PL220546B1 - Opatrunek wytworzony z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi, sposób jego wytwarzania i zastosowanie naturalnych niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych lnu i/lub konopi do wytwarzania opatrunku - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest opatrunek wytworzony z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi, sposób jego wytwarzania i zastosowanie naturalnych niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych lnu i/lub konopi do wytwarzania opatrunku. Wykorzystane do opracowania opatrunku włókna lnu i konopi pochodzą z polskich upraw roślin włóknistych oraz z innych rejonów upraw skąd dostarczane jest włókno o właściwościach porównywalnych z włóknami z Polski. Opracowane opatrunki w znaczny sposób poprawiają skuteczność leczenia trudnogojących się ran, przyspieszają proces ziarninowania oraz minimalizują ryzyko powstawania blizn. Opatrunki przyspieszają proces naskórkowania nawet w przypadku potwierdzonego zakażenia ran bez konieczności stosowania antybiotyków.

Włókna lniane i konopne od wieków służące człowiekowi uważane są za najbardziej przyjazne ludziom. Badania prowadzone w Pracowni Badań Fizjologicznego Oddziaływania Wyrobów Włókienniczych IWNiRZ we współpracy z Uniwersytetem Medycznym dowiodły, że odzież lniana dzięki swym doskonałym właściwościom higienicznym, pozytywnie wpływa na parametry fizjologiczne człowieka, przy czym nie przyczynia się do powstania stresu oksydacyjnego [1], usprawnia aktywność gruczołów łojowych [2], nie powoduje desynchronizacji jednostek ruchowych mięśni [3], wpływa na poprawę jakości snu [4]. Wstępne badania prowadzone we współpracy z Katedrą Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu wskazały, iż naturalne włókna lnu i konopi posiadają własną aktywność biologiczną pozwalającą na zabijanie pewnej liczby bakterii gronkowca złocistego i pałeczki coli.

Wykorzystanie aktywności biologicznej naturalnych włókien lnu i konopi w aspekcie leczenia ran jest problemem zupełnie nowym zarówno w Polsce jak i na świecie.

Problem wykorzystania lnu do leczenia trudnogojących się ran podjęty został przez profesora Jana Szopę-Skórkowskiego z Zakładu Biochemii Genetycznej Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego. W pracach profesora Szopy, włókno lniane zostało poddane genetycznej modyfikacji, w efekcie czego otrzymano transgeniczny len z antyoksydantami o wysokiej aktywności bakteriobójczej, który z powodzeniem przeszedł serię badań leczenia ran [1]. Genetycznie modyfikowany len został wzbogacony o kwasy fenolowe i flawonoidy, które wspomagają leczenie ran [2]. Transgeniczny len charakteryzuje się podwyższonym poziomem flawonoidów w nasionach oraz w zielonych częściach roślin. Zawartość antyoksydantów w genetycznie zmodyfikowanym włóknie wynosi:

• lignany - 1,056 pg/gFW, • ferulan - 0,432 pg/gFW.

Inżynieria genetyczna prowadząca do wzbogacenia lnu w antyoksydanty zwiększyła atrakcyjność transgenicznego włókna w zakresie wykorzystania go do leczenia ran. Zostały zgłoszone trzy patenty, z czego dwa dotyczą samej transformacji genetycznej rośliny lnu, a trzeci dotyczy wykorzystania nadanych właściwości leczniczych transgenicznego lnu w zakresie trudnogojących się ran.

W opisie patentowym PL198868 (opubl. 2003-07-28) opisano sposób wytwarzania lnu o podwyższonym, poziomie polihydroksymaślanu [4]. Sposób wytwarzania lnu z podwyższonym poziomem polihydroksymaślanu polega na tym, że do genomu komórek lnu wprowadza się trzygenowy konstrukt zawierający trzy cDNA kodujące trzy bakteryjne enzymy szlaku biosyntezy polihydroksymaślanu, którymi są β-ketotiolaza, reduktaza acetoacetylo-CoA i syntaza polihydroksymaślanu. Trzygenowy konstrukt wytwarza się przez wprowadzenie do wektora pBinAR Hyg trzech genów zawierających kolejno cDNA kodujący β-ketotiolazę z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 14-3-3 i terminatora Nos, cDNA kodujący reduktazę acetoacetylo-CoA z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 35S CaMV i terminatora Nos oraz cDNA kodujący syntazę polihydroksymaślanu z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 35S CaMV i terminatora Ocs. Trzygenowy konstrukt wprowadza się do genomu komórek lnu przez inkubację z kultury Agrobacterium tumefaciens zawierającej ten konstrukt. W alternatywnym sposobie do genomu komórek lnu wprowadza się jednogenowy konstrukt cDNA kodujący β-ketotiolazę. Jednogenowy konstrukt wytwarza się przez wprowadzenie do wektora pBinAR Hyg genu zawierającego cDNA kodujący β-ketotiolazę z Ralstonia eutropha pod kontrolą promotora 14-3-3 i terminatora Nos. Konstrukt wprowadza się do genomu komórek lnu przez inkubację z kultury Agrobacterium tumefaciens zawierającej ten konstrukt. Wynalazek znajduje zastosowanie w przemyśle tekstylnym.

W zgłoszeniu patentowym PL386186A1 (opubl. 2010-04-12) opisano biokompozyt zawierający zmodyfikowany genetycznie len i jego zastosowanie [5]. Przedmiotem wynalazku jest biokompozyt, który zawiera osnowę, zawierającą polimer, wybrany spośród: polipropylenu, polistyrenu lub polihydroksymaślanu oraz zmodyfikowane włókno lniane otrzymane z lnu, posiadającego genetycznie zmoPL 220 546 B1 dyfikowane komórki, zawierające wielogenowy konstrukt zawierający cDNA, kodujący β-ketotiolazę, reduktazę acetoacetylo-CoA i syntazę polihydroksymaślanu. Wynalazek dotyczy zastosowania biokompozytu w przemyśle, w rolnictwie i w medycynie, w szczególności do wytwarzania implantów.

