PL220630B1 - Nowe sulfonamidowe pochodne izoksazolo[5,4-b]pirydyny o aktywności przeciwbakteryjnej, sposób ich wytwarzania oraz nowe zastosowanie 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe sulfonamidowe pochodne izoksazolo[5,4-b]pirydyny o aktywności przeciw bakteryjnej i sposób ich wytwarzania. Przedmiotowe pochodne wykazują aktywność przeciwbakteryjną w stosunku do bakterii gram-ujemnych: Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli.

Na podstawie przeglądu piśmiennictwa można stwierdzić, że wcześniej zsyntezowane pochodne kwasu 4,7-dihydro-7-etylo-3-fenylo(etylo)-4-oksoizoksazolo[5,4-b]pirydyno-3-karboksylowego wykazały aktywność przeciwbakteryjną (Chiarino D., Napoletano M., Sala A.: Synthesis of 4,7-dihydro-7-etylo-3-fenylo(etylo)-4-oxoisoxazolo[5,4-b]pyridine-5-carboxylic agents. J.Hetrocycl.Chem., 1988, 5, 231-233).

Natomiast zsyntezowane w 2003 roku w Katedrze i Zakładzie Technologii Leków AM we Wrocławiu związki: 3-(bromopropionoiloamino)- i 3-choropropionoiloaminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny poddane wstępnym badaniom biologicznym wykazały aktywność antyproliferacyjną in vitro (Poręba K.,

Wietrzyk J., Opolski A.: Synthesis and antiproliferative activity in vitro 3-substituted Aminoisoxazolo[5,4-b]pyridines. Acta Pol. Pharm. Drug Res. 2003, 60. 293-301). Natomiast 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyna otrzymana również w 2003 roku w Katedrze i Zakładzie Technologii Leków AM we Wrocławiu (Poręba K., Wietrzyk J., Opolski A.: Synthesis and antiproliferative activity in vitro 3-substituted Aminoisoxazolo[5,4-b]pyridines. Acta Pol. Pharm. Drug Res. 2003) nie była badana w kierunku aktywności biologicznej. Przedstawiona aktywność biologiczna pochodnych izoksazolo[5,4-b]pirydyny była przyczyną podjęcia syntezy nowych jego pochodnych.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze ogólnym I:

gdzie R oznacza wodór lub grupę:

fenyłosulfonylową, 4-toluenosulfonylową,

Korzystnie związek według wynalazku jest związkiem wybranym z grupy obejmującej: 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę. 3-fenylo-sulfonyloaminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę i 3-(p-toluenosulfonyleno)aminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku określonego powyżej do wytwarzania preparatu przeciwbakteryjnego, zwłaszcza do zwalczania zakażeń wywołanych przez bakterie

Pseudomonas aeruginosa lub Escherichia coli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania związku o wzorze I gdzie R oznacza grupę fenylosulfonylową lub 4-toluenosulfonylową charakteryzujący się tym, że 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę poddaje się reakcji kondensacji z chlorkiem kwasu benzoilosulfonowego lub p-toluenosulfonowego w tetrahydrofuranie wobec bezwodnej pirydyny. Korzystnie, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się, korzystnie z równoczesnym mieszaniem, w temperaturze od 55 do 60°C. Równie korzystnie, reakcję prowadzi się w reaktorze mikrofalowym pod chłodnicą zwrotną, korzystnie w trzech cyklach po 3 minuty z pięciominutowymi przerwami, przy czym korzystnie moc zastosowanych mikrofal wynosiła 160 W.

W jednym z aspektów wynalazek dotyczy nowych pochodnych izoksazolo[5,4-b]pirydyny o aktywności przeciwbakteryjnej w stosunku do bakterii gram-ujemnych: w szczególności Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli i nazwach chemicznych: 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyna, 3-fenylosulfonylo-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyna (IP1) i 3-(p-toluenosulfonyleno)aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyna (IP2) oraz wzorach chemicznych przedstawionych na rysunku.

PL 220 630 B1

Wzory

(IPo) ,NH_a

3(ffM ,nhso₂

3(IP₂) ,NHSO_Z

-Och₃

Istota wynalazku polega na kondensacji 3-aminoizoksazolo[4,5-b]pirydyny z chlorkami arylosulfonowymi: benzenosulfonowym i p-tolueno-sulfonowym w tetrahydrofuranie wobec bezwodnej pirydyny po konwencjonalnym ogrzewaniu w koszu grzejnym i ogrzewaniu w reaktorze mikrofalowym.

Nieoczekiwanie okazało się, że nowe pochodne wykazują aktywność biologiczną, predestynującą ich do leczenia infekcji bakteryjnych. Pochodne te mogą stanowić nową klasę aktywnych związków przeciw bakteriom gram-ujemnym w szczególności przeciw bakteriom rodzajów Pseudomonas i Escherichia coli.

Związki otrzymane według wynalazku zostały przebadane na działanie przeciwbakteryjne przy użyciu krążkowego testu dyfuzyjnego (Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twenty-First Informational Supplement. CLSI dokument M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1). Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA, 2011).

