 30.045 | 9.29S | 34.559 |
| 1300 | CB | PJiE | 182 | 19.091 | -8-470 | 33 -6S6 |
| 1301 | CG | PHE | 182 | 17.644 | -8.886 | 33.639 |
| 1302 | CDI | PHE | 102 | 16.691 | *7.978 | 34.230 |
| 1303 | CE1 | ΡΗΞ | 102 | 15.373 | -8.355 | 34.446 |
| 1304 | CZ | PHE | 132 | 14.909 | -9.661 | 34.240 |
| 1305 | CE2 | PHE | 102 | 15,919 | -10,590 | 33.675 |
| 1 Ϊ06 | CD2 | PSS | 102 | 1? .259 | -10.192 | 33.657 |
| 1307 | Ć | ΡΗΞ | 1S2 | 21.441 | -3.706 | 34.542 |
| 1308 | 0 | EH 3 | 182 | 21.774 | -7.769 | 35.296 |
| 1309 | H | GLY | 183 | 22.259 | -9.227 | 33.6=7 |
| 1310 | CA | OLY | 163 | 23.526 | -8-523 | 33.426 |
| 1311 | C | GLY | 183 | 23.924 | 8.714 | 31.901 |
| 1312 | 0 | GLY | 163 | 23.237 | -9.435 | 31.171 |
| 1313 | w | UAL | 184 | 24,956 | -7.942 | 31.667 |
| 1314 | CA | VAL | 184 | 25.67S | -7.903 | 30.391 |
| 1315 | ca | VAL | 184 | 26.507 | -6.608 | 30.272 |
| 1316 | CG3 | VA1. | 184 | 27.195 | 6.529 | 28,965 |
| 1317 | CG 2 | VAL | 184 | 25.633 | 5.459 | 3(3.488 |
| 1319 | c | VAŁ. | 184 | 26.604 | -9.128 | 30.457 |
| 1319 | 0 | VAL | 184 | 27.516 | -9.217 | 31.282 |
| 13 20 | K | TYR | 195 | 26.201 | -10.119 | 2S.63S |
| 1321 | CA | TYR | 195 | 27.153 | -11.241 | 29.401 |
| 1322 | ca | TYR | 185 | 2S.2&B | -12-355 | 28.925 |
| 1323 | CG | TYR | 185 | 27.064 | 13,567 | 23.577 |
| 1324 | CD], | TYR | 185 | 27.329 | -13.872 | 27,235 |
| 1325 | CEL | TYK | 185 | 28.032 | •15.001 | 26.081 |
| 1326 | CS | TYR | 135 | 23-54.1 | -15.842 | 27.87S |
| 1327 | OH | TYR | 1S5 | 29.247 | -16.375 | 27.519 |
| 13 2 B | CE2 | TYR | 105 | 23.332 | -23.53S | 29.223 |
| 1329 | CD2 | TYR | 185 | 27-571 | -14.405 | 29.575 |
| 1330 | C | TYR | l&S | 2S.304 | -10,891 | 2B.363 |
| 1331 | 0 | TYR | 1&5 | 28.031 | 10-523 | 27.237 |
| 1332 | N | EHE | 186 | 29.583 | * 10.941 | 28-758 |
| 2333 | CA | PKE | 186 | 30.687 | -10.522 | 27.843 |
| 1334 | CB | PKE | 186 | 31.945 | -10.192 | 2R.S&3 |
| 1335 | CG | PSE | 186 | 31,739 | -9.017 | 29.529 |
| 1336 | CDI | PHE | Ififi | 32.609 | -3.367 | 30.604 |
| 1337 | CB1 | PKE | 166 | 32.475 | -7.723 | 31.414 |
| 1336 | CZ | PBB | 186 | 31.914 | -6-792 | 31.136 |
| 1339 | CS 2 | PHE | 166 | 30.674 | -5.969 | 30.079 |
| 1340 | CD2 | P1IG | 16G | 30.604 | -8.048 | 29.301 |
| 1341 | C | PHE | 186 | 30.950 | -11.608 | 26.848 |
| 1342 | <3 | PHE | 1SG | 31 .432 | -12.687 | 27.229 |
| 1343 | U | THE. | 187 | 30.630 | 11.321 | 25.601 |
| 1344 | CA | TUR | 187 | 30-990 | Ί2 .066 | 24 -42S |
| 1345 | CB | THE. | 187 | 30.011 | -11.750 | 23.345 |
| 1346 | OG1 | THE. | 137 | 30.061 | -10-342 | 23.139 |
| 1347 | CG2 | THE. | 137 | 36.621 | -12.171 | 23.70S |
| 1348 | C | THR | 137 | 32 .340 | *11.503 | 23.875 |
| 1349 | 0 | THR | 137 | 32.774 | -IG.396 | 24,200 |
| 135G | K | PRO | 338 | 33 .ooe | -12.272 | 22.941 |
| 1351 | CA | PRO | 138 | 34,263 | -11.851 | 22,331 |
| 1352 | CB | PRO | 188 | 34 .421 | -12-857 | 21.190 |
| 1353 | CG | PRO | 188 | 33.336 | -14.304 | 21,902 |
| 1354 | CD | PRO | .1,88 | 32.591 | -13.630 | 22,469 |
| 1355 | c | PRO | 18S | 34 .319 | -10.398 | 21.852 |
| 1356 | 0 | PRO | IBS | 35.343 | -9.708 | 22.072 |
| 1357 | M | GLM | IBS | 33 .243 | -9.S43 | 21.193 |
| l3Sft | CA | GLN | 165 | 33 -122 | -8.301 | 20.693 |
| 1359 1360 | CB | GLN | 169 | 31.765 | -3.500 | 20.090 |
| CG | GLN | 1&9 | 31-677 | -8.319 | 18.603 | |
| 1361 | C» | GLN | 189 | 30.515 | 7.327 | 10.211 |
| 1362 | OKI | GLN | 189 | 29.327 | -7 .667 | 1S-330 |
| 1363 | NE2 | GLN | 183 | 30.333 | -6.074 | 17.706 |
| 1364 | C | GLN | 185 | 33.195 | -7.476 | 21-822 |
| 1365 | 0 | GLN | 159 | 33.750 | -6.416 | 21.633 |
| 13S6 | X | l.Rii | 190 | 32.586 | -7.727 | 22.985 |
| 13 67 | CA | LGU | 190 | 32,430 | 6.715 | 24.021 |
| 13 SB | CB | LEU | 190 | 31.293 | “6-330 | 25.002 |
| 1359 | CG | LEU | 190 | 29.675 | -6 -735 | 24.417 |
| 1370 | CDI | LEU | 190 | 28.643 | -6.9S9 | 25.443 |
| 1371 | CD2 | LEU | 190 | 29.729 | *5.407 | 23.934 |
| 1372 | C | LEU | 190 | 33.773 | -6.762 | 24.730 |
| 1373 | 0 | LEC | 190 | 34.195 | -5.726 | 25.237 |
| 13 74 | N | LYS | 191 | 34.414 | -7.962 | 24.746 |
| 2375 | CA | LYS | 191 | 35.793 | -3.077 | 25.305 |
| 1375 | ca | LYS | 191 | 36.197 | -9.511 | 25-599 |
| 2377 | CG | LYS | 191 | 35.444 | -10,090 | 26,732 |