W zgłoszeniu patentowym W02010036135 (opubl. 2010-12-16) opisano materiał, przeznaczony zwłaszcza do wytwarzania materiału opatrunkowego [3], zawierający genetycznie zmodyfikowane włókno lniane otrzymane z lnu, posiadającego genetycznie zmodyfikowane komórki zawierających trzygenowy konstrukt zawierający trzy cDNA kodujące enzymy szlaku syntezy flawonoidów, obejmujący syntazę chalkonową (CHS), izomerazę chalconową (CHI) i reduktazę dihydroflawonolową (DFR) lub zawierający jednogenowy konstrukt zawierający cDNA kodujące transferazę glukozy. Materiał ma zastosowanie w wytwarzaniu opatrunków stosowanych do ran mechanicznych, fizycznych i chemicznych.

Jakość włókien łykowych jest ściśle związana z metodą ich ekstrakcji z roślin włóknistych. Włókna pozyskuje się z łodyg roślin w wyniku zastosowania wieloetapowej technologii:

• roszenie - proces polegający na obróbce biologicznej, • międlenie - wyodrębnianie i wydobywanie włókna z wyroszonych i wysuszonych łodyg, • trzepanie włókna - oczyszczanie włókna z inkrustracji ligninowo-pektynowych poprzez obróbkę mechaniczną.

Metoda wydobycia włókna z łodyg roślin ma duży wpływ na jakość surowca włókienniczego. Jest wiele metod roszenia: roszenie wodne, tzw. słanie, roszenie chemiczne, enzymatyczne lub z wykorzystaniem zjawiska osmozy lub ultradźwięków. Podczas procesu roszenia wodnego następuje rozkład biologiczny łodygi w wyniku działania bakterii i enzymów. W pierwszej fazie rozpuszczeniu w wodzie ulegają glikoza, policukry, część pektyn, garbniki i substancje białkowe, a następnie proces fermentacji przebiega z udziałem bakterii tlenowych i beztlenowych prowadzące do rozkładu pektyn, dzięki czemu osiągane jest rozluźnienie struktury łodyg i naruszenie więzi między łykiem i korą pierwotną oraz zdrewniałymi częściami łodygi [9]. Słanie polega na pozostawieniu zebranych roślin na polu i poddaniu ich działaniu warunków atmosferycznych: deszczy, słońca i wiatru, gdzie mikroorganizmy grzyby i bakterie za pomocą enzymów degradują pektyny, białka, cukry i inne [10, 11]. Podczas roszenia enzymatycznego lub chemicznego wykorzystuje się dodatkowo substancje - odpowiednio enzymy lub związki chemiczne, które mają za zadanie przyspieszenie procesu rozkładu łodyg [12]. W roszeniu osmotycznym i z wykorzystaniem, ultradźwięków wykorzystuje się zjawiska fizyczne [13]. Ponieważ każda z metod roszenia przebiega w różnych warunkach oraz z wykorzystaniem różnych czynników aktywnych, otrzymane włókno łykowe charakteryzuje się zróżnicowanymi właściwościami wynikającymi z różnic w składzie chemicznym roszonych włókien [7].

Włókno lnu i konopi zawiera w swoim składzie chemicznym naturalne polimery takie jak celuloza, ligniny, hemiceluloza, pektyny, woski, tłuszcze i substancje rozpuszczalne w wodzie. Średnie wartości poszczególnych komponentów włókna lnu i konopi są przedstawione w tabeli 1.

T a b e l a 1. Skład chemiczny włókna lnu i konopi - wartości uśrednione [7]

Włókno	Celuloza	Hemiceluloza	Lignina	Pektyny	Woski i tłuszcze	Substancje rozpuszczalne w wodzie
Len	71,2	18,6	2,2	2,0	1,7	4,3
Konopie	74,4	17,9	3,7	0,9	0,8	2,3

Zawartość lignin we włóknie lnu zawiera się w granicach od 0,6 do 5,0%, natomiast we włóknie konopi między 3,5 do 5,5%. Właściwości lignin opisane są w wielu publikacjach [14, 15], natomiast niewiele wzmianek można znaleźć o właściwościach antybakteryjnych lignin [16, 17].

Pomimo istniejącego niekwestionowanego osiągnięcia zespołu profesora Szopy, rozwiązanie to dotyczy genetycznie zmodyfikowanego lnu, zawierającego genetycznie zmodyfikowane włókno lniane, posiadające genetycznie zmodyfikowane komórki zawierające trzygenowy konstrukt zawierający trzy cDNA kodujące enzymy szlaku syntezy flawonoidów, obejmujący syntazę chalkonową (CHS), izomerazę chalconową (CHI) i reduktazę dihydroflawonolową (DFR) lub zawierający jednogenowy konstrukt zawierający cDNA kodujące transferazę glukozy. Nie ma natomiast żadnych badań dotyczących możliwości wykorzystania naturalnych, niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych, w tym lnu i konopi do opracowania opatrunku o określonej strukturze gwarantującej skuteczne leczenie ran. W innej pracy [16, 24], której współautorem jest jeden z twórców niniejszej innowacji, jest krótka

PL 220 546 B1 wzmianka o właściwościach antybakteryjnych tkanin lnianych pokrytych nanoligniną, nie mniej jednak przedmiotowa nanolignina jest pozyskana z ligniny kraft i jest naniesiona na tkaninę w celu uzyskania efektu barierowości przed promieniowaniem UV.