Pochodne izoksazolo-pirydyny wykazały aktywność hamującą wzrost bakterii Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) i Escherichia coli ATCC 25922 w dawkach: 125 μg, 250 μg i 500 μg.

Minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów Pseudomonas aeruginosa (MIC) oznaczone w teście z rezazuryną (Martin A., Camacho M., Portaels F., Patomino JC. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: rapid, Simple, and inexpensive metod. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47(11), 3616-9) wynosiło 50 μg/ml dla obydwu związków.

Badano również toksyczność związków w teście antyproliferacyjnym MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylobromek tetrazoliny) na linii komórek nowotworu piersi (MCF7) wobec Levofloksacyny jako wzorca. Po 48 godzinnej inkubacji IC50 a dla 3-fenylosulfonyloaminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny (IP1) wynosiła 190 μg/ml, dla 3-(p-toluenosulfonyleno)aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny (IP₂) - 163 μg/ml. Natomiast po 48 godzinnej inkubacji IC₅₀ dla Levofloksacyny wynosiła 131,9 μg/ml. Po 72 godzinnej inkubacji wynosiła IC₅₀ dla IP₁ wynosiła 152,5 μg/ml, dla IP₂ - 161,08 μg/ml, a dla Levofloksacyny - 114,92 μg/ml. Obydwa badane związki wykazały niższą toksyczność od wzorca.

Toksyczność badanych związków jest niższa od toksyczności Levofloksacyny. Różnica ta jest istotna statystycznie (p-0,01-0,007). Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono z użyciem testu T studenta, z zastosowaniem programu Statistica. Przedmiot wynalazku wytwarza się według podanego niżej przykładu.

P r z y k ł a d 1. Do roztworu 1,35 g (0,01 mola) 3-aminoizoksazolo[5,4-b)pirydyny w 50 ml tetrahydrofuranu dodano 0,4 ml bezwodnej pirydyny oraz 1,76 g (0,01 mola) chlorku benzenosulfono4

PL 220 630 B1 wego. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano z równoczesnym mieszaniem w temperaturze 55-60°C w reaktorze mikrofalowym pod chłodnicą zwrotną w trzech cyklach po 3 minuty z pięciominutowymi przerwami. Moc zastosowanych mikrofal wynosiła 160 W. Nadmiar rozpuszczalnika oddestylowano, wytrącony osad odfiltrowano, przemyto wodą destylowaną i po wysuszeniu krystalizowano z etanolu. Otrzymano 1,9 g 3-fenylosulfonyloaminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny o temperaturze topnienia 188-189°C z wydajnością równą 70%.

Charakterystykę nowego związku podaje poniższa tabela.

Wzór sumaryczny Masa cząsteczkowa	Temp. topn.	Spektroskopia 1H NMR (CDCh) δ (ppm) Spektroskopia IR(KBr) cm1
C12H9N3O3S1 m.cz. 275,28	188-189°C	7,35 (dd, 1H, H-5), 7,52-7,94 (m, 6H, H-4+P), 8,68 (dd, 1H, H-6), 10,82 (s, br, 1H, NH); 3300, 2900 (NH, CH), 1600, 1580, 1450 (C=C, C=N), 1330, 1160 (SO2)

P r z y k ł a d 2. Do roztworu 1,35 g (0,01 mola) 3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny w 50 ml tetrahydrofuranu dodano 0,4 ml bezwodnej pirydyny oraz 1,9 g (0,01 mola) chlorku p-toluenosulfonowego. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano z równoczesnym mieszaniem w temperaturze 55-60°C w reaktorze mikrofalowym pod chłodnicą zwrotną w trzech cyklach po 3 minuty z pięciominutowymi przerwami. Moc zastosowanych mikrofal wynosiła 160 W. Nadmiar rozpuszczalnika oddestylowano, wytrącony osad odfiltrowano, przemyto wodą destylowaną i po wysuszeniu krystalizowano z etanolu. Otrzymano 2,8 g 3-(p-toluenosulfonyleno)aminoizoksazolo[5,4-b]pirydyny o temperaturze topnienia 173-174°C z wydajnością równą 72%.

Charakterystykę nowego związku podaje poniższa tabela.

Wzór sumaryczny Masa cząsteczkowa	Temp. topn.	Spektroskopia 1H NMR (CDCI3) δ (ppm) Spektroskopia IR (KBr) cm1
C13H11N3O3S1 m.cz. 289,05	173-174°C	2,48 (s, 3H, CH3), 7,34 (m, 3H, H-5+Ph), 7,77 (m, 3H, H-4+Ph), 8,67 (dd, 1H, H-6), 10,83 (s, br, 1H, NH); 3100, 2800 (NH, CH), 1690, 1600, 1510, 1470 (C=C, C=N), 1310, 1160 (SO2), 810 (p-CHs)

P r z y k ł a d 3. Związki wg wzoru I, pochodne IP0, IP1 i IP2 rozpuszczono w roztworach 50% DMSO i 100% DMSO w stężeniu 50 mg/ml. Przygotowano szalki Petriego ze stałym podłożem mikrobiologicznym Mϋller-Hinton, na szalki wysiano szczepy bakterii Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 i Escherichia coli ATCC 25922 tak, aby uzyskać jednorodny wzrost powierzchniowy. Na tak przygotowane szalki nakładano krążki z waty szklanej średnicy 5 mm zawierające różne dawki badanych związków. Po 20 godzinach wzrostu w temperaturze 37°C odczytywano wynik mierząc średnicę stref zahamowania wzrostu w mm. Jako kontrolę stosowano roztwory 50% DMSO i 100% DMSO. Wyniki podano w tabeli 3.