| 1378 | CO | LYS | 191 | 35-566 | -11,511 | 27.030 |
| 2379 | CE | LYS | 191 | 35.029 | “32.616 | 2G.552 |
| 1380 | M3 | LYS | 191 | 34.799 | -13.551 | 27.675 |
| 1361 | C | LYS | 191 | 36 .370 | -7.306 | 24.520 |
| 1382 | 0 | LYS | 191 | 37,637 | -6.578 | 25.066 |
| 1383 | N | CLU | 192 | 36.340 | -7.3&S | 23 .229 |
| 1384 | CA | CŁU | 192 | 37.731 | -6-570 | 32,465 |
| 1385 | CB | GLU | 192 | 37.458 | 6-892 | 21,041 |
PL 221 052 B1
| 1386 | CG | GLU | 192 | 38.384 | -6.221 | 20.150 |
| 1387 | CD | GLU | 192 | 38.214 | -6 .694 | 18.776 |
| 1338 | OE1 | GLU | 192 | 37.036 | -6.680 | 18.274 |
| 1389 | OE2 | GLU | 192 | 39.264 | -7.096 | 18.239 |
| 1390 | c | GLU | 192 | 37.510 | -5.047 | 22 .612 |
| 1391 | ΰ | GLU | 192 | 38.493 | -4-228 | 22.635 |
| 1392 | N | PHE | 193 | 36.233 | -4.655 | 22.639 |
| 1393 | CA | PHE | 193 | 35.891 | -3-360 | 23,142 |
| 1394 | ca | PHE | 193 | 34.391 | -3-192 | 23.254 |
| 1395 | CG | PHE | 193 | 34.021 | -1.824 | 23.693 |
| 1395 | CDI | PHE | 193 | 34.015 | -0-760 | 22.751 |
| 1397 | CEI | PHE | 193 | 33.689 | 0.590 | 23.135 |
| 1398 | CZ | PHE | 192 | 33.401 | 0.828 | 24.486 |
| 1399 | CE 2 | PHE | 193 | 33.413 | 0.286 | 2S.481 |
| 1400 | CD 2 | PHE | 193 | 33-722 | -1,568 | 25.057 |
| 1401 | C | PHE | 193 | 36.584 | -2.926 | 24.475 |
| 1402 | 0 | PHE | 193 | 37.189 | -1.838 | 24.575 |
| 1403 | N | ILE | 194 | 36.438 | -3.747 | 2S.S02 |
| 14 04 | CA | ILE | 194 | 37.068 | -3.442 | 26.772 |
| 14 05 | CB | ILE | 194 | 36.677 | -4.485 | 27.829 |
| 1406 | CGl | ILE | 194 | 35.166 | -4.369 | 28.170 |
| 1407 | CDI | ILE | 194 | 34.545 | -5.666 | 28.801 |
| 1408 | CG2 | ILE | 194 | 37.564 | 4.329 | 29.055 |
| 1409 | C | ILE | 194 | 38,600 | 3.443 | 26.588 |
| 1410 | 0 | ILE | 194 | 39.328 | '2.607 | 27.101 |
| 1411 | N | GLN | 195 | 39,095 | -4.385 | 25.837 |
| 1412 | CA | GLN | 195 | 40.486 | -4.512 | 25.708 |
| 1413 | ca | GLN | 195 | 40.824 | -5.871 | 25.116 |
| 1414 | CG | GLN | 195 | 42.127 | -6.280 | 25.587 |
| 1415 | CD | GLN | 195 | 42.091 | -7,186 | 26.770 |
| 1416 | OE1 | GLN | 195 | 41.357 | -8,178 | 26,797 |
| 1417 | NE 2 | GLN | 195 | 42.966 | -6-313 | 27.731 |
| 1418 | C | GLN | 195 | 41,105 | -3,342 | 24,928 |
| 1419 | 0 | GLN | 195 | 42.169 | -2.352 | 25.282 |
| 1420 | N | ASN | 196 | 40.429 | -2.866 | 23.899 |
| 1421 | CA | ASN | 196 | 40.922 | -1.693 | 23.195 |
| 1422 | CB | ASN | 196 | 40.163 | -1.509 | 21.904 |
| 1423 | CG | ASN | 196 | 40.549 | -2 .523 | 20.906 |
| 1424 | om | ASN | 196 | 39.843 | -2.732 | 19.923 |
| 1425 | ND2 | ASN | 196 | 41.689 | -3.179 | 21.132 |
| 1426 | C | ASN | 196 | 40.892 | -0.372 | 23.959 |
| 1427 | G | ASN | 196 | 41-482 | 0.639 | 23.490 |
| 1428 | N | ASN | 197 | 40.196 | -0.363 | 25.098 |
| 1429 | CA | ASN | 197 | 40.110 | 0.831 | 25.949 |
| 1430 | CB | ASN | 197 | 38 .664 | 1.239 | 26-096 |
| 1431 | CG | ASN | 197 | 38 .114 | 1.836 | 24.823 |
| 1432 | GDI | ASN | 197 | 38-320 | 3.012 | 24 -568 |
| 1433 | ND 2 | ASN | 197 | 37,409 | 1.045 | 24.023 |
| 1434 | C | ASN | 197 | 40 .819 | 0.649 | 27,294 |
| 14 3 5 | 0 | ASN | 197 | 40-707 | 1.469 | 28.185 |
| 1436 | N | ILE | 198 | 41.550 | -0.459 | 27.4S3 |
| 1437 | CA | ILE | 198 | 42.568 | -0.485 | 28,530 |
| 1438 | CB | ILE | 198 | 42.990 | -1.887 | 28.873 |
| 1439 | CGl | ILE | 198 | 41.771 | -2.666 | 29.302 |
| 1440 | CDI | ILE | 198 | 42.073 | -4.115 | 29-729 |
| 1441 | CG2 | ILE | 198 | 43.952 | -1.895 | 30.049 |
| 1442 | C | ILE | 198 | 43.794 | 0 .452 | 28.231 |
| 1443 | 0 | ILE | 198 | 44.343 | 0.438 | 27.114 |
| 1444 | N | GLU | 199 | 44.084 | 1.367 | 29.154 |
| 1445 | CA | GLU | 199 | 45 .465 | 1.753 | 29.530 |
| 1446 | CB | GLU | 199 | 46.547 | 1.701 | 28-439 |
| 1447 | CG | GLU | 199 | 47.828 | 1.047 | 28,959 |
| 1448 | CD | GLU | 199 | 49.186 | 1.618 | 28,354 |
| 1449 | OE1 | GLU | 199 | 43.192 | 2.039 | 27.167 |
| 1450 | OE2 | GLU | 199 | 50.236 | 1,599 | 29.084 |
| 1451 | C | GLU | 199 | 45.725 | 2,960 | 30.461 |
| 1452 | O | GLU | 199 | 46.821 | 2,924 | 31.061 |
| 1453 | N | LYS | 200 | 44.856 | 3,386 | 30.652 |
| 1454 | CA | LYS | 200 | 45.177 | 4.952 | 31.804 |
| 1455 | CB | LYS | 200 | 46.679 | 5.147 | 32.063 |
| 1456 | C | LYS | 200 | 44.597 | 6.351 | 31.741 |
| 1457 | 0 | LYS | 200 | 44.106 | 6.601 | 30.642 |