Nie ma żadnych doniesień literaturowych na temat biologicznej aktywności lignin pozyskanych z włókien łykowych predysponujących je do wykorzystania jako czynnika wspomagającego leczenie ran. Właściwości włókien łykowych są badane i opisywane w wielu artykułach naukowych, głównie z punktu widzenia ich właściwości mechanicznych, fizycznych i chemicznych [6, 7, 8, 9], natomiast w istniejącym stanie techniki nie ma informacji dotyczących opracowania struktury wytworzonego z tych włókien opatrunku o aktywności biologicznej gwarantującej skuteczne leczenie ran. Prace polskich badaczy w zakresie inżynierii genetycznej, które doprowadziły do uzyskania transgenicznego włókna lnu wzbogaconego o antyoksydanty, o właściwościach wykazujących zdolność leczenia ran stanowią znaczące w skali świata osiągnięcie. Nie mniej jednak brak jest kompleksowych badań aktywności biologicznej niemodyfikowanych genetycznie lnu i konopi pod kątem przydatności tych włókien do wytwarzania opatrunków służących leczeniu ran.

Celem przedmiotowego wynalazku jest opatrunek wytworzony z naturalnych włókien łykowych w tym lnu i konopi przeznaczony do leczenia ran. Rozwiązanie obejmuje także sposób wytwarzania, skład surowcowy oraz strukturę opatrunku z niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych, przy jednoczesnym wykorzystaniu aktywności biologicznej niemodyfikowanych genetycznie włókien lnu i konopi pozyskanych i przetworzonych według przedstawionej w opisie technologii. Jest to przedsięwzięcie zupełnie nowe i nieopisywane w literaturze.

Nieoczekiwanie możliwe okazało się określenie aktywności biologicznej niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych w funkcji ich technologicznych procesów przetwórczych, co stanowi całkowite novum w dziedzinie nauk podstawowych jak i stosowanych. Stwierdzono, że możliwe jest kompleksowe opracowanie opatrunku na podstawie wyników badań naukowych prowadzonych w zakresie:

• zidentyfikowania w składzie chemicznym niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych czynników biologicznie aktywnych wykazujących zdolność leczenia ran w funkcji procesów przetwó rczych włókna, • optymalnych procesów wydobycia włókna gwarantujących maksymalną aktywność biologiczną surowca, • opracowania warunków procesów technologicznych wytwarzania opatrunków mających na celu wyeliminowanie czynników obniżających aktywność biologiczną włókna, • optymalnej struktury opatrunku gwarantującej efektywne leczenie ran.

Przedmiotem wynalazku jest opatrunek z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi przeznaczony do leczenia ran i zawierający niemodyfikowane genetycznie włókna lnu, które zawierają w swoim składzie chemicznym co najmniej 4% lignin, i/lub niemodyfikowane genetycznie włókna konopi, które zawierają co najmniej 5% lignin, otrzymany sposobem polegającym na wydobyciu włókna metodą słańcową, po czym stosuje się mechaniczny przerób, obejmujący: międlenie, trzepanie, sortowanie, przędzenie systemem czesankowym lub w przypadku włókien kolonizowanych - systemem bawełniarskim, po czym z wytworzonych przędz wytwarza się tkaniny opatrunkowe na krosnach rapierowych, i w którym, gęstość liniowa przędzy jest nie wyższa niż 100 tex w przypadku włókna koton izowanego lub nie wyższa niż 30 tex w przypadku włókna długiego, a gęstość tkaniny w kierunku osnowy i wątku jest nie mniejsza niż 160 nitek/dm w przypadku przędzy z włókna kotonizowanego lub 300 nitek/dm w przypadku włókna długiego, przy czym sztywność zginania tkaniny opatrunkowej nie większa niż 400 mg/cm.

Korzystnie, gdy opatrunek wytworzony jest z włókna długiego lub poddanego mechanicznemu procesowi kotonizacji, bez stosowania środków chemicznych ułatwiających technologiczny przerób włókna.

Korzystnie, gdy retencja płynów jest nie mniejsza niż 55% suchej masy opatrunku.

Korzystnie, gdy opatrunek jest przeznaczony do leczenia ran, z wyłączeniem ran oparzeniowych oraz, gdy przeznaczony jest do leczenia ran zakażonych bakteriami opornymi na antybiotyki, a w szczególności Staphylococcus aureus, Escherichia coli.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania opatrunku z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi, charakteryzujący się tym, że do wydobycia włókna wykorzystuje się metodę słańcową, po czym, stosuje się mechaniczny przerób, obejmujący: międlenie, trzepanie, sortowanie, przędzenie systemem czesankowym lub w przypadku włókien kotonizowanych - systemem bawełniarskim, po czym z wytworzonych przędz wytwarza się tkaniny opatrunkowe na krosnach rapieroPL 220 546 B1 wych oraz, że gęstość liniowca przędzy jest nie wyższa niż 100 tex w przypadku włókna kotonizowanego lub nie wyższa niż 30 tex w przypadku włókna długiego, a gęstość tkaniny w kierunku osnowy i wątku jest nie mniejsza niż 160 nitek/dm w przypadku przędzy z włókna kotonizowanego lub 300 nitek/dm w przypadku włókna długiego, przy czym sztywność zginania tkaniny opatrunkowej nie większa niż 400 mg/cm, a retencja płynów nie mniejsza niż 55% suchej masy opatrunku.

Korzystnie, gdy w procesie technologicznym na żadnym etapie nie wykorzystuje się środków chemicznych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie naturalnych niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych lnu i/lub konopi, gdzie włókna lnu, zawierają w swoim składzie chemicznym co najmniej 4% lignin, a niemodyfikowane genetycznie włókna konopi, zawierają co najmniej 5% lignin do wytwarzania opatrunków określonych powyżej.