T a b e l a 3

Nr	Związek/sposób rozpuszczania	Dawka ^g]	E. coli d [mm]	P. aeruginosa d [mm]
1	2	3	4	5
1	IP0 / DMSO 100%	125	-	18
2	IP0 / DMSO 100%	250	-	24
3	IP0 / DMSO 100%	500	23	30
4	IP1 / DMSO 100%	125	-	16
5	IP1 / DMSO 100%	250	-	21
6	IP1 / DMSO 100%	500	22	27
7	IP2 / DMSO 100%	125	-	16
8	IP2 / DMSO 100%	250	-	22
9	IP2 / DMSO 100%	500	22	26

PL 220 630 B1 cd. tabeli 3

1	2	3	4	5
10	IP1 / DMSO 50%	125	-	6
11	IP1 / DMSO 50%	250	-	13
12	IP1 / DMSO 50%	500	-	20
13	IP2 / DMSO 50%	125	-	6
14	IP2 / DMSO 50%	250	-	14
15	IP2 / DMSO 50%	500	-	23

P r z y k ł a d 4. W płytce 96 dołkowej przygotowano rozcieńczenia związków wg wzoru I IP0, IP1 i IP₂ w zakresie od 40 do 50 μg/ml, co 1 μg/ml w 100 μΐ 10% DMSO. Do tak przygotowanych rozcieńczeń dodawano 100 μl hodowli bakterii Pseudomonas aeruginosa ATCC 27833 o gęstości optycznej równej OD₆₀₀ = 0,1 w dwukrotnie stężonym podłożu płynnym M^ler-Hinton. Całość inkubowano z wytrząsaniem w 37°C przez 18 godzin. Jako kontrole stosowano hodowle nie zawierające związku i hodowle nie zawierające bakterii. Po tym czasie do hodowli dodawano po 20 μl 0,01% roztworu rezazuryny w wodzie. (Martin A., Camacho M., Portaets F., Palomino JC. Resazurin microtiter assay plate testing of Mycobacterium tuberculosis susceptibilities to second-line drugs: rapid, simple, and inexpensive method. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47(11), 3616-9). Po kolejnych dwu godzinach inkubacji dokonywano odczytu wyników. Odczytu dokonywano mierząc fluorescencję zredukowanej formy rezazuryny przy długościach fali wzbudzenia: 570 nm, i emisji 590 nm. Stężenie związku w hodowli, w której fluorescencja była znacząco niższa (ponad 50%) od kolejnej o niższym stężeniu uznawano za minimalne stężenie hamujące wzrost (MIC - ang. minimal inhibitory concentration). Odczytane wyniki wynosiły odpowiednio dla związku IP₀ = 43 μg/ml, IP₁ = 47 μg/ml, IP₂ = 44 μg/ml.

Claims (6)

1. Związek o wzorze:

gdzie R oznacza wodór lub grupę fenylosulfonylową albo 4-toluenosulfonylową.

2. Związek według zastrz. 1, znamienny tym, że jest związkiem wybranym z grupy obejmującej:

3-amino-izoksazolo[5,4-b]pirydynę, 3-fenylo-sulfonyloaminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę i 3-(p-toluenosulfonyleno)aminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę.

3. Zastosowanie związku określonego w zastrz. od 1 do 2 do wytwarzania preparatu przeciwbakteryjnego, zwłaszcza do zwalczania zakażeń wywołanych przez bakterie Pseudomonas aeruginosa i Escherichia coli.

4. Sposób wytwarzania związku o wzorze:

gdzie R oznacza grupę fenylosulfonylową albo 4-toluenosulfonylową, znamienny tym, że

3-aminoizoksazolo[5,4-b]pirydynę poddaje się reakcji kondensacji z chlorkiem kwasu benzoilosulfonowego lub p-toluenosulfonowego w tetrahydrofuranie wobec bezwodnej pirydyny.

PL 220 630 B1

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że mieszaninę reakcyjną ogrzewa się, korzystnie z równoczesnym mieszaniem, w temperaturze od 55 do 60°C.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w reaktorze mikrofalowym pod chłodnicą zwrotną, korzystnie w trzech cyklach po 3 minuty z pięciominutowymi przerwami, przy czym korzystnie moc zastosowanych mikrofal wynosiła 160 W.