| 1458 | ΟΧΤ | LYS | 200 | 44.631 | 7.215 | 32.717 |
PL 221 052 B1
Wykaz sekwencji <110> BioCentrum Sp. z o.o.
Dubin, Grzegorz Potempa, Jan
Proteinaza SplA i peptydy przez nią rozpoznawane oraz ich zastosowania <210> 1 <211? 708 <212> DNA <213? Staphylococcuo aurcug <221> CDS <222> (1)..(705) <223> gen kodujący proteinazę SplA ze Staphylococcus aurems wraz z peptydem sygnalnym <221 > raat_peptide <222> {106},.(705) <400? 1
| atg Met -35 | aat Asn | aaa aat gta atg gtt asa ggt tta act gct | tta Leu | act Thr | att Ile -20 | tta Leu | 48 | |||||||||
| Lys | Asn | Val | Met -30 | val | Lys | Gly | Leu | Thr -25 | Ala | |||||||
| aca | tct | ctt | ggt | ttt | gct | gaa | aat | att | tct | aat | cag | cct | cat | tca | att | 96 |
| Thr | Ser | Leu | Gly | Phe | Ala | Glu | Asn | Ile | Ser | Αεη | Gin | Pro | His | Ser | Ile | |
| 15 | -10 | -5 | ||||||||||||||
| gcc | aaa | gca | gaa | aag | aat | gtc | aaa | gaa | att | acc | gai | gca | act | aag | gaa | 144 |
| Ala | Lys | Ala | Glu | Lys | Asn | Val | Lya | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala | Thr | Lys | Glu | |
| -1 | 1 | 5 | 10 | |||||||||||||
| cca | tac | aat | tca | gtg | gta | gca | ttt | gtg | ggt | ggt | act | ggt | gta | gtt | gtt | 192 |
| Pro | Tyr | Asn | Ser | val | val | Ala | Phe | Val | Gly | Gly | Thr | Gly | Val | Val | Val | |
| 15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
| ggt | aaa | aat | aca | atc | gta | act | aac | aaa | cat | atc | gct | aaa | agt | aat | gat | 240 |
| Gly | Lys | Asn | Thr | Tle | Val | Thr | Asn | Lys | His | Ile | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp | |
| 30 | 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| att | ttt | aaa | aat | aga | gta | tca | gca | cat | cat | tcg | agt | aaa | ggt | aaa | ggt | Ξ38 |
| Ile | Phe | Lys | Asn | Arg | val | Ser | Ala | His | His | Ser | Ser | Lye | Gly | Lys | Gly | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| gga | aac | tac | gac | gtt | aaa | gac | att | gta | gaa | tat | ccc | gga | aaa | gaa | 336 | |
| Gly | Gly | Asn | Tyr | Asp | val· | Lys | Asp | Ile | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly | Lys | Glu | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| gac | ctt | gcg | ata | gtt | cat | gtt | cat | gaa | aca | agt | aca | gaa | ggt | ttg | aat | 384 |
| ASp | Leu | Ala | ile | vał | His | val | His | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu | Gly | Leu | Asn | |
| 80 | 8S | 90 | ||||||||||||||
| ttt | aat | a ag | aac | gtt | agt | tat | aca | aaa | ttt | gca | gac | gga | gca | aaa | gtg | 432 |
| Phe | Asn | Lys | Asn | Val | Ser | Tyr | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp | Gly | Ala | Lys | Val | |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
| aaa | gat | aga | att | tct | gtt | att | 33 h | tat | cca | aag | ggt | gca | caa | aca | aaa | 480 |
| Lys | Asp | Arg | He | Ser | Val | ile | Gly | Tyr | Pro | Lys | siy | Ala | Gin | Thr | Lye | |
| 110 | 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| tat | a aa | atg | ttt | gaa | tcg | aca | sga | acg | att | aac | cat | atc | agt | gga | acg | 52B |
| Tyr | Lys | Mat | Phe | Glu | Ser | Thr | Gly | Thr | Ile | Asn | His | Ile | Ser | Gly | Thr | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ttt | atg | gaa | ttt | gat | 3^3 | tat | gca | caa | cca | ggt | aat | tca | gga | tct | cct | 576 |
| Phe | Met | Glu | Phe | Asp | Ala | Tyr | Ala | Gin | Pro | Gly | Asn | Ser | Gly | Ser | Pro | |
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| gta | ttg | aat | tct | aaa | cat | gaa | ctg | att | ggt | att | tta | tat | gca | ggt | agt | 624 |
| vai | Leu | Asn | ser | Lys | His | Glu | Leu | Ile | Gly | Ile | Leu | Tyr | Ala | Gly | Ser | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| gga | aaa | gat | gaa | tct | gaa | aag | aat | ttc | ggt | gtt | tat | ttc | aca | cca | caa | 672 |
| Gly | Lys | Asp | Glu | Ser | Glu | Lys | Asn | Phe | Gly | Val | Tyr | Phe | Thr | Pro | Gin | |
| 175 | 180 | 165 | ||||||||||||||
| tta | aaa | gaa | ttt | att | caa | aat | aat | att | gaa | aaa | taa | 70S | ||||
| Leu | Lys | Glu | Phe | Tle | Gin | Asn | Asn | Ile | Glu | Lys | ||||||