W celu lepszego zobrazowania wynalazku rozwiązanie przedstawiono na rysunku, gdzie:

figura 1 a, b, c, d przedstawia zdjęcia dokumentujące leczenie ran po zastosowaniu opatrunku z włókna lnianego niemodyfikowanego genetycznie - przypadek 1;

figura 2 a, b, c przedstawia zdjęcia dokumentujące leczenie ran po zastosowaniu opatrunku z włókna lnianego niemodyfikowanego genetycznie - przypadek 2;

figura 3 a, b, c przedstawia zdjęcia dokumentujące leczenie ran po zastosowaniu opatrunku z włókna lnianego niemodyfikowanego genetycznie - przypadek 3;

figura 4 a, b, c, d przedstawia zdjęcia dokumentujące leczenie ran po zastosowaniu opatrunku z włókna konopnego niemodyfikowanego genetycznie - przypadek 4.

Poniżej przedstawiono przykładowe realizacje wynalazku.

P r z y k ł a d y

Włókna łykowe posiadają oryginalne właściwości antybakteryjne potwierdzone badaniami mikrobiologicznymi. Badania na niemodyfikowanych genetycznie włóknach lnu i konopi przeprowadzono z użyciem następujących bakteryjnych szczepów klinicznych izolowanych od chorych:

• Staphylococcus aureus (gronkowca złocistego) • Escherichia coli (pałeczka coli).

Szczepy ww. gatunków należą do najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń miejsca operowanego. W doświadczeniach stosowano zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5 McF (oznaczonej przy użyciu aparatu Densimat; bioMerieux). Badane próbki włókien inkubowano z przygotowaną zawiesiną bakterii w temp. 37°C w okresie 90 min. i 180 min. Celem sprawdzenia oddziaływania próbek wobec komórek ludzkich, przeprowadzono badania z zastosowaniem ludzkich fibriblastów skóry (ATCC nr CRL-2522, USA). Stosowano inkubację zawiesiny ww. komórek (10⁶/ml) z próbkami włókien w okresie 90 min. i 180 min. Ocenę żywotności bakterii dokonano stosując Bacterial Viability Kit (Molecular Probes), natomiast żywotność ludzkich fibroblastów analizowano stosując Cytotoxicity Kit (Invitrogen), przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Jednocześnie w każdym doświadczeniu wykonywano badania kontrolne. Wyniki prowadzonych doświadczeń potwierdziły, iż żadne z badanych włókien lnu i konopi nie wykazują działania cytotoksycznego wobec komórek ludzkich fibroblastów skóry.

Na podstawie badań mikrobiologicznych przeprowadzonych z udziałem niemodyfikowanych genetycznie włókien lnu i konopi uzyskanych z roślin włóknistych za pomocą różnych metod ekstrakcji stwierdzono, iż proces wydobycia włókna odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu ich aktywności biologicznej. Zarówno włókno lnu, jak i konopi wydobyte z łodyg z wykorzystan iem metody słańcowej, wykazują najwyższą aktywnością przeciwbakteryjną. Ma to ścisły związek ze zróżnicowanym składem chemicznym włókien lnu i konopi w zależności od prowadzonych procesów ekstrakcji. Niemodyfikowane genetycznie włókna lnu zawierają w swoim składzie chemicznym ok. 64 - 84% celulozy, 0,6 - 5% lignin, 19% pektyn i hemiceluloz, małe ilości wosków i innych. Natomiast konopie zawierają ok. 67 - 78% celulozy, 3,5 - 5,5% lignin, 17% pektyn i hemicelulozy oraz niewielkie ilości wosków. Zastosowanie metody słańcowej do wydobycia włókna gwarantuje utrzymanie najwyższej zawartości lignin we włóknie w zakresie właściwym dla danego rodzaju włókna.

W wyniku prowadzonych badań opracowano strukturę gwarantującą dużą zdolność opatrunku do wchłaniania i sekwestracji bakterii, prawidłowe przyleganie opatrunku do nierównej powierzchni rany, prawidłowe wchłanianie wysięku i zatrzymywanie płynów, co pozwala zapobiegać maceracji skóry wokół rany.

Dzięki opracowanej strukturze i składzie surowcowym opatrunków wytworzonych zgodnie z opracowaną metodą z niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych, opatrunki są skutecznym

PL 220 546 B1 naturalnym środkiem do skutecznego leczenia trudnogojących się ran bez konieczności stosowania terapii antybiotykowej.

PRZYKŁADY

Opis badań

W celu opracowania opatrunków z naturalnych włókien lnu i/lub konopi przeprowadzono następujące badania:

1) badania nad optymalizacją procesów technologicznych przerobu włókna i wytwarzania opatrunków w aspekcie aktywności biologicznej włókien, czyli właściwości predysponujących włókna do wykorzystania w leczeniu ran,

2) badania kliniczne.

P r z y k ł a d 1

Aktywność biologiczna naturalnych włókien łykowych w aspekcie procesów technologicznych

Ekstrakcja włókien lnu i konopi z niemodyfikowanych genetycznie roślin włóknistych

Włókna lnu i konopi wydobyto z roślin włóknistych za pomocą technologii wykorzystującej różne metody roszenia: roszenie wodne, słanie, osmozę, a także włókno dekortykowane jednopostaciowe. Uzyskane włókno poddano analizie chemicznej w celu oznaczenia ich składu chemicznego. Badania wykonane zostały zgodnie ze obowiązującymi w tym zakresie metodami:

• Wyznaczenie zawartości hemiceluloz: BN-77/7529-02: „Metody badań surowców i wyrobów włókienniczych. Włókno, półwyroby i wyroby lniane oraz konopne. Wyznaczenie zawartości hemiceluloz.” • Wyznaczenie zawartości celulozy: BN-86/7501-10: „Metody badań surowców włókienniczych. Włókno lniane oraz konopne. Wyznaczenie zawartości substancji woskowych i tłuszczowych.”

Wyniki badań przedstawione zostały w tabeli nr 1.

T a b e l a 1. Skład chemiczny włókna lnu i konopi wydobytego z łodyg rośliny w wyniku stosowania różnych metod

Lp.	Rodzaj włókna	Ligniny [%]	Hemiceluloza [%]	Pektyny [%]	Woski i tłuszcze [%]	Celuloza [%]
1	Kotonina lniana francuska	1,19	9,99	1,00	-	82,06
2	Włókno lniane krótkie - francuskie	2,74	13,50	1,96	-	81,41
3	Włókno lniane czesane po osmozie	1,74	10,57	0,86	0,81	86,03
4	Włókno lniane krótkie moczone	1,85	12,98	1,90	-	85,03
5	Włókno lniane długie słańcowe	4,11	16,13	2,75	1,26	79,24
6	Włókno konopne dekortykowane (zieleńcowe - surowe)	4,09	19,78	1,78	0,12	74,18
7	konopne krótkie słańcowe	5,02	18,04	1,23	0,68	74,02
8	Włókno konopne długie - moczone	3,20	13,71	0,93	0,42	78,83
9	Włókno lniane dekortykowane	3,92	26,77	2,97	0,75	72,05
10	Włókno konopne dekortykowane	4,51	20,02	1,85	0,22	74,03

Wyniki badań składu chemicznego włókna lnu i konopi wskazują ścisłą zależność między stosowaną metodą wydobycia włókna, a jego składem chemicznym. Włókno lnu, jak i konopi wydobyte metodą słańcową wykazują najwyższą zawartość lignin w swoim składzie chemicznym.

Badania aktywności biologicznej włókna lnu i konopi prowadzone były z wykorzystaniem, metody fluorescencyjnej. Badania dowiodły, że metoda roszenia włókna ma wpływ na jego aktywność biologiczną. Zastosowanie tej metody pozwoliło na ilościową analizę właściwości bakteriobójczych badanych włókien poprzez procentowe określenie ilości zabitych bakterii badanego szczepu. Dzięki temu możliwe było wyłonienie rodzaju włókna o najsilniejszych właściwościach bakteriobójczych oraz komponentu wchodzącego w skład włókna odpowiedzialnego za te właściwości.

Badania były prowadzone z użyciem następujących bakteryjnych szczepów izolowanych od chorych:

• Staphylococcus aureus (gronkowca złocistego) • Escherichia coli (pałeczka coli).

PL 220 546 B1

Szczepy ww. gatunków należą do najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń miejsca operowanego. W doświadczeniach stosowano zawiesinę bakteryjną o gęstości 0,5 McF. Badane próbki włókien inkubowano z przygotowaną zawiesiną bakterii w temperaturze 37°C w okresie 90 min. i 180 min.

Badania aktywności biologicznej włókien lnu i konopi pozyskanych w wyniku różnych metod ekstrakcji: roszenia wodnego, słania, osmozy oraz dekortykacji wskazały na istotne różnice w zdolności badanych włókien do zabijania bakterii. Wyniki badań aktywności przeciwbakteryjnej włókien lnu i konopi przedstawione są w tabeli 2.

T a b e l a 2. Wyniki badań aktywności przeciwbakteryjnej włókna lnianego

Lp.	Rodzaj włókna	Średnia procentowa wartość zabitych bakterii (czas inkubacji 90 min.)
Staphylococcus aureus	Escherichia coli
1	Kotonina lniane francuska	12	16
2	Włókno lniane krótkie - francuskie	13	14
3	Włókno lniane czesane po osmozie	19	21
4	Włókno lniane krótkie moczone	8	18
5	Włókno lniane długie słańcowe	23*	16
6	Włókno konopne dekortykowane (zieleńcowe - surowe)	13	11
7	konopne krótkie słańcowe	22*	23*
8	Włókno konopne długie - moczone	5	18
9	Włókno lniane dekortykowane	10	11
10	Włókno konopne dekortykowane	15	11
	Kontrola żywotności	4,6 - 6,5	4,0 - 6,0

Wyniki badań aktywności biologicznej włókien lnu i konopi wykazały, iż włókna konopne wydobyte z wykorzystaniem metody słańcowej wykazują najwyższą zdolność do zabijania baterii zarówno

Staphylococcus aureus, jak i Escherichia coli. Włókno lniane słańcowe charakteryzuje się również doskonałymi właściwościami przeciwbakteryjnymi w stosunku do Staphylococcus aureus. Aktywność przeciwbakteryjna badanych próbek występuje w następstwie powierzchniowego (90 min.) kontaktu z komórkami bakteryjnymi.

W celu sprawdzenia oddziaływania próbek włókien wobec komórek ludzkich, przeprowadzono badania z zastosowaniem ludzkich fibroblastów skóry. Stosowano inkubację zawiesiny ww. komórek (10⁶/ml) z próbkami włókien w okresie 90 min. i 180 min. Żywotność ludzkich fibroblastów analizowano stosując Cytotoxity Kit przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Jednocześnie w każdym doświadczeniu, wykonywano badania kontrolne.

Wyniki badań oddziaływania cytotoksycznego badanych próbek włókna wobec ludzkich fibroblastów skóry zawiera tabela 3.

T a b e l a 3. Wyniki badań oddziaływania cytotoksycznego badanych próbek włókna

Lp.	Rodzaj włókna	Średnia procentowa wartość zabitych ludzkich fibroblastów skóry
Czas inkubacji 90 min	Czas inkubacji 180 min
1	Kotonina lniane francuska	8	10
2	Włókno lniane krótkie - francuskie	10	10
3	Włókno lniane czesane po osmozie	6	8
4	Włókno lniane krótkie moczone	8	10
5	Włókno lniane długie słańcowe	9	10

PL 220 546 B1 cd. tabeli 3

6	Włókno konopne dekortykowane (zieleńcowe - surowe)	8	8
7	konopne krótkie słańcowe	10	10
8	Włókno konopne długie - moczone	8	10
9	Włókno lniane dekortykowane	10	10
10	Włókno konopne dekortykowane	10	10
	Kontrola żywotności	6,0 - 10,0	8,0 - 10,0

Jak wynika z tabeli 3, badane próbki włókna nie wykazują oddziaływania cytotoksycznego wobec ludzkich fibroblastów skóry.