| 190 | 195 | 200 |
<210> 2 <2ll> 240
PL 221 052 B1 <212> PRT <213 > Staphylococcus aureus <400> 2
| Met -35 | Asa Lys Asn Val | Met val -30 | Lys Gly Leu Thr -25 | Ala | Leu | Thr | Tle Leu -20 | ||||||||
| Thr | Ser | Leu | Gly | Phe | Ala | Glu | Asn | ile | Ser | Agn | Gin | Pro | His | Ser | He |
| -15 | -10 | -5 | |||||||||||||
| Ala | Lys | Ala | Glu | Lys | Asn | Val | Lys | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala | Thr | Lys | Glu |
| -1 | 1 | 5 | 10 | ||||||||||||
| Pro | Tyr | Asn | Ser | Val | Val | Ala | Phe | Val | Gly | Gly | Thr | Gly | Val | Val | Val |
| 15 | 20 | 25 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Asn | Thr | Tle | Val | Thr | Asn | Lys | His | Tle | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp |
| 30 | 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ile | Phe | Lys | Asn | Arg | val | Ser | Ala | His | His | Ser | Ser | Lys | Gly | Lys | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Gly | Gly | Asn | Tyr | Asp | Val | Lys | Asp | Ile | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly | Lys | Glu |
| 66 | 70 | 75 | |||||||||||||
| Asp | Len | Ala | ile | Val | His | Val | His | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu | Gly | Leu | Asn |
| 80 | 85 | 30 | |||||||||||||
| Phe | Asn | Lys | Asn | Val | Ser | Tyr | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp | Gly | Ala | Lys | Val |
| 95 | 100 | 105 | |||||||||||||
| Lys | Asp | Arg | Ile | Ser | val | ile | Gly | Tyr | Pro | Lys | Gly | Ala | Gin | Thr | Lys |
| 110 | 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| Tyr | Lys | Met | Phe | Glu | Ser | Thr | Gly | Thr | Ile | Asn | His | Ile | Ser | Gly | Thr |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Phe | Met | Glu | Phe | Asp | Ala | Tyr | Ala | Glu | Pro | Gly | Aon | Ser | Gly | Ser | Pro |
| 145 | 150 | 155 | |||||||||||||
| Val | Leu | Asn | Ser | Lys | His | Glu | Leu | ile | Gly | Tle | Leu | Tyr | Ala | Gly | Ser |
| 160 | 165 | 170 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Asp | Glu | Ser | Siu | Lys | Asn | Phe | Gly | Val | Tyr | Phe | Thr | Pro | Gin |
| 175 | 130 | 185 | |||||||||||||
| Leu | Lys | Glu | Phe | ile | Glu | Asn | AStl | Ile | Glu | Lys | |||||
| 190 | 195 | 200 |
<210> 3 <2ll> 690 < 212 > DNA <213> artificial setpience <220>
<223> sekwencja kodująca wariant białka SplA z peptydem sygnalnym rozpoznawanym przez B. subtilis <220>
<221> CDS <222> il) , - {687} <220>
<221> raat_peptide <222> {88} - - (6871 <400> 3
| atg Met | aac atc aaa aag ttt gca aaa | caa gca aca gta tta acc | ttt Phe -15 | act Thr | 48 | |||||||||||
| Asn | ile | Lys Lys -25 | Phe | Ala | Lys | Gin Ala -20 | Thr | Val | Leu | Thr | ||||||
| acc | gca | ctg | ctg | gca | 99* | ggc | gca | act | caa | gct | ttt | gcc | gaa | aag | aat | 9$ |
| Thr | Alu | Leu | Leu | Ala | Gly | Gly | Ala | Thr | Gin | Ala | Phe | Ala | Glu | Ifys | Asn | |
| -10 | -5 | -1 | 1 | |||||||||||||
| gtc | a&a | gaa | att | acc | gat | gca | act | aag | gaa | cca | tac | aat | tca | gtg | gta | 144 |
| Val | Lys | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala | Thr | Lys | Glu | Pro | Tyr | Asn | Ser | Val | Val | |
| 5 | 10 | 15 |
PL 221 052 B1
| gca Ala 20 | ttt Phe | gtg ggt Val Gly | ggt Gly | act Thr 25 | ggt Gly | gta gtt Val Val | gtt ggt Val Gly 30 | aaa Lys | aat Asn | aca Thr | atc Ile | gta Val 35 | 192 | |||
| act | aac | aaa | cat | atc | gct | aaa | agt | aat | gat | att | ttt | aaa | aat | aga | gta | 240 |
| Thr | Asn | Lys | His | Ile | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp | Ile | Phe | Lys | Asn | Arg | Val | |
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| tca | gca | cat | cat | tcg | agt | aaa | ggt | aaa | geje* | gga | gga | aac | tac | gac | gtt | 238 |
| Ser | Ala | His | His | Ser | Ser | Lys | Gly | Lys | Gly | Gly | Gly | Asn | Tyr | Asp | Val | |
| 55 | ¢0 | 65 | ||||||||||||||
| aaa | gac | att | gta | gaa | tat | CCC | gga | aaa | gaa | gac | ctt | gcg | ata | gtt | cat | 336 |
| Lys | Asp | Ile | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly | Lys | Glu | Asp | Leu | Ala | Ile | Val | His | |
| 70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
| gtt | cat | gaa | aca | agt | aca | gaa | ggt | ttg | aat | ttt | aat | aag | aac | gtt | agt | 384 |
| Val | His | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu | Gly | Leu | Asn | Phe | Asn | Lys | Asn | Val | Ser | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| tat | aca | aaa | ttt | gca | gac | gga | gca | aaa | gtg | aaa | gat | aga | att | tct | gtt | 432 |
| Tyr | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp | Gly | Ala | Lys | val | Lys | Asp | Arg | Ile | Ser | Val |
100 105 110 115 atc ggt tat cca aag ggt gca caa aca aaa tat aaa atg ttt gaa tcg 460
Ile Gly Tyr Pro Lys Gly Ala Gin Thr Lys Tyr Lys Met Phe Glu Ser
120 125 130 aca gga aeg att aac cat atc agt gga acg ttt atg gaa ttt gat gcg 526
Thr Gly Thr Ile Asn His Ile Ser Gly Thr Phe Ket Glu Phe Asp Ala
135 140 145
| tat Tyr | gca Ala | caa Gin 150 | cca Pro | ggt Gly | aat Asn | tca gga tct | cct gta ttg aat | tct Ser | aaa Lys | cat Hic | 576 | |||||
| Ser | Gly 155 | Ser | Pro | Val | Leu | Asn 160 | ||||||||||
| gaa | ctg | att | ggt | att | tta | tat | gca | ggt | agt | gga | aaa | gat | 9aa | tct | gaa | 624 |
Glu Leu Ile Gly Ile Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Lys Asp Glu Ser Glu
165 170 175
| aag aat | ttc | ggt | gtt | tat | ttc aca | cca caa | tta | aaa | gaa | ttt | att | caa | 672 |
| Lys Asn | Phe | Gly | Val | Tyr | Phe Thr | Pro Gin | Leu | Lys | Glu | Phe | Ile | Gin | |
| 1B0 | 185 | 190 | 195 |
aat aat att gaa aaa taa 690
Asn Asn Ile Glu Lys
200
| <210> <211? <212> <213> | 4 233 PRT a.rtif icial | secfuence |
| <220> | ||
| <223? | Synthetic | Construct |
| <400s | 4 |
| Met | Asn | Ile | Lys | Lys -25 | Phe | Ala | Lys | Gin | Ala -20 | Thr | Val | Leu | Thr | Phe -15 | Thr |
| Thr | Ala | Leu | Leu -10 | Ala | Gly | Gly | Ala | Thr -5 | Gin | Ala | Phe | Ala -I | Glxi 1 | Lys | Asn |
| Val | Lys 5 | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala 10 | Thr | Lys | Glu | Pro | Tyr 15 | Asn | Ser | Val | Val |
| Ala 20 | Phe | Val | Gly | Gly | Thr 25 | Gly | Val | Val | Val | Gly 30 | Lys | Asn | Thr | ile | Val 35 |
| Thr | Asn | Lys | His | Ile 40 | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp 45 | Ile | Phe | Lys | Asn | Arg 50 | Val |
| Ser | Ala | His | His 55 | Ser | Ser | Lys | Gly | Lys 60 | oiy | Gly | Gly | Asn | Tyr 65 | Asp | Val |
| Lys | Asp | Ile 70 | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly 7S | Lys | Glu | ASp | Leu | Ala 30 | Ile | Val | His |
PL 221 052 B1
| Val | His 85 | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu 90 | Gly | Leu | Asn | Phe | Asn 95 | Lys | Asn | Val | Ser |
| Tyr 100 | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp 105 | Gly | Ala | Lys | Val | Lys 110 | Asp | Arg | Ile | Ser | Val 115 |
| Ile | W | Tyr | Pro | Lys 120 | Gly | Ala | Gin | Thr | Lys 125 | Tyr | Lys | Met | Phe | Glu 130 | Ser |
| Thr | Gly | Thr | Ile 135 | Asn | His | Ile | Ser | Gly 140 | Thr | Phe | Met | Glu | Phe 1-45 | Asp | Ala |
| Tyr | Ala | Gin 150 | Pro | Gly | Asn | Ser | Gly 155 | Ser | Pro | Val | Leu | Asn 160 | Ser | Lys | His |
| Glu | Leu 165 | Ile | Gly | Ile | Leu | Tyr 170 | Ala | Gly | Ser | Gly | Lys 175 | Asp | Glu | Ser | Glu |
| Lys 180 | Asn | Phe | Gly | Val | Tyr 185 | Phe | Thr | Pro | Gin | Leu 130 | Lys | Glu | Phe | Ile | Gin 195 |
Asn Asn Ile Glu Lys 200 <2lO> 5 <211> 6S1 <212 > DWA <213> artificial sequence <223> sekwencja kodująca białko fuzujne zawierające dojrzałą sekwencje splA do której przyłączono metkę histydynową i sekwencję rozpoznawaną przez splA <221> CDS <222> iii = . (643) <400> 5
| atg ggc agc | agc Ser | cat His | cat His | cat His -10 | cat cat | cac His | agc Ser | agc Ser -5 | ggc Gly | tat Tyr | tta Leu | tat Tyr | 48 | ||
| Met Gly -15 | Ser | His | Kia | ||||||||||||
| gaa aag | aat | gtc | aaa | gaa | att | acc | gat | gca | act | aag | gaa | cca | tac | aat | 36 |
| Glu Lys | Asn | Val | Lys | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala | Thr | Lys | Glu | pro | Tyr | Asn | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| tca gtg | gta | gca | ttt | gtg | ggt | 93t | act | ggt | gta | gtt | gtt | ggt | aa a | aat | 144 |