Analizując wyniki badań aktywności biologicznej włókien i składu chemicznego tych włókien pozyskanych w wyniku stosowania różnych metod ekstrakcji można stwierdzić, iż włókna słańcowe posiadające w swoim składzie chemicznym najwyższą zawartość lignin, wykazują najlepsze właściwości bakteriobójcze.

Wobec powyższych wyników badań, do opracowania opatrunków leczących rany wykorzystano włókna lnu i konopi pozyskanych z wykorzystaniem metody słania.

P r z y k ł a d 2

Technologia przerobu i struktura opatrunku

Słańcowe włókno lnu i konopi poddane zostało przerobowi na lniarskim parku przędzalniczym według technologii przerobu włókna krótkiego i włókna długiego. W trakcie procesów technologicznych nie stosowano żadnych środków chemicznych mogących mieć negatywny wpływ w kontakcie z raną i mogących, spowodować zmniejszenie właściwości bójczych badanych włókien.

Wyprodukowane przędze charakteryzowały się liczbą skrętów niższą niż nominalna, aby zapewnić mniejszą sztywność przędzy. Liczba skrętów przędzy nadawanych w trakcie procesu przędzenia musi być tak dobrana, aby zapewnić prawidłowe równomierne ułożenie włókien wyznaczających oś przędzy oraz jej właściwości mechaniczne. Nominalna liczba skrętów jest ściśle związana z wybraną techniką przędzenia, masą liniową przędzy oraz właściwościami włókna (gęstość liniowa, średnia długość oraz rodzaj włókna) i gwarantuje uzyskanie przędzy o wymaganych właściwościach. Ponieważ skręt przędzy ma duży wpływ na jej sztywność, aby uzyskać przędze miękkie, należy obniżyć liczbę skrętów w taki sposób aby nie dopuścić do znacznej redukcji wytrzymałości dyskwalifikującej przędze w procesach tkackich. W przypadku przędz przeznaczonych na opatrunki, redukcja liczby skrętów będzie na poziomie 15 - 20%.

Opatrunek z włókien lnu lub konopi ma postać tkaniny o splocie płóciennym - taki splot tkaniny gwarantuje największą powierzchnię kontaktu opatrunku z raną. Gęstość nitek osnowy i wątku jest tak dobrana, aby zminimalizować przestrzenie międzynitkowe, w których działanie przeciwbakteryjne włókna lnianego byłoby ograniczone. Jak wykazały badania, niemodyfikowane genetycznie włókno lnu i konopi działa bójczo jedynie w przypadku bezpośredniego kontaktu z bakteriami.

Sztywność zginania tkaniny, z której wykonany jest opatrunek musi zapewniać przyleganie do nierównej powierzchni rany. Przy sztywności zginania poniżej 400 mg/cm przyleganie opatrunku do rany jest prawidłowe - zostało to potwierdzone badaniami organoleptycznymi.

Niemodyfikowane genetycznie włókno lnu i konopi posiada doskonałą zdolność do wchłaniania cieczy, retencja cieczy w stosunku do suchej masy włókna wynosi 55%, co potwierdzają dane literaturowe [7]. Dzięki temu wzrasta skuteczność leczenia - podczas leczenia wydzielina z ran jest natychmiast wchłaniana przez opatrunek z niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych, które dzięki swoim właściwościom bójczym skutecznie eliminują bakterie.

Etapy technologii wytwarzania opatrunków z lnu i konopi, począwszy od ekstrakcji włókien metodą słania, a skończywszy na gotowym opatrunku przedstawione są na schemacie 1:

PL 220 546 B1

snucie, tkanie

Schemat 1: Schematyczna ilustracja etapów technologii wytwarzania opatrunków z włókien łykowych z uwzględnieniem procesów przygotowania włókna, przędzenia i tkania

P r z y k ł a d 3

Badania kliniczne

Dla sprawdzenia możliwości wykorzystania opatrunków wykonanych z niemodyfikowanych genetycznie włókien lnu i konopi oraz oceny skuteczności leczenia ran przeprowadzono badania kliniczne.

W przypadku opisanych poniżej przykładów zastosowano:

Dla przykładów 1 do 3: Opatrunek z niemodyfikowanego genetycznie włókna lnu, który zawierał w swoim składzie chemicznym 4% lignin. Niemodyfikowane genetycznie włókno lniane pozyskano metodą słańcową. Włókno poddano kotonizacji a następnie w wyniku przędzenia wytworzono przędzę o gęstości liniowej 36 tex. Z przygotowanej przędzy wyprodukowano tkaninę o gęstości: 220 nitek osnowy/1 dm oraz 190 nitek wątku/dm. Sztywność zginania wynosiła 235 mg/cm. Opatrunek poddano sterylizacji za pomocą promieniowania gamma.

Dla przykładu 4: Opatrunek z niemodyfikowanego genetycznie włókna konopi, który zawierał 5% lignin. Niemodyfikowane genetycznie włókno konopi pozyskane metodą słańcową zostało poddane kotonizacji. Wyprodukowana z tego włókna przędza o gęstości liniowej 100 tex posłużyła wytworzeniu tkaniny o gęstości 160 nitek/dm w kierunku osnowy i wątku. Sztywność zginania wynosiła 368 mg/cm.

Retencja płynów wynosiła nie mniej niż 55% suchej masy opatrunku.

PL 220 546 B1

Przypadek 1

Chory DA lat 63 z wieloletnią cukrzycą insulinozależną palący papierosy

Martwica stopy lewej, amputacja V kości śródstopia z zakażeniem • Pałeczką ropy błękitnej.

• Gronkowcem złocistym/MRSA/ • Morganella morgani

Mimo podjętej metody leczenia z wykorzystaniem antybiotyków celowanych, nie udało się wyeliminować bakterii, martwica stopy postępowała.