| Ser Val | Val | Ala | Phe | Val | Gly | Gly | Thr | Gly | Val | Val | Val | Gly | Lys | Asn | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| aca atc | gta | act | aac | aaa | cat | atc | gct | aaa | agt | aat | gat | att | ttt | aaa | 192 |
| Thr Ile | Val | Thr | Asn | Lys | His | Ile | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp | Ile | Phe | Lys | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| aat aga | gta | tca | gca | cat | cat | tcg | agt | aaa | ggt | aa a | ggc | gga | gg* | aac | 240 |
| Asn Arg | Val | Ser | Ala | His | Kia | Ser | Ser | Lys | Gly | Lys | Gly Gly Gly | Asn | |||
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| tac gac | gtt | aaa | gac | at t | gta | gaa | tat | ccc | gga | aaa | gaa | gac | ctt | gcg | 288 |
| Tyr Asp | Val | Lys | Asp | Ile | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly | Lys | Glu | Asp | Leu | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| ata gtt | cat | gtt | cat | gaa | aca | aca | gaa | ggt | ttg | aat | ttt | aat | aag | 336 | |
| Ile Val | His | Val | His | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu | Gly | Leu | Asn | Phe | Asn | Lys | |
| 85 | 30 | 95 | |||||||||||||
| aac gtt | agt | tat | aca | aa a | ttt | gca | gac | gga | gca | aaa | gtg | aaa | gat | aga | 384 |
| Asn Val | Ser | Tyr | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp | Gly | Ala | Lys | Val | Lys | Asp | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| att tcfc | gtt. | att | ggt | tat | cca | aag | ggt | caa | aca | aa a | tat | aaa | atg | 432 | |
| ile Ser | val | Ile | Gly | Tyr | Pro | Lys | Gly | Ala | Gin | Thr | Lys | Tyr | Lys | Met | |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| ttt gaa | tcg | aca | gga | acg | att | aac | cat | atc | agt | gg* | acg | ttt | atg | gaa | 430 |
| Phe Glu | Ser | Thr | Gly | Thr | Ile | Asn | His | ile | Ser | Gly | Thr | Phe | Met | Glu | |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| ttt gat | gcg | tat | gca | caa | cca | ggt | aat | tca | 93* | tct | cct | gta | ttg | aat | 528 |
| Phe Asp | Ala | Tyr | Ala | Gin | Pro | Gly | Asn | Ser | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asn | |
| 145 | Χ50 | 155 | 160 |
PL 221 052 B1
| tct Ser | aaa Lys | cat His | gaa Glu | ctg Leu 165 | att Ile | 99t Gly | Ile | tta Leu | tat Tyr 170 | gca ggt | agt Ser | gga Gly | aaa gat Lys Asp 175 | ||
| Ala | Gly | ||||||||||||||
| gaa | tct | gaa | aag | aat | ttc | ggt | gtt | tat | ttc | aca | cca | caa | tta | gaa | |
| Glu | Ser | Glu | Lys | Asn | Phe | Gly | Val | Tyr | Phe | Thr | Pro | Gin | Leu | Lys | Glu |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ttt | att | caa | aat | aat | att | gaa | aaa | taa | |||||||
| Phe | Ile | Gin | Asn | Asn | Ile | Glu | Lys | ||||||||
| 195 | 200 | ||||||||||||||
| 6 | |||||||||||||||
| <211> | 221 | ||||||||||||||
| <2ΙΞ> | PRT | ||||||||||||||
| <213 > j | artiflcial sequen.ee | ||||||||||||||
| <223> | Synthetie Construet | ||||||||||||||
| <400> | S | ||||||||||||||
| Met | Gly | Ser | Ser | His | His | His | His | His | His | Ser | Ser | Gly | Tyr | Leu | Tyr |
| -15 | -10 | -5 | |||||||||||||
| Glu | Lys | Asn | Val | Lys | Glu | Ile | Thr | Asp | Ala | Thr | Lys | Glu | Pro | Tyr | Asn |
| 1 | S | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | Val | Val | Ala | Phe | Val | Gly | Gly | Thr | Gly | Val | Val | Val | Gly | Lys | Asn |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Thr | Ile | Val | Thr | Asn | Lys | His | Ile | Ala | Lys | Ser | Asn | Asp | Ile | Phe | Lys |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asn | Arg | Val | Ser | Ala | His | His | Ser | Ser | Lys | Gly | Lys | Gly | Gly | Gly | Asn |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | Val | Lys | Asp | Ile | Val | Glu | Tyr | Pro | Gly | Lys | Glu | Asp | Leu | Ala |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ile | Val | His | Val | His | Glu | Thr | Ser | Thr | Glu | Gly | Leu | Asn | Phe | Asn | Lys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Aan | Val | Ser | Tyr | Thr | Lys | Phe | Ala | Asp | Gly | Ala | Lys | Val | Lys | Asp | Arg |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ile | Ser | Val | ile | Gly | Tyr | Pro | Lys | Gly | Ala | Gin | Thr | Lys | Tyr | Lys | Met |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Phe | Glu | Ser | Thr | Gly | Thr | Ile | Asn | His | Ile | Ser | Giy | Thr | Phe | Met | Glu |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Phe | Asp | Ala | Tyr | Ala | Gin | Pro | Gly | Asn | Ser | Gly | Ser | Pro | Val | Leu | Asn |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Lys | His | Glu | Leu | Ile | Gly | Ile | Leu | Tyr | Ala | Gly | Ser | Gly | Lys | Asp |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Glu | Ser | Glu | Lys | Asn | Phe | Gly | Val | Tyr | Phe | Thr | Pro | Gin | Leu | Lys | Glu |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Phe | Ile | Gin | Asn | Asn | Ile | Glu | Lys |
195 200
Claims (14)
- Zastrzeżenia patentowe1. Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, znamienny tym, że posiada sekwencję wybraną spośród: Trp-Leu-Tyr, Trp-Leu-Tyr-Ser, Tyr-Glu-Tyr-Ala, Tyr-Glu-Tyr, Tyr-Met-Tyr, Tyr-Ala-Tyr-Ser, Tyr-Ala-Tyr, Tyr-Thr-Tyr-Ser, Tyr-Thr-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Gly, Tyr-Leu-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr, Val-Leu-Tyr-Thr, Val-Leu-Tyr, Trp-Leu-Ser-Thr, Trp-Leu-Ser, Trp-Met-Asn-Thr, Trp-Met-Asn, Trp-Trp-Tyr-Thr, Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp, Tyr-Trp-Met-Asn, Tyr-Trp-Met, Tyr-Trp-Leu-Ser, Tyr-Trp-Leu, Trp-Leu-Tyr.PL 221 052 B1
- 2. Białko rozpoznawane przez proteinazę SplA zawierające sekwencję aminokwasową polipeptydu jak określono w zastrz. 1.
- 3. Sekwencja nukleotydową kodująca polipeptyd jak określono w zastrz. 1.
- 4. Sekwencja nukleotydową kodująca białko jak określono w zastrz. 1.
- 5. Zastosowanie sekwencji polipeptydu jak określono w zastrz. 1, do wytwarzania białka rozpoznawanego przez proteinazę SplA.
- 6. Sposób otrzymywania dowolnego białka o znanej sekwencji aminokwasowej lub sekwencji kodującej, znamienny tym, że:a) dostarcza się białko fuzyjne posiadające sekwencję:Z1-Trp-Leu-Tyr-Z2, Z1-Trp-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Glu-Tyr-Ala-Z2, Z1-Tyr-Glu-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Met-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Ala-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Ala-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Thr-Tyr-Ser-Z2, Z1-Tyr-Thr-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Gly-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Phe-Leu-Tyr-Ser-Z2, Z1-Phe-Leu-Tyr-Z2, Z1-Val-Leu-Tyr-Thr-Z2, Z1-Val-Leu-Tyr-Z2, Z1-Trp-Leu-Ser-Thr-Z2, Z1-Trp-Leu-Ser-Z2, Z1-Trp-Met-Asn-Thr-Z2, Z1-Trp-Met-Asn-Z2, Z1-Trp-Trp-Tyr-Thr-Z2, Z1-Trp-Trp-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Trp-Trp-Tyr-Z2, Z1-Tyr-Trp-Trp-Z2, Z1-Tyr-Trp-Met-Asn-Z2, Z1-Tyr-Trp-Met-Z2, Z1-Tyr-Trp-Leu-Ser-Z2, Z1-Tyr-Trp-Leu-Z2, Z1-Trp-Leu-Tyr-Z2, gdzie:Z1 i Z2 oznacza polipeptyd zawierający jeden lub więcej aminokwasów, przy czym jeden z nich oznacza polipeptyd zawierający pożądane białko a drugi polipeptyd zawierający polipeptyd znacznikowy,b) izoluje się białko fuzyjne, korzystnie techniką chromatograficzną stosując złoże posiadające powinowactwo do polipeptydu znacznikowego,c) prowadzi się reakcję hydrolizy białka fuzyjnego za pomocą proteinazy posiadającej aktywność enzymatyczną proteinazy SplA i korzystnie izoluje się pożądane białko.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 0°C do 45°C, w pH od 5,0 do 8,0.
- 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się w buforze octanowym, cytrynianowym, mrówczanowym, MES, HEPES, PIPES, MOPS, Bis-Tris, fosforanowym lub Tris o stężeniu od 1 do 250 mM.
- 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się w roztworze zawierającym od 0 do 500 mM NaCl.
- 10. Zastosowanie proteinazy SplA do specyficznej hydrolizy polipeptydu do produkcji białek zawierającego sekwencję aminokwasową Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4, gdzie:Xaa1 jest aminokwasem wybranym spośród: Trp, Tyr, Phe, Val, He, Leu,Xaa2 jest aminokwasem wybranym spośród: Leu, Glu, Met, Ala, Thr, Trp, He, Val, Ser, Tyr,Phe, Asp,Xaa3 jest aminokwasem wybranym spośród: Tyr, Phe, Trp, Leu, Asn, Gln, Ser, Met, He, Val,Thr,Xaa4 jest pominięty lub jest dowolnym aminokwasem, korzystnie wybranym spośród: Ser, Thr, Gly, Ala, Val, Asn, Asp, Gln, Glu, Tyr.
- 11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że hydrolizowany polipeptyd posiada sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję wybraną spośród:Trp-Leu-Tyr, Trp-Leu-Tyr-Ser, Tyr-Glu-Tyr-Ala, Tyr-Glu-Tyr, Tyr-Met-Tyr, Tyr-Ala-Tyr-Ser, Tyr-Ala-Tyr, Tyr-Thr-Tyr-Ser, Tyr-Thr-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Gly, Tyr-Leu-Tyr, Tyr-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr-Ser, Phe-Leu-Tyr, Val-Leu-Tyr-Thr, Val-Leu-Tyr, Trp-Leu-Ser-Thr, Trp-Leu-Ser, Trp-Met-Asn-Thr, Trp-Met-Asn, Trp-Trp-Tyr-Thr, Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp-Tyr, Tyr-Trp-Trp, Tyr-Trp-Met-Asn, Tyr-Trp-Met, Tyr-Trp-Leu-Ser, Tyr-Trp-Leu, Trp-Leu-Tyr.
- 12. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, znamienne tym, że hydrolizę prowadzi się w temperaturze od 0°C do 45°C, w pH od 5,0 do 8,0.
- 13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że hydrolizę prowadzi się w buforze octanowym, cytrynianowym, mrówczanowym, MES, HEPES, PIPES, MOPS, Bis-Tris, fosforanowym lub Tris o stężeniu od 1 do 250 mM.
- 14. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że hydrolizę prowadzi się w roztworze zawierającym od 0 do 500 mM NaCl.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382770A PL221052B1 (pl) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplA |
| PCT/PL2008/000042 WO2008153429A2 (en) | 2007-06-11 | 2008-06-11 | A protease from staphylococcus aureus, particularly spia or spib, peptides it recognises and their use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL382770A PL221052B1 (pl) | 2007-06-28 | 2007-06-28 | Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL382770A1 PL382770A1 (pl) | 2009-01-05 |
| PL221052B1 true PL221052B1 (pl) | 2016-02-29 |
Family
ID=42984958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL382770A PL221052B1 (pl) | 2007-06-11 | 2007-06-28 | Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL221052B1 (pl) |
-
2007
- 2007-06-28 PL PL382770A patent/PL221052B1/pl not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL382770A1 (pl) | 2009-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lu et al. | Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide | |
| Feller et al. | Enzymes from Cold‐Adapted Microorganisms—The Class C β‐lactamase from the Antarctic Psychrophile Psychrobacter Immobilis A5 | |
| Narinx et al. | Subtilisin from psychrophilic antarctic bacteria: characterization and site-directed mutagenesis of residues possibly involved in the adaptation to cold. | |
| EP0542931B1 (en) | Serine protease variants having peptide ligase activity | |
| Michalska et al. | Crystal structure of plant asparaginase | |
| WO2004067737A2 (en) | Subtilases | |
| US5629173A (en) | Methods of use of serine protease variants having peptide ligase activity | |
| Zdzalik et al. | Biochemical and structural characterization of SplD protease from Staphylococcus aureus | |
| Martin et al. | New insights into the regulation of the blood clotting cascade derived from the X-ray crystal structure of bovine meizothrombin des F1 in complex with PPACK | |
| AU708674B2 (en) | Chimeric serine protiases | |
| KR102309234B1 (ko) | 세제에서의 개선된 효소 안정성을 갖는 프로테아제 | |
| WO2008153429A2 (en) | A protease from staphylococcus aureus, particularly spia or spib, peptides it recognises and their use | |
| Van den Berg et al. | Solution structure of porcine pancreatic phospholipase A2. | |
| Murakami et al. | Intermolecular interactions and characterization of the novel factor Xa exosite involved in macromolecular recognition and inhibition: crystal structure of human Gla-domainless factor Xa complexed with the anticoagulant protein NAPc2 from the hematophagous nematode Ancylostoma caninum | |
| Jin et al. | Mutation of surface residues to promote crystallization of activated factor XI as a complex with benzamidine: an essential step for the iterative structure-based design of factor XI inhibitors | |
| Almog et al. | The 0.93 Å crystal structure of sphericase: a calcium-loaded serine protease from Bacillus sphaericus | |
| Woodman et al. | Homologous substitution of ACE C-domain regions with N-domain sequences: effect on processing, shedding, and catalytic properties | |
| PL221052B1 (pl) | Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplA, białko, (54) sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplA | |
| Singh et al. | Detection of native peptides as potent inhibitors of enzymes: Crystal structure of the complex formed between treated bovine α‐chymotrypsin and an autocatalytically produced fragment, Ile‐Val‐Asn‐Gly‐Glu‐Glu‐Ala‐Val‐Pro‐Gly‐Ser‐Trp‐Pro‐Trp, at 2.2 Å resolution | |
| WO1994018329A2 (en) | Serine protease variants having peptide ligase activity | |
| Aÿ et al. | Structure of a hybrid squash inhibitor in complex with porcine pancreatic elastase at 1.8 Å resolution | |
| Arlaud et al. | Structure, function and molecular genetics of human and murine C1r | |
| KR0180103B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 속 균주 유래의 혈전용해효소 | |
| PL214451B1 (pl) | Polipeptyd wykazujący powinowactwo do centrum aktywnego proteinazy SplB, białko sekwencja nukleotydowa kodująca polipeptyd i białko, zastosowanie sekwencji polipeptydu, sposób otrzymywania białka oraz zastosowanie proteinazy SplB | |
| PL213994B1 (pl) | Mutant proteinazy SpIB i sposób otrzymywania mutanta proteinazy SpIB |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| VOID | Decisions declaring the decisions on the grant of the patent lapsed |