Dnia 23.09.2010 odstawiono antybiotyki i zastosowano opatrunki z niemodyfikowanego genetycznie lnu, opisane powyżej.

Mimo istniejącego zakażenia / dodatnie posiewy z rany, nastąpiło wygojenie rany w ciągu niecałych trzech miesięcy (07.12.2011), co przedstawiono na fig. 1.

Przypadek 2

Chora MJ 74

Rozpoznanie: Niegojące się owrzodzenie żylakowate podudzia prawego

Wywiad trzyletni: chora leczona rożnymi opatrunkami: ze srebrem, jodyną, z maścią detromycynową

W dniu 30.08.2010 zastosowano leczenie opatrunkami z lnu, opisanymi powyżej - uzyskano wyleczenie w styczniu 2011 (zdjęcie 14.01.2011) - co przedstawiono na fig. 2.

Przypadek 3

Mężczyzna SK l 49 w wieloletnim owrzodzeniu podudzia na tle przewlekłej niewydolności żylnej podudzia prawego.

W dniu 16.10.2010 rozpoczęto leczenie opatrunkami z lnu, opisanymi powyżej - wygojono 26.12.2010 (fig. 3).

Przypadek 4

Chory P. M l 52 od lat 18 leczony z powodu owrzodzenia obejmującego podudzie prawe w przebiegu zespołu pozakrzepowego i cukrzycy insulinozależnej.

Wymaz z rany:

• Pseudomonas aeroginosa (+++) • Proteus mirabilis (ESBL ujemny)

Leczony (od 23.07.2011 do 09.10.2011) zmianą codzienną opatrunków z włókna konopi bez antybiotyków uzyskano wygojenie bez przeszczepu skóry. Gojenie przez samoistne pączkowanie wysp skóry. Obecnie chory jest kontrolowany co 1 miesiąc, bez nawrotu choroby.

WNIOSKI

Przeprowadzone badania kliniczne potwierdzają, iż opatrunki wykonane z niemodyfikowanego genetycznie włókna lnu lub konopi, wytworzone z włókna pozyskanego metodą słańcową zgodnie z opisaną procedurą wykazują aktywność bakteriobójczą i mogą być stosowane do skutecznego leczenia trudnogojących się ran.

Zalety stosowania opatrunków z włókien naturalnych (lnu i konopi) niemodyfikowanych genetycznie:

1. Stosunkowo szybkie wygojenie ran zakażonych bez stosowania antybiotyków ogólnie i miejscowo, soli srebra itp.

• W ranach zainfekowanych bakteriami opornymi na wszystkie antybiotyki następuje gojenie ran (naskórkowanie) mimo dodatnich posiewów bakteriologicznych.

• Włókna w/w roślin posiadają właściwości hamowania rozwoju bakterii, odprowadzają wysięk z ran.

2. Dotychczasowe wyniki leczenia pozwalają na ostrożne wyciągniecie wniosków - stosowanie opatrunków z włókien naturalnych (len, konopie) pozwoli wyeliminować w dużym stopniu antybiotyki z leczenia zakażonych ran.

3. Koszty wytworzenia i stosunkowo niskie koszty zakupu w/w opatrunków przez chorych i placówki służby zdrowia stawiają ten produkt na pierwszym miejscu w leczeniu trudno gojących się ran.

PL 220 546 B1

Bibliografia

1. K. Skórkowska-Telichowska, A. Bugajska-Prusak, P. Pluciński, Z. Rybak, J. Szopa, 2009, Fizjologia i patologia przewlekle niegojących się owrzodzeń oraz sposoby ich miejscowego leczenia w świetle współczesnej wiedzy medycznej, Dermatologia praktyczna, 5/2009, str. 15-29,

2. K. Skórkowska-Telichowska, M. Żuk, A. Bugajska-Prusak, K. Ratajczak, K. Gąsiorowski, K. Kostyn, J. Szopa, (2010), New dressing materials derived from transgenic flax products to treat long-standing venous ulcers - a pilot study, Wound Rep Reg, 18 pp. 168-179, by the Wound Healing Society,

3. WO2010036135A3 2010-12-16 A Textile, Particularly for the Production of Wound Dressings,

4. PL198868B1 2008-07-31 Sposób wytwarzania lnu o podwyższonym poziomie polihydroksymaślanu,

5. PL386186A1 2010-04-12 Biokompozyt zawierający zmodyfikowany genetycznie len i jego zastosowanie,

6. Zimniewska M, Władyka - Przybylak M, Mańkowski J, (2011) Cellulosic Bast Fibres, their Structure and Properties suitable for Composite Applications, Chapter of book: Cellulose Fibers, Bio-, and Nano- Polymer Composites, Publisher: Springer-Verlag, Germany, p. 97-119],

7. G. Urbańczyk, (1978), Nauka o włóknie, Redakcja Wydawnictw Naukowych Politechniki Łódzkiej,

8. R. R. Franck, Bast and other plant fibres, (2005) Woodhead Publishing,

9. M.A.Hann, (2005) Innovation in Linen Manufacture, Textile Progress Series, Vol37 No 3, Woodhead Publishing,

10. Mańkowski J. (2003) The Effect of Some Agronomic Factors on the Amount and Quality of Homomorphic Fibre - Fibres&Textiles in Eastern Europe vol. 11, nr 4 (43),

11. J.A. Rosamberg and F.P. De Franca, (1967) Importance of Galacturonic Acid in Controlling the Retting of Flax, Appl. Microbiol, 15, 484-486],

12. D. Akin, J, Foulk, R. Dodd, and D. McAlister, (2001) Enzyme retting of Flax and Characteristics of Processed Fibers”, J. Biotechnol, 89, 193-203,

13. Kozłowski, R., Konczewicz, W, (2007), Application of Osmotic Pressure for Evaluation of Quality and Quantity of Fiber in Flax and Hemp in Textiles for Sustainable Development, Anandjiwala, R. et al„ Nova Science Publishers, Inc., ISBN 978-1-60021-559-9,

14. M. Hofrichter, A. Steinbuchel, (2001), Biopolymers, Lignin, Humic Substances and Coal, WILEY-VCH,

15. Z. Kin, Lignina, chemia i wykorzystanie, WNT, 1971],

16. Zimniewska M. Kozłowski R. Batog J. (2008) „Nanolignin Modified Linen Fabric as Multifunctional Product” “Molecural crystals and liquid crystals” Volume 484 Issue 1-2008, p.43/[409]50/[416|,

17. Gosselink R.J.A., Jong E., Abacherli A., Guran B, (2005): Activities and Results of the Thematic Network Eurolignin. Proceeding of the 7th International Lignin Institute Forum, April 27-28, Barcelona, Spain, 25-30,

18. Abreu H.S., Nascimento A.M., Maria M.A. (1999): Lignin structure and wood properties, Wood and Fibres Science, 31 (4), 426-433,

19. J. Batog, (2006), Aktywacja kompozytów lignocelulozowych enzymami utleniającymi. Doctor's thesis - August Cieszkowski University, Poznan,

20. H. Barton, M. Fołta, Z. Zachwieja, (2005), Zastosowanie metod FRAP, ABTS i DPPH w badaniu aktywności antyoksydacyjnej produktów spożywczych, Nowiny Lekarskie 2005, 74, 4, 510-513,

21. M. Zimniewska, R. Kozłowski (2004) Natural And Man - Made Fibers And Their Role In Creation Of Physiological State Of Human Body. Molecular Crystals and Liquid Crystals, Publisher: Taylor & Francis, Vol. 418, p. 841-858,

22. M. Zimniewska; I. Krucińska, „The Effect of Raw Material Composition of Clothes on Selected Physiological Parameters of Human Organism“ Journal of the Textile Institute, Volume 101, Issue 2, 2010, Pages 154-164,

23. M. Zimniewska Why Natural Fibres are Better than Synthetic Fibers in Clothing: Scientific Basis, The ICAC Recorder, Technical Information Section, VOL. XXVIII No. 3, September 2010, USA, str. 13-20,

PL 220 546 B1

24. Kozłowski R., Zimniewska M., Batog J. PCT/PL2007/000025 ”Cellulose fibre textiles containing nanolignin, a method of applying nanolignin onto textiles and the use of nanolignin in textile production”.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Opatrunek z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi przeznaczony do leczenia ran i zawierający niemodyfikowane genetycznie włókna lnu, które zawierają w swoim składzie chemicznym co najmniej 4% lignin, i/lub niemodyfikowane genetycznie włókna konopi, które zawierają co najmniej 5% lignin, otrzymany sposobem polegającym na wydobyciu włókna metodą słańcową, po czym stosuje się mechaniczny przerób, obejmujący: międlenie, trzepanie, sortowanie, przędzenie systemem czesankowym lub w przypadku włókien kotonizowanych - systemem bawełniarskim, po czym z wytworzonych przędz wytwarza się tkaniny opatrunkowe na krosnach rapierowych, i w którym, gęstość liniowa przędzy jest nie wyższa niż 100 tex w przypadku włókna kotonizowanego lub nie wyższa niż 30 tex w przypadku włókna długiego, a gęstość tkaniny w kierunku osnowy i wątku jest nie mniejsza niż 160 nitek/dm w przypadku przędzy z włókna kotonizowanego lub 300 nitek/dm w przypadku włókna długiego, przy czym sztywność zginania tkaniny opatrunkowej nie większa niż 400 mg/cm.
2. 2. Opatrunek według zastrz. 1, znamienny tym, że wytworzony jest z włókna długiego lub poddanego mechanicznemu procesowi kotonizacji, bez stosowania środków chemicznych ułatwiających technologiczny przerób włókna.
3. 3. Opatrunek według zastrz. 1, znamienny tym, że retencja płynów jest nie mniejsza niż 55% suchej masy opatrunku.
4. 4. Opatrunek według zastrz. 1 przeznaczony do leczenia ran, z wyłączen iem, ran oparzeniowych.
5. 5. Opatrunek według zastrz. 4, przeznaczony do leczenia ran zakażonych bakteriami opornymi na antybiotyki, a w szczególności Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
6. 6. Sposób wytwarzania opatrunku z naturalnych włókien łykowych lnu i/lub konopi, znamienny tym, że do wydobycia włókna wykorzystuje się metodę szańcową, po czym stosuje się mechaniczny przerób, obejmujący: międlenie, trzepanie, sortowanie, przędzenie systemem czesankowym lub w przypadku włókien kotonizowanych - systemem bawełniarskim, po czym z wytworzonych przędz wytwarza się tkaniny opatrunkowe na krosnach rapierowych oraz, że gęstość liniowa przędzy jest nie wyższa niż 100 tex w przypadku włókien kotonizowanego lub nie wyższa niż 30 tex w przypadku włókna długiego, a gęstość tkaniny w kierunku osnowy i wątku jest nie mniejsza niż 160 nitek/dm w przypadku przędzy z włókna kotonizowanego lub 300 nitek/dm w przypadku włókna długiego, przy czym sztywność zginania tkaniny opatrunkowej nie większa niż 400 mg/cm, a retencja płynów nie mniejsza niż 55% suchej masy opatrunku.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w procesie technologicznym na żadnym etapie nie wykorzystuje się środków chemicznych.
8. 8. Zastosowanie naturalnych niemodyfikowanych genetycznie włókien łykowych lnu i/lub konopi, gdzie włókna lnu, zawierają w swoim składzie chemicznym co najmniej 4% lignin, a niemodyfikowane genetycznie włókna konopi, zawierają co najmniej 5% lignin do wytwarzania opatrunków określonych zastrzeżeniami 1 do 5.